CN109444420A - 一种定量测定猫血清淀粉样蛋白a的化学发光免疫分析试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，该试剂盒包括了已包被的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的毛细管、碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体、猫血清淀粉样蛋白A校准品和作用于碱性磷酸酶的化学发光底物。本发明能够定量测定猫血清淀粉样蛋白A，且加样量少，成本低，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精密度、操作方法简单和检查效率高的优点。

Description

一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试 剂盒

技术领域

本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒。

背景技术

猫血清淀粉样蛋白A（SAA）是淀粉样沉积的前体物质，是在研究淀粉样变性的过程中发现的，其后作为一种急性时相反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质。在急性时相反应中，经白细胞介素-1、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子刺激，猫血清淀粉样蛋白A在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100 -1000倍。在炎症期间，猫血清淀粉样蛋白A能与血浆高密度脂蛋白（HDL）结合，调节高密度脂蛋白的代谢。此外，猫血清淀粉样蛋白A的降解产物能以淀粉样蛋白A(AA)原纤维的方式沉积在不同的器官中，在慢性炎症疾病中这是一种严重的并发症。猫血清淀粉样蛋白A升高可发生在动脉粥样硬化、糖尿病肾病、急性心肌梗死、冠心病、慢性肾脏疾病等炎症性疾病中。

在兽医学中，猫血清淀粉样蛋白A是一种灵敏的炎症和组织损伤标志物，测定血液中的猫血清淀粉样蛋白A可以用于诊断亚临床炎症、监控动物炎症和感染的治疗效果以及监控病患外科手术。猫血清淀粉样蛋白A是一种主要的猫急相蛋白。当猫患有系统性炎症时，猫血清淀粉样蛋白A浓度水平会出现升高。目前，猫血清淀粉样蛋白A已经被建议作为一种合适的标志物用以诊断猫炎症反应。此外，还有报道显示猫猫血清淀粉样蛋白A可以作为一种患病个体的预后标志物。

目前关于猫猫血清淀粉样蛋白A的检测方法有乳胶凝集免疫检测法，免疫层析分析法、酶联免疫吸附方法。

上述所说方法无法实现精确定量。且灵敏度不够高，检测范围窄，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。化学发光免疫检测(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、抗体、激素、酶、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项免疫测定技术。化学发光法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，检测范围宽等优点。相对于酶联免疫检测法的半定量，化学发光是真正的定量，且检测速度较快，更为方便。同时，化学发光标记物稳定，试剂有效期长，大大方便了临床应用的需要。

申请公布号为CN108169219A，申请公布日为2018年6月15日的中国发明专利申请公布了一种定量检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂盒，试剂盒包括：辣根过氧化物酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体；包被有猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体的载体；猫血清淀粉样蛋白A校准品；化学发光底物。同时，试剂盒的制备方法包括：用辣根过氧化物酶标记猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体；以猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被载体；以猫血清淀粉样蛋白A纯品配制猫血清淀粉样蛋白A校准品；分装上述猫血清淀粉样蛋白A校准品、辣根过氧化物酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体和该HRP所作用的化学发光底物；组装为成品。本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，定量检测结果准确度高，使用成本低，更易推广应用。

1、该专利用到的载体是磁性微粒、微孔板、塑料管或塑料珠，采用这样的载体存在上样量较大，使用的血清样本量较大的缺陷，检测效率较低；

2、该专利提供的试剂盒并不能用于定量检测猫血清淀粉样蛋白A。

发明内容

鉴于现有技术测定猫血清淀粉样蛋白A存在的上述缺陷，本发明提出了定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，通过该试剂盒能够定量测定猫血清淀粉样蛋白A，且加样量少，成本低，具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精密度、操作方法简单和检查效率高的优点。

为了达到上述技术目的，本发明所采用的技术方案是：

一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括了已包被的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的毛细管、碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体、猫血清淀粉样蛋白A校准品和作用于碱性磷酸酶的化学发光底物。

所述已包被的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的毛细管的制备方法包括毛细管的前期处理步骤和以猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被毛细管步骤。

