CN102262156B

CN102262156B - 一种柯萨奇病毒A16型（CA16）IgM抗体检测试纸条

Info

Publication number: CN102262156B
Application number: CN201110151062.9A
Authority: CN
Inventors: 刘明
Original assignee: BEIJING ZHUANGDI HAOHE BIOMEDICINE SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Liaoning Di Hao Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2011-06-07
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2031-06-07
Also published as: CN102262156A

Abstract

本发明提供了一种用于检测柯萨奇病毒A16型(CA16)IgM抗体的检测试纸条。它是在硝酸纤维膜(NC膜)上包被CA16基因抗原(VP1)和抗鼠IgG，结合胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体，应用膜层析捕获法，检测感染人标本中CA16特异性IgM抗体。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和早期诊断，对CA16感染诊断起到辅助作用。

Description

一种柯萨奇病毒A16型(CA16)IgM抗体检测试纸条

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种柯萨奇病毒A16型(CA16)IgM抗体检测试纸条及其应用。

背景技术

柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是一种人类疾病严重的致病病原，其感染可以导致许多疾病，从较轻的呼吸道感染疾病，到比较严重的心肌炎、心包炎及神经系统的一些疾病，甚至可以引起婴幼儿死亡。CoxV可分A、B两组：A组病毒有24个血清型，B组有6个血清型。B组所有型别和A组第9型有共同组特异性抗原；B组各型病毒血清型之间有交叉反应，而A组没有。感染人体的CoxV以A组居多，引起手足口病的CoxV多以A16型、A4型、A5型、A7型、A10型、B2型、B5型、B13型为主。CoxV为单股正链RNA病毒，分子量为(2～2.8)×106，呈球形，直径20-30nm，无包膜，含有由32个壳微粒形成的二十面体立体对称的衣壳；耐低温，对乙醚、乙醇、来苏尔等消毒液敏感，对热、干燥、紫外线等也较敏感。

柯萨奇病毒是单股正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，为二十面体立体对称，无包膜。基因组全长为7389～7402个核苷酸，不包括3’端的多聚腺苷酸尾。在柯萨奇病毒基因组的5’端，以共价键结合了一个小的蛋白质，称为毒粒蛋白，叉称VPg；而在3’末端有一个多聚腺苷酸尾，其由几十个到近百个腺苷酸连结而成。柯萨奇病毒RNA基因组的顺序依次为5’端非编码区，P1区、P2区、P3区和一段3’端非编码区(图1)。病毒外壳由结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4构成，其中VP1、VP2、VP3裸露于病毒外壳表面，VP4隐藏于病毒外壳内面。

Cox A16的基因组长约7400bp，包括5′及3′端的非编码区和中间一个大的开放读码框(ORF)，依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 11个基因组成，主要编码产生病毒结构蛋白和病毒复制所需要的酶类。其中VP1区长891bp，编码含297个氨基酸的VP1蛋白。VP1是病毒主要的中和抗原决定簇所在的部位，是肠道病毒血清型的分型依据。VP1区的核苷酸序列也是肠道病毒基因分型的依据。

通过基因工程获得该抗原的表达蛋白，并用其作为抗原检测CA16的特异性IgM抗体。

目前，手足口病的诊断，除了依据临床症状外，实验室诊断是不可缺如的环节。实验室的诊断标准如下：

1)血液检查的细胞总数一般正常或偏高，分类时淋巴细胞较高，中性粒细胞较低。2)有中枢神经系统并发症时，脑脊液细胞数可增多，蛋白升高。3)发病后从粪便、咽喉漱口液分离或检测到相关病毒。4)从脑脊液或疱疹液分离或检测到相关病毒。5)从早期血清中检测出相关病毒IgM抗体。6)恢复期血清中和抗体比急性期有≥4倍的增长。

然而到目前为止，还没有一种能够方便、快捷检测CA16特异性IgM抗体的试纸条的报道。

发明内容

(一)、要解决的技术问题

发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测CA16特异性IgM抗体的试纸条，检测感染患者标本中CA16特异性IgM抗体，用于人CA16感染的辅助诊断。

(二)、技术方案

本发明提供了一种检测试纸条，它包含以下成分：

(1)包被CA16病毒抗原VP1和二抗IgG两个条带的反应膜；

(2)含有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体的结合物释放垫。

上述二抗可以是抗鼠IgG二抗，所述反应膜可以是硝酸纤维素膜，所述结合物释放垫可以是玻璃纤维膜。

本发明还提供制备上述试纸条的方法，其包括如下步骤：

1)将CA16病毒抗原VP1以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；

2)用胶体金标记抗人IgM单克隆抗体，包被到结合物释放垫中；

3)将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。

本发明还公开了所述试纸条在检测CA16特异性IgM抗体的应用。

本发明通过采用高纯度的纯化的CA16基因工程抗原VP1和抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体，应用膜层析捕获法的原理检测人标本中的CA16特异性IgM抗体。

(三)、有益效果

本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性检测样本中可能存在的CA16特异性IgM抗体，达到快速筛检病人，及时诊断治疗的目的。可节省大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和早期诊断，对CA16的感染诊断起到辅助作用。

附图说明

图1：A本发明试纸条的正面示意图；B 本发明试纸条的侧面示意图。其中，1：吸水垫；2：硝酸纤维膜(T：CA16基因工程抗原VP1；C：包被抗鼠IgG的质控条带)；3：含有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体的玻璃纤维膜；4：金标抗体保护膜；5：反应支持物。

图2：检测结果示意图。其中，从左至右依次为：T、C两条线阳性；C一条线阴性；T、C两条线阴性或仅有T线阳性，无效。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：CA16特异性IgM抗体检测试纸条(胶体金法)(参见图1)

柯萨奇病毒A16型VP1抗原购于北京安波特基因技术有限公司

反应支持物为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫为2cm×0.4cm的滤油纸；2.0cm×0.4cm的硝酸纤维膜依次包被抗鼠IgG(2mg/ml)，CA16抗原VP1(2.3mg/ml)，含有0.4cm×0.4cm胶体金标记的抗人IgM(标记量25μg/ml)的单克隆抗体聚酯膜；样品垫2.7cm×0.4cm的玻璃纤维；即组成了柯萨奇病毒A16型(CA16)IgM抗体检测试纸条(胶体金法)。

实施例2检测方法(参见图2)

将患者全血、血浆或血清标本100-150μl直接滴加入实施例1试纸条“4”处，样品液沿膜上行，10-15分钟判读结果。

结果：

如检测样本中含有CA16的IgM抗体，则与试纸条上胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的CA16特异性抗原VP1结合，形成红色线条，即在T处形成红色条带。

无论标本中是否含有相应的抗体，胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体继续向上爬行与包被在膜上的抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。

取150例血清样本，其中，100例为柯萨奇病毒A16型临床阳性血清样本，50例为正常血清样本，按上述的检测方法用实施例1的的试纸条对样本进行检测。结果表明，100例临床阳性样本中检测出99例，正确率为99％，50例正常血清样本均为阴性，正确率为100％。

Claims

1.一种检测试纸条，其特征在于，它包含：

（1）包被CA16病毒抗原VP1和二抗IgG两个条带的反应膜；

（2）含有胶体金标记的抗人IgM单克隆抗体的结合物释放垫，其中二抗IgG为抗鼠IgG，浓度为2mg/ml；CA16抗原VP1浓度为2.3mg/ml；所述试纸条包括含有胶体金标记的抗人IgM的单克隆抗体聚酯膜，标记量为25μg/ml。

2.如权利要求1所述的检测试纸条，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

3.一种制备权利要求1～2任一项所述试纸条的方法，其包括如下步骤：

1）将CA16病毒抗原VP1以及二抗IgG在反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；

2）用胶体金标记抗人IgM单克隆抗体，包被到结合物释放垫中；

3）将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。

4.CA16病毒抗原VP1在制备胶体金检测试纸条中的应用，其中，CA16抗原VP1浓度为2.3mg/ml。