CN108931643A - 一种检测流感病毒抗体的试纸条或检测卡 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测流感病毒抗体的试纸条或检测卡，该试纸条或检测卡利用昆虫杆状病毒表达系统表达的H5N1禽流感病毒NP蛋白作为检测抗原，以双抗原夹心法进行检测，本发明的试纸条或检测卡可用于A型流感病毒感染时产生的抗体的检测或评价注射流感疫苗后的接种效果。本发明的试纸条或检测卡具有灵敏、稳定、快速，制备方法简单等优点，可在商业上进行推广使用。

Description

一种检测流感病毒抗体的试纸条或检测卡

技术领域

本发明涉及生物技术领域，利用昆虫杆状病毒表达系统表达H5N1流感病毒NP蛋白，纯化后作为诊断用抗原建立胶体金试纸条或检测卡。

背景技术

流感病毒(AIV)属于正黏病毒科流感病毒属，是单股负链RNA病毒，基因组由8个RNA片段组成。依据NP和M1蛋白的不同，流感病毒分为甲型、乙型和丙型，即A、B、C型。根据病毒表面糖蛋白HA和NA的抗原差异可以分为18个HA亚型和11个NA亚型。根据宿主源，甲型流感病毒可以分类为禽流感、猪流感或其它类的动物流感病毒，包括甲型H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2等亚型。

1997年在中国香港，首次报告了人感染高致病性H5N1禽流感病毒并引起死亡的病例。从2003年以来，H5N1禽流感病毒已经从亚洲传播到欧洲和非洲，并导致数百万家禽感染，并引数百人感染和死亡病例。2003年到2017年，全球共16个国家发生H5N1人感染病例，共感染859人，死亡453人，死亡率53％，感染人数由多到少依次有：埃及、印尼、越南、柬埔寨、中国(53例)和泰国。家禽中的疫情严重影响了人民生计、经济和国际贸易。对于禽流感病毒，人类感染的首要危险因素似乎是直接或间接暴露于受感染活禽或病死禽类或污染环境中，例如活禽市场。屠宰受感染禽类、拔毛和处理尸体及制备供食用的禽类，尤其是在家庭环境中，也很有可能成为危险因素。少数甲型H5N1流感人感染病例与生食受到污染的禽类血液菜肴相关，控制禽流感病毒在家禽中流行对减少人类感染的风险至关重要。

建立一种快速诊断方法对于防控流感的流行有重要帮助，流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)为主要抗原，但变异较快，核蛋白(NP)具有型和种群特异性，可作为流感分型和诊断的基础。在昆虫杆状病毒表达系统中表达的NP蛋白具有生物活性高，蛋白表达后具有良好的修饰加工，磷酸化、糖基化等反应，抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似等优点。利用表达纯化的NP蛋白作为检测抗原，可对感染流感病毒的野生动物(虎)、禽类、人中的抗体进行检测，利用双抗原夹心法建立胶体金检测卡的诊断方法，该检测卡具有灵敏、稳定、快速，制备方法简单等优点。

发明内容

本发明的目的是之一在于提供一种利用昆虫杆状病毒表达系统制备H5N1亚型禽流感病毒NP蛋白的方法。

本发明的目的之二在于提供一种利用上述纯化的NP蛋白制备的胶体金试纸条或检测卡。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种流感病毒NP蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)通过PCR方法获得流感病毒NP蛋白编码基因；

(2)将NP蛋白编码基因克隆到杆状病毒载体中，转化昆虫细胞以表达NP蛋白；

(3)采用亲和层析方法对NP蛋白进行纯化，从而得到流感病毒NP蛋白。

本发明的流感病毒NP蛋白，其编码基因序列如SEQ ID NO：1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的杆状病毒载体可以选自：pFastBac 1,pFastBac Dual,pFastBac HT等.；在本发明的具体实施方案中，所述杆状病毒载体为pFastBac 1。

