CN109444419A - 一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,包括包被了犬促甲状腺激素的单克隆抗体的毛细管、碱性磷酸酶标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体、犬促甲状腺激素校准品和作用于碱性磷酸酶的化学发光底物。本发明灵敏度高,特异性好,定量检测结果准确度高,更易推广应用,且上样量小,大大节约了血清样本量。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域,尤其涉及一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒。
背景技术
促甲状腺激素(TSH)是由腺垂体嗜碱细胞中的S-细胞分泌的激素。它是一种糖蛋白,分子量为28,000,能促进甲状腺激素的制造,还能促进已制造好的甲状腺激素释放入血,对甲状腺本身的生长和新陈代谢也起着重要作用。TSH全面促进甲状腺的机能:包括加强碘泵活性,增强过氧化物酶活性,促进甲状腺球蛋白合成及酪氨酸碘化等各个环节。垂体分泌TSH,一方面受下丘脑分泌的促甲状腺激素释放激素(TRH)的促进性影响,另方面又受到T3、T4反馈性的抑制性影响,二者互相拮抗,它们组成下丘脑-腺垂体-甲状腺轴。由于过量的甲状腺激素是TSH分泌最重要的生理性抑制因子,因此临床上常常把TSH当作甲亢最重要的实验室诊断指标之一。一般认为血液中TSH浓度降低提示甲状腺功能发生亢进。测定血清中TSH的含量,是诊断甲状腺功能和研究下丘脑-垂体-甲状腺轴的重要指标之一。在甲状腺功能评估中,可鉴别原发性和继发性(垂体性或下丘脑性)甲状腺功能低下症,并可作为对甲低症疗效观察的指标。
目前关于促甲状腺激素的检测方法主要有免疫层析分析法、酶联免疫吸附方法。
上述所说方法无法实现精确定量。且灵敏度不够高,检测范围窄,影响因素较多,易造成假阴性和假阳性。化学发光免疫检测(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合,用于各种抗原、抗体、激素、酶、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项免疫测定技术。化学发光法具有灵敏度高,特异性强,准确度高,检测范围宽等优点。相对于酶联免疫检测法的半定量,化学发光是真正的定量,且检测速度较快,得出结果用时更少,更为方便。同时,化学发光标记物稳定,试剂有效期长,大大方便了临床应用的需要。
如,授权公告号为CN101949943B,授权公告日为2013年9月18日的中国发明专利公开了一种促甲状腺激素定量检测试剂盒,它包括包被有抗促甲状腺激素单克隆抗体的磁微粒混悬液、促甲状腺激素系列校准品、辣根过氧化物酶标记的抗促甲状腺激素单克隆抗体、发光底物A液、发光底物B液及浓缩洗液;该发明还公开了该试剂盒的制备方法。该发明的优点在于采用双抗体夹心的一步法反应模式,从大量的活性材料中优选出一对特异性较高、亲和力较强的单克隆抗体分别作为包被抗体和酶标记抗体,使得本试剂盒诊断灵敏度、精密性和检测范围明显优于同类试剂盒,反应时间大大缩短,同时该发明采用抗促甲状腺激素单克隆抗体与免疫磁微粒的偶联方法,偶联效率较高,结合牢固,工艺稳定,在提高产品性能的同时,大大降低了产品成本。
又如,授权公告号为CN103048474B,授权公告日为2015年7月1日的中国发明专利公开了一种促甲状腺激素的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备方法和检测方法,该试剂盒包括含有荧光素标记的促甲状腺激素抗体的溶液、包被有荧光素抗体的磁微粒的悬浮液,以及含有碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体的溶液。该发明使得能够以更低成本和更高准确度和精密度对促甲状腺激素进行定量检测。
再如,申请公布号为CN106645689A,申请公布日为2017年5月10日的中国发明专利申请公开了一种促甲状腺激素受体抗体化学发光免疫测定试剂盒,所述试剂盒包括:促甲状腺激素受体包被的磁微粒、鼠抗人IgG抗体包被的吖啶酯、促甲状腺激素受体抗体定标品、预激发液、激发液。另外该发明还公开了一种促甲状腺激素受体抗体化学发光免疫测定试剂盒的制备方法。该发明所述试剂盒与现有试剂盒相比操作简便,灵敏度高等特点。
上述三件关于采用化学发光免疫检测方法来测定促甲状腺激素都存在如下不足之处:
1、用到的固相载体都是磁微粒,上样量较大,使用的血清样本量较大,检测效率较低;
2、该专利提供的试剂盒并不能用于定量犬检测促甲状腺激素。
发明内容
鉴于现有采用化学发光免疫检测方法来测定犬促甲状腺激素存在的上述缺陷,本发明提供了一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,本发明提供的试剂盒灵敏度高,特异性好,定量检测结果准确度高,更易推广应用,且上样量小,大大节约了血清样本量。
