JP3310090B2 - 抗原又はハプテンの免疫測定 - Google Patents

抗原又はハプテンの免疫測定

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗原又はハプテンによ
って構成される物質の免疫測定(immunometric determin
ation)のための方法に係わる。
【０００２】本発明は、更に具体的には、ハプテン、即
ち、殆どの場合にそれ自体の中に単一の固定部位だけし
か持たない小分子（すなわち、モノエピトープ性ハプテ
ン(monoepitopic hapten) ）の定量に適用可能である。
すなわち、ハプテンは、それ自体としては抗体の合成を
促進することは不可能であるが、抗原キャリヤとして働
くタンパク質と結合させられる時に抗体の形成を誘導す
ることが可能な小分子である。
【０００３】
【従来の技術】２つの抗体に同時に結合させられるのに
は適していない大きさを有するハプテンの場合、サブス
タンスＰに関してAnal. Chem. 57, 1985, p 1170におい
てPradelles らによって記載され、また、Trends in Cl
uster Headache, F. Sicuteriら編, Elsevier, NY, 198
7, pp 125-134においてRengi らによって記載されてい
るように、従来の免疫学的測定は、任意に別の抗体を介
して固相に固定された限定量の抗体部位に対する、定量
すべきハプテンと、それと同一の標識ハプテンとの間の
競合(competition) によって行われる。
【０００４】抗原が第１の抗体を介して固相に結合さ
れ、その後で過剰の第２の標識抗体によって識別され
る、サンドイッチ型の又は２部位を有する免疫測定法の
ような別の免疫学的測定法は、上記競合法よりも著しく
高い感度を得ることを可能にするが、残念ながら、この
ような測定法はモノエピトープ性ハプテンには適用不可
能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特
に、競合による測定法よりも高い感度を得ることを可能
にする、こうしたハプテンの定量に特に使用可能な免疫
測定法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明による、抗原又は
ハプテンによって構成される物質の免疫測定法は、(1)
測定すべき物質のエピトープに特異的であり且つ第１抗
体と称する捕捉抗体(capture antibody)と飽和物質(sat
uration substance)とを固定した固相に、測定すべき物
質を含むサンプルを接触させて、前記測定すべき物質と
前記固定化抗体とを免疫学的に結合させる段階、(2) 前
記飽和物質と前記抗体と前記測定すべき物質とを固定し
た固相を、少なくとも１種の試薬による処理に掛けて、
測定すべき物質を共有結合の形成によって前記固相上に
固定化し、且つ、更なる免疫学的反応のために測定すべ
き物質のエピトープを使用可能(accessible)にする段
階、(3) こうして処理した固相を、前記測定すべき物質
に特異的であり且つ第２抗体と称する標識抗体に接触さ
せる段階、(4) 前記固相に固定された前記第２抗体の量
を測定する段階、(5) 第４段階において測定された前記
第２抗体の量に基づいて、前記サンプル中に存在する前
記測定すべき物質の量を、検量線に従って決定する段
階、を包含する。
【０００７】この方法では、上記第２段階で行われる処
理が、共有化学結合によって上記測定すべき物質を上記
固相上に完全に固定化することと、上記測定すべき物質
が再び抗体と免疫学的に反応することが可能であるよう
に上記測定すべき物質の免疫学的性質を回復させること
とをもたらすので、非常に重要である。
【０００８】一般的に、この処理は、第１抗体に免疫学
的に結合させられる上記測定すべき物質を、一方では上
記測定すべき物質と共有結合を形成することが可能な且
つ他方では上記第１抗体と上記飽和物質とで被覆された
上記固相と共有結合を形成することが可能な少なくとも
二官能性の試薬と反応させて、上記測定すべき物質を上
記試薬によって上記固相上に固定化する第１の段階と、
上記固相上に固定化された上記測定すべき物質に対し
て、第１抗体との免疫学的結合の変性(denaturation)の