本发明的昆虫细胞可以选自：sf9,sf21,High Five等；在本发明的具体实施方案中，所述昆虫细胞为sf9细胞。

本发明的亲和层析方法可以选自：Nickel亲和层析法，NP抗体亲和层析法，离子交换层析等，在本发明的具体实施方案中，所述亲和层析方法为Nickel亲和层析法。

进一步，所述Nickel亲和层析法具体包括如下步骤：P3代病毒以感染复数为1，感染Sf9悬浮细胞，病毒上清接种时的细胞密度为2×10⁶个/ml，接毒后72h收获细胞，用裂解液裂解细胞，离心得到上清，上Nickel亲和柱，用含有150mM NaCL和25mM咪唑的20mM PB洗去非特异性结合蛋白，之后改用含有150mM NaCL和250mM咪唑的20mM PB收获特异性结合蛋白，此蛋白即为NP蛋白。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种前面所述的制备方法制备的流感病毒NP蛋白。

根据本发明的又一方面，本发明提供了前面所述的流感病毒NP蛋白在制备检测流感病毒抗体的产品中的应用。进一步，所述流感病毒是A型流感病毒。

根据本发明的又一方面，本发明提供了前面所述的流感病毒NP蛋白在制备检测评价流感疫苗接种效果的产品中的应用。进一步，所述流感疫苗是A型流感疫苗。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种检测流感病毒抗体的产品，所述产品包括前面所述的流感病毒NP蛋白。

进一步，所述产品是检测流感病毒抗体的试纸条或检测卡。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种评价流感疫苗接种效果的产品，所述产品包括前面所述的流感病毒NP蛋白。

进一步，所述产品是评价流感疫苗接种效果的试纸条或检测卡。

进一步，所述试纸条或检测卡包括底板、放置在所述底板上的样品垫、灌注有标记物标记的抗原的结合垫、含有检测线T和质控线C的反应垫、吸水垫。

更进一步，所述检测线T由抗原形成。

在本发明的具体实施方案中，所述抗原是H5N1亚型流感病毒的NP蛋白。

优选地，所述结合垫上NP蛋白的标记量是6.0μg。

更进一步，所述标记物包括胶体金、胶体银、或胶体硒。

优选地，所述标记物是胶体金；更优选地，所述胶体金微粒直径为18-25nm。

更进一步，所述质控线C为鼠抗NP单克隆抗体。

更进一步，所述结合垫的材质是玻璃纤维素膜，在本发明的具体实施方案中，所述结合垫是由GF-06玻璃纤维膜制备而成。

更进一步，所述样品垫的材质是玻璃纤维素膜，在本发明的具体实施方案中，所述结合垫是由GF-08玻璃纤维膜制备而成。

更进一步，所述反应垫的材质是NC膜。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种前面所述的试纸条或检测卡的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)制备所述灌注有标记物标记的抗原的结合垫；

(2)制备含有检测线T和质控线C的反应垫；

(3)在底板上，将所述反应垫、所述样品垫、所述结合垫、所述吸水垫等按如下工艺组装在一起：所述反应垫的底面粘贴在所述底板上面，在所述反应垫的两端上分别粘贴所述结合垫和所述吸水垫，在所述结合垫的另一端粘贴所述样品垫。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种检测流感病毒抗体的方法，所述方法包括如下步骤：利用前面所述的试纸条或检测卡检测包含流感病毒抗体的样品。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种评价流感疫苗接种效果的方法，所述方法包括如下步骤：利用前面所述的试纸条或检测卡检测包含流感病毒抗体的样品。

优选地，本发明的包含流感病毒抗体的样品指的是包含A型流感病毒抗体的样品。所述A型流感病毒包括H5N1、H7N9等。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的试纸条或检测卡在制备检测流感病毒抗体的产品中的应用。

进一步，所述流感病毒是A型流感病毒。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的试纸条或检测卡在制备评价流感疫苗接种效果的产品中的应用。

进一步，所述流感疫苗是A型流感疫苗。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明利用昆虫杆状病毒表达系统制备的NP蛋白生物活性高，蛋白表达后具有良好的修饰加工，磷酸化、糖基化等反应，抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似等优点。

(2)利用表达纯化的NP蛋白作为检测抗原，可对感染流感病毒的野生动物(虎)、禽类、人中的抗体进行检测，利用双抗原夹心法建立的胶体金试纸条或检测卡具有灵敏、稳定、快速，制备方法简单等优点。

