CN104297482B - EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂及其制备方法 - Google Patents
EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种EB病毒VCA/NA1‑IgA抗体联合检测试剂,至少包括一反应膜,所述反应膜上划有检测线和质控线,所述检测线含有鼠抗人IgA单克隆抗体;所述质控线含有生物素;一抗原垫,所述抗原垫含有由生物素标记的重组EB病毒VCA抗原和由生物素标记的重组EB病毒NA1抗原;一金标垫,所述金标垫含有胶体金标记的亲和素复合物。本发明的联合检测试剂盒将VCA和NA1抗原联合检测,可节约成本,有利于检测试剂盒的应用推广,降低检测费用,具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地涉及一种抗体检测试剂。
本发明还涉及包含该检测试剂的试剂盒及制备方法。
背景技术
EB病毒(epstein-barr virus,EBv),又称人类疱疹病毒4型(Humanherpesvirus 4(HHV-4))。Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株,并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒,认为该病毒是多种恶性肿瘤(如鼻咽癌)的病因之一,它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有EB病毒基因组存在。EB病毒分布广泛,多呈散发性,亦可引起流行。EB病毒与鼻咽癌关系十分密切,EB病毒在感染过程中形成的病毒特异抗原可以区分为早期抗原(EA)、病毒衣壳抗原(VCA)、核相关肿瘤抗原(EBNA)和膜抗原(MA)。检测这些抗原的相应抗体反应,有助于EBV相关疾病的诊断和治疗。
病毒衣壳抗原(VCA)具有很强的免疫原性,最初感染EBV的患者血清中可检测到VCA-IgM,之后IgM抗体逐渐减少到无法检出的水平,几乎同时VCA-IgG逐渐增加,并可在正常人体内终生存在。若此试验阴性,可以排除EBV感染。
核相关肿瘤抗原(EBNA)可分为六种,其中NA1抗原是唯一一种在所有EB病毒相关肿瘤细胞中都表达的病毒蛋白,出现在所有持续受感染细胞的核中,其免疫原性表达相对迟些,仅数周或数月后形成抗NA1抗体。一个明显阳性试验结果(第二滴度阶段)显示曾有过感染。若VCA试验阳性,滴度为1:160或更高,结合阴性或弱阳性的抗EBNA1试验,就表示一种急性、新的或复发感染。
因此,EB病毒VCA和NA1抗原的检测对于鼻咽癌的早期诊断和发展预后判断有非常重要的意义。而将VCA和NA1抗原联合检测可进一步提高EB病毒IgA相关抗体对鼻咽癌早期诊断的有效性;且联合检测节约成本,有利于检测试剂盒的应用推广,降低检测费用。
目前检测EB病毒的检测试剂主要是采用酶联免疫吸附(ELISA)法、Real-time定量PCR法等,但存在操作复杂、检测灵敏度较低、检测时间长的缺陷。
胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,形成带负电的疏水胶溶液,故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其它生物大分子结合,如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。
胶体金法检测试剂将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上,胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上,当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后,通过毛细作用向前移动,溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应,再移动至固定的抗原或抗体的区域时,待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留,聚集在检测带上,可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条,使用十分方便。
