CN105288609A - 一种基于杆状病毒表达系统的禽流感病毒疫苗制备方法 - Google Patents
一种基于杆状病毒表达系统的禽流感病毒疫苗制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105288609A CN105288609A CN201510672182.1A CN201510672182A CN105288609A CN 105288609 A CN105288609 A CN 105288609A CN 201510672182 A CN201510672182 A CN 201510672182A CN 105288609 A CN105288609 A CN 105288609A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- vaccine
- avian influenza
- protein gene
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种基于杆状病毒表达系统的禽流感病毒疫苗制备方法，该方法以NP蛋白和HA蛋白共同作为疫苗抗原，由于NP蛋白具有高度的保守性，因此能够诱导产生交叉保护作用，抵抗同型或异型流感病毒的攻击。在此基础上，选用杆状病毒表达系统，其基因组大，可容纳大片段的目的基因，表达量高，安全性好，可以对蛋白进行翻译后修饰。本发明意在利用杆状病毒表达系统，同时表达流感病毒的HA和NP，从而提供一种新型的安全、有效的流感病毒疫苗。利用本发明制备的疫苗其免疫效果好，制备效率高，具有突出的推广前景。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，具体涉及一种基于杆状病毒表达系统的禽流感病毒疫苗制备方法。
背景技术
禽流感(AvianInfluenza)是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被国际兽疫局定为Ⅰ类传染病。本病发病急骤，一旦感染将给养殖业带来重大的经济损失，成为危害畜牧业发展的重大疫病之一。疫苗免疫接种是预防本病的有效措施。
目前大量使用的是鸡胚生产的全病毒灭活疫苗，使用矿物油佐剂，利用皮下或肌肉接种方式免疫动物。这种疫苗的生产依赖于大量的鸡胚，并且在新毒株出现的时候很难根据疫情的变化做出迅速的反应，且不同毒株之间交叉保护性较差，这使得疫苗株不得不经常更新，增大了禽流感疫情的防控难度。矿物油佐剂难于吸收，操作难度大。研制一种安全性好、能够同时抵御不同抗原群病毒攻击的“通用型”禽流感疫苗成为当前AIV疫苗研究的新热点。
现有技术的禽流感疫苗多以禽流感病毒HA蛋白作为抗原，虽然能够诱导产生中和抗体，但由于HA易发生突变，因此难以保证疫苗的有效性。此外，现有技术的抗原表达效率较低，从而限制了制备效率。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种基于杆状病毒表达系统的禽流感病毒疫苗制备方法，已解决现有技术疫苗制备方法免疫效果不佳的技术问题。
本发明解决的另一技术问题是现有技术疫苗制备方法因抗原性能不完善从而导致免疫效果不佳的技术问题。
本发明解决的再一技术问题是现有技术的疫苗制备方法中抗原表达效率较低。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种禽流感疫苗制备方法，包括以下步骤：
1)制备含有禽流感病毒HA蛋白和NP蛋白的抗原；
2)以步骤1)所述的抗原制备禽流感疫苗。
优选的，步骤1)具体包括以下步骤：
a)分别提取禽流感病毒HA蛋白基因和NP蛋白基因；
b)将步骤a)得到的HA蛋白基因和NP蛋白基因连接到pFastBacDual载体上得到重组质粒，而后将所述重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞，再筛选得到重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid；
c)将所述重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid转染Sf9昆虫细胞，表达，取细胞培养液上清，即得到含有禽流感病毒HA蛋白和NP蛋白的抗原。
优选的，所述禽流感病毒是H9N2禽流感病毒。
优选的，步骤a)中对HA蛋白基因或NP蛋白基因的提取是先提取其RNA，而后反转录得到相应的cDNA，再利用PCR方法扩增得到HA蛋白基因或NP蛋白基因。
优选的，步骤c)所述的表达，是在25～30℃条件下孵育60～96h。
优选的，步骤b)中所述的筛选，是先后利用卡那霉素、庆大霉素和四环素进行筛选。
优选的，步骤c)是利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达HA蛋白和NP蛋白。
优选的，所述疫苗的接种方式是滴鼻免疫。
优选的，所述疫苗的接种剂量是：每羽份中含有20ugNP蛋白和29血凝滴度的HA蛋白。
优选的，步骤c)中表达后，当细胞病变达75％以上时取细胞培养液上清。
在以上技术方案中，步骤2)所述的制备禽流感疫苗，是在利用本发明所制备的抗原基础上，以公知技术制备疫苗，具体的操作内容依照本技术领域的常规方法执行。所述pFastBacDual载体是指invitrogen公司出品的pFastBacDual载体，可自市面购得。
本发明以NP蛋白和HA蛋白共同作为疫苗抗原，由于NP蛋白具有高度的保守性，因此能够诱导产生交叉保护作用，抵抗同型或异型流感病毒的攻击。在此基础上，选用杆状病毒表达系统，其基因组大，可容纳大片段的目的基因，表达量高，安全性好，可以对蛋白进行翻译后修饰。本发明意在利用杆状病毒表达系统，同时表达流感病毒的HA和NP，从而提供一种新型的安全、有效的流感病毒疫苗。利用本发明制备的疫苗其免疫效果好，制备效率高，具有突出的推广前景。
