CN108169219A - 一种定量检测血清淀粉样蛋白a的试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒,试剂盒包括:辣根过氧化物酶标记的血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体;包被有血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体的载体;血清淀粉样蛋白A校准品;化学发光底物。同时,试剂盒的制备方法包括:用辣根过氧化物酶标记血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体;以血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被载体;以血清淀粉样蛋白A纯品配制血清淀粉样蛋白A校准品;分装上述血清淀粉样蛋白A校准品、辣根过氧化物酶标记的血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体和该HRP所作用的化学发光底物;组装为成品。本发明的试剂盒灵敏度高,特异性好,定量检测结果准确度高,使用成本低,更易推广应用。
Description
本发明涉及生物医学领域,特别涉及一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒及制备方法。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)是一种急性时限反应蛋白,属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质,相对分子量约12000。在急性时限反应中,经IL-1、IL-6和TNF刺激,SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成,可升高到最初浓度的100-1000倍,但半衰期极短,只有50分钟左右。血清淀粉样蛋白A与高密度脂蛋白 (HDL)有关,它能在炎症期间调节高密度脂蛋白的代谢。血清淀粉样蛋白A一个特别重要的特性是其降解产物能以淀粉样蛋白A (AA) 原纤维的方式沉积在不同的器官中,在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。
与 C 反应蛋白 (CRP) 类似,血清淀粉样蛋白A的含量浓度是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标,有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗。但是,血清淀粉样蛋白 A 检测在诊断发生病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特别是进行免疫抑制治疗的患者)以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面,比 C 反应蛋白更确凿。研究发现,在炎性关节炎的案例中,血清淀粉样蛋白A与疾病活动性的关系密切。同时检测 C 反应蛋白和血清淀粉样蛋白 A 能提高对感染的诊断灵敏度。对于淀粉样蛋白A 淀粉样变性患者,以将血清淀粉样蛋白 A 水平回复至正常为宗旨的治疗,能改善病情。
现有技术检测血清学指标的方法主要包括放射性同位素免疫分析、生化免疫比浊的方法分析、胶体金免疫层析法和酶联免疫吸附方法。放射免疫分析须用125I等放射性元素标记,检测设备复杂,其放射性核素的半衰期短,不能长期保存,测定结果不稳定,同时也给实验操作人员带来了放射性伤害。免疫比浊的方法,该方法检测灵敏度低,溶液受环境的影响。胶体金免疫层析法来检测,快速,便捷,单人份操作,但是缺点是只能实现半定量,只能指示一个大概范围,无法实现精确定量。酶联免疫分析检测灵敏度不够高,检测范围窄,影响因素较多,易造成假阴性和假阳性。
发明内容
本方案通过提供一种定量检测血清淀粉样蛋白A的化学发光检测试剂及制备方法,解决现有技术的检测灵敏度低,特异性差,检测范围窄的缺点。本发明研制的血清淀粉样蛋白A测定试剂(化学发光免疫分析法)采用的是双抗体夹心的反应模式,使免疫标记和有关示踪分析更加灵敏,血清淀粉样蛋白A特异性的单克隆抗体纯度高、无传染性,非特异结合反应小,可以大批量生产,同时本发明的试剂盒灵敏度高,特异性好,定量检测结果准确度高,更易推广应用。
一方面,本发明提供了一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒,本发明的试剂盒包括:
(1)辣根过氧化物酶(HRP)标记的血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体;
(2)包被有血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体的载体;
(3)血清淀粉样蛋白A校准品;
(4)上述辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物。
另一方面,本发明提供了一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂的制备方法,该方法包括:
(1)用辣根过氧化物酶标记血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体;
(2)以血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被载体;
(3)以血清淀粉样蛋白A纯品配制血清淀粉样蛋白A校准品;
(4)分装上述血清淀粉样蛋白A校准品、辣根过氧化物酶标记的血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体和该HRP所作用的化学发光底物;