所述毛细管的前期处理步骤具体为：

步骤1，清洗

将浓盐酸与乙醇按照1:1（体积比）的比例混合，制成混合溶液Ⅰ，温度为22～28℃下，将毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中20～30min后，取出毛细管，用超纯水淋洗，并吹干，然后用碱性溶液浸泡毛细管，浸泡温度为22～28℃，浸泡时间为20～30min，取出毛细管，用超纯水淋洗，并吹干；

步骤1中，毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中后，用超纯水淋洗5次以上，毛细管用碱性溶液浸泡后，用超纯水淋洗5次以上；

步骤2，羟基化

将双氧水和浓硫酸按1：2～3（体积比）混合，制成混合溶液Ⅱ，在温度为22～28℃的条件下将毛细管浸泡在混合溶液Ⅱ中，超声处理20～30min后，取出毛细管，用超纯水淋洗并吹干，改用碱性溶液淋洗，乙醇淋洗，然后用超纯水淋洗并吹干；

步骤2中，毛细管用混合溶液Ⅱ浸泡后，用超纯水淋洗3次以上，毛细管用碱性溶液淋洗3次后，用乙醇淋洗次3次，然后用超纯水淋洗5次并吹干；

步骤3，氨化

将毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中，3～4小时后取出，用乙醇冲洗；然后将毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中，20～24小时后取出，用乙醇冲洗；最后将毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中，20～24小时后取出，用乙醇冲洗，并烘干；

所述3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中，3-氨丙基三乙基硅烷的体积百分比为5～10%，含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中，甲基丙烯酸甲酯的体积百分比为5～10%，含乙二胺的乙醇中，乙二胺的体积百分比为5～10%；

所述毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中的浸泡温度为70～80℃，所述毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中的浸泡温度为40～50℃，所述毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中的浸泡温度为40～50℃；

每次用乙醇冲洗毛细管的次数都是3次；

步骤4，活化

用SMCC活化剂在室温条件下活化毛细管1～1.5小时，然后用Tris-HCL缓冲液清洗，吹干；

步骤4中，毛细管吹干后在温度为2～8℃的条件下，放置保存。

所述以猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被毛细管步骤具体为：

透析：取猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，

活化：用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，15～30min后用1M甘氨酸终止活化，5～10min后再次过柱透析，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体。

包被：将收集后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体稀释到3～10μg/ml，制成包被液，然后将毛细管浸泡在包被液中进行包被，在温度为2～8℃条件下浸泡20～24h后取出，然后用Tris-HCL缓冲液清洗；

封闭：用含BSA的Tris-HCL缓冲液在温度为35～40℃条件下封闭毛细管1～2小时，然后，用清洗液冲洗，吹干；

封闭步骤中，含BSA的Tris-HCL缓冲液中，BSA的质量百分比为1～2%；

毛细管吹干后，在温度为2～8℃的条件下保存待用。

碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体采用如下方法制备：

抗体活化：取猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，15～30min后用1M甘氨酸终止活化，5～10min后再次过柱，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体；

酶活化：用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶，30～40min后用1M甘氨酸终止活化，5～10min后再次过柱，收集液体；

偶联：将活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶混合进行偶联，温度为2～8℃，20～24h取出，用马来酰亚胺终止，然后10～20min后用100mM乙醇胺最后终止；

所述活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶混合时，按照1:1～2的体积比进行混合；

偶联完成后，将偶联后的溶液稀释至1～6μg/ml，制成碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体，在温度为2～8℃的条件下放置待用。

所述猫血清淀粉样蛋白A校准品采用如下方法制备：

用含BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释猫血清淀粉样蛋白A校准品，制成浓度分别为400μg/ml、100μg/ml、25μg/ml、6.25μg/ml和1.56 μg/ml的猫血清淀粉样蛋白A校准品，在温度为2～8℃的条件下保存待用；

所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中，BSA的质量百分比为1～2%。

作用于碱性磷酸酶的化学发光底物为APS-5。

所述定量测定猫猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，还包括毛细管化学发光检检测装置，该毛细管化学发光检测装置采用授权公告号CN107091923B，授权公告日为2018年1月30日的中国发明专利公开的毛细管化学发光检测装置。将碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体、猫血清淀粉样蛋白A校准品和作用于碱性磷酸酶的化学发光底物，装在其液体试剂杯里，而将已包被的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的毛细管替换下该专利中的毛细管本体即可。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