附图说明

图1显示pFastBac1-H5N1NP酶切验证的电泳图；其中，1：Marker 5,000；2：空载体酶切产物；3和4：pFastBac1-H5N1NP酶切产物；

图2显示H5N1NP蛋白镍柱纯化后的SDS-PAGE电泳图和和Western Blot鉴定图；其中，A：SDS-PAGE电泳图，B：Western Blot鉴定图；1：Marker；2：细胞裂解液；3：流穿液；4-6：25mM咪唑洗涤液；7：50mM咪唑洗涤液；8：100mM咪唑洗涤液；9-10：250mM咪唑洗脱液；

图3显示H5N1NP蛋白胶体金检测卡的结构示意图；

图4显示本发明的胶体金检测卡特异性检测结果图；1：马阴性血清；2：马H5N1阳性血清；3：马H7N9阳性血清；4：马细小病毒阳性血清；

图5显示本发明胶体金检测卡灵敏度检测结果图；1：鸡阴性血清；2-7：H5N1Re8鸡禽流感阳性血清2¹-2⁶倍比稀释；

图6显示双抗体夹心法对比检测卡特异性检测结果图；1：pH 7.0，Re8待测组；2：pH7.5，Re8待测组；3：pH 8.0，Re8待测组；4：阴性组；

图7显示间接法对比检测卡特异性检测结果图；1：样品稀释液；2：鸡H5N1阴性血清；3：鸡H5N1阳性血清；4：鸡H5N1阳性血清2倍稀释。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。H5N1 A/meerkat/Shanghai/2012(SH-1)，2.3.2.1由中国人民解放军军事科学研究院军事医学研究院军事兽医研究所提供。

H5N1 Re8鸡禽流感阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司，犬H3N2阳性血清、马H5N1阳性血清、马H7N9阳性血清、马细小病毒阳性血清由中国人民解放军军事科学研究院军事医学研究院军事兽医研究所提供。

H5N1 Re8鸡禽流感阳性血清血凝抑制效价为2⁴。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 H5N1 NP蛋白的表达、纯化与鉴定

1、材料和方法

主要试剂：E.coli DH5α和E.coli DH10Bac由本实验室保存，供体质粒pFastBacl购自Invitrogen公司，重组质粒H5N1 NP基因测序和引物合成(EcoR I和Not I)等技术服务由金唯智公司提供。昆虫细胞转染试剂盒购自Invitrogen公司，核酸内切酶购自NEB公司，基因组提取试剂盒购自AXYGEN公司，Sf-900ⅡSFM购自Gibco公司。

2、H5N1 NP pFastBac1载体构建：从H5N1A/meerkat/Shanghai/2012(SH-1)，2.3.2.1中提取总RNA，将提取出来的总RNA反转录为cDNA，合成NP基因序列引物H5N1NP F:CCGGAATTCATGGCGTCCCAAGGCACCAA(EcoR1)(SE

ID NO：3)，H5N1NP R:TATGCGGCCGCTTAGTGATGATGGTGGTGATGATTGTCATACTCCTCTG(NotI)(SE ID NO：4)，用PCR方法(95℃5min后，95℃30s，56℃90s，72℃1分钟共30个循环)，扩增出NP基因，将得到的NP基因根据EcoR1和NotI酶切位点克隆到质粒pFastBac1中，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板过夜培养。筛选阳性菌，提质粒PCR、测序和酶切鉴定，酶切鉴定结果正确，如图1所示。以含有NP基因的pFastBac1质粒转化DH10Bac感受态细胞，从细菌生长产生的蓝白斑菌落中，挑选白斑，提质粒PCR鉴定正确。

3、H5N1 NP蛋白表达：将鉴定阳性结果Bacmid用Cellreagent转染试剂盒，转入sf9细胞，27℃培养三天后，收集细胞培养上清P1，将P1按2％的体积接种到新的sf9细胞中，继续培养，用以扩增病毒毒力，培养三天，收集P2代上清，将P2按2％的体积接种到新的sf9细胞中，继续培养三天后，收集P3代上清。提取P3代上清中DNA PCR验证，并观察记录P3细胞形态变化。同时，对P3代细胞进行表达鉴定，用带HRP的His抗体进行western blot验证，发现在55kD～70KD之间有反应条带，表明NP蛋白得到正确表达。

4、H5N1 NP蛋白纯化和鉴定：P3代病毒以感染复数为1感染sf9悬浮细胞，病毒上清接种时的细胞密度为2×10⁶个/ml，接毒后72h收获细胞，用裂解液裂解细胞，离心得到上清，上Nickel亲和柱，用20mM PB(150mM NaCL，25mM咪唑)洗去非特异性结合蛋白，之后改用20mM PB(150mM NaCL，250mM咪唑)收获特异性结合蛋白，此蛋白即为NP蛋白，NP蛋白纯化后进行SDS-PAGE和WB鉴定结果正确，如图2所示。

实施例2 H5N1亚型禽流感病毒NP蛋白胶体金检测卡的制备

1、材料和方法

主要试剂：SDS购自aladdin公司、PEG-20000购自源叶生物、四氯化金购自amresco公司、柠檬酸三钠购自Sigma公司、羊抗鼠二抗购自Boster公司、底板购自上海杰一生物技术有限公司、NC膜购自密理博公司、玻璃纤维购自上海捷宁生物公司、禽流感病毒H5亚型(Re-8株)阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司，甲型流感NP抗体购自Abcam公司。

2、胶体金溶液的制备

(1)配制1％的四氯化金：取100μl浓度为10％的四氯化金母液，加入900ul超纯水，混合均匀，备用；

(2)称取0.02g柠檬酸钠溶于2mL超纯水中，震荡均匀，用0.45μm的滤膜过滤后，即为1.5％柠檬酸钠溶液，备用；

(3)锥形瓶中加入80mL超纯水，加热至有油珠状升起时，加入1％的四氯化金1mL，继续加热至沸腾时，加入1％的柠檬酸三钠1mL，此时锥形瓶内溶液颜色很快变蓝，煮7min，至溶液由蓝色变为酒红色，拿下锥形瓶。自然冷却，用容量瓶定容至100mL，4℃备用。

胶体金的粒径为15-28nm。

3、金标NP抗原的制备

采用10％NaCl的颜色反应以确定NP蛋白和胶体金结合的最佳pH以及最佳标记pH。由于不同蛋白所带电荷的不同，当溶液的pH使蛋白表面净电荷为零，此时的pH值就是等电点。研究表明，在等电点附近，蛋白整体不带电，不带电的蛋白此时处于疏水状态，更易和胶体金蛋白和胶体金之间能形成牢固的结合物。设计实验如下表1，通过加入不同体积的K₂CO₃来改变溶液pH，观察溶液颜色变化，来判定保护效果的好坏，结果显示最佳标记pH为7.5。

表1优化NP蛋白的最佳pH

同理，当胶体金表面结合的蛋白量足够的时候，就在胶体金表面形成一层稳定的保护层，阻止10％NaCl的加入通过改变胶体金表面的电子层而使胶体金发生聚沉。而当加入过量蛋白的时候，因为胶体金表面的结合位点都被占满了，胶体金无法进一步的结合蛋白，浪费标记蛋白的同时，因为大量蛋白的加入，也提高了整个体系的不稳定性。摸索最佳标记量的实验设计如下表2，本实验是在上步最佳pH的条件下进行的，NP蛋白最佳标记量为6.0μg。

表2优化NP蛋白的最佳标记量

4、胶体金检测卡的组装

H5N1 NP蛋白禽流感病毒抗体检测胶体金检测卡，利用双抗原夹心法，C线浓度为1.2mg/ml的NP单抗，T线浓度为0.35mg/ml的NP抗原，结合垫处是标记量为6.0μg的金标NP抗原，待测样品流感阳性血清。所述检测卡由反应垫、样品垫、结合垫、吸水垫和底板(PVC胶板)等构成。将NC膜置于B工ODOTXYZ喷点系统(XYZ3200)平台上展平压紧，将0.35mg/mlH5N1 NP抗原放于A池点射于NC膜上，形成检测线(T)，将1.2mg/ml NP抗体放于A池点射于NC膜上，形成质控线(C)，37℃烘干后，加入干燥剂，4℃密封保存，得到含有检测线(T)和质控线(C)的反应垫。

