CN108802120A - 一种基于Au@Ag核壳纳米粒子电化学检测硫化氢的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于Au@Ag核壳纳米粒子电化学检测硫化氢的方法，所述方法包括如下步骤：(1)Au@Ag核壳纳米粒子的制备；(2)Au@Ag核壳纳米粒子修饰玻碳电极的制备；(3)硫化氢的电化学检测；(4)Hela细胞中内源性硫化氢的检测。本发明检测灵敏度高，电化学响应信号强且稳定，操作简便且选择性好，在实际生物样品硫化氢的检测方面有较好的应用前景。

Description

一种基于Au@Ag核壳纳米粒子电化学检测硫化氢的方法
技术领域
本发明涉及化学传感器技术领域，尤其是涉及一种采用Au@Ag核壳纳米粒子修饰电极并制成传感器，用于检测硫化氢的方法。
背景技术
硫化氢是一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体。在污水，煤矿，石油天然气等行业会产生大量硫化氢，对环境和人体造成重大危害。另一方面，人们发现在生物体内有内源性的硫化氢生成。内源性硫化氢的生成有多条途径，在细胞浆内主要以半胱氨酸为底物，在胱硫醚-β-合酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的作用下产生；在线粒体内，以β-巯基丙酮酸为底物，在巯基丙酮酸转硫酶的作用下产生。其中由CSE和CBS催化L-半胱氨酸生成硫化氢是其主要途径。机体内CSE和CBS的表达具有组织特异性，神经系统内主要有CBS而没有CSE，血管等具有平滑肌的组织上只有CSE表达而无CBS，肝脏和肾脏则同时表达有CBS和CSE。其在心血管系统，中枢神经系统，肝脏肾脏和胃肠道等组织器官发挥重要的病理生理学作用。近年来，硫化氢被认为是重要的气体信号分子，参与于各种生理过程，硫化氢与肿瘤的关系也已引起广泛关注。因此，硫化氢的定量检测对于环境和人体健康具有重要意义。
目前，已有多种技术被用于检测硫化氢，如荧光法，比色法，化学发光法和表面增强拉曼法等。然而，这些方法通常试剂制备方法繁琐，操作复杂且检测灵敏度较低。与之相比电化学方法具有诸多优点，如成本低廉，操作简单，检测限低，灵敏度高等。而现今已有的电化学方法多以Fe(CN)6 4-/3-,Ru(NH3)6 3+/2+和二茂铁及其衍生物等作为信号分子，这些传感器由于信号分子存在于溶液中与电极表面接触较少导致电化学响应信号普遍偏低且不稳定，因此，制备出信号强而稳定且对硫化氢响应灵敏的电化学传感器十分必要。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种基于Au@Ag核壳纳米粒子电化学检测硫化氢的方法。本发明检测灵敏度高，电化学响应信号强且稳定，操作简便且选择性好，在实际生物样品硫化氢的检测方面有较好的应用前景。
本发明的技术方案如下：
一种基于Au@Ag核壳纳米粒子电化学检测硫化氢的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)Au@Ag核壳纳米粒子的制备；
(2)Au@Ag核壳纳米粒子修饰玻碳电极的制备；
(3)硫化氢的电化学检测；
(4)Hela细胞中内源性硫化氢的检测。
所述Au@Ag核壳纳米粒子的制备方法为：在室温下，将金纳米粒子溶液、磷酸盐缓冲液、聚乙烯吡咯烷酮溶液与抗坏血酸溶液按比例混合，之后再加入硝酸银溶液，避光反应3h，离心水洗，制得Au@Ag核壳纳米粒子，之后定容形成Au@Ag核壳纳米粒子水溶液备用。
所述金纳米离子的粒径为17.8±1.8nm；所述金纳米粒子溶液的粒子浓度为1×10-8mol/L；所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量浓度为0.5～5％，体积用量为400～4000μL；所述抗坏血酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.2mol/L，体积用量为500～2000μL；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为1～5mmol/L，体积用量为0.1～10mL。
所述Au@Ag核壳纳米粒子修饰玻碳电极的制备方法为：
①首先采用三氧化二铝抛光粉对裸玻碳电极进行抛光处理，用乙醇与超纯水超声清洗30～60s，洗净后用氮气吹干；
②然后利用循环伏安法在干净的玻碳电极表面电镀上对氨基苯磺酸；将电镀好的电极浸入五氯化磷溶液中活化5～30分钟后取出清洗干净；
③最后在修饰好的电极表面滴涂Au@Ag核壳纳米粒子水溶液，静置后用水冲洗掉多余未连接的粒子晾干备用。