(5)组装为成品。
在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中,所述载体可以为固相载体、磁性微粒、微孔板、塑料管或塑料珠;
所述载体优选为微孔板,微孔板一次可同时检验得样本量为200例,检验效率高,适合批量检验,并且方便实验人员操作。
所述标记物辣根过氧化物酶还可以为碱性磷酸酶。
所述化学发光底物可以为过氧化脲、过氧化氢、过氧化二苯甲酰和过氧化二异丙苯。
在根据本发明的方法中,其中所述步骤(1)中的用辣根过氧化物酶标记血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包括以下过程:
(1)称取5mg HRP,溶解于1ml蒸馏水中,形成浓度为5mg/ml的HRP溶液;
(2)往HRP溶液中加入0.2ml的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌30min;
(3)将溶液装入透析袋中,1mM pH 4.4的醋酸钠缓冲液进行透析,在2-8℃下过夜,获得透析后的醛化HRP溶液;
(4)加入20μl 0.2M pH 9.5的碳酸钠缓冲液,调节醛化HRP溶液的pH至9.0~9.5,加入含10mg 抗SAA抗体的1ml 0.01M碳酸盐缓冲液,室温避光轻轻搅拌2小时;
(5)加入0.1ml 4mg/ml NaBH4溶液,混匀,在2-8℃下放置2小时;
(6)溶液装入透析袋中,在2-8℃下0.05M pH 7.4的 PBS缓冲液透析过夜;中间换两次透析液;
(7)将透析袋中溶液移入到5mL玻璃瓶中,加入等体积的甘油,获得HRP标记SAA抗体溶液备用。
在根据本发明的方法中,其中所述步骤(2)中的以血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被载体可以包括以下过程:
(1)用含2μg/mL血清淀粉样蛋白A的0.05M pH 4.6柠檬酸盐缓冲液加入到微孔板中,110μL/孔,2-8℃包被20-24小时,弃去孔内液体,用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗液洗板三次;
(2)用含质量比2%的水解明胶,质量比2.5%的蔗糖,0.05M pH 7.4的PBS缓冲液,按200μL/孔、2-8℃封闭18-24小时后,弃去孔内液体;
(3)放入37℃恒温箱中干燥16-28小时,用封口袋封口后,2-8℃存放。
本发明“血清淀粉样蛋白A化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人血清淀粉样蛋白A的含量,可以根据血清淀粉样蛋白A含量,监测感染性疾病早期炎症,有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗,有很高的临床价值。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。
进一步地,本发明中对血清淀粉样蛋白A的包被浓度进行了筛选及优化,其浓度的含量将影响包被板的吸附能力及包被效果;最终影响试剂盒的灵敏度和精密性。
更进一步地,本发明中对血清淀粉样蛋白A的包被缓冲液进行了筛选及优化,包被缓冲液的离子浓度大小,pH值的高低将影响包被板的稳定性,重复性;从而影响试剂盒的灵敏度和精密性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是试剂盒校准曲线图,以校准品浓度为横坐标,发光值RLU为纵坐标绘出标准曲线,进行线性拟合,其中线性方程为y=11646x-77461,r= 0.9989;
图2为试剂盒制备方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1 血清淀粉样蛋白A的抗体的制备
SAA单克隆抗体,用0.05M pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS) 4℃透析过夜。
实施例2 制备本发明的血清淀粉样蛋白A定量测定试剂盒
一、辣根过氧化酶抗体制备
1. 辣根过氧化酶标记单抗稀释液 :
磷酸盐缓冲液(PBS):重量比为0.2% 0.02M pH7.5的牛血清白蛋白(BSA)。
2. 辣根过氧化酶标记单抗浓度选定:
辣根过氧化酶标记单抗的工作浓度为0.2μg/mL。
二、SAA校准品的制备
用SAA纯品配制,稀释液稀释,分装为0.5mL/瓶,浓度为 0、5、20、60、200、600ng/mL,共6瓶,2-8℃保存。
三、辣根过氧化酶标记的抗体制备:
(1)称取5mg 辣根过氧化酶(HRP),溶解于1ml蒸馏水中,形成浓度为5mg/ml的HRP溶液;
(2)往HRP溶液中加入0.2ml的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌30min;
(3)将溶液装入透析袋中,1mM pH 4.4的醋酸钠缓冲液透析,2-8℃下过夜,获得透析后的醛化HRP溶液;
(4)加入20μl 0.2M pH 9.5的碳酸钠缓冲液,调节醛化HRP溶液的pH至9.0~9.5,加入含10mg 抗SAA抗体的1ml 0.01M碳酸盐缓冲液,室温避光轻轻搅拌2小时;
(5)加入0.1ml 4mg/ml NaBH4溶液,混匀,在2-8℃下放置2小时;
(6)溶液装入透析袋中,在2-8℃下0.05M pH 7.4的 PBS缓冲液透析过夜;中间换两次透析液;
(7)将透析袋中溶液移入到5mL玻璃瓶中,加入等体积的甘油,获得HRP标记SAA抗体溶液备用。
四、血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被载体的制备:
(1)用含2μg/mL血清淀粉样蛋白A的0.05M pH 4.6柠檬酸盐缓冲液加入到微孔板中,110μL/孔,2-8℃包被20-24小时,弃去孔内液体,用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗液洗板三次;