本发明提供的试剂盒可用于定量测定猫血清淀粉样蛋白A的含量。同时本发明采用毛细管为反应载体，需要的上样量较小，使用的血清样本量较小，仅仅需要10μl，大大节约了血清样本量。采用毛细管作为反应载体，其灵敏度和准确度都得到了提高，而且反应速度快，检测效率高。通过本发明提供的试剂盒中各个成分的制备方法以及各种参数的要求制备出来的各成分来定量测定猫血清淀粉样蛋白A时，才会具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。

本发明利用毛细管加样量少，大大节约血清样本，实现了微量化学发光免疫反应。

本发明化学发光免疫分析法的选择：化学发光法具有灵敏度高，特异性强，准确度高，检测范围宽等优点。相对于其他方法，化学发光是真正的定量，且检测速度较快，更为方便。同时，化学发光标记物稳定，试剂有效期长，大大方便了临床应用的需要。

本发明可以准确地定量检测出猫血清淀粉样蛋白A的含量，可以根据猫血清淀粉样蛋白A含量，监测感染性疾病早期炎症，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及治疗，有很高的临床价值。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供了一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒。该试剂盒包括了已包被的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的固相载体，碱性磷酸酶（ALP）标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体，猫血清淀粉样蛋白A校准品，作用于碱性磷酸酶的化学发光底物。同时提供了一种定量检测猫血清淀粉样蛋白A的试剂的制备方法，该方法包括：（1）固相载体的前期处理；（2）以猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被载体；（3）用碱性磷酸酶标记猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体；（4）以猫血清淀粉样蛋白A纯品配制猫血清淀粉样蛋白A校准品；（5）分装上述猫血清淀粉样蛋白A校准品、碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物；（6）组装为成品。在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述固相载体为毛细管，上样量低，仅仅需要10μl，大大节约了血清样本量。

本发明中，步骤（1）和步骤（2）用于制备已包被的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的固相载体，具体为：

所述步骤（1）中固相载体的前期处理包括以下过程：

1）清洗：浓盐酸与乙醇按照1:1的比例混合，室温下，将毛细管浸泡30min用超纯水淋洗5次并吹干，改用0.1M NaOH室温浸泡30min用超纯水淋洗5次并吹干；

2）羟基化：将双氧水和浓硫酸按1：3混合，室温超声处理30min用超纯水淋洗3次并吹干，改用0.1M NaOH淋洗3次，乙醇淋洗3次，用超纯水淋洗5次并吹干；

3）氨化：将毛细管浸泡在含10%的3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇的70℃烘箱中，4小时后取出，乙醇冲洗三遍；然后将毛细管浸泡在含10%的甲基丙烯酸甲酯的乙醇的40℃烘箱中，24小时后取出，乙醇冲洗三遍；最后将毛细管浸泡在含10%的乙二胺的乙醇的40℃烘箱，24小时后取出，乙醇冲洗三遍，并烘干；

4）活化：用SMCC活化剂在室温下活化毛细管1.5小时，用Tris-HCL缓冲液清洗5遍，吹干，放置4℃冰箱，待抗体包被。

所述步骤（2）以猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被载体包括以下步骤：

1）透析：取0.5mg猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，

2）活化：用2-IT活化过柱后的抗体，15min后用1M甘氨酸终止活化，5min后再次过柱，收集抗体。将收集后的抗体稀释到包被浓度（3μg/ml），置于已处理好的毛细管中，4℃浸泡过夜包被，次日取出用Tris-HCL缓冲液清洗；

3）封闭：用含2%的BSA的Tris-HCL缓冲液在37℃烘箱封闭毛细管2小时，用封闭清洗液冲洗1遍，吹干，放置4℃保存待用。

所述步骤（3）用于制备碱性磷酸酶标记猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体，碱性磷酸酶标记猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体有以下过程：

1）抗体活化：取0.5mg猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，15min后用1M甘氨酸终止活化，5min后再次过柱，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体；

2）酶活化：用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶，30min后用1M甘氨酸终止活化，5min后再次过柱，收集液体（酶）；