ための処理を行う第２の段階とを含む。
【０００９】その第１の段階で使用される二官能性試薬
は、上記固相、上記飽和物質、及び／又は、上記固相に
固定された第１抗体と化学的に反応することが可能な第
１の官能基と、上記測定すべき物質と反応することが可
能な、第１の官能基と同一であるか又は異なっている第
２の官能基とを有する試薬である。こうした官能基は、
例えば、アミン基、酸基、アルデヒド基、チロシル基、
ヒスチジル基、又は、チオール基であることが可能であ
る。
【００１０】これらの官能基が同一である場合には、上
記試薬は、ホモ二官能性又はホモ多官能性の試薬であ
る。こうした試薬の例は、グルタルアルデヒド、ジフル
オロジニトロベンゼン、ジスクシンイミジルスベレー
ト、ビス（マレイミド）ヘキサン、及びビス［β−(4−
アジド−サリチルアミド) −エチル］−ジスルフィドで
ある。
【００１１】上記の２つの官能基が異なっている場合に
は、上記試薬は、ヘテロ二官能性又はヘテロ多官能性の
試薬である。こうした試薬の例は、 N−スクシンイミジ
ル−3−(2−ピリジルジチオ) −プロピオナート、スク
シンイミジル− 4−(N−マレイミドメチル) −シクロヘ
キサン− 1−カルボキシレートである。
【００１２】使用試薬の選択は、測定すべき物質に依存
するばかりでなく、使用される固相と抗体とにも依存す
る。
【００１３】固相は、免疫学的定量に一般的に使用され
る固相、例えば、プラスチック材料（例えばポリスチレ
ンかニトロセルロースかポリエステル）から作られた微
量滴定プレート(microtitration plate)、チューブ、
膜、ガラスボール、又は、共有結合的にもしくは非共有
結合的に、直接的にもしくは非直接的に第１抗体を固定
することが可能な任意の物質によって構成されることが
可能である。この固定は、吸着、共有化学結合、又は、
抗体のような分子とアビジンービオチン系とを結合させ
ることによって行ない得る。ヒドロキシルアパタイト、
ムライト、アルミナ、 ZrO2 、Ca3 （PO4 ）2 のような
鉱物材料として固相を使用することも可能である。
【００１４】固相の表面に対する第１抗体の固定は、能
動的でも受動的でもよい。この固定は、直接的吸着によ
って、又は、適切な試薬によって得ることが可能であ
る。
【００１５】本発明の方法では、使用する第１抗体と第
２抗体は両方とも、測定すべき物質に対して特異的な抗
体である。前記第１抗体と前記第２抗体は、同一の起源
からのものであっても、異なった起源からのものであっ
てもよい。更に、これらの抗体は、ポリクローナル抗体
であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００１６】測定すべき物質がモノエピトープ性ハプテ
ンである場合には、第１抗体と第２抗体は、同一であ
り、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００１７】測定すべき物質が抗原である場合には、２
つの互いに異なった抗体を使用することが可能である
が、２つの同一の抗体、好ましくはモノクローナル抗体
を使用することが有利である。第２の標識された又はマ
ークされた抗体に関しては、例えば、放射性元素、酵
素、蛍光マーカー、発光マーカー、又は、ビオチンとそ
の構造的類似物とのようなアビジンもしくはストレプト
アビジンと反応することが可能な分子といった様々な種
々の方法で、標識化を行うことが可能である。
【００１８】第２抗体が、酵素のような分子、蛍光マー
カー、蛍光マーカー、又は、アビジンもしくはストレプ
トアビジンと反応することが可能な分子によってマーキ
ング又は標識化される場合には、こうした測定に通常使
用される慣用方法によって、抗体への標識の結合を行う
ことが可能である。
【００１９】本発明の方法は、この場合に、単一の抗体
（好ましくはモノクローナル抗体）を使用してサンドイ
ッチ型の測定法の場合と同じ感度を得ることが可能なた
め、抗原の定量に有利に使用することが可能である。
【００２０】しかし、本発明の方法は、この場合に、二
部位免疫測定法の場合のように過剰量の試薬（捕捉抗体
と標識抗体）を使用するという利点を有すると同時に、
競合による測定法の場合よりも著しく高い感度を単一の
抗体を使用して得ることが可能なため、モノエピトープ
性ハプテンの定量にとって更に大きな重要性を有する。