(2)用含质量比2%的水解明胶,质量比2.5%的蔗糖,0.05M pH 7.4的PBS缓冲液,按200μL/孔、2-8℃封闭18-24小时后,弃去孔内液体;
(3)放入37℃恒温箱中干燥16-28小时,用封口袋封口后,2-8℃存放。
五、化学发光底物液制备:
化学发光底物液含有:
A液:
鲁米诺 2g/L
邻苯基苯酚 0.16g/L
Tris-HCl缓冲液 0.2M pH 7.4;
B液:
过氧化脲 0.6g/L
Tris-HCl缓冲液 0.2M pH 7.4
六、浓缩洗涤液:
浓缩洗涤液含有:
NaCl 16%(重量)
KCl 0.4%(重量)
吐温20 0.1%(体积)
Tris-HCl缓冲液 0.2M pH 7.4。
七、成品组成。
实施例3 包被微孔板工艺:
化学发光(chemiluminescence)是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时,吸收了反应过程中所产生的化学能,使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态,当电子从激发态回复到基态时,以发射光子的形式释放出能量。
化学发光工艺中,包被工艺过程中的包被浓度不同,缓冲液的离子浓度及pH值的高低,对包被微孔板的吸附能力,吸附效果及孔间的一致性影响较大,从而影响整个试剂盒的精密性,重复性及准确性。
1. 血清淀粉样蛋白A包被浓度筛选
本发明对血清淀粉样蛋白A的包被浓度进行了筛选及优化,其浓度的含量将影响包被板的吸附能力及包被效果;最终影响试剂盒的灵敏度和精密性。
在其中一个实施例中,血清淀粉样蛋白A得包被浓度在1.0μg/mL -8.0μg/mL,但包被浓度将直接影响化学发光得信号得信噪比Q5 RLU /Q0 RLU值,该值越大,试剂盒得灵敏度越好;
在其中一个实施例中,当包被浓度为2.0μg/mL时,其信噪比Q5 RLU /Q0 RLU值最大,灵敏度最好,因此优选地,当血清淀粉样蛋白A包被浓度为2.0μg/mL时,试剂盒灵敏度较高。
2.包被缓冲液的筛选
本发明中对血清淀粉样蛋白A的包被缓冲液进行了筛选及优化,包被缓冲液的离子浓度大小将影响包被板的稳定性,重复性;从而影响试剂盒的灵敏度和精密性;
在其中一个实施例中,包被缓冲液可以为柠檬酸盐、磷酸盐或碳酸盐,不同离子浓度及PH值得包被缓冲液得化学发光信号得信噪比值不同,将直接影响试剂盒得灵敏度和精密性;
将血清淀粉样蛋白A分别用0.05M pH 4.6柠檬酸盐缓冲液,0.05M pH 7.5磷酸盐缓冲液,0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释2.0μg/mL浓度,制备好微孔板后,进行参考品Q0和Q5的检测,包被缓冲液将直接影响化学发光得信号得信噪比Q5 RLU /Q0 RLU值,该值越大,试剂盒得灵敏度越好;
在其中一个实施例中,当包被缓冲液为0.05M 柠檬酸盐缓冲液时,其信噪比Q5 RLU /Q0 RLU值最大,灵敏度最好,因此优选地,包被缓冲液为0.05M 柠檬酸盐缓冲液。
3.包被缓冲液pH值的筛选
本发明中对血清淀粉样蛋白A的包被缓冲液进行了筛选及优化,包被缓冲液的pH值将影响包被板的稳定性,重复性;从而影响试剂盒的灵敏度和精密性;
在其中一个实施例中,包被缓冲液得pH值可以为4.0-5.0;
将血清淀粉样蛋白A分别用0.05M pH 4.0柠檬酸盐缓冲液,0.05M pH 4.6柠檬酸盐缓冲液,0.05M pH 5.0柠檬酸盐缓冲液稀释2.0μg/mL浓度,制备好微孔板后,进行参考品Q0和Q5的检测,0.05M pH 4.6柠檬酸盐缓冲液其信噪比Q5 RLU/Q0 RLU比值较其他pH值的较好,因此选择0.05M pH 4.6柠檬酸盐缓冲液作为血清淀粉样蛋白A包被缓冲液。
实施例4 本发明的试剂盒的方法学鉴定
按照该产品的技术标准要求对实施例2中制备的试剂盒进行检定,
(1)试剂盒灵敏度实验
以S0校准品进行20孔重复测定,其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的浓度值为试剂盒的灵敏度,其灵敏度为 0.65 ng/mL。
(2)试剂盒特异性实验
与其类似物作交叉反应实验,交叉反应率<0.01%。
(3)试剂盒精密性实验
批内变异
取20、200ng/mL两水平质控品分别进行10孔平行实验,计算测定值的平均值()和标准差(s)。按公式CV=s/×100%计算变异系数,批内变异系数CV分别为3.64%、2.58%;
批间变异
选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定,计算其批间变异系数(CV%),批间变异CV小于5%。
(4)试剂盒准确性实验
将高浓度的校准品原料,用正常人血清稀释成四个不同浓度值,每个浓度做5孔平行实验,分别计算回收率在91-108%范围内。
(5)试剂盒稳定性实验
试剂盒保存温度为2-800C,经过15个月的测定试剂盒的各项指标均满足要求,考虑到运输和使用过程中对试剂盒的影响,我们进行370C ,7天的加速实验,实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。
说明“血清淀粉样蛋白A化学发光免疫分析定量测定试剂盒”的灵敏度、特异性、精密性、准确性和稳定性是完全合格的。
本发明“血清淀粉样蛋白A化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以准确地定量检测出病人血清淀粉样蛋白A的含量,可以根据血清淀粉样蛋白A含量,监测感染性疾病早期炎症,有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗,有很高的临床价值。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。