所述三氧化二铝抛光粉的粒径为1.0μm、0.5μm或0.3μm；所述循环伏安法电镀对氨基苯磺酸的体系为三电极体系，其参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极；所述循环伏安法电镀对氨基苯磺酸的扫描范围为-0.5～0.5V，扫描速度为100mV/s，扫描时间为30分钟；所述对氨基苯磺酸溶液的摩尔浓度为5～50mmol/L，体积用量为1～4mL；所述五氯化磷溶液的摩尔浓度为10～100mmol/L，体积用量为1～4mL。
所述硫化氢的电化学检测方法为：将Au@Ag核壳纳米粒子修饰玻碳电极浸入到磷酸缓冲液和硫化钠溶液的混合溶液中反应30分钟，经超纯水冲洗干净后用作工作电极，利用差分脉冲伏安法检测Au@Ag核壳纳米粒子的电化学氧化峰强度变化，以硫化氢浓度的对数值为横坐标，所得的电化学氧化峰电流值为纵坐标，绘制标准曲线。
所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L；所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；所述混合溶液的体积为100μL，硫化钠溶液的摩尔浓度为0.05～100000nmol/L；所述电化学检测体系为三电极体系，其参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极；所述差分脉冲伏安法检测的扫描范围为-0.2～0.6V；扫描速度为4mV/s；所述差分脉冲伏安法使用磷酸盐缓冲液的体积为2mL。
所述Hela细胞中内源性硫化氢的检测方法是：将100μL不同浓度的半胱氨酸分别加入到1mL含有Hela细胞的磷酸钾缓冲液中，37℃条件下，温育90min之后反复冻融裂解细胞，离心后取上清液定容到1mL冷藏备用，最后对定容后的细胞裂解液用差分脉冲伏安法进行检测，根据标准曲线判断检测液中硫化氢的浓度。
所述含有Hela细胞的磷酸钾缓冲液中Hela细胞的浓度为106个/mL，磷酸缓冲液的浓度为50mmol/L；所述半胱氨酸的摩尔浓度为1～5mmol/L；所述反复冻融的温度分别为-80℃、37℃，反复冻融的次数大于3次；用于差分脉冲伏安法检测的细胞分解液的体积为100μL。
本发明方法中，修饰在玻碳电极表面的Au@Ag核壳纳米粒子具有明显且稳定的电化学氧化峰，该氧化峰来源于Au@Ag核壳纳米粒子外层银的电化学氧化。然后，在正常含氧环境下，硫化氢将会自发与Au@Ag核壳纳米粒子外层的银发生氧化还原反应生成硫化银，因此导致之后电化学氧化过程中Au@Ag核壳纳米粒子的氧化峰电流减弱。从而我们可以通过监测Au@Ag核壳纳米粒子电化学氧化峰强度的变化来达到检测硫化氢的目的。最后需要注意的是，本发明中有关硫化氢的测定均以硫化钠作为硫化氢的供给体，在pH＝7.4的水溶液中，硫化钠中的硫以硫氢根离子和硫化氢分子的形式存在，二者均可以与Au@Ag核壳纳米粒子表面的银发生氧化还原反应生成硫化银。
本发明有益的技术效果在于：
1.本发明采用壳层厚度可调控的Au@Ag核壳纳米粒子相比于单一的银纳米粒子更易于合成和富集，更有利于其在电极表面定量修饰的操作；
2.本发明将Au@Ag核壳纳米粒子通过化学方法稳定修饰到玻碳电极表面进一步放大了银的电化学响应信号，增强了这种检测方法的准确性且扩大了检测范围；
3.本发明Au@Ag核壳纳米粒子表面的银和硫化氢的氧化还原反应十分灵敏迅速，使得该检测方法能够实现对硫化氢的快速准确检测。
附图说明
图1为实施例1合成的Au@Ag核壳纳米粒子的透射电子显微镜图。
图2为实施例1中Na2S检测的标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明进行具体描述。
实施例1：
一种基于Au@Ag核壳纳米粒子电化学检测硫化氢的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)Au@Ag核壳纳米粒子的制备：依据之前已报道的方法合成粒径为17.8±1.8nm的金纳米粒子，取10mL在8000r/min条件下离心10分钟后浓缩10倍重溶于1mL超纯水中。将2mL，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液，1mL浓度为1％(wt％)的聚乙烯吡咯烷酮溶液，1mL金纳米粒子溶液和500μL浓度为0.1mol/L的抗坏血酸溶液混合均匀，最后加入3.2mL浓度为3mmol/L的硝酸银溶液，均匀振荡条件下反应3小时后得到Au@Ag核壳纳米粒子，离心水洗后定容为500μL备用，如图1所示为合成的Au@Ag核壳纳米粒子的透射电子显微镜图，其粒径约为46.4±2.5nm。
(2)Au@Ag核壳纳米粒子修饰玻碳电极的制备：首先将裸玻碳电极分别用1.0，0.5和0.3μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，用乙醇和超纯水分别超声清洗40秒后用氮气吹干。然后将处理好的具有光滑镜面的裸玻碳电极用作工作电极，饱和甘汞电极用作参比电极，铂丝电极用作对电极，在浓度为20mmol/L的对氨基苯磺酸溶液中进行循环伏安曲线扫描，扫描范围为-0.5～0.5V，扫描速度为100mV/s，扫描30分钟结束后用超纯水冲洗干净已镀上对氨基苯磺酸的玻碳电极，将其浸入2mL浓度为40mmol/L的五氯化磷溶液中活化30分钟后取出清洗干净，最后在电极表面滴涂上10μL制备好的Au@Ag核壳纳米粒子，静置一段时间后用水冲洗掉多余未连接的粒子晾干备用。
(3)硫化氢的电化学检测：为精确检测硫化氢，建立Au@Ag核壳纳米粒子电化学氧化峰电流强度与硫化氢浓度的标准曲线，首先将Au@Ag核壳纳米粒子修饰的玻碳电极浸入到2mL，0.1mol/L磷酸缓冲液和100μL的不同浓度的硫化钠溶液的混合溶液中反应30分钟，经超纯水冲洗干净后用作工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极扫描差分脉冲伏安曲线，其扫描范围为-0.2～0.6V；扫描速度为4mV/s，电解质溶液为2mL，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液。利用差分脉冲伏安法检测Au@Ag核壳纳米粒子的电化学氧化峰强度变化。根据所得的Au@Ag核壳纳米粒子的电化学氧化峰电流值与硫化氢浓度的对数呈线性关系，绘制相应的标准曲线。如图2所示，该标准曲线在0.1～500nmol/L的浓度范围内表现出良好的线性关系，检测限为0.04nmol/L。
(4)Hela细胞中内源性硫化氢的检测：将100μL浓度为1mmol/L的半胱氨酸加入到1mL浓度为106/mL的Hela细胞中，将其在37℃温育90分钟后在-80℃和37℃条件下反复冻融三次裂解细胞，离心后取上清液定容到1mL后冷藏备用，取100μL定容后细胞裂解液用传统亚甲蓝法测得其中H2S的含量为20.18μmol/L，稀释1000倍后使用上述基于Au@Ag核壳纳米粒子的电化学方法对Hela细胞中内源性的硫化氢进行检测，测得其中H2S的含量为19.72nmol/L，误差为2.3％，检测结果比较准确。
实施例2：
一种基于Au@Ag核壳纳米粒子电化学检测硫化氢的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)Au@Ag核壳纳米粒子的制备；方法同实施例1步骤(1)；
(2)Au@Ag核壳纳米粒子修饰玻碳电极的制备；方法同实施例1步骤(2)；
(3)硫化氢的电化学检测；方法同实施例1步骤(3)；
(4)Hela细胞中内源性硫化氢的检测：将100μL浓度为2mmol/L的半胱氨酸加入到1mL浓度为106/mL的Hela细胞中，将其在37℃温育90分钟后在-80℃和37℃条件下反复冻融三次裂解细胞，离心后取上清液定容到1mL后冷藏备用，取100μL定容后细胞裂解液用传统亚甲蓝法测得其中H2S的含量为73.32μmol/L，稀释10000倍后使用上述基于Au@Ag核壳纳米粒子的电化学方法对Hela细胞中内源性的硫化氢进行检测，测得其中H2S的含量为6.95nmol/L，误差为5.2％，检测结果比较准确。
实施例3：
一种基于Au@Ag核壳纳米粒子电化学检测硫化氢的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)Au@Ag核壳纳米粒子的制备；方法同实施例1步骤(1)；
(2)Au@Ag核壳纳米粒子修饰玻碳电极的制备；方法同实施例1步骤(2)；
(3)硫化氢的电化学检测；方法同实施例1步骤(3)；
(4)Hela细胞中内源性硫化氢的检测：将100μL浓度为5mmol/L的半胱氨酸加入到1mL浓度为106/mL的Hela细胞中，将其在37℃温育90分钟后在-80℃和37℃条件下反复冻融三次裂解细胞，离心后取上清液定容到1mL后冷藏备用，取100μL定容后细胞裂解液用传统亚甲蓝法测得其中H2S的含量为120.55μmol/L，稀释2000倍后使用上述基于Au@Ag核壳纳米粒子的电化学方法对Hela细胞中内源性的硫化氢进行检测，测得其中H2S的含量为62.34nmol/L，误差为3.4％，检测结果比较准确。

Claims (9)

1.一种基于Au@Ag核壳纳米粒子电化学检测硫化氢的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)Au@Ag核壳纳米粒子的制备；
(2)Au@Ag核壳纳米粒子修饰玻碳电极的制备；
(3)硫化氢的电化学检测；
(4)Hela细胞中内源性硫化氢的检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Au@Ag核壳纳米粒子的制备方法为：在室温下，将金纳米粒子溶液、磷酸盐缓冲液、聚乙烯吡咯烷酮溶液与抗坏血酸溶液按比例混合，之后再加入硝酸银溶液，避光反应3h，离心水洗，制得Au@Ag核壳纳米粒子，之后定容形成Au@Ag核壳纳米粒子水溶液备用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述金纳米离子的粒径为17.8±1.8nm；所述金纳米粒子溶液的粒子浓度为1×10-8mol/L；所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量浓度为0.5～5％，体积用量为400～4000μL；所述抗坏血酸溶液的摩尔浓度为0.05～0.2mol/L，体积用量为500～2000μL；所述硝酸银溶液的摩尔浓度为1～5mmol/L，体积用量为0.1～10mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Au@Ag核壳纳米粒子修饰玻碳电极的制备方法为：
①首先采用三氧化二铝抛光粉对裸玻碳电极进行抛光处理，用乙醇与超纯水超声清洗30～60s，洗净后用氮气吹干；
②然后利用循环伏安法在干净的玻碳电极表面电镀上对氨基苯磺酸；将电镀好的电极浸入五氯化磷溶液中活化5～30分钟后取出清洗干净；
③最后在修饰好的电极表面滴涂Au@Ag核壳纳米粒子水溶液，静置后用水冲洗掉多余未连接的粒子晾干备用。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述三氧化二铝抛光粉的粒径为1.0μm、0.5μm或0.3μm；所述循环伏安法电镀对氨基苯磺酸的体系为三电极体系，其参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极；所述循环伏安法电镀对氨基苯磺酸的扫描范围为-0.5～0.5V，扫描速度为100mV/s，扫描时间为30分钟；所述对氨基苯磺酸溶液的摩尔浓度为5～50mmol/L，体积用量为1～4mL；所述五氯化磷溶液的摩尔浓度为10～100mmol/L，体积用量为1～4mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫化氢的电化学检测方法为：
将Au@Ag核壳纳米粒子修饰玻碳电极浸入到磷酸缓冲液和硫化钠溶液的混合溶液中反应30分钟，经超纯水冲洗干净后用作工作电极，利用差分脉冲伏安法检测Au@Ag核壳纳米粒子的电化学氧化峰强度变化，以硫化氢浓度的对数值为横坐标，所得的电化学氧化峰电流值为纵坐标，绘制标准曲线。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L；所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；所述混合溶液的体积为100μL，硫化钠溶液的摩尔浓度为0.05～100000nmol/L；所述电化学检测体系为三电极体系，其参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极；所述差分脉冲伏安法检测的扫描范围为-0.2～0.6V；扫描速度为4mV/s；所述差分脉冲伏安法使用磷酸盐缓冲液的体积为2mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Hela细胞中内源性硫化氢的检测方法是：
将100μL不同浓度的半胱氨酸分别加入到1mL含有Hela细胞的磷酸钾缓冲液中，37℃条件下，温育90min之后反复冻融裂解细胞，离心后取上清液定容到1mL冷藏备用，最后对定容后的细胞裂解液用差分脉冲伏安法进行检测，根据标准曲线判断检测液中硫化氢的浓度。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有Hela细胞的磷酸钾缓冲液中Hela细胞的浓度为106个/mL，磷酸缓冲液的浓度为50mmol/L；所述半胱氨酸的摩尔浓度为1～5mmol/L；所述反复冻融的温度分别为-80℃、37℃，反复冻融的次数大于3次；用于差分脉冲伏安法检测的细胞分解液的体积为100μL。
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