将12.0μL 1M的碳酸钾溶液加入已制备好的1mL胶体金溶液，混匀后测得其pH值为最佳pH值7.5；加入6.0μg NP蛋白标记，室温混匀30min，使NP蛋白与胶体金颗粒充分结合。标记完成后，向溶液里加入0.01g BSA，室温混匀30min，使胶体金粒子上的裸露位点充分封闭，将已封闭的溶液10000rpm离心10min，小心弃去上清，沉淀用120μL工作液重悬，均匀的铺在GF-06玻璃纤维膜上(2.8mm×75mm)在温度为37℃的鼓风干燥箱中干燥3h，使NP蛋白固定在玻璃纤维膜上。干燥完成后，加入干燥剂，4℃密封保存结合垫。

把GF-08玻璃纤维膜裁剪为220mm×100mm的规格，浸泡在样品垫处理液中5min，去多余液体，置于37℃鼓风干燥箱中干燥12h，取出样品垫，放入自封袋中备用。

在底板上，将反应垫、样品垫、结合垫、吸水垫等按如下工艺组装在一起(如图3所示)：反应垫的底面粘贴在底板上面，在该反应垫的两端上分别粘贴结合垫和吸水垫在该玻璃纤维膜的另一端粘贴样品垫，叠压宽度为2mm用切割机制成3.5mm宽的检测卡，刚入带干燥剂的密闭容器中储存，得到胶体金免疫层析检测卡。

实施例3胶体金免疫层析检测卡的特异性和灵敏度检测

1、特异性检测

以马阴性血清、马H5N1阳性血清、马H7N9阳性血清、马细小病毒阳性血清为待测样品，用由实施例2制备的胶体金免疫层析检测卡进行检测，检测方法如下：将检测卡平放，取200μL待处理样品，滴加到检测卡的样品孔中，任其沿着检测卡自由扩散，15min内观察结果。

结果如图4所示：马H5N1阳性血清、马H7N9阳性血清、在T线和C线位置同时出现两条深色反应带，结果判定为阳性；马阴性血清、马细小病毒阳性血清呈阴性反应，说明本发明的检测卡具有高度的特异性。

2、灵敏度检测

以无流感感染和疫苗免疫的鸡血清做阴性对照，H5N1 Re8禽流感鸡阳性血清做2¹-2⁶倍比稀释，用由实施例2制备的胶体金免疫层析检测卡按照如下步骤的方法进行检测。

结果如图5所示，2¹倍、2²倍、2³倍、2⁴倍、在T线和C线位置同时出现两条深色反应带，结果判定为阳性；2⁵倍、2⁶倍的样品只在C线位置出现一条深色反应带，结果判定为阴性。结果说明该检测卡的灵敏度为1:2⁴倍。

若检测线T处和质控线C处均出现两条深色反应带，结果判定为阳性，待测样品含有或候选含有流感病毒感染后产生的抗体或进行过流感疫苗免疫。

若仅有质控线C处出现一条深色反应带，结果判定为阴性；待测样品不含或候选不含流感病毒感染后产生的抗体或未进行过流感疫苗免疫。

其他情况，均为无效检测卡。

随机取出不同批次和批间的检测卡，进行不同亚型流感病毒阳性血清重复性试验，检测结果显示保存3个月之内检测卡效果良好，无特异性产生。

实施例4双抗体夹心法对比检测卡

H5N1NP蛋白禽流感病毒抗体检测双抗体夹心法胶体金检测卡，C线标记羊抗鼠IgG二抗(1mg/ml)，T线标记1mg/ml鼠源NP单抗，结合垫为金标NP抗原浓度为1mg/ml加入6μl，胶体金溶液的制备、胶体金检测卡的组装如实施例2所述，选取鸡禽流感毒株Re8阳性血清作为待测组，阴性血清为阴性组进行检测。为检测结合垫在最佳NP抗原标记量下，不同的标记pH进行实验，分别以pH 7.0，7.5，8.0进行标记。

结果如图6所示，若检测线T处和质控线C处均出现两条深色反应带，结果判定为阴性；若仅有质控线C处出现一条深色反应带，结果判定为阳性。阴性组C线和T线均明显显现。对于不同pH下的待测组，C线均显现，T线可以看到微弱的条带，显示假阳性，降低金标NP抗原的包被量为3μg时，依然显示假阳性，表明H5N1 NP抗原通过双抗体夹心法建立的胶体金检测卡时特异性较差。

实施例5间接法对比检测卡

H5N1 NP蛋白禽流感病毒抗体检测双抗体夹心法胶体金检测卡，C线标记羊抗鼠二抗(1mg/ml)标记3μg，T线标记1mg/ml鼠源NP单抗，结合垫为金标鼠抗鸡抗体(博奥森)浓度为2mg/ml加入3μg，胶体金溶液的制备、胶体金检测卡的组装如实施例2所述，选取鸡禽流感毒株Re8阳性血清作为待测组，阴性血清为阴性组进行检测。

结果如图7所示，若检测线T处和质控线C处均出现两条深色反应带，结果判定为阳性；若仅有质控线C处出现一条深色反应带，结果判定为阴性。鸡禽流感毒株Re8阳性血清组C线和T线均明显显现；空白组和阴性血清组C线显现，T线可以看到微弱的条带，显示假阳性，降低金标NP抗原的包被量和PH值，依然显示假阳性，表明H5N1 NP抗原通过间接法建立的胶体金检测卡时特异性较差。

与实施例4建立的双抗体夹心法对比检测卡和实施例5建立的间接法对比检测卡相比，双抗原夹心法胶体金检测卡具有较高的特异性和灵敏性，因此，用实施例3建立的双抗原夹心法胶体金检测卡能够检测或辅助检测待测样品是否感染流感病毒产生抗体或评价流感疫苗接种效果。

序列表

<110> 河南大学

<120> 一种检测流感病毒抗体的试纸条或检测卡

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1497

<212> DNA

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 1

atggcgtccc aaggcaccaa acgatcttat gaacagatgg aaactggtgg agagcgccag 60

aatgctactg agatcagggc atctgttgga agaatggtta gtggcattgg gaggttctac 120

atacagatgt gcacagaact caaactcagt gaccatgaag ggagactgat ccagaacagc 180

ataacaatag agagaatggt actttctgca tttgatgaaa gaaggaacag gtacctggaa 240

gagcacccca gtgcagggaa ggaccctaag aaaactggag gtccaattta tcggaggaga 300

gacgggaaat gggtgagaga gctgattctg tacgacaaag aagagatcag gaggatttgg 360

cgccaagcga acaatggaga ggacgcaact gctggcctta cccacctgat gatatggcat 420

tccaatctga atgatgccac atatcagaga acaagagctc tcgtgcgtac cggaatggac 480

cccaggatgt gctctctgat gcaaggatca actctcccga ggagatctgg agctgctggt 540

gcagcagtga agggggtagg aacaatggtg atggagctga ttcgaatgat aaaacgaggg 600

attaacgacc ggaatttctg gagaggcgaa aatggaagaa gaacaaggat tgcatatgag 660

agaatgtgca acatcctcaa agggaaattc caaacagctg cacaaagagc aatgatggat 720

caagtgcgag agagcagaaa tcctgggaat gctgaaattg aagatctcat ttttctggca 780

cggtctgcac tcatcctgag aggatcagtg gcccataagt cctgcttgcc tgcttgtgtg 840

tacggacttg cagtggccag tgggtatgac ttcgagagag aaggatactc tctggttgga 900

atagatcctt tccgtctgct ccaaaacagc caggtcttta gtctcattag gccaaatgaa 960

aacccagcac ataagagtca attagtgtgg atggcatgcc actctgcagc atttgaggac 1020

ctcagagtct caagtttcat cagaggggca agagtggtcc caagagggca gctatccacc 1080

agaggggttc aaattgcttc aaatgagaac acggaaacaa tggactccaa cacccttgaa 1140

ctgagaagta gatattgggc tataagaacc aggagcggag ggaacaccaa ccagcagagg 1200

gcatctgcag ggcagatcag cgttcaaccc actttctcgg tacagagaaa ccttcccttc 1260

gaaagggcga ccattatggc agcatttaca ggaaatactg aaggtagaac gtccgacatg 1320

aggactgaaa tcataagaat gatggaaagt gccaaaccag aagatgtgtc attccaggga 1380

cggggtgtct tcgagctctc ggacgaaaag gcaacgaacc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440

atgaataatg aaggatctta tttcttcgga gacaatgcag aggagtatga caattaa 1497

<210> 2

<211> 498

<212> PRT

<213> 禽流感病毒(Avian influenza virus)

<400> 2

Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Gly

1 5 10 15

Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met

20 25 30

Val Ser Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys

35 40 45

Leu Ser Asp His Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu

50 55 60

Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Arg Tyr Leu Glu

65 70 75 80

Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile

85 90 95

Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp

100 105 110

Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp

115 120 125

Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn

130 135 140

Asp Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp

145 150 155 160

Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser

165 170 175

Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu

180 185 190

Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg

195 200 205

Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn

210 215 220

Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp

225 230 235 240

Gln Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu

245 250 255

Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His

260 265 270

Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Ala Ser Gly

275 280 285

Tyr Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe

290 295 300

Arg Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Phe Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu

305 310 315 320

Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala

325 330 335

Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Ala Arg Val

340 345 350

Val Pro Arg Gly Gln Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn

355 360 365

Glu Asn Thr Glu Thr Met Asp Ser Asn Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg

370 375 380

Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg

385 390 395 400

Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Arg

405 410 415

Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn

420 425 430

Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met

435 440 445

Glu Ser Ala Lys Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe

450 455 460

Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp

465 470 475 480

Met Asn Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr

485 490 495

Asp Asn

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaattca tggcgtccca aggcaccaa 29

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatgcggccg cttagtgatg atggtggtga tgattgtcat actcctctg 49

Claims (10)

1.一种流感病毒NP蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)通过PCR方法获得流感病毒NP蛋白编码基因；

(2)将NP蛋白编码基因克隆到杆状病毒载体中，转化昆虫细胞以表达NP蛋白；

(3)采用亲和层析方法对NP蛋白进行纯化，从而得到流感病毒NP蛋白；

优选地，所述杆状病毒载体为pFastBac 1；

优选地，所述昆虫细胞为sf9细胞；

优选地，所述亲和层析方法为Nickel亲和层析法；更优选地，所述Nickel亲和层析法具体包括如下步骤：P3代病毒以感染复数为1，感染Sf9悬浮细胞，病毒上清接种时的细胞密度为2×10⁶个/ml，接毒后72h收获细胞，用裂解液裂解细胞，离心得到上清，上Nickel亲和柱，用含有150mM NaCL和25mM咪唑的20mM PB洗去非特异性结合蛋白，之后改用含有150mMNaCL和250mM咪唑的20mM PB收获特异性结合蛋白，此蛋白即为NP蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述NP蛋白的编码基因序列如SEQ IDNO：1所示，所述NP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种利用权利要求1或2所述的制备方法制备的流感病毒NP蛋白。

4.权利要求3所述的流感病毒NP蛋白在制备检测流感病毒抗体或评价流感疫苗接种效果的产品中的应用，优选地，所述产品包括试纸条，或检测卡。

5.一种检测流感病毒抗体或评价流感疫苗接种效果的产品，其特征在于，所述产品包括试纸条，或检测卡；所述试纸条或检测卡包括底板、放置在所述底板上的样品垫、灌注有标记物标记的抗原的结合垫、含有检测线T和质控线C的反应垫、吸水垫。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述检测线T由抗原形成。

7.根据权利要求5或6所述的产品，其特征在于，所述抗原是H5N1亚型流感病毒的NP蛋白，优选地，所述结合垫上NP蛋白的标记量是6.0μg。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的产品，其特征在于，所述标记物包括胶体金、胶体银、或胶体硒；优选地，所述标记物是胶体金；更优选地，所述胶体金微粒直径为18-25nm。

9.根据权利要求5-9中任一项所述的产品，其特征在于，所述质控线C为鼠抗NP单克隆抗体。

10.权利要求5-9中任一项所述的产品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)制备所述灌注有标记物标记的抗原的结合垫；

(2)制备含有检测线T和质控线C的反应垫；

(3)在底板上，将所述反应垫、所述样品垫、所述结合垫、所述吸水垫等按如下工艺组装在一起：所述反应垫的底面粘贴在所述底板上面，在所述反应垫的两端上分别粘贴所述结合垫和所述吸水垫，在所述结合垫的另一端粘贴所述样品垫。