进一步地,本发明中对血清淀粉样蛋白A的包被浓度进行了筛选及优化,其浓度的含量将影响包被板的吸附能力及包被效果;最终影响试剂盒的灵敏度和精密性。
更进一步地,本发明中对血清淀粉样蛋白A的包被缓冲液进行了筛选及优化,包被缓冲液的离子浓度大小,pH值的高低将影响包被板的稳定性,重复性;从而影响试剂盒的灵敏度和精密性。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种定量检测血清淀粉样蛋白A的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:辣根过氧化物酶标记的血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体、包被有血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体的载体、血清淀粉样蛋白A校准品和上述辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述载体为固相载体、磁性微粒、微孔板、塑料管或塑料珠。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物为过氧化脲、过氧化氢、过氧化二苯甲酰和过氧化二异丙苯。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物液包括A液和B液,A液包括2g/L的鲁米诺、0.16g/L的邻苯基苯酚和0.2M pH 7.4的Tris-HCl缓冲液;B液包括0.6g/L的过氧化脲和0.2M pH 7.4的Tris-HCl缓冲液。
5.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)用辣根过氧化物酶标记血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体;
(2)以血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被载体;
(3)以血清淀粉样蛋白A纯品配制血清淀粉样蛋白A校准品;
(4)分装上述血清淀粉样蛋白A校准品、辣根过氧化物酶标记的血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体和该辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物;
(5)组装为成品。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述用辣根过氧化物酶标记血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包括以下过程:
(1)称取5mg 辣根过氧化物酶,溶解于1ml蒸馏水中,形成浓度为5mg/ml的辣根过氧化物酶溶液;
(2)往辣根过氧化物酶溶液中加入0.2ml的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌30分钟;
(3)将溶液装入透析袋中,1mM pH 4.4的醋酸钠缓冲液进行透析,在2-8℃下过夜,获得透析后的醛化辣根过氧化物酶溶液;
(4)加入20μl 0.2M pH 9.5的碳酸钠缓冲液,调节醛化辣根过氧化物酶溶液的pH至9.0~9.5,加入含10mg 抗血清淀粉样蛋白A抗体的1ml 0.01M碳酸盐缓冲液,室温避光轻轻搅拌2小时;
(5)加入0.1ml 4mg/ml NaBH4溶液,混匀,在2-8℃下放置2小时;
(6)溶液装入透析袋中,在2-8℃下0.05M pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析过夜;中间换两次透析液;
(7)将透析袋中溶液移入到5mL玻璃瓶中,加入等体积的甘油,获得辣根过氧化物酶标记血清淀粉样蛋白A抗体溶液备用。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述以血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被载体包括以下过程:
(1)用含2μg/mL血清淀粉样蛋白A的0.05M pH 4.6柠檬酸盐缓冲液加入到微孔板中,110μL/孔,2-8℃包被20-24小时,弃去孔内液体,用磷酸盐吐温缓冲液洗液洗板三次;
(2)用含质量比的2%的水解明胶,质量比2.5%的蔗糖,0.05M pH 7.4的磷酸盐缓冲液,按200μL/孔、2-8℃封闭18-24小时后,弃去孔内液体;
(3)放入37℃恒温箱中干燥16-28小时,用封口袋封口后,2-8℃存放。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述血清淀粉样蛋白A纯品配制血清淀粉样蛋白A校准品包括以下过程:用血清淀粉样蛋白A纯品配制,稀释液稀释,分装为0.5mL/瓶,浓度为 0、5、20、60、200、600ng/mL,共6瓶,2-8℃保存。
9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述血清淀粉样蛋白A得包被浓度为2.0μg/mL。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述血清淀粉样蛋白A包被缓冲液为0.05M pH 4.6柠檬酸盐缓冲液、0.05M pH 4.6柠檬酸盐缓冲液、0.05M pH 7.5磷酸盐缓冲液或0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液。
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