3）偶联：将活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶按照1:1.2（体积比）方式进行偶联，4℃过夜后取出，用马来酰亚胺终止，10min后用100mM乙醇胺最后终止，放置4℃保存，即偶联完成。

4）酶工作液配制：将步骤3偶联后的液体配制成6μg/ml的工作液（即碱性磷酸酶标记猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体），放置4℃冰箱待用。

所述步骤（4）用于制备猫血清淀粉样蛋白A校准品，具体包括以下步骤：

用含2%（质量百分比）BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释猫血清淀粉样蛋白A校准品至400μg/ml,100μg/ml,25μg/ml,6.25μg/ml,1.56 μg/ml浓度下。放置4℃冰箱保存待用。

实施例2

本实施例中，毛细管的前期处理步骤具体为：

步骤1，清洗

将浓盐酸与乙醇按照1:1（体积比）的比例混合，制成混合溶液Ⅰ，22℃条件下，将毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中20min后，取出毛细管，用超纯水淋洗5次，并吹干，然后氢氧化钙溶液室温浸泡毛细管20min后，取出毛细管，用超纯水淋洗5次，并吹干；

步骤2，羟基化

将双氧水和浓硫酸按1：2体积比）混合，制成混合溶液Ⅱ，在22℃条件下将毛细管浸泡在混合溶液Ⅱ中，超声处理20min后，取出毛细管，用超纯水淋洗3次并吹干，改用氢氧化钙溶液淋洗5次，乙醇淋洗3次，然后用超纯水淋洗5次并吹干；

步骤3，氨化

将毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中，3小时后取出，用乙醇冲洗3次；然后将毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中，20小时后取出，用乙醇冲洗3次；最后将毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中，20小时后取出，用乙醇冲洗3次，并烘干；

所述3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中，3-氨丙基三乙基硅烷的体积百分比为5%，含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中，甲基丙烯酸甲酯的体积百分比为5%，含乙二胺的乙醇中，乙二胺的体积百分比为5%；

所述毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中的浸泡温度为80℃，所述毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中的浸泡温度为50℃，所述毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中的浸泡温度为50℃；

步骤4，活化

用SMCC活化剂在22℃条件下活化毛细管1小时，然后用Tris-HCL缓冲液清洗，吹干；

步骤4中，毛细管吹干后在温度为2℃的条件下，放置保存。

所述以猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被毛细管步骤具体为：

透析：取猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，

活化：用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，15min后用1M甘氨酸终止活化，5min后再次过柱透析，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体。

包被：将收集后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体稀释到3μg/ml，制成包被液，然后将毛细管浸泡在包被液中进行包被，在温度为2℃条件下浸泡过夜包被，20h后取出，然后用Tris-HCL缓冲液清洗；

封闭：用含BSA的Tris-HCL缓冲液在温度为35℃条件下封闭毛细管2小时，然后，用清洗液冲洗，吹干；

封闭步骤中，含BSA的Tris-HCL缓冲液中，BSA的质量百分比为1%；

毛细管吹干后，在温度为2℃的条件下保存待用。

碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体采用如下方法制备：

抗体活化：取猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，15min后用1M甘氨酸终止活化，5min后再次过柱，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体；

酶活化：用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶，30min后用1M甘氨酸终止活化，5min后再次过柱，收集液体；

偶联：将活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶混合进行偶联，温度为2℃，20h后取出，用马来酰亚胺终止，然后10min后用100mM乙醇胺最后终止；

所述活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶混合时，按照1:1的体积比进行混合；

偶联完成后，将偶联后的溶液稀释至1μg/ml，制成碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体，在温度为2℃的条件下放置待用。

所述猫血清淀粉样蛋白A校准品采用如下方法制备：

用含BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释猫血清淀粉样蛋白A校准品，制成浓度分别为400μg/ml、100μg/ml、25μg/ml、6.25μg/ml和1.56 μg/ml的猫血清淀粉样蛋白A校准品，在温度为2℃的条件下保存待用；

所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中，BSA的质量百分比为1%。

实施例3

本实施例中，毛细管的前期处理步骤具体为：

步骤1，清洗

将浓盐酸与乙醇按照1:1（体积比）的比例混合，制成混合溶液Ⅰ，28℃条件下，将毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中25min后，取出毛细管，用超纯水淋洗6次，并吹干，然后用氢氧化镁溶液室温浸泡毛细管24min后，取出毛细管，用超纯水淋洗7次，并吹干；

步骤2，羟基化

将双氧水和浓硫酸按1：2.5（体积比）混合，制成混合溶液Ⅱ，在28℃条件下将毛细管浸泡在混合溶液Ⅱ中，超声处理25min后，取出毛细管，用超纯水淋洗4次并吹干，改用氢氧化镁溶液淋洗6次，乙醇淋洗4次，然后用超纯水淋洗5次并吹干；

步骤3，氨化

将毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中，3.5小时后取出，用乙醇冲洗4次；然后将毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中，22小时后取出，用乙醇冲洗4次；最后将毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中，22小时后取出，用乙醇冲洗4次，并烘干；

所述3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中，3-氨丙基三乙基硅烷的体积百分比为8%，含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中，甲基丙烯酸甲酯的体积百分比为7%，含乙二胺的乙醇中，乙二胺的体积百分比为6%；

所述毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中的浸泡温度为75℃，所述毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中的浸泡温度为45℃，所述毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中的浸泡温度为44℃；

步骤4，活化

用SMCC活化剂在室温条件下活化毛细管1.2小时，然后用Tris-HCL缓冲液清洗，吹干；

步骤4中，毛细管吹干后在温度为6℃的条件下，放置保存。

所述以猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被毛细管步骤具体为：

透析：取猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，

活化：用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，25min后用1M甘氨酸终止活化，8min后再次过柱透析，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体。

包被：将收集后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体稀释到7μg/ml，制成包被液，然后将毛细管浸泡在包被液中进行包被，在温度为6℃条件下浸泡包被，24h取出，然后用Tris-HCL缓冲液清洗；

封闭：用含BSA的Tris-HCL缓冲液在温度为38℃条件下封闭毛细管1.5小时，然后，用清洗液冲洗，吹干；

封闭步骤中，含BSA的Tris-HCL缓冲液中，BSA的质量百分比为1.5%；

毛细管吹干后，在温度为6℃的条件下保存待用。

碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体采用如下方法制备：

抗体活化：取猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，22min后用1M甘氨酸终止活化，8min后再次过柱，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体；

酶活化：用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶，35min后用1M甘氨酸终止活化，8min后再次过柱，收集液体；

偶联：将活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶混合进行偶联，温度为6℃，24h后取出，用马来酰亚胺终止，然后15min后用100mM乙醇胺最后终止；

所述活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶混合时，按照1:1.5的体积比进行混合；

偶联完成后，将偶联后的溶液稀释至5μg/ml，制成碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体，在温度为6℃的条件下放置待用。

所述猫血清淀粉样蛋白A校准品采用如下方法制备：

用含BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释猫血清淀粉样蛋白A校准品，制成浓度分别为400μg/ml、100μg/ml、25μg/ml、6.25μg/ml和1.56 μg/ml的猫血清淀粉样蛋白A校准品，在温度为6℃的条件下保存待用；

所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中，BSA的质量百分比为1.5%。

实施例4

本实施例中，毛细管的前期处理步骤具体为：

步骤1，清洗

将浓盐酸与乙醇按照1:1（体积比）的比例混合，制成混合溶液Ⅰ，室温下，将毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中30min后，取出毛细管，用超纯水淋洗6次，并吹干，然后用氢氧化钾溶液室温浸泡毛细管30min后，取出毛细管，用超纯水淋洗7次，并吹干；

步骤2，羟基化

将双氧水和浓硫酸按1： 3（体积比）混合，制成混合溶液Ⅱ，在室温条件下将毛细管浸泡在混合溶液Ⅱ中，超声处理30min后，取出毛细管，用超纯水淋洗3次并吹干，改用氢氧化钾溶液淋洗6次，乙醇淋洗3次，然后用超纯水淋洗8次并吹干；

步骤3，氨化

将毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中， 4小时后取出，用乙醇冲洗3次；然后将毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中， 24小时后取出，用乙醇冲洗3次；最后将毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中， 24小时后取出，用乙醇冲洗3次，并烘干；

所述3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中，3-氨丙基三乙基硅烷的体积百分比为10%，含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中，甲基丙烯酸甲酯的体积百分比为10%，含乙二胺的乙醇中，乙二胺的体积百分比为10%；

所述毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中的浸泡温度为80℃，所述毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中的浸泡温度为50℃，所述毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中的浸泡温度为50℃；

步骤4，活化

用SMCC活化剂在室温条件下活化毛细管1.5小时，然后用Tris-HCL缓冲液清洗，吹干；

步骤4中，毛细管吹干后在温度为8℃的条件下，放置保存。

所述以猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被毛细管步骤具体为：

透析：取猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，

活化：用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体， 30min后用1M甘氨酸终止活化， 10min后再次过柱透析，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体。

包被：将收集后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体稀释到10μg/ml，制成包被液，然后将毛细管浸泡在包被液中进行包被，在温度为8℃条件下浸泡过夜包被，次日取出，然后用Tris-HCL缓冲液清洗；

封闭：用含BSA的Tris-HCL缓冲液在温度为40℃条件下封闭毛细管1小时，然后，用清洗液冲洗，吹干；

封闭步骤中，含BSA的Tris-HCL缓冲液中，BSA的质量百分比为2%；

毛细管吹干后，在温度为8℃的条件下保存待用。

碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体采用如下方法制备：

抗体活化：取猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体， 30min后用1M甘氨酸终止活化， 10min后再次过柱，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体；

酶活化：用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶， 40min后用1M甘氨酸终止活化， 10min后再次过柱，收集液体；

偶联：将活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶混合进行偶联，温度为8℃，过夜后取出，用马来酰亚胺终止，然后20min后用100mM乙醇胺最后终止；

所述活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶混合时，按照1:2的体积比进行混合；

偶联完成后，将偶联后的溶液稀释至6μg/ml，制成碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体，在温度为8℃的条件下放置待用。

所述猫血清淀粉样蛋白A校准品采用如下方法制备：

用含BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释猫血清淀粉样蛋白A校准品，制成浓度分别为400μg/ml、100μg/ml、25μg/ml、6.25μg/ml和1.56 μg/ml的猫血清淀粉样蛋白A校准品，在温度为8℃的条件下保存待用；

所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中，BSA的质量百分比为2%。

按照该产品的技术标准要求对实施例中制备的试剂盒进行检定：

（1）试剂盒灵敏度实验

以0点校准品进行20次重复测定，其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的浓度值为试剂盒的灵敏度，其灵敏度为0.36μg/mL。

（2）试剂盒精密性实验

批内变异

取6.25、100μg/mL两水平质控品分别进行10孔平行实验，计算测定值的平均值（

v）和标准差（s）。按公式CV＝s/v×100％计算变异系数，批内变异系数CV分别为3.21%、2.46%；

批间变异

选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定，计算其批间变异系数

（CV％），批间变异CV小于5%。

（3）试剂盒准确性实验

将高浓度的校准品原料，用猫血清稀释成四个不同浓度值，每个浓度做5孔平行实验，分别计算回收率在90-107%范围内。

（4）试剂盒稳定性实验

试剂盒保存温度为2-8℃，经过12个月的测定试剂盒的各项指标均满足要求，考虑到运输和使用过程中对试剂盒的影响，我们进行37℃，7天的加速实验，实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。

英文缩写解释：

BSA：牛血清白蛋白

2-IT：2-亚氨基硫烷盐酸盐

SMCC：4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯

Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷-盐酸，Tris-HCl缓冲液中仅含有Tris，用盐酸调节pH

APS-5：（4-氯苯巯基）（10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基）磷酸二钠盐。

Claims (10)

1.一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括了已包被的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的毛细管、碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体、猫血清淀粉样蛋白A校准品和作用于碱性磷酸酶的化学发光底物。

2.根据权利要求1所述的一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述已包被的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体的毛细管的制备方法包括毛细管的前期处理步骤和以猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被毛细管步骤。

3.根据权利要求2所述的一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述毛细管的前期处理步骤具体为：

步骤1，清洗

将浓盐酸与乙醇混合，制成混合溶液Ⅰ，将毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中，然后取出毛细管，用超纯水淋洗，并吹干，然后用碱性溶液浸泡毛细管，然后取出毛细管，用超纯水淋洗，并吹干；

步骤2，羟基化

将双氧水和浓硫酸按混合，制成混合溶液Ⅱ，将毛细管浸泡在混合溶液Ⅱ中，超声处理后，取出毛细管，用超纯水淋洗并吹干，改用碱性溶液淋洗，然后用乙醇淋洗，最后用超纯水淋洗并吹干；

步骤3，氨化

将毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中，3～4小时后取出，用乙醇冲洗；然后将毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中，20～24小时后取出，用乙醇冲洗；最后将毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中，20～24小时后取出，用乙醇冲洗，并烘干；

步骤4，活化

用SMCC活化剂活化毛细管，然后用Tris-HCL缓冲液清洗，吹干。

4.根据权利要求3所述的一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：步骤1中，浓盐酸与乙醇按照体积比1:1的比例混合，将毛细管浸泡20～30min后，取出毛细管，用超纯水淋洗5次以上，并吹干，然后用碱性溶液室温浸泡毛细管20～30min后，取出毛细管，用超纯水淋洗5次以上，并吹干。

5.根据权利要求3所述的一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：步骤2中，双氧水和浓硫酸按体积比1：2～3混合，将毛细管超声20～30min后，取出毛细管，用超纯水淋洗3次以上，并吹干，改用碱性溶液淋洗3次以上后，乙醇淋洗3次以上后，然后用超纯水淋洗5次以上并吹干。

6.根据权利要求3所述的一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：步骤3中，将毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中，浸泡温度为70～80℃，3～4小时后取出，用乙醇冲洗3次以上；浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中，浸泡温度为40～50℃，20～24小时后取出，用乙醇冲洗3次；浸泡在含乙二胺的乙醇中，浸泡温度为40～50℃，20～24小时后取出，用乙醇冲洗3次以上。

7.根据权利要求3所述的一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：步骤4中，活化时间为1～1.5小时，吹干后在温度为2～8℃的条件下，放置保存。

8.根据权利要求1所述的一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述以猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体包被毛细管步骤具体为：

透析：取猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，

活化：用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，15～30min后用甘氨酸终止活化，5～10min后再次过柱，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体；

包被：将收集后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体稀释到3～10μg/ml，制成包被液，然后将毛细管浸泡在包被液中进行包被，在温度为2～8℃条件下浸泡过夜包被，次日取出，然后用Tris-HCL缓冲液清洗；

封闭：用含BSA的Tris-HCL缓冲液在温度为35～40℃条件下封闭毛细管1～2小时，然后，用封闭清洗液冲洗，吹干；

封闭步骤中，含BSA的Tris-HCL缓冲液中，BSA的质量百分比为1～2%；

毛细管吹干后，在温度为2～8℃的条件下保存待用。

9.根据权利要求1所述的一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体采用如下方法制备：

抗体活化：取猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体过柱透析，用2-IT活化过柱后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体，15～30min后用甘氨酸终止活化，5-10min后再次过柱，收集猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体；

酶活化：用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶，30～40min后用甘氨酸终止活化，5～10min后再次过柱，收集液体；

偶联：将活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶混合进行偶联，温度为4℃，过夜后取出，用马来酰亚胺终止，然后10～20min后用乙醇胺最后终止；

所述活化后的猫血清淀粉样蛋白A单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶混合时，按照1:1～2的体积比进行混合；

偶联完成后，将偶联后的溶液稀释至1～6μg/ml，制成碱性磷酸酶标记的猫血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体，在温度为2～8℃的条件下放置待用。

10.根据权利要求1所述的一种定量测定猫血清淀粉样蛋白A的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于：所述猫血清淀粉样蛋白A校准品采用如下方法制备：

用含BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释猫血清淀粉样蛋白A校准品，制成浓度分别为400μg/ml、100μg/ml、25μg/ml、6.25μg/ml和1.56 μg/ml的猫血清淀粉样蛋白A校准品，在温度为2～8℃的条件下保存待用；所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中，BSA的质量百分比为1～2%。