附图说明
图1是本发明实施例1中重组质粒酶切鉴定结果图；图中，1号区域为5000bpDNAMarker，2号区域为HA基因，3号区域为5000bpDNAMarker，4号区域为NP基因。
图2是本发明实施例1中western-blotting结果图；图中，1号区域为proteinmarker，2号区域为NP蛋白，3号区域为proteinmarker，4号区域为HA蛋白。
图3是本发明实施例1中HI抗体检测结果图。
图4是本发明实施例1中IFN-γ检测结果图。
图5是本发明实施例1中针对H9亚型禽流感的ELISA-MVN实验结果图。
图6是本发明实施例1中针对H5亚型禽流感的ELISA-MVN实验结果图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1
1、HA和NP基因扩增
利用RNA提取试剂盒提取流感病毒的RNA，将其反转录为cDNA。利用各自的引物经PCR扩增获得流感病毒的HA和NP基因。
HA引物序列
上游：5’-GCGGATCCATGGAAACAATATCACTAATAAC-3’BamHⅠ
下游：5’-GCGGTCGACTTATATACAAATGTTGCATCTGC-3’SalⅠ
NP引物序列
上游：5'-CGCCTCGAGATGGCGTCTCAAGGCACCA-3’XhoI
下游：5’-CGGCTAGCTTAATTGTCATACTCCTCTGC-3’NheⅠ
2、重组病毒HA-NP-Bac获得
将HA和NP基因分别经BamHⅠ/SalⅠ,XhoI/NheⅠ酶切，克隆至pFastBacDual载体，小量提取质粒，分别进行双酶切(鉴定结果见图1)、PCR和测序鉴定。鉴定结果均为阳性的重组质粒命名为pFastBacDual-HA-NP。将重组质粒pFastBacDual-HA-NP转化到DH10Bac感受态细胞，经卡那霉素，庆大霉素和四环素三重抗生素筛选后，获得重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，转染Sf9昆虫细胞，27℃孵育72h～96小时，待细胞病变达75％以上时收获病毒。将细胞液以3500r/min离心10min，弃去细胞碎屑，所得上清即为p1代病毒原液HA-NP-Bac，利用western-blotting试验鉴定目的蛋白的表达，结果见图2。将P1代重组杆状病毒连续传3代，分别检测目的蛋白的表达及其表达量。
3、目的蛋白的定量
将收获的3代病毒分别按《中国兽药典》方法测定HA血凝滴度，利用BCA定量试剂盒说明测定总蛋白浓度，跑SDS-PAGE蛋白胶，利用蛋白纯度测定仪测定NP蛋白纯度，从而计算目的蛋白NP的浓度，测定结果见表1。
表1重组杆状病毒Bac-HA-NP定量结果
4、重组杆状病毒HA-NP-Bac的扩大培养及其纯化
以P2代重组杆状病毒为种毒，当sf9昆虫细胞处于对数生产期时(细胞密度为1～2×106细胞/ml)接种病毒，使病毒感染复数MOI为0.1。27℃培养72小时收获细胞液。
将细胞液反复冻融3次，3500r/min离心10分钟，弃去细胞碎屑。使用亲和层析介质Ni-NTA对目的蛋白进行纯化回收。具体过程为将细胞液用BindingBuffer稀释、上柱；再用BingdingBuffer冲洗柱子，去杂蛋白；ElutionBuffer洗脱，收集洗脱峰；洗脱后重生柱子。将纯化后的蛋白稀释至一定浓度，即可用于疫苗的安全检验和效力检验。
5、安全检验
将重组杆状病毒Bac-HA-NP定量后，通过滴鼻方式以2倍的免疫剂量免疫SPF鸡，未出现局部或全身不良反应。
6、效力检验
取SPF鸡40只，平均分为4组，每组10只鸡，按照表2进行疫苗的免疫。第1组：自制疫苗(滴鼻)；第2组：自制疫苗(皮下接种)；第3组：商品灭活苗(皮下接种)；第4组：Bacmid空载体(对照)
疫苗免疫后第14天，30天，45天，60天、75天、90天、105天和120天分别采血，分离血清，按照《中国兽药典》测定HI效价，利用鸡IFN-γELISA试剂盒测定疫苗诱导产生的IFN-γ。同时将血清进一步做酶联免疫的微量病毒中和试验(ELISA-MVN)，抗原分别为H9亚型禽流感和H5亚型禽流感标准抗原。效力检验结果见表2-4，图3～6。
表2疫苗免疫分组及免疫剂量
表3HI测定结果(nlog2)
表4IFN-γ测定结果(pg/ml)
表5中和抗体测定结果(H9亚型禽流感抗原-nlog2)
表6中和抗体测定结果(H5亚型禽流感抗原)
由以上结果可知，本发明制备的流感病毒疫苗Bac-HA-NP通过滴鼻免疫，能够较快的产生高水平抗体，并且抗体持续期与市场上商品苗相当。另外，本疫苗还可以诱导鸡只产生IFN-γ，即可以诱导产生细胞免疫反应。由中和试验结果证明本发明研制的疫苗能够同时中和H9和H5亚型禽流感病毒，即该疫苗可能能够诱导产生交叉保护作用，防止不同亚型流感病毒的攻击。
实施例2
一种禽流感疫苗制备方法，包括以下步骤：
a)分别提取禽流感病毒HA蛋白基因和NP蛋白基因；
b)将步骤a)得到的HA蛋白基因和NP蛋白基因连接到pFastBacDual载体上得到重组质粒，而后将所述重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞，再筛选得到重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid；
c)将所述重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid转染Sf9昆虫细胞，表达，取细胞培养液上清，即得到含有禽流感病毒HA蛋白和NP蛋白的抗原；
d)以步骤c)所述的抗原制备禽流感疫苗。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
