CN106046124A - 一种柯萨奇病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测柯萨奇病毒抗体的快速检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种柯萨奇病毒基因工程人工表达抗原；制备该抗原的方法，该方法人工合成优化的柯萨奇病毒VP1蛋白抗原基因序列，构建原核表达载体，大肠杆菌表达柯萨奇病毒VP1蛋白抗原，采用透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性包涵体，获得具有三维结构和免疫活性的重组柯萨奇病毒VP1蛋白抗原；一种柯萨奇病毒抗体快速检测方法，该方法包括应用柯萨奇病毒VP1蛋白抗原；一种用于柯萨奇病毒抗体检测的快速检测试剂盒，该试剂盒包含柯萨奇病毒VP1蛋白抗原，可直接用于全血检测。该试剂盒包含风湿因子处理垫，可以去除样品中的风湿因子，直接检测样品中的IgM。本发明提供了一种柯萨奇病毒抗原，该抗原具有高度的特异性。本发明提供了制备该抗原的方法，快速测定柯萨奇病毒抗体的方法，以及用于快速测定柯萨奇病毒抗体的试剂盒。

Description

一种柯萨奇病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测柯萨 奇病毒抗体的快速检测试剂盒

技术领域

本发明属于临床医学检测领域，涉及免疫层析检测技术，具体涉及一种用于诊断柯萨奇病毒感染的柯萨奇病毒抗原，制备该抗原的方法，用该抗原检测柯萨奇病毒的快速检测试剂盒。

背景技术

柯萨奇病毒（Coxsackievirus, Cox V）是一种人类疾病严重的致病病原，其感染可以导致许多疾病，从较轻的呼吸道感染疾病，到比较严重的心肌炎、心包炎及神经系统的一些疾病，甚至可以引起婴幼儿死亡。妊娠期感染可引起非麻痹性脊髓灰质炎性病变，并致宫内感染和致畸。柯萨奇病毒是单股正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，为二十面体立体对称，无包膜。基因组全长为7389~7402个核苷酸。柯萨奇病毒可以分为A、B两组，A组有24型病毒，B组有6型病毒。通过型特异性抗原，经中和试验，ELISA 方法等可以对各型进行鉴定。所有的B组及A组的第9型有共同的组特异性抗原，在B组内病毒之间有交叉反应，但是A组病毒没有共同的组特异性抗原。其中A组的16型(Cox A16)是最常见的引起手足口病的病原体。CoxA16的基因组包括5^’及3^’端的非编码区和中间一个大的开放阅读框（ORF）, 依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D等11个基因组成，主要编码产生病毒结构蛋白和病毒复制所需要的酶类。

柯萨奇病毒A型感染一般潜伏期为1～3天，引起上呼吸道感染，起病急，流涕、咳嗽、咽痛、发热，全身不适。典型症状为疱疹性咽峡炎，即在鼻咽部、会厌、舌和软腭部出现小疱疹，黏膜红肿，淋巴滤泡增生、渗出，扁桃体肿大，伴吞咽困难，食欲下降。皮疹可为疱疹和斑丘疹，主要分布于躯干外周侧、背部、四肢背面，呈离心性分布，尤以面部、手指、足趾、背部皮疹多见，故称手、足、口三联症。

手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有流行报导。1957年新西兰首次报导该病，1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出“手足口病” 命名，1981年我国上海首次报告了手足口病疫情。死亡病例大多为5岁以下的儿童，并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性软瘫和心肌炎等。手足口病主要的病原体有CA16和肠病毒71型（EV71），他们的初始临床症状非常相似，但CA16感染的患者可引起心肌炎、心包炎等并发症，而EV71感染容易引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎及由此引发的急性弛缓性瘫痪、肺水肿和出血等严重并发症，死亡率较高。因此，分清它们之间谁是感染源对于手足口病的预防和治疗有非常重要的意义。此外，柯萨奇病毒感染也需要和其他引起上呼吸道感染的病毒如EB病毒、腺病毒感染相鉴别。

病原微生物感染症的实验室检测主要包括对感染部位等处的病原菌的检测和对患者血清、体液中的抗体检测两种方法。病原学检测方法中，病毒分离是最早用于CA16病毒的检测诊断的方法，这种方法具有较高的特异性，但由于技术操作难度大、周期长，不适合临床使用。目前柯萨奇病毒检测主要有聚合酶链式反应（PCR）法、免疫荧光抗体技术（IFA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等技术。聚合酶链式反应（PCR）法等核酸检测技术虽然具有较高的特异性和敏感性，但其准确性不高，极易造成污染。抗体的检测是比较理想的检测柯萨奇病毒感染的方法之一。目前常用的抗体检测技术有免疫荧光抗体技术（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等技术。特异性的IgG和IgM的测定可以准确确证感染的阶段，对于病原的防治有重要的意义。

在柯萨奇病毒的抗原中，VP1抗原是一种最佳候选抗原。VP1是柯萨奇病毒的主要结构蛋白之一，其保守性较好，抗原表位集中，能刺激机体产生相应抗体，从而中和病毒。VP1区长891bp, 编码含297个氨基酸的VP1蛋白，VP1是病毒主要的中和抗原决定簇所在的部位，也是激发机体产生保护性抗体最主要的病毒抗原，这使得VP1成为研制诊断试剂盒候选抗原的首选。由于患者为婴幼儿，病情发展快，所以更需要早期、及时诊断疾病。疾病的早期和及时诊断，可以准确鉴别病毒，并对疾病的诊疗和预后判断有重要的临床意义，因此建立手足口病快速分型检测方法尤为重要。

手足口病传染性强，传播速度快，并可造成局部暴发流行。疫情暴发初期，重症病例常常难以明确诊断，常被误诊为肺炎。由于目前尚无十分安全有效的 手足口病疫苗和特效药，因此,及时快速的检测对于手足口病的治疗和控制起着至关重要的作用。目前，还没有一种能快速检测柯萨奇病毒感染的便捷方法。因此，急需要一种快速方便快捷的方式去检测柯萨奇病毒的感染，利于手足口病的早期临床诊断，将对挽救重症患儿的生命极其重要。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种工程表达柯萨奇病毒VP1蛋白特异性抗原，该抗原具有高度的特异性和免疫反应性。抗原具有免疫原性高，无特异反应，抗原表位集中等优点。

本发明的第二目的是提供一种制备工程表达柯萨奇病毒VP1抗原的方法，该方法利用合成基因的原核表达，通过包涵体复性制备活性高的特异抗原，该方法制备的柯萨奇病毒抗原具有特异性和免疫反应性。

本发明的第三目的是提供一种测定抗柯萨奇病毒抗体的试剂盒，该试剂盒为快速“一步检测法”试剂盒，具有灵敏度高、特异性强，检测速度快、操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病学调查和场地检疫等多种场合。

本发明的第四目的是提供一种柯萨奇病毒抗体全血快速检测装置，它是一种装有滤膜的可以过滤掉红细胞的柯萨奇病毒全血检测装置。

本发明的第五目的是提供一种风湿因子处理垫，它是一种固定有抗风湿因子抗体的无纺布或者硝酸纤维素膜。

本发明的主要内容

(1) 一种柯萨奇病毒抗原，它是一种采用基因工程技术人工制备的抗原。

(2) 一种制备柯萨奇病毒抗原的方法，包括人工合成优化的柯萨奇病毒融VP1抗原基因序列，构建原核表达载体，大肠杆菌表达柯萨奇VP1蛋白，采用透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性包涵体，获得具有三维结构和免疫活性的重组柯萨奇病毒VP1蛋白抗原。

(3) 一种柯萨奇病毒抗体快速检测方法，包括应用上面（1）中的柯萨奇病毒抗原。

(4) 上述（3）中柯萨奇病毒抗体快速检测方法，包括（1）中的柯萨奇病毒抗原固定到一种硝酸纤维素膜，一种标记抗体（二抗）固定到固相载体上，待测样品与标记抗体（二抗）接触，若待测样品中存在柯萨奇病毒抗体，则柯萨奇病毒抗体与标记二抗形成抗体-标记二抗复合物，“复合物”在硝酸纤维素膜水平移动，遇到固定到膜上的柯萨奇病毒抗原产生反应，带有标记的“复合物”就被特异地固定到抗原上，固定抗原的位置就会有显色反应；若待测样品不含柯萨奇病毒抗体，则“复合物”不能固定到抗原的位置上，此处就没有显色反应，可依据硝酸纤维素膜固定抗原位置是否有显色反应，来判断检测结果，即待测样品中是否有柯萨奇病毒抗体。

(5) 上述（4）柯萨奇病毒抗体检测方法，其中待测样品是人的全血，血浆或血清。

(6) 上述（4）或（5）中测定柯萨奇病毒抗体的方法，其中的标记抗体（二抗）是标记的抗人IgM或抗人IgG抗体。

(7) 上述（4）-（6）中标记抗体是胶体金属颗粒或者彩色胶乳颗粒标记的抗体。

(8) 一种快速检测柯萨奇病毒抗体的试剂盒，它所用抗原为上述（1）中的柯萨奇病毒抗原。

(9) 上述（8）中用于快速检测柯萨奇病毒抗体的试剂盒，其中的标记抗体是胶体金属颗粒标记抗体或者彩色胶乳颗粒标记抗体。

(10) 上述（8）中用于检测的试剂盒，其中的滤血膜是固定有抗红细胞单抗或者多抗的无纺布。

(11) 上述（8）中用于检测的试剂盒，其中的风湿因子处理垫是固定有抗风湿因子单抗或者多抗的无纺布或者硝酸纤维素膜。

下面对本发明进行详细阐述。

本发明的柯萨奇病毒抗原，主要通过将柯萨奇病毒VP1蛋白基因构建到原核表达载体pET30a，pET30a-VP1表达载体转化大肠杆菌，筛选阳性重组菌，IPTG诱导重组菌表达柯萨奇病毒VP1蛋白，经细菌裂解、包涵体溶解和重组蛋白结构复性与纯化等步骤获得。

下面将详述本发明制备柯萨奇病毒抗原的方法。

从GenBank获取柯萨奇病毒VP1蛋白基因序列，根据柯萨奇病毒VP1蛋白基因人工合成柯萨奇病毒VP1蛋白优化的基因序列。目的基因经双酶切后与经同样双酶切过得原核表达载体连接，转化感受态细胞（大肠杆菌）、筛选阳性重组菌。阳性克隆菌提取质粒、双酶切和测序鉴定，证明插入的目的基因正确。重组菌经IPTG诱导表达、离心得重组菌沉淀，菌体重悬于缓冲液后超声裂解，离心获得包涵体形式的的蛋白沉淀，经洗涤后溶于尿素溶液中复性。变性蛋白需要经过结构复性与纯化才能获得天然蛋白的免疫反应原性和达到柯萨奇病毒抗体检测的应用标准。

对于柯萨奇病毒VP1重组蛋白包涵体复性方法，可应用透析法、梯度稀释法、凝胶层析法等，优选透析法和梯度稀释法相结合的方法，因为它们易于控制，蛋白复性率高。

对于包涵体复性后柯萨奇病毒VP1蛋白的纯化方法，可应用凝胶层析、亲和层析等，优选凝胶层析法，因为它最易于控制，收率高。

通过基因重组获得的柯萨奇病毒VP1抗原具有较高的特异性和敏感性。

对于快速测定抗体的方法，这里列举的是优选的方法，如应用各种标记抗体的免疫层析测定，应用各种标记抗体的免疫渗滤法等。

下面详述免疫层析测定方法。

抗柯萨奇病毒抗体免疫层析测定方法包括下述步骤：柯萨奇病毒VP1抗原固定到固相载体1上，标记抗体（二抗）固定到固相载体2上，待测样品与标记抗体（二抗）接触，若待测样品存在柯萨奇病毒抗体，则柯萨奇病毒抗体与二抗反应形成抗体-标记二抗复合物，该“复合物”在固相载体1上水平移动，遇到固定到载体1上的柯萨奇病毒抗原产生反应，带有标记的“复合物”就被特异地固定到抗原上，固相载体上固定固定抗原的位置就会有显色反应；若待测样品不含柯萨奇病毒抗体，则“复合物”不能固定到抗原的位置上，此处就没有显色反应，可依据固相载体上固定抗原位置是否有显色反应，来判断检测结果，即待测样品中是否有柯萨奇病毒抗体。

对于固相载体1，可应用例如硝酸纤维素膜（NC膜）、PVDF膜等。优选硝酸纤维素膜。

对于固相载体2，可应用例如玻璃纤维素膜，无纺布等任何一种形式。优选无纺布作结合物释放垫，因为它最易于控制。

对于标记的抗体，这里指的是用不同标记物标记的抗体，这里指的是抗人IgM抗体或抗人IgG抗体，可依据被检测抗体的种类适当应用。

本发明的有益效果

（1） 本发明包括柯萨奇病毒VP1抗原的优化表达，合成了优化的VP1基因序列，这一序列的表达更高，特异性更强。而且本发明还探索出了一套完整的包涵体抗原纯化和复性的方法，制备出的抗原收率高，免疫原性高。

（2） 本发明还制备出了一种一步法检测柯萨奇病毒抗体的试剂盒。该试剂盒检测柯萨奇病毒的IgG或IgM抗体，利于确证感染的阶段，对于柯萨奇病毒的治疗提示作用明显。

（3） 本发明还可以直接检测全血样本，其实现原理是在检测卡上有滤血膜，可以用少量全血样本检测。

（4） 本发明还可以直接检测未提前处理的样本，其实现原理是在检测卡上有风湿因子处理垫，可以去掉血液中的风湿因子，实现样本IgM的直接检测。

因此，本发明可以通过一次取样一步法全血检测呼吸道柯萨奇病毒的感染，适于基层医疗机构和医院门诊。

附图说明

图1 显示了发明试剂—检测板的外观结构示意图

1-检测板 2-加样孔 3-检视窗

图2显示了发明试剂—检测条的外部结构示意图

4-加样端吸水纸层 5-金标抗体层 6-控制线 7-检测线

8-检测层 9-吸水端吸水层 10-衬板

具体实施方式

实施例1 重组柯萨奇病毒VP1蛋白抗原重组表达、结构复性与纯化

柯萨奇病毒A型VP1基因参考GenBank序列GQ279371.1，进行全基因合成，合成时进行了大肠杆菌稀有密码子优化，表达载体pET30a，连接时酶切位点为HindII/XhoI，目的基因共894bp（297aa），转化到BL21（DE3），表达的重组蛋白共345aa，分子量38.7 kDa，等电点8.32。重组蛋白以包涵体形式表达，可用Ni柱纯化。

基因合成序列

>CA16 ，VP1 optimized sequence

GCGGTGATCCTATCGCCGACATGATCGATCAGACCGTGAACAACCAGGTTAATCGCAGTCTGACCGCACTGCAGGTTCTGCCGACCGCAGCCAATACCGAAGCCAGCAGCCATCGTCTGGGTACCGGTGTGGTTCCGGCCTTACAGGCAGCCGAAACCGGCGCCAGCAGCAACGCAAGCGACAAAAACCTGATCGAGACCCGCTGTGTTCTGAATCACCATAGCACCCAGGAGACCGCAATTGGTAACTTCTTCAGCCGCGCAGGCCTGGTTAGCATTATCACCATGCCGACCACCGGCACCCAGAATACCGACGGCTACGTGAACTGGGACATTGATCTGATGGGCTATGCCCAGCTGCGCCGCAAATGCGAGCTGTTCACCTATATGCGCTTCGACGCCGAGTTTACCTTCGTGGTTGCCAAGCCGAATGGCGAGCTGGTGCCTCAGCTGCTGCAGTATATGTATGTGCCGCCGGGTGCACCGAAACCTACAAGCCGCGATAGTTTTGCCTGGCAGACAGCCACCAACCCGAGCGTGTTCGTTAAAATGACCGATCCGCCGGCCCAGGTTAGCGTTCCGTTTATGAGCCCGGCCAGCGCCTACCAGTGGTTCTATGACGGTTACCCGACCTTTGGTGAGCATCTGCAGGCAAACGATCTGGATTACGGTCAGTGCCCGAACAACATGATGGGCACATTTAGCATTCGCACCGTGGGCACCGAAAAAAGCCCGCATAGCATCACCCTGCGTGTGTATATGCGCATCAAACACGTGCGTGCATGGATTCCGCGTCCGCTGCGCAACCAGCCGTATCTGTTTAAGACCAACCCGAACTATAAAGGTAACGATATCAAGTGTACCAGCACCAGCCGCGATAAGATTACCACCCTGTAA

重组表达载体的构建与鉴定：分别用EcoRI和XhoI对柯萨奇病毒VP1目的基因片段及pET30a质粒进行双酶切，酶切产物纯化回收后，16℃连接过夜，再转入E . coli DH5α感受态细胞，挑取转化菌落提取质粒进行PCR、酶切及测序鉴定。经PCR及双酶切鉴定，均证实有大小约900bp的基因片段插入载体，与预期的结果一致。测序结果表明插入目的基因片段900bp，核酸序列与提交合成的柯萨奇病毒VP1基因序列完全相同，构建的表达载体开放阅读框正确，可以表达重组蛋白。

重组蛋白的诱导表达：取50µL pET30a-VP1 BL21(DE3)菌液加入到5mL含100 µg/mL卡那霉素的LB培养基中，37 ℃、200 rpm培养过夜，次日按1:50接种于含卡那霉素的LB培养基中，培养至吸光值OD600为0.6左右时，加入IPTG至浓度为1mmol/L，进行诱导表达4小时，5000rpm离心30分钟，收集菌体，用TE缓冲液悬浮，充分混匀，-80 ℃反复冻融3次，超声破菌，4 ℃、12000 rpm离心15 min，收集上清，沉淀用2 M尿素洗2次，4 ℃、12000 rpm离心15 min，剩余沉淀用8 M尿素溶解，4 ℃保存。沉淀用SDS-PAGE分析蛋白表达量。电泳条件，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。蛋白染色为考马斯亮蓝染色法，考马斯亮蓝R-250染色3h，乙酸-乙醇脱色液脱色至背景无色为止。

重组蛋白的结构复性与纯化：室温条件下用10mmol/L, pH7.2的PBS缓冲液对柯萨奇病毒VP1重组表达蛋白8M尿素的溶解液进行梯度透析稀释，按溶液中尿素浓度分别为6mol/L、4mol/L、3 mol/L控制稀释梯度，每个梯度稀释的时间分别为3-4h。将完成稀释复性的含3mol/L尿素的溶解液4℃放置24h。稀释复性的溶液10000r/min离心除去沉淀物质，上清液通过以S-300为介质的凝胶层析分离法进行纯化，从而获得重组柯萨奇病毒VP1抗原。所得重组柯萨奇病毒VP1抗原组分进行SDS-PAGE，以确定蛋白质的分子量及蛋白纯度。电泳条件，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。蛋白染色为考马斯亮蓝染色法，考马斯亮蓝R-250染色液染色3h，乙酸-乙醇脱色液脱色至背景无色为止。主蛋白条带出现在38.7kDa处，蛋白纯度达到95%以上。

实施例2 一种柯萨奇病毒抗体IgG/IgM金标快速检测试剂盒的制备

上述所得到基因重组柯萨奇病毒VP1蛋白作检测抗原，在硝酸纤维素膜包被检测线；参照图2，制备柯萨奇病毒抗体金标快速检测试剂，其组成成分包括：在衬板10上设有加样端吸水层4、检测层8和吸水层9，在检测层和加样端吸水层4之间设有金标抗柯萨奇病毒抗体层5，在检测层8上包被有检测线7和质控线6。其中加样端吸水层4和吸水端吸水层9由多层滤纸制成：检测层8为硝酸纤维素膜；金标抗体层为玻璃纤维或无纺布浸取胶体金标记抗体。

检测试剂制备程序包括：制备金标抗体层5和检测层8的质控线6、检测线7的包被，然后再在衬板10上组合金标测试条和检测卡1.在塑料衬板10的两端分别粘贴加样端吸水纸层4与吸水端吸水层9；在其中段粘贴包被检测线和质控线的纤维素层8，在加样端吸水纸层4与纤维素膜层8的交接部位，夹贴含金标抗体层5的玻璃纤维，玻璃纤维的4/5部分在加样端吸水纸层4中间，1/5部分在纤维素膜层8上。然后按照4毫米宽、7厘米长规格切条。再参照图2，将检测条组装于塑料盒内形成检测卡1。盒盖上加样孔2正对测试条的加样端吸水纸层4，观察孔3正对纤维素膜的检测层8。

上述的金标抗体层的制备方法包括下述步骤：ⅰ胶体金的制备，取100mg氯金酸溶于1000mL三蒸水中，加入15mL浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，煮沸15分钟，可得到直径为15-50纳米的胶体金颗粒溶液；ⅱ胶体金标记抗人IgG或IgM单克隆抗体，取100ml胶体金溶液，用0.2M碳酸钾溶液调pH为8.4，加入1mg抗人IgG/IgM单克隆抗体，搅拌20分钟，再加入240mg牛血清白蛋白（BSA）,继续搅拌5分钟，4℃静置2-4小时；ⅲ将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10-15分钟，去沉淀，得到上清；ⅳ 将上清液经10000转/分钟离心60分钟得到沉淀；ⅴ将沉淀溶于4mL0.02M pH7.4的Tris-Hcl缓冲液得到胶体金溶液，该溶液中含有0.25%BSA和0.02%叠氮钠；ⅵ将胶体金溶液浸入玻璃纤维或者无纺布至液体开始渗出为止，37℃干燥2小时形成金标抗体层5。

所述的检测层8是在硝酸纤维素膜上设有重组柯萨奇病毒VP1抗原构成的检测线7和由羊或兔抗鼠IgM/IgG抗体形成的质控线6。其制备方法是取上述1）所制备的重组柯萨奇病毒VP1抗原，调浓度为1.5mg/mL，加入2%的甲醇，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线7；再取羊或兔抗鼠IgM/IgG抗体调浓度为1.5mg/mL，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0.5cm处，喷涂质控线6，按2uL/cm设置喷膜量，喷膜后置于37℃干燥2小时，再用0.01mLpH7.0的含10%小牛血清的PBS在37℃下封闭30分钟，0.01mLpH7.0的PBS漂洗，45℃干燥。

实施例3 柯萨奇病毒抗体的测定

取血清或者血浆样品10μL滴于检测板1的样品孔2内，再滴加100μL样品稀释液于样品孔2内，在观察窗3观察检测结果，观察结果20分钟内有效。若样品中含有抗柯萨奇病毒抗体，则在观察窗内看到检测线和质控线出现两条红色线条，检测结果判为阳性；若血清中不含有抗柯萨奇病毒抗体，则在观察窗质控线位置看到一条红色线，检测结果判定为阴性；若观察窗内一条红色都看不到，则检测结果无效。

实施例4 全血样品的检测

本发明实现的柯萨奇病毒免疫层析快速检测试剂盒对抗凝全血样本可直接检测，无需血浆或血清分离，其实现的原理在于，在样品垫增加一层滤血膜，滤血膜中固化有抗人血红细胞抗体（单抗或多克隆抗体），检测时，当抗凝血全血进入滤血膜后血液中红细胞被抗体结合到滤血膜上，血浆渗入样品垫，完成检测。

实施例5 风湿因子处理垫的确定

本发明实现的柯萨奇病毒免疫层析快速检测试剂盒在检测卡上安装有分湿因子处理垫，可以去除掉样品中的分湿因子，无需提前除去血液样品中的分湿因子。其实现的原理在于，在样品垫增加一层抗分湿因子处理垫，处理垫上固化有抗人分湿因子抗体（单克隆抗体或多克隆抗体），检测时，当血液样品进入样品垫后血液中的分湿因子被抗体结合到处理垫上，其余样品渗入样品垫，完成检测。

实施例6 对临床样品的敏感性和特异性

用本发明的柯萨奇病毒抗原及检测方法制备柯萨奇病毒抗体（IgM）金标检测试剂，检测55份柯萨奇病毒抗体IgM阳性临床血清样品和95份柯萨奇病毒抗体IgM阴性临床血清样品来进行特异性和敏感性试验。同时，为了验证本发明的效果，对用本发明的柯萨奇病毒抗原进行的金标检测试剂与北京贝尔生物工程公司产的试剂盒进行符合率分析，结果见表一、表二。

表1：本发明的柯萨奇病毒抗原的特异性及敏感性检测结果

	阳性样本数	阴性样本数
			阳性	51	3
阴性	4	92
			合计	55	95

表1的结果显示，本发明抗原的敏感性达到92.73%，特异性达到96.84% 。本发明的抗原可以作为进一步研发柯萨奇病毒抗体检测试剂盒。

表2： 用本发明抗原进行的检测试剂与北京贝尔试剂的符合率分析

表2结果显示，本发明检测试剂盒与北京贝尔公司试剂的阳性符合率为96.36% ，阴性符合率为97.89%，总符合率为97.33%，说明本发明试剂盒的检测结果与贝尔公司用柯萨奇病毒抗体检测试剂盒具有较好的符合率。因此，本发明具有较好的临床应用价值。

需要指出的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

<110> 兰州雅华生物技术有限公司

<120> 一种柯萨奇病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的检测柯萨奇病毒抗体的快

速检测试剂盒

<130> 01

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 896

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcggtgatcc tatcgccgac atgatcgatc agaccgtgaa caaccaggtt aatcgcagtc 60

tgaccgcact gcaggttctg ccgaccgcag ccaataccga agccagcagc catcgtctgg 120

gtaccggtgt ggttccggcc ttacaggcag ccgaaaccgg cgccagcagc aacgcaagcg 180

acaaaaacct gatcgagacc cgctgtgttc tgaatcacca tagcacccag gagaccgcaa 240

ttggtaactt cttcagccgc gcaggcctgg ttagcattat caccatgccg accaccggca 300

cccagaatac cgacggctac gtgaactggg acattgatct gatgggctat gcccagctgc 360

gccgcaaatg cgagctgttc acctatatgc gcttcgacgc cgagtttacc ttcgtggttg 420

ccaagccgaa tggcgagctg gtgcctcagc tgctgcagta tatgtatgtg ccgccgggtg 480

caccgaaacc tacaagccgc gatagttttg cctggcagac agccaccaac ccgagcgtgt 540

tcgttaaaat gaccgatccg ccggcccagg ttagcgttcc gtttatgagc ccggccagcg 600

cctaccagtg gttctatgac ggttacccga cctttggtga gcatctgcag gcaaacgatc 660

tggattacgg tcagtgcccg aacaacatga tgggcacatt tagcattcgc accgtgggca 720

ccgaaaaaag cccgcatagc atcaccctgc gtgtgtatat gcgcatcaaa cacgtgcgtg 780

catggattcc gcgtccgctg cgcaaccagc cgtatctgtt taagaccaac ccgaactata 840

aaggtaacga tatcaagtgt accagcacca gccgcgataa gattaccacc ctgtaa 896

Claims (6)

1.一种柯萨奇病毒（Cox V）抗原，它是一种采用基因工程技术原核表达，透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性得到的大小为38.7 kDa的重组抗原。

2.根据权利要求1所述的抗原，它是柯萨奇病毒VP1蛋白部分序列进行优化序列后人工合成的基因原核表达而来，所述抗原有表达稳定，表达量高，免疫原性高等优点。

3.一种柯萨奇病毒抗体快速检测方法，包括应用权利要求1中任一权项的柯萨奇病毒抗原固定到硝酸纤维素膜，胶体金属颗粒或彩色胶乳颗粒标记抗体（二抗）接触，若待测样品中存在柯萨奇病毒抗体，则柯萨奇病毒抗体与标记二抗反应形成抗体-标记二抗复合物，“复合物”在硝酸纤维素膜水平移动，遇到固定到硝酸纤维素膜上的柯萨奇病毒抗原产生反应，带有标记的“复合物”就被特异地固定到抗原上，固定抗原的位置就会有显色反应，若待测样品不含柯萨奇病毒抗体，则“复合物”不能固定到抗原的位置上，此处就没有显色反应，可依据硝酸纤维素膜上固定抗原位置是否有显色反应，来判断样品中是否有柯萨奇病毒抗体；它所用检测抗体为血清或者全血的IgM/IgG，取样方便。

4.一种快速检测柯萨奇病毒抗体的试剂盒，它所用抗原为权利要求2所述的优化的VP1蛋白，以包涵体形式存在的，通过纯化和复性得到的表达蛋白，它所用抗原为权利要求1中的柯萨奇病毒抗原，所用方法为权利要求2所述方法。

5.一种快速检测柯萨奇病毒抗体的滤血装置，所述过滤装置滤血装置是对权利要求4所述检测装置进行改造，它由玻璃纤维或无纺布和滤血样品垫组合构成，所述滤血样品垫由经抗人血红细胞单克隆抗体或多抗抗体固化处理的玻璃纤维或无纺布构成。

6.一种风湿因子处理垫，所述的风湿因子处理垫是对权利要求4所述的检测装置进行改造而来的，它由包被了抗风湿因子抗体的无纺布或者硝酸纤维素膜构成，所述风湿因子处理垫由经抗人风湿因子单克隆抗体或多克隆抗体固化处理的无纺布或硝酸纤维素膜构成。