【００２１】本発明の方法によって測定可能なハプテン
の例としては、ACTH、アンギオテンシン、ANF 、ブラジ
キニン、エンセファリン(encephalin)、LHRH、オキシト
シン(oxytocin)、バソプレシン、ニューロキニン(neuro
kinin)、エンドテリン(endotheline) 、サブスタンス
Ｐ、チロキシン、ロイコトリエン E4 を挙げることがで
きる。
【００２２】これらのハプテンの式は次の通りである。
【００２３】
【化１】
【００２４】本発明の他の特徴と利点が、添付図面を参
照して、以下の非限定的な説明から更に明確になるだろ
う。
【００２５】図1Aは、本発明の免疫測定法の第１段階を
示し、この図では、測定すべき抗体(3) に特異的である
捕捉抗体(2) と、一般にウシ血清アルブミンのようなタ
ンパク質によって構成される飽和物質(6) とが固定され
た固相(1) を見ることが可能である。この段階を行うた
めには、測定すべき物質(3) を固定化抗体(2) に免疫学
的に結合させるために、捕捉抗体(2) と飽和物質(6) と
を有する支持体(1) を、前記物質(3) に接触させる。そ
の固相に固定された抗体の量は、サンプル中に含まれる
測定すべき物質の量に比較して過剰量に相当する。
【００２６】図1Bと図1Cにその２つのパート(parts) が
示されている第２段階では、固相が、固相(1) 上での共
有結合(4) の形成によって、測定すべき物質(3) を固定
化するために、少なくとも二官能性の試薬による処理を
受ける（図1B）。この共有結合は、固相、第１捕捉抗
体、及び／又は、飽和物質に対して、直接的に形成され
ることが可能である。
【００２７】その第２のパートでは、測定すべき物質
(3) のエピトープを、抗体(2) と物質(3) との免疫学的
結合を変性させることによって、更に別の免疫学的反応
のために使用可能(accessible)にする。
【００２８】第１の固定化パートを得るために、飽和物
質と、捕捉抗体(2) と、前記抗体に免疫学的に結合され
た測定すべき物質(3) とが固定された固相(1) を、適切
なpHを有する少なくとも二官能性の試薬の溶液と、適切
な時間に亙って攪拌しながら接触させる。
【００２９】更に明確に言えば、このpHは、使用する多
官能性試薬に応じて決まる。例えば、グルタルアルデヒ
ドの場合には、５〜９のpH値が好ましく、一方、ジスク
シンイミジルスベレート(DSS) の場合には、７〜９のpH
値が好ましい。これらのpH値は、適切な緩衝液によって
得られる。
【００３０】その後で、反応を停止させるために、上記
二官能性試薬と反応することが可能な既存の官能基を破
壊する働きを有するか、又は、上記二官能性試薬の遊離
官能基と反応する働きを有する停止液を加えることが可
能である。例えば、グルタルアルデヒドを二官能性試薬
として使用する時には、この停止液は、グルタルアルデ
ヒドの過剰アルデヒド基を破壊するために、NaBH4 のよ
うな還元剤からなることが可能であり、又は、そのアミ
ン基と反応することが可能なグルタルアルデヒドの残留
基を使用するために、エタノールアミンのようなアミン
からなることが可能である。
【００３１】第２のパート（図1C）には、第１抗体と測
定すべき物質との免疫学的結合の変性のための処理が示
されている。この変性処理は、適切な試薬を使用して、
又は、超音波又は熱の作用によって、従来の仕方で行う
ことが可能である。
【００３２】例えば、こうした試薬は、HCl のような
酸、NaOHのような塩基、有機溶媒（例えばメタノールの
ようなアルコール等）、界面活性剤、鉱物塩の中から選
択されることが可能である。使用試薬は、「抗原−抗
体」対と、第１抗体と固相との間の結合の性質とに応じ
て選択される。
【００３３】場合によっては、使用される反応条件の結
果として、第１の固定化パートにおいて第２の変性が同
時に得られることが可能なので、この第２の変性を行う
必要がないことがある。
【００３４】図1Dに示される第３段階では、測定すべき
物質(3) が共有結合(4) によって固定化された固相(1)
を、物質(3) に対して特異的な標識付きの第２の抗体
(5) と接触させる。固定化された測定すべき物質の量に
比較して過剰量に相当する量の標識抗体を含む溶液を使
用して、この接触を行う。
【００３５】第４段階（図1E）では、測定すべき物質
(3) との免疫学的結合によって固相に固定された標識抗
体(5) の量を測定する。この測定は、使用標識に応じ
た、このタイプの定量に慣用的に使用される慣用法によ
って行う。
【００３６】検量線を得るために、既知の濃度で上記測
定すべき物質を含む複数の標準液に対して各々に同一の
操作条件下において定量を行い、それによって、検量線
をプロットするための、各々の濃度に対応した固定化抗
体レベルが得られる。
【００３７】この後に、上記検量線を参照しながら、同
一の条件下で、未知の濃度を有するサンプルの定量を行
う。固定された第２抗体の量の測定値に基づいて、サン
プルの測定すべき物質の濃度が得られる。
【００３８】この方法の各段階の前に、洗浄緩衝液を使
用する従来通りの洗浄操作を行ってもよいことに留意さ
れたい。
【００３９】
【実施例】以下では、本発明に従って行う測定を説明す
る。
【００４０】実施例１：サブスタンスＰの測定 この実施例では、固相は、96個の窪み（穴）を有するポ
リスチレン製の微量滴定プレートであり、この固相に、
J. of Neurochemistry, vol. 49, No.6, 1987,pp 1708-
1718 においてCouraud らによって記載されているSP14
抗体からなる抗サブスタンスＰモノクローナル抗体を固
定する。
【００４１】上記窪みの各々の中に、抗サブスタンスＰ
抗体(SP14)を10μg/ml含む５×10-2M(pH 7.4)のリン酸
塩緩衝液 200μl を加え、18時間に亙って22℃でインキ
ュベートした。その後で、先に使用した（更に0.05％の
Tween 20も含む）リン酸塩緩衝液からなる洗浄緩衝液で
各々の窪みを洗浄し、その後で、飽和物質(BSA) で固相
を飽和させるために、EIA 緩衝液 300μl を各々の窪み
に加えた。このEIA 緩衝液は、NaCl 0.1 mol/lと、エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA) 1 mmole/lと、ウシ血清アル
ブミン(BSA) 0.1 ％と、窒化ナトリウム 0.01 ％とを含
む、0.1 M (pH7.5)のリン酸カリウム緩衝液だった。最
初の使用の前に、上記微量滴定プレートを少なくとも24
時間に亙って 4℃に維持した。
【００４２】その後で、測定の第１段階を行うために、
緩衝液で洗浄した後に、サブスタンスＰの標準液又はサ
ンプルを、EIA 緩衝液中に 100μl の割合で、上記窪み
の各々の中に入れた。＋4 ℃で18時間に亙ってインキュ
ベートし、その後で洗浄緩衝液を使用して洗浄した。
【００４３】更に、定量の第２の段階を２つのパートに
分けて行った。第１のパートには、2.5 ％のグルタルア
ルデヒドを含む 0.1 M (pH 9) ホウ酸塩緩衝液 100μl
を各々の窪みに加え、穏やかに攪拌しながら１時間に亙
って反応させた。洗浄後に、4 mg/ml の水素化ホウ素ナ
トリウム溶液からなる停止液 250μl を各々の窪みに加
え、１時間に亙って反応させ、その後で洗浄緩衝液で洗
浄した。
【００４４】第２のパートには、0.1 N HCl 250 μl を
加え、22℃で10分間に亙って反応させた。その結果とし
て、更に別の免疫学的反応のためにサブスタンスＰのエ
ピトープを使用可能にするように、サブスタンスＰ(3)
と第１抗体(2) との間の免疫学的結合を変性させた。
【００４５】洗浄後に、第１段階で使用した抗サブスタ
ンスＰモノクローナル抗体 200μlを各々の窪みに加え
ることによって、第３段階を行った。このサブスタンス
Ｐモノクローナル抗体は、アセチルコリンエステラーゼ
(AChE)(5EU/ml)で標識化され、且つ EIA緩衝液で希釈さ
れた。18時間の間 4℃でインキュベートした後で洗浄し
た。
【００４６】第４段階を行うために、即ち、固相に固定
された第２抗体(5) の量を測定するために、Anal. Che
m., 57, 1985, p 1170 でPradelles らによって記載さ
れる通りのアセチルチオコリンとDTNBとの混合物で構成
されるEllman試薬 200μl を、各々の窪みに加えること
によって、酵素活性の測定を行い、１時間に亙って酵素
反応を続けさせ、その後で、 414nmの吸光度の測定を行
った。標準液に関して得られた吸光度測定値に基づい
て、 414nmの吸光度の関数としてサブスタンスＰ濃度(p
g/ml単位) を示す、図２に示されている検量線をプロッ
トした。
【００４７】サンプルを収容する窪み内で得られた吸光
度に基づいて、図２の検量線を参照することによってサ
ンプルのサブスタンスＰ濃度を得ることが可能である。
【００４８】したがって、本発明の方法は、正確で高感
度のサブスタンスＰの定量を可能にし、その検出可能濃
度は 6pg/ml だった。
【００４９】比較例１：サブスタンスＰの測定 この実施例は、サブスタンスＰの定量のために、競合に
よる測定法と、実施例１と同一のモノクローナル抗体SP
14とを使用する。
【００５０】この場合には、J. of Neurochemistry, vo
l. 49, No. 6, 1987, p 1708-1718においてCouraud ら
によって記載されている方法を用いて、微量滴定プレー
トとモノクローナル抗体SP14とを使用する。この後に、
標準液又はサンプル50μl と、酵素トレーサーとして働
くサブスタンスＰ−アセチルコリンエステラーゼ結合体
50μl とを、上記窪みの各々の中に入れた。 4℃におい
て一晩に亙ってインキュベートした後で、そのプレート
を洗浄し、固定化された酵素活性を実施例１で説明した
仕方で定量した。
【００５１】これは、図３に示す検量線を与え、この曲
線上では、サブスタンスＰの濃度(ng/ml単位) に応じた
比率 B/Bo （％単位）が縦座標上にプロットされてい
る。Bが、サブスタンスＰの存在下での測定吸光度を表
し、BoがサブスタンスＰの不在下での測定吸光度を表す
ということを指摘しておく。
【００５２】図４は、実施例１の測定で得た精度特性(p
recision profile) （曲線１）と比較例１の測定で得た
精度特性（曲線２）とを示す。これらの精度特性は、サ
ブスタンスＰの量(pg/ml単位) の関数としての精度係数
(precision coefficient)CV（％単位）の変化を対数座
標で表す。
【００５３】これらの曲線をプロットするために、各々
の濃度に関する標準偏差ｄと平均値Vm を決定するよう
に、標準液中のサブスタンスＰの各々の濃度に関して８
回の測定を行った。これらの測定値に基づいて次式によ
って精度係数CV（％単位）を評価した。
【００５４】
【数１】
【００５５】図４は、曲線１の場合の方が精度係数と感
度とが優れていることと、特に30〜1000 pg/mlの濃度範
囲において精度係数が非常に高いということとを示して
いる。
【００５６】図５は、実施例１の測定の場合（曲線１）
と比較例１の測定の場合（曲線２）とにおける、サブス
タンスＰの濃度に応じた吸光度を示す。
【００５７】これらの結果は、本発明による測定法の場
合には検出限界(LDD) が約10pg/mlであり、一方、従来
技術による競合を用いた測定法の場合には検出限界が約
900pg/mlであるということを示している。
【００５８】従って、本発明の免疫測定法はサブスタン
スＰの正確で高感度な定量を可能にする。特に、本発明
の方法は、より高い精度を得ることと、より少量のサブ
スタンスＰを検出することとを可能にする。
【００５９】実施例２：サブスタンスＰの測定 この実施例では、サブスタンスＰを固定化するための第
２段階で使用するグルタルアルデヒドの濃度が定量結果
に与える影響を調べた。この場合には、実施例１の場合
と同様に、サブスタンスＰを500 pg/ml 含む標準液に対
して、０〜2.5％のグルタルアルデヒド濃度を使用して
定量を行い、各々の場合において414nmの吸光度を測定
した。
【００６０】得られた結果を図６に示し、この図は、グ
ルタルアルデヒド濃度に応じた414nm の吸光度を示して
いる。グルタルアルデヒド濃度の増大に応じて吸光度が
増大することと、 0.5〜2.5 ％の濃度範囲内で良好な結
果が得られることを、この図は示している。
【００６１】実施例３：サブスタンスＰの測定 この実施例では、固定化段階中に使用されるpH、即ち、
グルタルアルデヒド溶液のpHが定量に与える影響を調べ
た。
【００６２】サブスタンスＰを500 pg/ml 含む標準液に
対して、固定化段階中に３〜10のpH値を使用して、実施
例１の場合と同一の操作手順に従った。
【００６３】図７は、使用pHに応じた吸光度の変化を示
している。更に、５〜９のpH値範囲内で吸光度が高いこ
とを示している。
【００６４】実施例４〜７：サブスタンスＰの測定 これらの実施例では、本発明による方法の第２段階の２
つのパートが定量に与える影響を調べた。これらの実施
例全てでは、第２のパートに対して下記の変更を加えた
ことを除いて、実施例１の場合と同一の操作手順に従っ
た。
【００６５】実施例４では、NaBH4 を使用せず、即ち、
固定化反応停止液を使用しなかった。
【００６６】実施例５では、グルタルアルデヒド溶液は
使用せず、その還元段階ではNaBH4を使用した。
【００６７】実施例６では、固定化段階、即ち、グルタ
ルアルデヒド溶液との反応と、停止液の添加とを完全に
除外した。
【００６８】実施例７では、固定化段階は行ったが、塩
酸液によるエピトープの遊離段階は行わなかった。
【００６９】これらの変更を次表に集約してある。
【００７０】
【表１】
【００７１】得られた結果を図８に示し、この図は、各
々の場合に得た検量線を表し、即ち、サブスタンスＰの
濃度(pg/ml) に応じた 414nmの吸光度の変化を表す。
【００７２】図８では、曲線１は実施例１に相当し、曲
線４は実施例４に相当し、曲線５は実施例５に相当し、
曲線６は実施例６に相当し、曲線７は実施例７に相当す
る。
【００７３】図８は、微量滴定プレート上のサブスタン
スＰ固定化段階の実施と、そのエピトープの遊離とが、
サブスタンスＰの定量を可能にするために不可欠である
ということを明らかにしている。
【００７４】実施例８：チロキシンの測定 96個の窪みを有する微量滴定プレートを、この定量のた
めに使用し、この微量滴定プレートは上記実施例の微量
滴定プレートと同一であり、実施例１の場合と同一の条
件下の操作によって、パスツール研究所から得たモノク
ローナル抗体からなる抗チロキシン抗体を上記窪みの中
に固定した。
【００７５】その後で、0.1 ％BSA を含む0.05 M (pH
8.6) バルビタール緩衝液中に 100μl の割合で標準チ
ロキシン溶液を入れ、その後で22℃で１時間に亙ってイ
ンキュベートした。その後で、実施例１で使用した緩衝
液を用いて洗浄した。
【００７６】第２段階では、各々の窪みの中に、ジメチ
ルホルムアミドと n−プロパノールとの混合液（体積で
1/9)中の0.1 M (pH 7)リン酸塩緩衝液 100μl とジスク
シンイミジルスベレート(DSS) 10μl とを濃度 1 mg/ml
に加え、22℃で15分間に亙って反応させた。この後で、
洗浄緩衝液で洗浄し、0.1 M (pH 9)ホウ酸塩緩衝液中の
0.1 M エタノールアミンを用いて反応を停止させた。洗
浄後に、チロキシンからエピトープを遊離させるため
に、0.1 N 炭酸ナトリウム(soda) 250μl を各々の窪み
に加えた。
【００７７】洗浄後に、バルビタール緩衝液で希釈した
アセチルコリンエステラーゼ(AChE)(5 EU/ml)で標識付
けした同一の抗チロキシンモノクローナル抗体 100μl
を加え、22℃で１時間に亙ってインキュベートした。
【００７８】洗浄後に、Ellman試薬(200μl)を加え、10
分間に亙って酵素反応を続けさせ、その後で、414nm の
吸光度を測定した。
【００７９】得られた結果、即ち、検量線を図９に示
し、この検量線は、チロキシン濃度(ng/ml) に応じた 4
14nmの吸光度の変化を表す。検出限界は61 pg/mlだっ
た。
【００８０】こうして、単一の抗体を使用することと、
モノクローナル抗体の使用によって測定の特異性を高め
ることとによって、高い感度を得た。
【００８１】比較のために、同一の抗体との競合によっ
て行った同一の定量では、検出限界が 1 ng/mlであった
ということを指摘しておく。
【００８２】実施例９〜11：チロキシン測定 これらの定量のために、結合タンパク質の作用を抑制す
るための様々な試薬（例えばTBG ）を使用することと、
バルビタール緩衝液 100μl （実施例９）か、ANS（8
−アニリノ− 2−ナフタレンスルホン酸) 1 mg/ml を含
むバルビタール緩衝液 100μl （実施例10）か、 0.4％
のチメロザール(thymerosal)を含むバルビタール緩衝液
100μl （実施例11）のいずれかに、標準血漿又はサン
プルを加えることとによって、実施例８と同じ操作手順
に従った。
【００８３】この後で、ホウ酸塩緩衝液中の 2.5％グル
タルアルデヒド溶液を使用して、上記窪み内のチロキシ
ン固定化段階を行い、その後で、穏やかに攪拌しながら
30分間に亙って反応させた。その後で、NaBH4 を使用し
て反応を停止させ、その後で30分間に亙って反応させ
た。
【００８４】エピトープの遊離と測定段階の残りの段階
とのために、実施例８の手順を使用した。
【００８５】得られた結果を図10に示す。この図10は、
得られた検量線を示し、即ち、チロキシン濃度(nmole/l
単位) に応じた 414nmの吸光度を示す。
【００８６】図10では、曲線９が実施例９に相当し、曲
線10が実施例10に相当し、曲線11が実施例11に相当す
る。
【００８７】バルビタール緩衝液をチメロザールととも
に使用する時に最良の結果が得られるということを、図
10に基づいて理解することができる。
【００８８】実施例12〜14：チロキシン測定 これらの実施例では、本発明による方法の個々の段階が
定量に及ぼす影響を調べた。これらの実施例全てでは、
下記の変更を除いて、実施例８の操作手順と同一の操作
手順に従った。
【００８９】実施例12では、固定化試薬としてDSS を使
用し、停止液としてエタノールアミンを使用し、エピト
ープ遊離試薬として 0.1 N塩酸を使用した。
【００９０】実施例13では、DSS とエタノールアミンと
を用いてチロキシン固定化段階を行ったが、そのエピト
ープはHCl によって遊離させられることはなかった。
【００９１】実施例14には、チロキシン固定化段階又は
エピトープ遊離段階がなかった。
【００９２】得られた結果を図11に示す。この図は、得
られた検量線を示している。図11では、曲線12、13、14
は各々実施例12、13、14に関連する。
【００９３】チロキシン濃度に応じた吸光度の変化が実
施例13、14では認められないので、固定化段階とエピト
ープ遊離段階という２つの段階が、チロキシン定量を可
能にする上で不可欠であるということが理解できる。
【００９４】従って、本発明の方法は、単一の抗体を使
用して高い感度を得ることを可能にするので、非常に有
利である。更に、様々な供給源から得たサブスタンスＰ
に対して行った相関関係の調査を示す下記の表２に示さ
れている結果は、本発明の方法を使用する時に、同一の
抗体を使用する競合による定量の結果と同等の結果が得
られるということを示し、このことは、本発明による方
法の信頼性を確証する。
【００９５】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】本発明による免疫測定法の第１段階を概略的
に示す図である。
【図１Ｂ】本発明による免疫測定法の第２段階の第１パ
ートを概略的に示す図である。
【図１Ｃ】本発明による免疫測定法の第２段階の第２パ
ートを概略的に示す図である。
【図１Ｄ】本発明による免疫測定法の第３段階を概略的
に示す図である。
【図１Ｅ】本発明による免疫測定法の第４段階を概略的
に示す図である。
【図２】本発明による方法を用いたサブスタンスＰの免
疫測定定量に関して得られた検量線である。
【図３】従来技術の方法を用いたサブスタンスＰの競合
による定量に関して得られた検量線である。
【図４】本発明による免疫測定定量と従来技術の競合定
量とを使用して得られたサブスタンスＰの定量の精度特
性を示すグラフである。
【図５】本発明による免疫測定定量と従来技術の競合定
量とを使用して得られたサブスタンスＰの定量の感度を
示すグラフである。
【図６】本発明の方法によるサブスタンスＰの定量に対
するグルタルアルデヒド濃度の影響を示すグラフであ
る。
【図７】本発明の方法によるサブスタンスＰの定量に対
する固定化段階のpH値の影響を示すグラフである。
【図８】サブスタンスＰの定量に対する本発明による方
法の各々の段階の影響を示すグラフである。
【図９】本発明の方法によるチロキシン定量に関して得
られた検量線である。
【図１０】本発明の方法によるチロキシン定量に関して
得られた検量線である。
【図１１】チロキシン定量に対する本発明による方法の
各々の段階の影響を示すグラフである。
【符号の説明】
１ 固相 ２ 捕捉抗体 ３ 測定すべき物質 ４ 共有結合 ５ 標識付きの第２抗体 ６ 飽和物質

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 抗原又はハプテンによって構成される物