所述禽流感病毒是H9N2禽流感病毒。
步骤a)中对HA蛋白基因或NP蛋白基因的提取是先提取其RNA，而后反转录得到相应的cDNA，再利用PCR方法扩增得到HA蛋白基因或NP蛋白基因。
步骤c)所述的表达，是在25℃条件下孵育60h。
步骤b)中所述的筛选，是先后利用卡那霉素、庆大霉素和四环素进行筛选。
步骤c)是利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达HA蛋白和NP蛋白。
所述疫苗的接种方式是滴鼻免疫。
所述疫苗的接种剂量是：每羽份中含有20ugNP蛋白和29血凝滴度的HA蛋白。
步骤c)中表达后，当细胞病变达75％以上时取细胞培养液上清。
实施例3
一种禽流感疫苗制备方法，包括以下步骤：
a)分别提取禽流感病毒HA蛋白基因和NP蛋白基因；
b)将步骤a)得到的HA蛋白基因和NP蛋白基因连接到pFastBacDual载体上得到重组质粒，而后将所述重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞，再筛选得到重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid；
c)将所述重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid转染Sf9昆虫细胞，表达，取细胞培养液上清，即得到含有禽流感病毒HA蛋白和NP蛋白的抗原；
d)以步骤c)所述的抗原制备禽流感疫苗。
在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
步骤a)中对HA蛋白基因或NP蛋白基因的提取是先提取其RNA，而后反转录得到相应的cDNA，再利用PCR方法扩增得到HA蛋白基因或NP蛋白基因。
步骤c)所述的表达，是在30℃条件下孵育96h。
所述疫苗的接种剂量是：每羽份中含有20ugNP蛋白和29血凝滴度的HA蛋白。
步骤c)中表达后，当细胞病变达75％时取细胞培养液上清。
实施例4
一种禽流感疫苗制备方法，包括以下步骤：
a)分别提取禽流感病毒HA蛋白基因和NP蛋白基因；
b)将步骤a)得到的HA蛋白基因和NP蛋白基因连接到pFastBacDual载体上得到重组质粒，而后将所述重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞，再筛选得到重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid；
c)将所述重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid转染Sf9昆虫细胞，表达，取细胞培养液上清，即得到含有禽流感病毒HA蛋白和NP蛋白的抗原；
d)以步骤c)所述的抗原制备禽流感疫苗。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种禽流感疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备含有禽流感病毒HA蛋白和NP蛋白的抗原；
2)以步骤1)所述的抗原制备禽流感疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)具体包括以下步骤：
a)分别提取禽流感病毒HA蛋白基因和NP蛋白基因；
b)将步骤a)得到的HA蛋白基因和NP蛋白基因连接到pFastBacDual载体上得到重组质粒，而后将所述重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞，再筛选得到重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid；
c)将所述重组穿梭质粒HA-NP-Bacmid转染Sf9昆虫细胞，表达，取细胞培养液上清，即得到含有禽流感病毒HA蛋白和NP蛋白的抗原。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述禽流感病毒是H9N2禽流感病毒。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤a)中对HA蛋白基因或NP蛋白基因的提取是先提取其RNA，而后反转录得到相应的cDNA，再利用PCR方法扩增得到HA蛋白基因或NP蛋白基因。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤c)所述的表达，是在25～30℃条件下孵育60～96h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤b)中所述的筛选，是先后利用卡那霉素、庆大霉素和四环素进行筛选。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤c)是利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达HA蛋白和NP蛋白。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述疫苗的接种方式是滴鼻免疫。