中国专利申请CN101949932A提供了一种胶体金法检测EB病毒IgA抗体的检测试剂,其采用EB病毒NA1抗原包被检测线,鼠抗人IgA单抗标记胶体金,用羊抗鼠IgG抗体包被质控线。中国专利申请CN102539768A提供了一种EB病毒Zta IgA抗体胶体金检测试剂,其采用EB病毒Zta抗原包被检测线,鼠抗人IgA单抗标记胶体金,用羊抗鼠IgG抗体包被质控线。
以上两种胶体金法检测试剂均采用EB病毒抗原包被检测线,检测线的抗原可与检测样本中的EB病毒IgG、IgA、IgM等所有抗体反应,由于IgG是血清中免疫球蛋白主成分,约占血清中免疫球蛋白总含量的75%,是检测目标IgA抗体的4~7倍,可严重竞争干扰检测目标IgA与包被EB病毒抗原的结合,造成检测结果灵敏度与特异性降低。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂,用鼠抗人IgA单克隆抗体划检测线,并引入生物素-亲和素系统,直接捕获检测样本中的全部IgA抗体,可以有效的避免IgG、IgM等抗体的干扰,提高检出的灵敏度与特异性。
本发明的另一个目的在于提供一种EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂盒。
本发明还提供所述检测试剂的制备方法。
根据本发明的一方面,一种EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂,至少包括
一反应膜,所述反应膜上划有检测线和质控线,所述检测线含有鼠抗人IgA单克隆抗体;所述质控线含有生物素;
一抗原垫,所述抗原垫含有由生物素标记的重组EB病毒VCA抗原和由生物素标记的重组EB病毒NA1抗原;
一金标垫,所述金标垫含有胶体金标记的亲和素复合物。
所述的EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂,其中优选地,所述检测线以包被浓度为1.4mg/ml的鼠抗人IgA单克隆抗体划线,所述质控线以包被浓度为2.2mg/ml的生物素划线,所述胶体金标记的亲和素复合物中亲和素的标记浓度为25μg/ml,所述生物素标记的重组EB病毒VCA抗原和NA1抗原中生物素的标记浓度分别为30μg/ml。
所述的EB病毒NA1-IgA抗体联合检测试剂,进一步包括一用于加载检测样品的样品垫。
根据本发明的另一方面,提供一种检测试剂盒,其包括所述的EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂,以及与之同时提供的相关使用说明、辅助检测工具、试剂和/或商品销售信息。
根据本发明的再一方面,提供制备权利要求1所述的EB病毒VCA/NA1-IgA抗体检测试剂的方法,包括:
1)划线NC膜的制备:用包被浓度的鼠抗人IgA单克隆抗体在NC膜上划检测线;用包被浓度的生物素在NC膜上划质控线;
2)金标垫的制备:将标记浓度的亲和素与胶体金偶联制备胶体金标记的亲和素复合物,浸泡涂抹玻璃纤维素膜制备金标垫;
3)抗原垫的制备:将标记浓度的生物素与重组EB病毒VCA抗原进行偶联制得生物素标记的重组EB病毒VCA抗原复合物;将标记浓度的生物素与重组EB病毒NA1抗原进行偶联制得生物素标记的重组EB病毒NA1抗原复合物,将标记好的两种抗原复合物等体积混合,浸泡涂抹玻璃纤维素膜制备抗原垫。
本发明所述的方法,优选地包括下述步骤:
(1)划线NC膜的制备:用磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgA单克隆抗体稀释到包被浓度为1.4mg/ml,将生物素稀释成包被浓度为2.2mg/ml,用金标划线机将两种包被液划到NC膜上,干燥后保存备用;
(2)金标垫的制备:将标记浓度为25μg/ml的亲和素与胶体金进行偶联制得胶体金标记的亲和素复合物,以转速为10000转/分钟离心30分钟,弃上清,加入胶体金结合物稀释液至原体积的80%,然后用稀释液按60μl/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫,干燥后保存备用;
(3)抗原垫的制备:将标记浓度为25~30μg/ml的生物素与重组EB病毒VCA抗原进行偶联制得生物素标记的重组EB病毒VCA抗原复合物;将标记浓度为25~30μg/ml的生物素与重组EB病毒NA1抗原进行偶联制得生物素标记的重组EB病毒NA1抗原复合物,混合两种抗原复合物,将混合液按60μl/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成抗原垫,干燥后保存备用;
(4)切割装配:将划线NC膜、金标垫、抗原垫、吸水纸、样品垫装配成反应板,再用切条机切成4mm的试纸条,装卡后,装入铝箔袋内制成检测试剂。
本发明所述的方法,其中NC膜、金标垫和抗原垫的制备中干燥条件为37℃干燥3小时。
本发明所述的方法,其中步骤1)中,检测线的包被浓度为1.4mg/ml,按0.15μl/mm的包被量包被NC膜检测线;步骤2)中胶体金的制备方法包括:在100ml双蒸水中加入1%氯金酸溶液1.0ml煮沸,在搅拌条件下加入1.4ml的1%柠檬酸三钠溶液,继续煮沸5分钟,自然冷却待用;胶体金标记亲和素的pH为9.0~10.0,亲和素浓度为25μg/ml,胶体金标记亲和素稀释比例为1:8,金标垫的制备条件为稀释后的胶体金结合物按60μl/cm2浸泡涂抹;步骤3)中,生物素的标记量为30μg/ml,质控线生物素浓度为2.2mg/ml。
本发明采用胶体金免疫层析法,将鼠抗人IgA单克隆抗体、生物素分别以条带状固定在NC膜上,金标记的亲和素吸附在金标垫上,生物素标记的重组EB病毒VCA抗原和NA1抗原吸附在抗原垫上,含有EB病毒VCA/NA1抗体的待测样品加到试纸条的样品垫上后,通过毛细作用向前移动,溶解抗原垫上的生物素标记的重组EB病毒VCA/NA1抗原和金标垫上的胶体金标记的亲和素后相互反应,再移动至固定在NC膜的鼠抗人IgA单克隆抗体区域反应形成金标记免疫复合物而被截留,聚集在检测带上。通过可目测的胶体金标记物检测人血清或血浆中的EB病毒VCA-IgA抗体或NA1-IgA抗体。
本发明用鼠抗人IgA单克隆抗体划检测线,直接捕获检测样本中的全部IgA抗体,可以有效的避免IgG、IgM等抗体的干扰,提高检出的灵敏度与特异性。
本发明引进生物素-亲和素系统(BAS),这是一种新型生物反应放大系统。亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力,其反应呈高度专一性。亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍,二者结合形成复合物的解离常数很小,呈不可逆反应性;而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。因此,BAS在实际应用中,产物的稳定性高,从而可降低操作误差,提高测定的精确度。此外,每个亲和素分子有四个生物素结合部位,因此,BAS具有多级放大作用,使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
本发明的有益效果为:EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂盒(胶体金法)具有快速、简便、准确和灵敏度高的特点,整个操作时间仅需20分钟就可判读结果,不需要辅助仪器,可直接肉眼观察结果,适用范围广,可单份检测,易于普及,对于EB病毒的检测和控制效果明显。
附图简述
图1为本发明检测试剂的生产工艺流程和检测原理图。
具体实施方式
下面结合附图,通过对本发明具体实施方式的描述,详细说明但不限制本发明。
材料来源:以下材料除非特别说明均由市售商购。
实施例1检测试剂制备条件筛选
1.胶体金颗粒的选择
1.1原理:根据煮沸条件下氯金酸与柠檬酸三钠发生氧化还原反应制备胶体金。通过调节氯金酸和柠檬酸三钠的加入比例来改变和控制胶体金的颗粒大小。
1.2制备方法
在100ml双蒸水中加入1%氯金酸溶液1ml煮沸,在搅拌条件下加入不同量的1%柠檬酸三钠溶液,继续煮沸5分钟以制备不同大小的胶体金颗粒,自然冷却待用。用不同大小的胶体金标记亲和素,以企业内部质控品为研究材料进行检测,结果详见表1,表2。
表1.1%柠檬酸三钠用量的选择实验——胶体金颗粒大小的选择(1)
表2.内部质控品检测结果——胶体金颗粒大小的选择(2)
结果分析:表1、表2可以看出,2号胶体金溶液颜色紫红、透亮,无混浊及漂浮物,标记后的胶体金亲和素其敏感性、特异性最好,故选择制备胶体金的工艺条件为:在100ml双蒸水中加入1%氯金酸溶液1.0ml煮沸,在搅拌条件下加入1.4ml的1%柠檬酸三钠溶液,继续煮沸5分钟,自然冷却待用。
2.胶体金标记亲和素工艺的优化
2.1原理:胶体金由于静电作用形成带负电的疏水胶溶液,胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与亲和素的正电荷基团形成牢固的结合,形成稳定的亲和素金标记物。
2.2胶体金标记最适PH值的选择
取若干个1.5ml离心管,分别加入1.0ml胶体金,用5.0mol/L的HCl和0.1mol/L的K2CO3将pH分别调整为3,4,5,6,7,8,9,10。每管加入50μg的亲和素,混匀,室温放置10分钟。每管加入100μl 10%NaCl溶液,混匀,室温放置2小时,观察胶体金颜色变化,记录胶体金颜色保持不变的最低pH(X)。调整pH为X-0.8、X-0.4、X、X+0.4、X+0.8,重复以上步骤,胶体金颜色保持不变的最低pH值即为标记的最适pH值。结果详见表3、表4。
表3.胶体金标记最适PH值的选择(1)
表4.胶体金标记最适PH值的选择(2)
结果分析:从表3、表4可以看出,当pH值为9.0~10.0时,金标记亲和素的稳定性好,故选定胶体金标记的最适pH值为9.0,即加入0.1mol/L的K2CO3 29μl/ml。
2.3亲和素最适标记量的选择
取若干个1.5ml离心管,分别加入1ml胶体金,用0.1mol/L的K2CO3将pH分别调整为9.0。每管依次分别按5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg加入亲和素,混匀,室温放置10分钟。每管加入100μl 10%NaCl溶液,混匀,室温放置2小时,观察胶体金颜色变化,记录胶体金颜色保持不变的最低亲和素加入量,胶体金颜色保持不变的最低亲和素加入量即为标记的亲和素最适标记量。结果详见表5。
表5.亲和素最适标记量的选择
结果分析:从表5可以看出,当加入的亲和素浓度为25~40μg/ml时,金标记亲和素不变色,故选定亲和素最适标记量为30μg/ml。
3.检测线包被浓度和胶体金标记亲和素稀释比例的选择
按照上述确定好的金标记工艺标记亲和素,将其体积浓缩至原体积的1/10,再以不同的稀释比例稀释浓缩液,用稀释液按60μl/cm2涂金标垫,干燥备用;
向原倍的重组EB病毒VCA抗原中按30μg/ml的浓度加入生物素,混匀,将混合液按60μl/cm2涂抗原垫,干燥备用。以不同检测线包被浓度按0.15μl/mm的包被量包被硝酸纤维素膜(NC膜)检测线。将金标垫、抗原垫和划线NC膜配对,检测内部质控血清,实验方案如表6,实验结果如表7、表8。
表6.试验设计方案
表7.10份阳性内部质控品和最低检出限质控品检测结果
表8.10份阴性内部质控品检测结果
用以上相同的设计方案,向原倍的重组EB病毒NA1抗原中按30μg/ml的浓度加入生物素,重复实验,获得相同结果。
结果分析:通过表7、表8结果可以看出D2组合的灵敏度高,特异性好,故将检测线的包被浓度定为1.4mg/ml,按0.15μl/mm的包被量包被NC膜检测线;将胶体金标记亲和素稀释比例定为1:8,即胶体金结合物稀释液加入至原体积的80%,原体积以胶体金体积计算。金标垫的制备条件为稀释后的胶体金结合物按60μl/cm2浸泡涂抹。
4.生物素标记重组EB病毒VCA抗原和NA1抗原最适标记量的选择
取若干个1.5ml离心管,分别加入1ml重组EB病毒VCA抗原。每管依次分别按5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg、35μg、40μg加入生物素,混匀,将混合液按60μl/cm2涂抗原垫,干燥备用。按照上述确定好的金标垫制作工艺、检测线包被工艺制作金标垫和划线NC膜,将金标垫、抗原垫和划线NC膜配对,检测内部质控血清。结果见表9、表10。
表9.10份阳性内部质控品和最低检出限质控品检测结果
表10.10份阴性内部质控品检测结果
结果分析:通过表9、表10结果可以看出,当加入的生物素浓度为25~30μg/ml时,抗原垫的灵敏度高,特异性好,选定生物素最适标记量为30μg/ml。
以重组EB病毒NA1抗原重复上述实验,获得相同结果。
5质控线包被浓度的选择
将生物素配成不同浓度,与鼠抗人IgA单克隆抗体1.4mg/ml,以0.15μl/mm的包被量分别包被在NC膜的检测线和质控线位置上,干燥后与制备好的金标垫配套使用,用内部质控品进行检测,结果详见表11。
表11质控线检测结果
结果分析:从表11可以看出,当C线抗体浓度≥2.2mg/ml时,反应到达最大值,所以选择最适质控线生物素浓度为2.2mg/ml。
综上所述,NC膜最终包被条件为:
包被量为0.15μl/mm;
检测线包被浓度:鼠抗人IgA单克隆抗体为1.4mg/ml;
质控线包被浓度:生物素为2.2mg/ml。
6.划线NC膜和金标垫干燥条件的选择
适宜的干燥条件,不仅影响试剂盒的灵敏度,而且关系到试剂盒的稳定性。结果表明,在干燥环境为37℃条件下,干燥3小时制备的试纸条,其敏感性,稳定性均较好,故选择37℃条件下干燥3小时为划线NC膜和金标垫生产的干燥条件。
实施例2.试剂配制
1.原料要求
1.1重组EB病毒VCA抗原和NA1抗原
生产商:香港神农有限公司
商品名:重组EB病毒VCA抗原、重组EB病毒NA1抗原
批号:20131224E(VCA)、20140126E(NA1)
外观:无色透明液体;
浓度及纯度要求:浓度大于2.0mg/ml,用SDS-PAGA测定,上样量在10微升条件下仅存一条带。
1.2鼠抗人IgA抗体
生产商:杭州隆基生物技术有限公司
商品名:鼠抗人IgA抗体
批号:20131105
外观:无色透明液体;
浓度及纯度要求:浓度大于2.0mg/ml,用SDS-PAGA测定,上样量在10微升条件下存两条带。
2.液体配制
2.10.05M PBS缓冲液的配制:
(1)标准配方:按照100ml量计。
纯化水定容至100.0ml
(2)配制方法
按照标准配方内容准确称取Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl加纯化水80.00mL,搅拌使充分溶解后,使用pH计测量液体pH值应在7.30~7.50范围内,用纯化水两倍稀释检测所配溶液的电导率应在9000μs/cm~13000μs/cm,用纯化水定容至100.00mL,混合均匀。2~8℃保存备用,有效期14天。
2.21%氯金酸溶液的配制:
(1)标准配方:按照100mL量计。
纯化水定容至100mL
(2)配制方法:
取一支1g/支的氯金酸,打开瓶子;量取2mL纯化水倒入容器内;取纯化水把氯金酸溶解并且将盛放氯金酸的试剂瓶清洗干净,将清洗瓶倒入容器内,再加纯化水至100mL;盖紧瓶盖,充分摇晃15分钟,混合均匀,用铝箔包好,2~8℃保存备用,有效期12个月。
2.30.1M碳酸钾溶液配制:
(1)标准配方:按照20mL量计。
K2CO3 0.276g
纯化水 20.0mL
(2)配制方法:
量取待配液体积80%的纯化水于试剂瓶中,按照标准配方中内容准确称取K2CO3加入试剂瓶中,加纯化水至20mL,使充分溶解。2~8℃保存备用,有效期14天。
2.410%牛血清白蛋白溶液的配制:
(1)标准配方:按照20mL量计。
牛血清白蛋白 2.00g
纯化水 20.00mL
(2)配制方法:
量取待配液体积80%的纯化水于试剂瓶中,按照标准配方内容准确称取牛血清白蛋白加入试剂瓶中,待完全溶解,加纯化水至20.0mL,使充分溶解,即用即配。
2.5胶体金结合物稀释液的配制:
(1)标准配方:按照100mL量计。
以纯化水定容至100.0mL
(2)配制方法:
按照标准配方内容准确称取三羟甲基氨基甲烷于容器中,加纯化水80mL,搅拌使充分溶解后,然后滴加盐酸使其pH调制到9.0,再将称量好的其他配方组分依次加入上述溶液中,充分搅拌溶解后,根据配方用加样器量取吐温-20加入试剂瓶中,使用纯化水定容至100.0mL,使用pH计测量液体的pH值为8.60~8.80。2~8℃保存备用,有效期14天。
2.6样本稀释液的配制:
(1)标准配方:按照100.0mL量计。
以纯化水定容至100.0mL
(2)配制方法
按照标准配方准确称取NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O,加纯化水80.0mL,搅拌使充分溶解后加入0.85g氯化钠,充分混匀,定容至100mL,使用pH计测量液体的pH值为7.30~7.50,4~30℃保存,有效期14个月。
2.7胶体金的制备:
(1)标准配方:按照100.0mL量计。
以纯化水定容至100.0mL
(2)制备方法
按照标准配方内容准确量取1%氯金酸溶液1mL,加入到99mL纯化水中,边加热边搅拌至沸腾;5分钟后,准确量取1.4mL的1%柠檬酸三钠,迅速、一次性加入到容器中,继续加热煮沸5min。冷却至室温后加入纯化水恢复至原来体积。2~8℃保存备用,有效期14天。
2.8检测线包被液体的配制:
(1)标准配方:按10mL量计。
以0.05M PBS缓冲液定容至10.0mL
2)制备方法:
按照标准配方内容准确量取鼠抗人IgA单克隆抗体12mg,加入到相应体积的0.05M PBS缓冲液中。充分混匀15min,即用即配。
2.9质控线包被液的配制:
(1)标准配方:按照10mL量计
0.05M PBS缓冲液定容至终体积10mL
(2)制备方法:
按照标准配方内容准确量取生物素22mg,加入到相应体积的0.05M PBS缓冲液中,充分混匀15min,用0.05M PBS缓冲液定容至终体积10mL,使生物素的终浓度为2.2mg/mL,即用即配。
2.10胶体金标记亲和素的制备:
(1)相关实际标准用量:按照80mL量计。
胶体金结合稀释液浓缩至终体积160.0mL
(2)制备方法:
按照试剂标准用量量取主配方规定量的胶体金于三角瓶中,准确加入主配方规定量的0.1M碳酸钾溶液,混匀,静置10min。准确量取主配方规定量的亲和素,快速搅拌下,将亲和素逐滴加入到三角瓶中,室温静置40min。准确量取主配方规定量的10%牛血清白蛋白溶液,快速搅拌下逐滴加入到三角瓶中,室温静置15min。10000rpm,4℃离心30min,小心弃去上清液,加入胶体金结合物稀释液至原体积的80%,2~8℃保存备用,有效期14天。
实施例3.EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂盒(胶体金法)制备
(1)划线NC膜的制备:用磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgA单克隆抗体稀释到包被浓度为1.4mg/mL,将生物素稀释成包被浓度为2.2mg/mL,用点膜机将两种包被液分别划到NC膜上,将已包被的NC膜干燥后保存;
(2)亲和素金标垫的制备:将标记浓度为30μg/mL的亲和素与胶体金进行偶联制得胶体金标记生物素溶液,以转速为10000r/min离心30min,弃上清,加入胶体金结合物稀释液至原体积的80%,然后用混合液按60μl/m2浸泡涂抹制成金标垫,将金标垫干燥保存;
(3)抗原垫的制备:按照已确定好的EB VCA胶体金法工艺用生物素标记重组EB病毒VCA抗原,按照已确定好的EB NA1胶体金法工艺用生物素标记重组EB病毒NA1抗原;将标记好的抗原等体积混合,摇匀后将混合液按60μl/cm2涂抗原垫,干燥后保存备用。
(4)切割装配:将划线NC膜、金标垫、抗原垫、粗纤维滤纸、样品垫装配成反应板,在用切条机切成4mm试纸条,进行装卡后,装入铝箔袋内制成产品。
实施例4.样品检测
1.检测样本的要求
血清样本按常规方法由静脉采集。血浆样本可以采用肝素、柠檬酸钠、EDTA进行处理。5天内测定的样本可放置4℃保存。样本放在-20℃至少可以保存3个月。样本避免溶血或者反复冻融。混浊或者有沉淀的样本要进过离心或者过滤后澄清后再检测。
2.检验方法
从原包装铝箔袋中取出试剂卡,放在水平工作台面上平置并做好样本标记。用加样器取10μl血清或者血浆样品,直接加入到加样孔中,再滴加样本稀释液2滴。15-25分钟内判读结果,25分钟后检验结果无效。
3.检验结果(需要联合检测的结果判读)
(1)、阳性:在质控区及检测区均出现紫红色条带。
(2)、阴性:只在质控区出现一条紫红色条带。
(3)、无效:质控区(C)未出现紫红色条带,表明不正确的操作过程或试剂已变质损坏,实验无效。
本产品阴阳性符合率、精密性、灵敏度等均符合质量标准要求,效期内产品质量稳定。类风湿因子、乙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、人类免疫缺陷病毒抗体、巨细胞病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体阳性标本不会对本品检测结果造成干扰。
4.反应时间和加样量的选择
生产EB病毒VCA/NA1IgA抗体联合检测试剂盒(胶体金法),对其反应时间和加样量进行确定。结果见表12:
表12.加样量和判读时间的选择实验结果
结果分析:从表12实验结果可以看出,加样量的多少会影响试纸条产生正确的反应结果,加样量低会出现漏检,加样量高时容易产生假阳性。通过以上实验结果,考虑到检测结果的稳定性和操作的方便性,选择加样量为10μl血清再加入90μl样本稀释液,15-25分钟判读为加样判读条件。
实施例5血清及血浆不同抗凝剂标本对比验证试验
采集血清用不同抗凝剂肝素、柠檬酸钠、EDTA处理血液样本和制备血清,用上述确定的生产条件制备的试纸条检测处理后的样本,结果显示:抗凝剂肝素、柠檬酸钠、EDTA处理血液样本对检测结果无影响,与血清检测结果一致。因此,本试剂盒可用于血清和血浆样本的检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换,这些修改和替换均应属于本发明的范围。
Claims (8)
1.一种EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂,至少包括
一反应膜,所述反应膜上划有检测线和质控线,所述检测线含有鼠抗人IgA单克隆抗体;所述质控线含有生物素;
一抗原垫,所述抗原垫含有由生物素标记的重组EB病毒VCA抗原和由生物素标记的重组EB病毒NA1抗原;
一金标垫,所述金标垫含有胶体金标记的亲和素复合物;
一用于加载检测样品的样品垫;
所述检测线以包被浓度为1.4mg/ml的鼠抗人IgA单克隆抗体划线,所述质控线以包被浓度为≥2.2mg/ml的生物素划线,所述胶体金标记的亲和素复合物中亲和素的标记浓度为25~40μg/ml,所述生物素标记的重组EB病毒VCA抗原和生物素标记的重组EB病毒NA1抗原中生物素的标记浓度为25~30μg/ml。
2.一种检测试剂盒,其包括权利要求1所述的EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂。
3.制备权利要求1所述的EB病毒VCA/NA1-IgA抗体联合检测试剂的方法,包括:
1)划线NC膜的制备:用包被浓度的鼠抗人IgA单克隆抗体在NC膜上划检测线;用包被浓度的生物素在NC膜上划质控线;
2)金标垫的制备:将标记浓度的亲和素与胶体金偶联制备胶体金标记的亲和素复合物,浸泡涂抹玻璃纤维素膜制备金标垫;
3)抗原垫的制备:将标记浓度的生物素与重组EB病毒VCA抗原进行偶联制得生物素标记的重组EB病毒VCA抗原复合物;将标记浓度的生物素与重组EB病毒NA1抗原进行偶联制得生物素标记的重组EB病毒NA1抗原复合物,将标记好的两种抗原复合物等体积混合,浸泡涂抹玻璃纤维素膜制备抗原垫。
4.权利要求3所述的方法,包括:
(1)划线NC膜的制备:用磷酸盐缓冲液将鼠抗人IgA单克隆抗体稀释到包被浓度为1.4mg/ml,将生物素稀释成包被浓度为≥2.2mg/ml,用金标划线机将两种包被液划到NC膜上,干燥后保存备用;
(2)金标垫的制备:将标记浓度为30~40μg/ml的亲和素与胶体金进行偶联制得胶体金标记的亲和素复合物,以转速为10000转/分钟离心30分钟,弃上清,加入胶体金结合物稀释液至原体积的80%,然后用稀释液按60μl/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成金标垫,干燥后保存备用;
(3)抗原垫的制备:将标记浓度为25~30μg/ml的生物素与重组EB病毒VCA抗原进行偶联制得生物素标记的重组EB病毒VCA抗原复合物;将标记浓度为25~30μg/ml的生物素与重组EB病毒NA1抗原进行偶联制得生物素标记的重组EB病毒NA1抗原复合物,混合两种抗原复合物,将混合液按60μl/cm2浸泡涂抹玻璃纤维素膜制成抗原垫,干燥后保存备用;
(4)切割装配:将划线NC膜、金标垫、抗原垫、吸水纸、样品垫装配成反应板,再用切条机切成4mm的试纸条,装卡后,装入铝箔袋内制成联合检测试剂。
5.权利要求4所述的方法,其中NC膜、金标垫和抗原垫的制备中干燥条件为37℃干燥3小时。
6.权利要求3所述的方法,其中步骤1)中,检测线的包被浓度为1.4mg/ml,按0.15μl/mm的包被量包被NC膜检测线。
7.权利要求3所述的方法,其中步骤2)中胶体金的制备方法包括:在100ml双蒸水中加入1%氯金酸溶液1.0ml煮沸,在搅拌条件下加入1.4ml的1%柠檬酸三钠溶液,继续煮沸5分钟,自然冷却待用;胶体金标记亲和素的pH为9.0~10.0,亲和素浓度为30μg/ml,胶体金标记亲和素稀释比例为1:8,即胶体金结合物稀释液加入至原体积的80%,原体积以胶体金体积计算,金标垫的制备条件为稀释后的胶体金结合物按60μl/cm2浸泡涂抹。
8.权利要求3所述的方法,其中步骤3)中,生物素的标记浓度为30μg/ml;步骤1)中质控线生物素浓度为2.2mg/ml。
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