    質の免疫測定法であって、 (1) 測定すべき物質のエピトープに特異的であり且つ第
    １抗体と称する捕捉抗体と飽和物質とを固定した固相
    に、測定すべき前記物質を含むサンプルを接触させて、
    前記測定すべき物質と前記固定化抗体とを免疫学的に結
    合させる段階、 (2) 前記飽和物質と前記抗体と前記測定すべき物質とを
    固定した固相を、少なくとも１種の試薬による処理に掛
    けて、測定すべき物質を共有結合の形成によって前記固
    相上に固定化し、且つ、更に別の免疫学的反応のために
    測定すべき物質のエピトープを使用可能にする段階、 (3) こうして処理した固相を、前記測定すべき物質に特
    異的であり且つ第２抗体と称する標識抗体に接触させる
    段階、 (4) 前記固相に固定された前記第２抗体の量を測定する
    段階、 (5) 第４段階において測定された前記第２抗体の量に基
    づいて、前記サンプル中に存在する前記測定すべき物質
    の量を、検量線に従って決定する段階、を包含すること
    を特徴とする前記方法。
  2. 【請求項２】 前記第２段階において、前記第１抗体に
    免疫学的に結合させた前記測定すべき物質を、一方では
    前記測定すべき物質と共有結合を形成することが可能な
    且つ他方では前記第１抗体と前記飽和物質とで被覆され
    た前記固相と共有結合を形成することが可能な少なくと
    も二官能性の試薬と反応させて、前記測定すべき物質を
    前記試薬によって前記固相上に固定化することを特徴と
    する請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記試薬がグルタルアルデヒド又はジス
    クシンイミジルスベレートであることを特徴とする請求
    項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記第２段階において、前記固相上に固
    定化した前記測定すべき物質に対して、前記第１抗体と
    の免疫学的結合の変性処理を行うことを特徴とする請求
    項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記変性処理を試薬によって行うことを
    特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記試薬を、酸、塩基、有機溶媒、界面
    活性剤、鉱物塩の中から選択することを特徴とする請求
    項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記変性処理を超音波又は熱の作用によ
    って行うことを特徴とする請求項４に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記第１抗体と前記第２抗体とが同一で
    あることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記２つの抗体がモノクローナル抗体で
    あることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 放射性元素、酵素、蛍光標識、発光標
    識、又は、アビジンもしくはストレプトアビジンと反応
    することが可能な分子を使用して、前記第２抗体に標識
    を付けることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記測定すべき物質がサブスタンスＰ
    又はチロキシンであることを特徴とする請求項１に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 前記測定すべき物質が、ACTH、アンギ
    オテンシン、ANF 、ブラジキニン、エンセファリン、LH
    RH、オキシトシン、バソプレシン、ニューロキニン、エ
    ンドテリン、及びロイコトリエン E4 から成る群から選
    択されるハプテンであることを特徴とする請求項１に記
    載の方法。
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