9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述疫苗的接种剂量是：每羽份中含有20ugNP蛋白和29血凝滴度的HA蛋白。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤c)中表达后，当细胞病变达75％以上时取细胞培养液上清。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510672182.1A CN105288609A (zh) | 2015-10-16 | 2015-10-16 | 一种基于杆状病毒表达系统的禽流感病毒疫苗制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510672182.1A CN105288609A (zh) | 2015-10-16 | 2015-10-16 | 一种基于杆状病毒表达系统的禽流感病毒疫苗制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105288609A true CN105288609A (zh) | 2016-02-03 |
Family
ID=55186880
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510672182.1A Pending CN105288609A (zh) | 2015-10-16 | 2015-10-16 | 一种基于杆状病毒表达系统的禽流感病毒疫苗制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105288609A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108931643A (zh) * | 2018-05-28 | 2018-12-04 | 河南大学 | 一种检测流感病毒抗体的试纸条或检测卡 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009068992A1 (en) * | 2007-11-26 | 2009-06-04 | Novartis Ag | Vaccination with multiple clades of h5 influenza a virus |
-
2015
- 2015-10-16 CN CN201510672182.1A patent/CN105288609A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009068992A1 (en) * | 2007-11-26 | 2009-06-04 | Novartis Ag | Vaccination with multiple clades of h5 influenza a virus |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 乔传玲等: "表达禽流感HA和NP双基因重组禽痘病毒的免疫保护性", 《畜牧兽医学报》 * |
| 赵双成等: "禽流感病毒H5亚型HA基因在杆状病毒系统中的表达及生物学活性鉴定", 《中国预防兽医学报》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108931643A (zh) * | 2018-05-28 | 2018-12-04 | 河南大学 | 一种检测流感病毒抗体的试纸条或检测卡 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Qiao et al. | Protection of chickens against highly lethal H5N1 and H7N1 avian influenza viruses with a recombinant fowlpox virus co-expressing H5 haemagglutinin and N1 neuraminidase genes | |
| Lu et al. | Cross-protective immunity in mice induced by live-attenuated or inactivated vaccines against highly pathogenic influenza A (H5N1) viruses | |
| Rockman et al. | Neuraminidase-inhibiting antibody is a correlate of cross-protection against lethal H5N1 influenza virus in ferrets immunized with seasonal influenza vaccine | |
| ES2636965T3 (es) | Partículas tipo virus de la glicoproteína de la rabia (VLPs) | |
| Tian et al. | Protective efficacy of the H5 inactivated vaccine against different highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses isolated in China and Vietnam | |
| Delva et al. | The attenuated pseudorabies virus vaccine strain Bartha K61: a brief review on the knowledge gathered during 60 years of research | |
| Kamlangdee et al. | Broad protection against avian influenza virus by using a modified vaccinia Ankara virus expressing a mosaic hemagglutinin gene | |