为了达到上述技术目的,本发明所采用的技术方案是:
一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:包括包被了犬促甲状腺激素的单克隆抗体的毛细管、碱性磷酸酶标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体、犬促甲状腺激素校准品和作用于碱性磷酸酶的化学发光底物。
所述包被了犬促甲状腺激素的单克隆抗体的毛细管的制备方法包括毛细管前期处理步骤和用犬促甲状腺激素的单克隆抗体包被毛细管步骤:
所述毛细管前期处理步骤具体为:
步骤1,清洗
将浓盐酸与乙醇混合制成混合溶液Ⅰ;将毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中;浸泡完成后,取出毛细管,用超纯水淋洗并吹干毛细管;用碱性溶液浸泡毛细管,浸泡完成后,用超纯水淋洗并吹干毛细管;
所述毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中的时间为30~40min,浸泡温度为22~28℃;
所述毛细管浸泡在碱性溶液中的时间为20~30min,浸泡温度为22~28℃;
所述混合溶液Ⅰ中,浓盐酸与乙醇的体积比为1:1~2。
步骤2,羟基化
将双氧水和浓硫酸混合,制成混合溶液Ⅱ;将毛细管浸泡在混合溶液Ⅱ中进行超声处理;超声处理完成后,用超纯水淋洗并吹干;用碱性溶液淋洗,然后乙醇淋洗,最后用超纯水淋洗并吹干;
所述混合溶液Ⅱ中,双氧水和浓硫酸的体积比为1:2~3,超声处理的时间为20~30min,温度为22~28℃;
步骤3,氨化
将毛细管浸泡在含有3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中,浸泡3~4h后,用乙醇进行冲洗;冲洗完成后,将毛细管浸泡在含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇中,浸泡20~24h后,用乙醇冲洗;然后再将毛细管浸泡在含有乙二胺的乙醇中,浸泡温度为40~50℃,浸泡20~24h后,用乙醇冲洗并烘干;
所述含有3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中,3-氨丙基三乙基硅烷的体积百分比为5~10%,所述含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇中,甲基丙烯酸甲酯的体积百分比为5~10%,所述含乙二胺的乙醇中,乙二胺的体积百分比为5~10%;
所述毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中的浸泡温度为70~80℃,所述毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中的浸泡温度为40~50℃,所述毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中的浸泡温度为40~50℃;
步骤4,活化
用SMCC活化剂在活化毛细管1~1.5h,然后用Tris-HCL缓冲液清洗,吹干后,在温度为2~8℃条件下放置,活化温度为22~28℃。
所述用犬促甲状腺激素的单克隆抗体包被毛细管步骤具体为:
透析:取犬促甲状腺激素的单克隆抗体过柱透析,
活化:用2-IT活化透析后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,15~30min后用1M甘氨酸终止活化,5~10min后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体;
包被:将经过活化后的抗体稀释到浓度为10 μg/ml,制成包被液,然后将经过活化后的毛细管浸泡在包被液中,在温度为2~8℃的条件下浸泡20~24h包被,取出用Tris-HCL缓冲液清洗;
封闭:用含BSA的Tris-HCL缓冲液在35~40℃的条件下封闭毛细管1~2h,然后用清洗液冲洗,吹干,在温度为2~8℃的条件下保存待用,所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中BSA的质量百分比为1~2%。
所述碱性磷酸酶标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体通过如下方法制成:
抗体活化:取犬促甲状腺激素的单克隆抗体过柱透析,然后用2-IT活化透析后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,15~30min后用1M甘氨酸终止活化,5~10min后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体;
酶活化:取碱性磷酸酶过柱透析,然后用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶,30~40min后用1M甘氨酸终止活化,5~10min后再次过柱,收集液体;
偶联:将活化后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶按照1:1~2(体积比)进行偶联,温度为2~8℃,偶联20~24h后,用马来酰亚胺终止,10~20min后用100mM乙醇胺最后终止,然后稀释至0.5 μg/ml后,在温度为2~8℃的条件保存。
所述犬促甲状腺激素校准品配制包括以下步骤:
用含BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释犬促甲状腺激素校准品,分别制备出浓度为250ng/ml、100ng/ml、40ng/ml、16ng/ml和6.4ng/ml的犬促甲状腺激素校准品,在温度为4℃条件下保存待用,所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中BSA的质量百分比为1~2%。
所述作用于碱性磷酸酶的化学发光底物为:APS-5。
所述检测犬促甲状腺激素的试剂盒还包括毛细管化学发光检检测装置,该毛细管化学发光检测装置采用授权公告号为CN107091923B,授权公告日为2018年1月30日的中国发明专利公开的毛细管化学发光检测装置。将碱性磷酸酶标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体、犬促甲状腺激素校准品和作用于碱性磷酸酶的化学发光底物装在其液体试剂杯里,而将包被了犬促甲状腺激素的单克隆抗体的毛细管替换下该专利中的毛细管本体即可。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果:
本发明可以准确地定量检测出犬促甲状腺激素的含量,可以根据犬促甲状腺激素含量,判断甲状腺和下丘脑—垂体—甲状腺轴的功能是否正常,有很高的临床价值。它具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。而且本发明提供的试剂盒可定量检测犬促甲状腺激素的含量。同时本发明采用毛细管为反应载体,需要的上样量较小,使用的血清样本量较小,仅仅需要10μl,大大节约了血清样本量。采用毛细管作为反应载体,其灵敏度和准确度都得到了提高。通过本发明提供的试剂盒中各个成分的制备方法以及各种参数的要求制备出来的各成分来检测犬促甲状腺激素时,才会具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点。
本发明固相载体的选择:利用毛细管加样量少,大大节约血清样本,实现了微量化学发光免疫反应。
本发明化学发光免疫分析法的选择:化学发光法具有灵敏度高,特异性强,准确度高,检测范围宽等优点。相对于其他方法,化学发光是真正的定量,且检测速度较快,更为方便。同时,化学发光标记物稳定,试剂有效期长,大大方便了临床应用的需要。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例,都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒。
该试剂盒包括了已包被的犬促甲状腺激素单克隆抗体的毛细管,碱性磷酸酶(ALP)标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,犬促甲状腺激素校准品,作用于碱性磷酸酶的化学发光底物。检测犬促甲状腺激素的试剂盒还包括毛细管化学发光检检测装置,该毛细管化学发光检测装置采用授权公告号为CN107091923B,授权公告日为2018年1月30日的中国发明专利公开的毛细管化学发光检测装置。将碱性磷酸酶标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体、犬促甲状腺激素校准品和作用于碱性磷酸酶的化学发光底物装在其液体试剂杯里,而将包被了犬促甲状腺激素的单克隆抗体的毛细管替换下该专利中的毛细管本体即可。
本实施例同时提供了一种测量犬促甲状腺激素的试剂的制备方法,该方法包括:(1)固相载体的前期处理;(2)以犬促甲状腺激素的单克隆抗体包被载体;(3)用碱性磷酸酶标记犬促甲状腺激素的单克隆抗体;(4)以犬促甲状腺激素纯品配制犬促甲状腺激素校准品;(5)分装上述犬促甲状腺激素校准品、碱性磷酸酶标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物;(6)组装为成品。在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中,所述固相载体为毛细管,其上样量低,仅仅需要10μl,大大节约了血清样本量。
本实施例中的已包被的犬促甲状腺激素单克隆抗体的毛细管通过如下方法制成该方法包括:(1)固相载体(毛细管)的前期处理;(2)以犬促甲状腺激素的单克隆抗体包被载体;
其中所述步骤(1)中固相载体的前期处理包括以下过程:
1)清洗:浓盐酸与乙醇按照1:1(体积比)的比例混合,室温下,将毛细管浸泡30min用超纯水淋洗5次并吹干,改用0.1M NaOH溶液室温浸泡30min用超纯水淋洗5次并吹干;
2)羟基化:将双氧水和浓硫酸按1:3(体积比)混合,室温超声处理30min用超纯水淋洗3次并吹干,改用0.1M NaOH溶液淋洗3次,乙醇淋洗3次,用超纯水淋洗5次并吹干;
3)氨化:将毛细管浸泡在含10%(体积百分比)的3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇的70℃烘箱中,4小时后取出,乙醇冲洗三遍;然后将毛细管浸泡在含10%(体积百分比)甲基丙烯酸甲酯的乙醇的40℃烘箱中,24小时后取出,乙醇冲洗三遍;最后将毛细管浸泡在含10%(体积百分比)乙二胺的乙醇的40℃烘箱,24小时后取出,乙醇冲洗三遍,并烘干;
4)活化:用SMCC活化剂在室温下活化毛细管1.5小时,用Tris-HCL缓冲液清洗5遍,吹干,放置4℃冰箱,待抗体包被。
所述步骤(2)以犬促甲状腺激素的单克隆抗体包被载体包括以下步骤:
1)透析:取0.5mg犬促甲状腺激素的单克隆抗体过柱透析,
2)活化:用2-IT活化过柱后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,15min后用1M甘氨酸终止活化,5min后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体。将收集后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体稀释到包被浓度(10 μg/ml),置于已处理好的毛细管中,4℃浸泡过夜包被,次日取出用Tris-HCL缓冲液清洗;
3)封闭:用含2%BSA的Tris-HCL缓冲液在37℃烘箱封闭毛细管2小时,用封闭清洗液冲洗1遍,吹干,放置4℃保存待用。
本实施例用碱性磷酸酶标记犬促甲状腺激素的单克隆抗体的制备方法包括如下步骤:
1)抗体活化:取0.5mg犬促甲状腺激素的单克隆抗体过柱透析,用2-IT活化过柱后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,15min后用1M甘氨酸终止活化,5min后再次过柱,收集抗体;
2)酶活化:用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶,30min后用1M甘氨酸终止活化,5min后再次过柱,收集液体(酶);
3)偶联:将抗体与酶按照1:1.2(体积比)进行偶联,4℃过夜后取出,用马来酰亚胺终止,10min后用100mM乙醇胺最后终止,放置4℃保存,即偶联完成。
4)酶工作液配制:将经过步骤3)的液体配制成0.5 μg/ml的工作液,放置4℃冰箱待用。
所述犬促甲状腺激素校准品采用如下方法制备:
用含2%BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释犬促甲状腺激素校准品至250ng/ml、100ng/ml,40ng/ml、16ng/ml和6.4ng/ml浓度下。放置4℃冰箱保存待用。
所述作用于碱性磷酸酶的化学发光底物为:APS-5。
实施例2
本实施例提供了一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,包括包被了犬促甲状腺激素的单克隆抗体的毛细管、碱性磷酸酶标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体、犬促甲状腺激素校准品和作用于碱性磷酸酶的化学发光底物。
所述包被了犬促甲状腺激素的单克隆抗体的毛细管的制备方法包括毛细管前期处理步骤和用犬促甲状腺激素的单克隆抗体包被毛细管步骤:
所述毛细管前期处理步骤具体为:
步骤1,清洗
将浓盐酸与乙醇混合制成混合溶液Ⅰ;将毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中;浸泡完成后,取出毛细管,用超纯水淋洗并吹干毛细管;用0.1M氢氧化钾溶液浸泡毛细管,浸泡完成后,用超纯水淋洗并吹干毛细管;
所述毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中的时间为30min,浸泡温度为28℃;
所述毛细管浸泡在碱性溶液中的时间为20min,浸泡温度为28℃;
所述混合溶液Ⅰ中,浓盐酸与乙醇的体积比为1:1。
步骤2,羟基化
将双氧水和浓硫酸混合,制成混合溶液Ⅱ;将毛细管浸泡在混合溶液Ⅱ中进行超声处理;超声处理完成后,用超纯水淋洗并吹干;用0.1M氢氧化钾溶液淋洗,然后乙醇淋洗,最后用超纯水淋洗并吹干;
所述混合溶液Ⅱ中,双氧水和浓硫酸的体积比为1:2,超声处理的时间为20min,温度为28℃;
步骤3,氨化
将毛细管浸泡在含有3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中,浸泡3h后,用乙醇进行冲洗;冲洗完成后,将毛细管浸泡在含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇中,浸泡20h后,用乙醇冲洗;然后再将毛细管浸泡在含有乙二胺的乙醇中,浸泡20h后,用乙醇冲洗并烘干;
所述含有3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中,3-氨丙基三乙基硅烷的体积百分比为5%,所述含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇中,甲基丙烯酸甲酯的体积百分比为5%,所述含乙二胺的乙醇中,乙二胺的体积百分比为5%;
所述毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中的浸泡温度为80℃,所述毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中的浸泡温度为50℃,所述毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中的浸泡温度为50℃;
步骤4,活化
用SMCC活化剂在活化毛细管1h,然后用Tris-HCL缓冲液清洗,吹干后,在温度为2℃条件下放置,活化温度为22℃。
所述用犬促甲状腺激素的单克隆抗体包被毛细管步骤具体为:
透析:取犬促甲状腺激素的单克隆抗体过柱透析,
活化:用2-IT活化透析后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,15min后用1M甘氨酸终止活化,5min后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体;
包被:将经过活化后的抗体稀释到浓度为10 μg/ml,制成包被液,然后将经过活化后的毛细管浸泡在包被液中,在温度为2℃的条件下浸泡24h包被,取出用Tris-HCL缓冲液清洗;
封闭:用含BSA的Tris-HCL缓冲液在35℃的条件下封闭毛细管2h,然后用清洗液冲洗,吹干,在温度为2℃的条件下保存待用,所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中BSA的质量百分比为1%。
所述碱性磷酸酶标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体通过如下方法制成:
抗体活化:取犬促甲状腺激素的单克隆抗体过柱透析,然后用2-IT活化透析后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,15min后用1M甘氨酸终止活化,5min后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体;
酶活化:取碱性磷酸酶过柱透析,然后用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶,30min后用1M甘氨酸终止活化,5min后再次过柱,收集液体;
偶联:将活化后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶按照1:1(体积比)进行偶联,温度为2℃,偶联24h后,用马来酰亚胺终止,10min后用100mM乙醇胺最后终止,然后稀释至0.5 μg/ml后,在温度为2℃的条件保存。
所述犬促甲状腺激素校准品配制包括以下步骤:
用含BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释犬促甲状腺激素校准品,分别制备出浓度为250ng/ml、100ng/ml、40ng/ml、16ng/ml和6.4ng/ml的犬促甲状腺激素校准品,在温度为4℃条件下保存待用,所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中BSA的质量百分比为1%。
所述作用于碱性磷酸酶的化学发光底物为:APS-5。
实施例3
本实施例与实施例2基本相同,不同的是:
所用到的碱性溶液为0.2M的氢氧化镁溶液;
所述毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中的时间为40min,浸泡温度为22℃;
所述毛细管浸泡在碱性溶液中的时间为30min,浸泡温度为22℃;
所述混合溶液Ⅰ中,浓盐酸与乙醇的体积比为1: 2。
所述混合溶液Ⅱ中,双氧水和浓硫酸的体积比为1: 3,超声处理的时间为30min,温度为22℃;
将毛细管浸泡在含有3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中,浸泡4h后,用乙醇进行冲洗;冲洗完成后,将毛细管浸泡在含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇中,浸泡24h后,用乙醇冲洗;然后再将毛细管浸泡在含有乙二胺的乙醇中,浸泡24h后,用乙醇冲洗并烘干;
所述含有3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中,3-氨丙基三乙基硅烷的体积百分比为10%,所述含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇中,甲基丙烯酸甲酯的体积百分比为10%,所述含乙二胺的乙醇中,乙二胺的体积百分比为10%;
所述毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中的浸泡温度为70℃,所述毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中的浸泡温度为40℃,所述毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中的浸泡温度为40℃;
用SMCC活化剂在活化毛细管1.5h,然后用Tris-HCL缓冲液清洗,吹干后,在温度为8℃条件下放置,活化温度为22℃。
用2-IT活化透析后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体, 30min后用1M甘氨酸终止活化, 10min后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体;
将经过活化后的抗体稀释到浓度为10 μg/ml,制成包被液,然后将经过活化后的毛细管浸泡在包被液中,在温度为8℃的条件下浸泡20h包被,取出用Tris-HCL缓冲液清洗;
用含BSA的Tris-HCL缓冲液在40℃的条件下封闭毛细管1h,然后用清洗液冲洗,吹干,在温度为8℃的条件下保存待用,所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中BSA的质量百分比为2%。
抗体活化:取犬促甲状腺激素的单克隆抗体过柱透析,然后用2-IT活化透析后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体, 30min后用1M甘氨酸终止活化10min后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体;
酶活化:取碱性磷酸酶过柱透析,然后用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶, 40min后用1M甘氨酸终止活化, 10min后再次过柱,收集液体;
偶联:将活化后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶按照1: 2(体积比)进行偶联,温度为8℃,偶联20h后,用马来酰亚胺终止, 20min后用100mM乙醇胺最后终止,然后稀释至0.5 μg/ml后,在温度为8℃的条件保存。
用含BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释犬促甲状腺激素校准品,该含BSA的Tris-HCL缓冲液中BSA的质量百分比为2%。
实施例4
本实施例与实施例2基本相同,不同的是:
所用到的碱性溶液为0.15M的氢氧化钙溶液;
所述毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中的时间为32min,浸泡温度为24℃;
所述毛细管浸泡在碱性溶液中的时间为25min,浸泡温度为25℃;
所述混合溶液Ⅰ中,浓盐酸与乙醇的体积比为1:1.5。
所述混合溶液Ⅱ中,双氧水和浓硫酸的体积比为1:2.5,超声处理的时间为25min,温度为24℃;
将毛细管浸泡在含有3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中,浸泡3.5h,将毛细管浸泡在含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇中,浸泡22h后,将毛细管浸泡在含有乙二胺的乙醇中,浸泡22h;
所述含有3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中,3-氨丙基三乙基硅烷的体积百分比为6%,所述含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇中,甲基丙烯酸甲酯的体积百分比为7%,所述含乙二胺的乙醇中,乙二胺的体积百分比为6%;
所述毛细管浸泡在含3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中的浸泡温度为75℃,所述毛细管浸泡在含甲基丙烯酸甲酯的乙醇中的浸泡温度为45℃,所述毛细管浸泡在含乙二胺的乙醇中的浸泡温度为45℃;
用SMCC活化剂在活化毛细管1.2h,然后用Tris-HCL缓冲液清洗,吹干后,在温度为6℃条件下放置,活化温度为26℃。
活化:用2-IT活化透析后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,18min后用1M甘氨酸终止活化,6min后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体;
包被:将经过活化后的抗体稀释到浓度为10 μg/ml,制成包被液,然后将经过活化后的毛细管浸泡在包被液中,在温度为6℃的条件下浸泡22h包被,取出用Tris-HCL缓冲液清洗;
封闭:用含BSA的Tris-HCL缓冲液在38℃的条件下封闭毛细管1.5h,然后用清洗液冲洗,吹干,在温度为6℃的条件下保存待用,所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中BSA的质量百分比为1.5%。
抗体活化:取犬促甲状腺激素的单克隆抗体过柱透析,然后用2-IT活化透析后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,20min后用1M甘氨酸终止活化,8min后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体;
酶活化:取碱性磷酸酶过柱透析,然后用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶,35min后用1M甘氨酸终止活化,6min后再次过柱,收集液体;
偶联:将活化后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶按照1:1.5(体积比)进行偶联,温度为6℃,偶联22h后,用马来酰亚胺终止,15min后用100mM乙醇胺最后终止,然后稀释至0.5 μg/ml后,在温度为6℃的条件保存。
用含BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释犬促甲状腺激素校准品,所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中BSA的质量百分比为1.5%。
按照该产品的技术标准要求对实施例中制备的试剂盒进行检定:
(1)试剂盒灵敏度实验
以0点校准品进行20次重复测定,其平均值加上两倍标准差带入曲线方程所得的浓度值为试剂盒的灵敏度,其灵敏度为0.23ng/mL。
(2)试剂盒精密性实验
批内变异
取16、100ng/mL两水平质控品分别进行10孔平行实验,计算测定值的平均值(v)和标准差(s)。按公式CV=s/v×100%计算变异系数,批内变异系数CV分别为3.99%、4.75%;
批间变异
选择5份不同浓度的血清样品对每份血清进行3次重复测定,计算其批间变异系数(CV%),批间变异CV小于5%。
(3)试剂盒准确性实验
将高浓度的校准品原料,用犬血清稀释成四个不同浓度值,每个浓度做5孔平行实验,分别计算回收率在93-112%范围内。
(4)试剂盒稳定性实验
试剂盒保存温度为2-8℃,经过12个月的测定试剂盒的各项指标均满足要求,考虑到运输和使用过程中对试剂盒的影响,我们进行37℃,7天的加速实验,实验结果表明试剂盒的各项指标完全符合要求。
英文缩写解释:
BSA:牛血清白蛋白
2-IT:2-亚氨基硫烷盐酸盐
SMCC:4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯
Tris-HCl:三羟甲基氨基甲烷-盐酸,Tris-HCl缓冲液中仅含有Tris,用盐酸调节pH
APS-5:(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐 。
Claims (10)
1.一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:包括包被了犬促甲状腺激素的单克隆抗体的毛细管、碱性磷酸酶标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体、犬促甲状腺激素校准品和作用于碱性磷酸酶的化学发光底物。
2.根据权利要求1所述的一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:所述包被了犬促甲状腺激素的单克隆抗体的毛细管的制备方法包括毛细管前期处理步骤和用犬促甲状腺激素的单克隆抗体包被毛细管步骤。
3.根据权利要求2所述的一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:所述毛细管前期处理步骤具体为:
步骤1,清洗
将浓盐酸与乙醇混合制成混合溶液Ⅰ;将毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中;浸泡完成后,取出毛细管,用超纯水淋洗并吹干毛细管;用碱性溶液浸泡毛细管,浸泡完成后,用超纯水淋洗并吹干毛细管;
步骤2,羟基化
将双氧水和浓硫酸混合,制成混合溶液Ⅱ;将毛细管浸泡在混合溶液Ⅱ中进行超声处理;超声处理完成后,用超纯水淋洗并吹干;用碱性溶液淋洗,然后用乙醇淋洗,最后用超纯水淋洗并吹干;
步骤3,氨化
将毛细管浸泡在含有3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中,然后用乙醇进行冲洗;冲洗完成后,将毛细管浸泡在含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇中,然后用乙醇冲洗;然后再将毛细管浸泡在含有乙二胺的乙醇中,最后用乙醇冲洗并烘干;
步骤4,活化
用SMCC活化剂活化毛细管,然后用Tris-HCL缓冲液清洗,吹干。
4.根据权利要求3所述的一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:步骤1中,所述毛细管浸泡在混合溶液Ⅰ中的时间为30~40min,浸泡温度为22~28℃;所述毛细管浸泡在碱性溶液中的时间为30~40min,浸泡温度为22~28℃;所述混合溶液Ⅰ中,浓盐酸与乙醇的体积比为1:1~2。
5.根据权利要求3所述的一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:步骤2中,所述混合溶液Ⅱ中,双氧水和浓硫酸的体积比为1:1~3,超声处理的时间为20~30min,温度为22~28℃。
6.根据权利要求3所述的一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:步骤3中,所述含有3-氨丙基三乙基硅烷的乙醇中的3-氨丙基三乙基硅烷的体积百分比为5~10%,所述含有甲基丙烯酸甲酯的乙醇中甲基丙烯酸甲酯的体积百分比为5~10%,所述含有乙二胺的乙醇中,乙二胺的体积百分比为5~10%。
7.根据权利要求2所述的一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:所述用犬促甲状腺激素的单克隆抗体包被毛细管步骤具体为:
透析:取犬促甲状腺激素的单克隆抗体过柱透析;
活化:用2-IT活化透析后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,加入终止剂终止活化,然后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体;
包被:将经过活化后的抗体稀释到浓度为10 μg/ml,制成包被液,然后将经过活化后的毛细管浸泡在包被液中,包被完成后,取出毛细管,用Tris-HCL缓冲液清洗;
封闭:用含BSA的Tris-HCL缓冲液封闭毛细管,封闭完成后,用清洗液冲洗,吹干。
8.根据权利要求7所述的一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:
活化步骤中,活化时间为15~30min,终止剂为甘氨酸,终止活化5~10min后再次过柱;封闭步骤中,封闭温度为35~40℃,封闭时间为1~2h,吹干后在温度为2~8℃的条件下保存待用;所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中BSA的质量百分比为1~2%。
9.根据权利要求1所述的一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:所述碱性磷酸酶标记的犬促甲状腺激素的单克隆抗体通过如下方法制成:
抗体活化:取犬促甲状腺激素的单克隆抗体过柱透析,然后用2-IT活化透析后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体,然后用终止剂终止活化,然后再次过柱,收集犬促甲状腺激素的单克隆抗体;
酶活化:取碱性磷酸酶过柱透析,然后用SMCC活化过柱后的碱性磷酸酶,然后用终止剂终止活化,最后再次过柱,收集液体;
偶联:将活化后的犬促甲状腺激素的单克隆抗体与活化后的碱性磷酸酶按照体积比为1:1~2,进行偶联,偶联完成后用马来酰亚胺终止,然后用乙醇胺最后终止,然后稀释至0.5μg/ml后,在温度为2~8℃的条件保存。
10.根据权利要求1所述的一种检测犬促甲状腺激素的化学发光免疫分析试剂盒,其特征在于:所述犬促甲状腺激素校准品配制包括以下步骤:
用含BSA的Tris-HCL缓冲液分别稀释犬促甲状腺激素校准品,分别制备出浓度为250ng/ml、100ng/ml、40ng/ml、16ng/ml和6.4ng/ml的犬促甲状腺激素校准品,在温度为2~8℃条件下保存待用,所述含BSA的Tris-HCL缓冲液中BSA的质量百分比为1~2%。
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