| Mooney et al. | Recombinant parainfluenza virus 5 vaccine encoding the influenza virus hemagglutinin protects against H5N1 highly pathogenic avian influenza virus infection following intranasal or intramuscular vaccination of BALB/c mice | |
| Lee et al. | Development and application of reference antisera against 15 hemagglutinin subtypes of influenza virus by DNA vaccination of chickens | |
| CN110305898A (zh) | 哺乳动物细胞非易感h9n2亚型冷适应禽流感病毒的拯救 | |
| Chen et al. | Efficacy of live-attenuated H9N2 influenza vaccine candidates containing NS1 truncations against H9N2 avian influenza viruses | |
| CN114891074A (zh) | 一种季节性甲型流感通用病毒样颗粒及其制备方法与应用 | |
| Ricklin et al. | Virus replicon particle vaccines expressing nucleoprotein of influenza A virus mediate enhanced inflammatory responses in pigs | |
| Naguib et al. | Heterologous post-infection immunity against Egyptian avian influenza virus (AIV) H9N2 modulates the course of subsequent infection by highly pathogenic AIV H5N1, but vaccination immunity does not | |
| Qiao et al. | Recombinant fowlpox virus vector-based vaccine completely protects chickens from H5N1 avian influenza virus | |
| Xue et al. | Incorporation of conserved nucleoprotein into influenza virus-like particles could provoke a broad protective immune response in BALB/c mice and chickens | |
| Firouzamandi et al. | Improved immunogenicity of Newcastle disease virus inactivated vaccine following DNA vaccination using Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase and fusion protein genes | |
| Hu et al. | Recombinant baculovirus vaccine expressing hemagglutinin of H7N9 avian influenza virus confers full protection against lethal highly pathogenic H7N9 virus infection in chickens | |
| CN105288609A (zh) | 一种基于杆状病毒表达系统的禽流感病毒疫苗制备方法 | |
| Xu et al. | Emerging of H5N6 subtype influenza virus with 129-glycosylation site on hemagglutinin in poultry in china acquires immune pressure adaption | |
| CN101610787B (zh) | 在培养物中复制流感病毒的方法 | |
| Abolnik et al. | Dose immunogenicity study of a plant-produced influenza virus-like particle vaccine in layer hens | |
| Yang et al. | Response of BALB/c mice to a monovalent influenza A (H1N1) 2009 split vaccine | |
| CN115894636A (zh) | 一种季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原及其疫苗和应用 | |
| Li et al. | Protective efficacy of an inactivated chimeric H5 avian influenza vaccine against H5 highly pathogenic avian influenza virus clades 2.3. 4.4 and 2.3. 2.1 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160203 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |