JPS59224562A - 不均一系結合検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は液体成分と顆粒状粒子固相？゛所定１時間イン
キュベートする不均一系結合検定法に関する。

本発明は特に免疫分析検定法に関し、また本発明の不拘
−系結合検足法ケ実施するためのキットに関する。

結合検定法の基礎は、試料中の被分析物分子と特異的結
合相手との１川の結合相互作用できる。４足結果は、被
分析＊’に試料ケ特異的結合相手と所定時間インキュベ
ートし、被分析物に結合した特異的結合相手の量？決に
することによって得られる。不均一系結合検定法におい
ては、この決２ｙは、検定の成分ヤ物理的に分離するこ
とによって容易に行うことができる。これは、検だの成
分’（ｒ　％インキュベーション後に液体成分から取除
かレル固相に結合することによって達成される。不均一
系結合検定法ＶＣは多くの種類があるが、もつとも普通
なものは％外的結合相手として抗体ケ使用する抗原性被
分析物に対する検定法である。このような検定法の例と
しては放射線免疫検定Ｌ　ａ　Ｉ　Ａ　）等の免疫検定
法や免疫放射分析検ｉ（ＩＲＭＡ）等の免疫分析検定が
ある。ＲＩＡにおりてはイノキュペーショ／の間抗原注
破分析物の放射線標識類似物が同相に結合しｆｃ抗体と
結合すべく抗原性被分析物とｍ液中で競争する。適当な
所定のインキュベーション期間後固相？溶液から取除き
、洗浄し、固相と会合している放射線標識類似物の鰯′
を測定する。この量は試料中の抗原性被分析物の量に逆
比例する。Ｉ几ＭＡＶｃおいても、検出信号音発生する
ために標識抗体ケ用いる以ｌＡｒ１同様の方法に従う。

「サンドイッチ検定法」と呼ばれる特別の型のエルＭＡ
ＩＣおいては、抗原性被分析物の決定基に対し結合能カ
ケ有する抗体が同相に与えられている。抗原性被分析物
決定基に対する第２の標識された抗体は液体成分中に与
えられる。

固相と液体成分ケ被分析物を含んでいると思われる試料
と一諸にインキュベートする。存在する被分析物は固相
に結合し、標識された抗体は被分析物に結合する。イン
キュベーション後固相紫液体成分から分離し、同相と会
合している標識のｆｔ’に測定する。この量は存在する
被分析物の量？直接に示すものである。

不均一系結合検定法においては、種々の異る同相ケ使用
することができる。これらｒｉ破覆した管やビード等の
１単一粒子」から微小結晶体セルローズまたは細分した
シリカ等の細分粒子何科を含む。固相の選択は、結合剤
（全表面積と結合している）の８ｔや同相の使用上の便
利さ等多くの要因に支配される。たとえば、微細に分割
した粒子状材料は分配し易いという利点はあるが、固相
を検足試楽中の液体成分から分離するため遠心分離全装
するという不便がある。「単一粒子」システムは遠心外
１１１１１：　’に必要としないがノ２ラソキがあり、
結合剤としての容量が不充分である。

中間の大きさの固相は上記両極端の固相システムの妥協
点ゲ与えるものである。このような中間゛の大きさの固
相は、本明細書においては「顆粒状粒子固相」と呼ぶこ
ととするが、一般に高い結合剤芥量葡有しており、重力
（ｌｖの加速度）Ｋよる分離を許容するのに充分な寸法
と密度を有している。このよつな分離は一般に単位車力
沈降（ｕｎｉｔ　ｇｒａｖｉｔｙ　ｓｅｄｉｍｅｒ＋ｔ
ａｔｉｏｎ　）と呼ばれている（ジエイ、エフ、ライト
およびダプリュ、エム、ハンター「診療ｆヒ学用免投検
５ｉロア０〜１７７頁、チャーチル−リビングストン１
．９８３年）にの型の固相は分離のために遠心外ＰＪＩ
Ｉ　ｋ必要とせず、かつ満足すべき検に？行うのに充分
な結合剤容量？有する。インキュベーション後同相ケ検
定試桑中の液体成分から分離するために遠心分離ケ不要
とすることによって、検定法は非常に簡単なものになる
。特に、たとえば英国特許第１５６６０９８号明細書に
記載の密度分離技術を！ｌＩ＃１粒状粒子同相に関連し
て使用することができるので、簡単で安価な検定法が提
供される。

このような検定法の残る欠点は、インキュベーションの
間顆粒状粒子固相が検定の液体成分中ケ沈降してしまう
という点である。これは結合成分間の相互作用全署るし
ぐ損い、検定法の感度と精度ケ減小させる。したがって
このような検定法を使用する場合は、固相が遊離懸濁状
態に維持される仁と４確保するため顆粒状粒子同相と液
体成分の混合物？連続して攪拌する必要がある。加えて
、固相が液体中の懸濁物として容器中に貯蔵される場合
は、不正確な供給葡防止するため、使用前に固相全部が
懸濁状態にあること［１保する必要がある。

本発明は、顆粒状粒子同相紮使用し、イ／キュベーショ
／の間縫拌を必要としない不拘−系結合゛検定法ケ提供
するものである。

本発明ＶＣよれば、液体成分と顆粒状粒子固相と紮所足
時間インキュベートする不拘−系結合検屋法において、
少くとも該所定時間の間該液体成分の密度を該顆粒状粒
子固相の密度に実質的に等しい値に維持すること？特徴
とする不均一系結合検定法が提供される。

かぐしてＭ【力による顆粒状粒子固相の沈降は防止され
、または少くとも実質的に減小させることができる。本
明細書で用いる「実質的Ｖｒ−等しい」という言葉は、
インキュベーションの間軸粒状粒子固相の実質的な浮揚
または沈降ケ防止するために充分な精度ケもって液体成
分の密度？顆粒状粒子固相の密ＩＪｊｊＣ等しく維持す
ることケ意味する。

これによってインキュベーションの間検定成分を攪拌す
る必要がなくなり、検定工程は簡素化され。

攪拌機は不必要となる利点がある。

顆粒状粒子固相は５通常のインキュベーション混合物か
ら適当な時間内に重力ＶＣｌ２分Ｓ（単位重力沈降）し
つるよう適当な寸法と密度の粒子材料金倉むものである
。顆粒状粒子固相が通常のインキュベーション混合物か
ら重力により分離するのは５分ないし３０分が適当であ
り、特［５分ないし１５分（たとえば約２０分）がもつ
とも好適である。適当な顆粒状粒子固相ｔまデキストラ
フ。

アガロース、アクリルアミド重合体および共取合体等の
多孔性粒子まＬはラテックス粒子等の非多孔性粒子？含
む。適当な顆粒状粒子同相の粒子の例は５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　、８ｅｐｈａｄｅｘおよび５ｅｐｈａｃｒｙｌで
ある。、５ｅｐｈａｃｒｙｌ粒子、％に５ｃｐｈａｃ＋
ｙｌＳ−３００は特に好適である。、’（ｅｐｈａｃｒ
ｙｌ　　ｒまアリルデキストランｉＮ、Ｎ’−メチレン
ビスアクリルアミドで共有結合的に架橋することによＶ
調整される固いゲルである。５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−
３００の粒子は４０〜１．０５μｍの範囲の直径を有し
ている。

液体成分の密度は、顆粒状粒子同相の密度より大きい密
度ケ有する密度修正媒体ケ添加することに工っで、顆粒
状粒子固相の密度に実質的に等しい値に維持することが
好ましい。

適当な密度修正媒体は、検定システムの化合物に悪影響
を及ぼさず、かつ比較的に低粘度の溶液を適当に提供す
る非毒性高分子量物質ケ含む。密度修正媒体は砂糖（た
とえば蔗糖）の溶液、他の炭水化物（たとえばデキスト
ランまたｒ、Ｊ：Ｐ’１ｃｏｌｌ（高分子量の蔗糖の親
水性重合体））または他の重合体（たとえばポリビニル
ピロリジン）ゲ含むことができる。しかし顆粒状粒子固
相が多孔性の場合は、このような密度イし正媒体は顆粒
状粒子固相中に吸収されてその密度に影響を与えること
がありうる。このような場合には、コロイド等の不浴性
密度修正媒体が適当である。好ましい密度修正媒体はポ
リビニルビロリジ／で′Ｍ値したシリカ粒子のコロイド
＠濁物である。このような懸濁物は商業的に人手可能で
あり、　　Ｐｅｔｃａｌｌ　　として知られている。

顆粒状粒子固相は好ましくはＮ　、　Ｎ′−メチ１／ン
ピスアクリルアミドで架橋したアリルデキストラｙ？含
み、密度修正媒体は好ましくはポリビニルピロリジンで
被覆したシリカ粒子のコロイド懸濁物を含む。

５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３００ｋ顆粒状粒子同相と
して用いる好ましい検定法において、ＰｅｒＣｏｌｌ　
　のコロイド懸濁物を検定の液体成分に約４０％の割合
で合体すると、液体成分の密度は顆粒状粒子固相ゲ約４
時間懸濁状態に維持するのに充分なだけ上昇する。この
時間はたｒていの検定法にとって充分の長さである。

所定時間のインキュペーンヨ／に続いて、顆粒状粒子固
相を液体成分から分離することが必要である。

該液体成分の密度は、所定時間の経過後、液体取分と密
度修正媒体との混合物ケ混合物エリも小さい密度の液体
で希釈することによって減小し、顆粒状粒子固相が重力
により分離することケ許容することが好ましい。水また
は緩衝液のような希釈液ケ液体成分と媒体の混合物に添
加し、混合物の密度ケ減小させて、顆粒状粒子固相の車
力による分離ケ許谷することが適当である。残余の液体
成分と媒との混θ物ケ同相から分離するには遠心分離等
の適当な方法？用いればよいが、顆粒状粒子同相奮イン
キュベーション混合物から分離するため英国特許第１５
６６０９８号明雄書Ｖこ開示された分離法ケ使用するこ
とが好ましい。たとえば、インキュベーション後、希釈
液ケイノキュベーション混合物に添加し混合物の音度ケ
減小させるようにしてもよい。第２の肢体、好ましくは
１０％庶糖蔗糖はインキュベーション混合物の下に層音
形成し、顆粒状粒子固相は１に力にＬＦ）この第２の液
体の中１０分離される。このような分離技術ケ使用すれ
ば遠ｒ９分離の必要がなく有利である。したがって、好
ましい形において、本発明は、イノヤユペーショノの間
攪拌會必装とせず、さらに固相ケ液体成分から分離する
ため遠心分離ケ必要としない不拘−系結合検定法ケ実施
する方法？提供するものである。

本発明の検定法はＲＩ　Ａ等の免疫検定法でもよいし、
好ましくは、ＩＩＬＭＡ等の免疫分析検定法でもよい。

本検定法で用いる標識は放射能標識でも工いし、他の公
知の標識たとえば発光団、発色団、酵素、化学発光基環
ゲ用いてもよい、本検定法は広い範囲の溶液中の被分析
物の決定に使用することができる。このような被分析物
しこは診療上または診断上の重要性ケ有するものもあり
、たとえば、ホルモン（たとえは甲状腺刺激ホルモン（
Ｔ　Ｓ　Ｈ）、ヒト成長ホルモ７　（ｈ　ＧＨ）、卵胞
刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン）、ステロ
イドおよびその中間代謝物（たとえばエストロゲンおよ
びプロゲストゲン）、診ＫＪｉ用のタン白質（たとえば
アルファフィートプロティン（ＡＩ”Ｐ））および抗原
（たとえばクラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ　）抗原お
よびヘルペスウィルス抗原）等が含まれる。

不均一系結合検定法のインキュベーション時間はしばし
ば数時間？要し、この種の検定法ケ実施するに際しての
著るしい難点となっている。

不均一系結合検定法の本質は、検定成分が固相に付着し
た結合相手と会合することによって浴液から取除かれる
ように固相に付着する結合相手ｒ提供し、この固相？後
で浴液から取除くことにある。したがってこの方法は固
相と液相との間の会合を套装とし、これは力学的に不利
であって、このため長時間のインキュベーション會必要
とするのである。

好ましくは不均一系結合検定法は、ビオチンが共有結合
する結合相手會含む検定成分ケ含有する浴液と、アビジ
ンが共有結合する顆粒状粒子固相と分イ吏用し、 （イ）該顆粒状粒子同相の不存在下に該浴液検定成分會
インキュベートする工程 （ロ）該インキユペートシｆｃ浴液成分を該顆粒状粒子
固相と接触させることにエリアビジンとビオチンの会合
全許容する工程 （ハ）顆粒状粒子同相ケ溶液成分から分離する工程 を含むことが好ましい。

この好ましい型の検定法は、能動的検定成分が浴液中で
インキュベートして結合化学種ケ形成し、かつこの化学
稲が顕粒状粒子同相上にすみやかに固定されることを可
能とする。この好ましい型の検定法はサンドインチ型の
免疫分析検足ケ実施する際ＶＣ％に有効である。この種
の検定法においては、標識抗体、被分析物ケ含むと思わ
れる試料およびビオチンが付着する抗体はｍ液中でイン
キュベートすることができる。この３つ組の免疫複合体
は浴液中のいかなる被分析物についても形成しつるもの
である。後の段階におけるビオチノーアビジン相互作用
により、免疫複合体は、アビジンが付着している顆粒状
粒子同相に結合することができる。次に顆粒状粒子固相
に会合した標識の量ケ測定すれば工い。本検定法は結合
検定に安するインキュイー９３フ時間會大幅に減小させ
る。このインキュベーション時間の減小ｔよ所与の検定
ゲ実施するために心安な全体の時間ケ短縮し、単位重力
沈降ケ含む検定法においては、インキュベーション時に
おける望ましくない沈降の可能性ケ減小させる。

本発明の他の面においてｔよ、■または複数の検定試薬
容器ケ含むキットであって、音曲修正媒体が別個の容器
または検定試薬の容器の１または複数によって提供され
る不拘−系結合検足法ケ実施するためのキットが提供さ
れる。

好ましくは、キットは試料中の抗原憔被分析物のための
免疫分析検定法ケ実施するためのキットであって、被分
析物に対する標識された抗体と、被分析物に対する抗体
であって顆粒状粒子同相に結合した抗体と、密度修正媒
体と勿含与、これらの試薬ゲ１または複数の容器に別個
にまたはいずれかの組合せで含む。

好ましくは、キットは、被検出物に対する抗体であって
顆粒状粒子固相に結合した抗体ケ、液体の密度が顆粒状
粒子同相の密度と実質的に等しくなるように密度修正媒
体ゲ含む液体中１ｃ懸ｌ蜀状態で含有する第１の容器と
、第１の容器の試薬と第２の容器の試楽ケ試料と混合し
た時液体成分の留出ｉが顆粒状粒子固相の密度と実質的
に等しくなるように被分析物に対する標識抗体と密度修
正媒体とを含有する第２の容器と紮含む。第１の容器に
密度修正媒体ケ含ませることは、！ｌＪ粒状粒子同相が
均一な懸濁状態で保持される結果試薬の圧砕な供給が容
易になるとｂう利点ケ有する。

好捷しぐは、キットは、被分析物に対する標識抗体と、
ビオチンが共有結合する被分析物ＶＣ対する抗体と、ア
ビジ／が共有結合する顆粒状粒子同相と、密度修正媒体
とケ含み、これらの試薬’ｋｌまたは複数の容器に別個
ＶＣまたはいずれかの絹合せで含む。

以下添付図面ケ参照して本発明の実施例ケ詳細ｉｃ説明
する。

実施例１ 未修正５ｅｐｂａｃｒｙｌ　Ｓ　　３００　（Ｐｈａｒ
ｍａｒｉａ　）固相支持体ケ検定中懸濁状態に維持する
ために心安なＰｅｒｃｏｌｌ　　Ｌ　Ｐｈａｒｎ・ａｃ
ｉａ　、製品査号ＰＩ６４４）高密変媒体の濃度？決定
するため実験ケ行った。

５ｃｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　　３０　Ｕ　ｋ　３％　ｖ／
ｖ　　Ｔｗｅｅｎ希釈ｉ　（０，２５Ｍ　　′ｒ　ＩＬ
Ｉ　Ｓ　　緩＋ｉｉ液、ｐ【Ｉｓ５．０１％　ｗ／ｖ　
　アジ化ナトリウム＋３％　ｖ／ｖ’ｒｗｅｃｎ　　２
　Ｑ　（１３１）Ｉ（ＣｈｅｍｉＣａｌ　Ｃｏ。

Ｌｉｍ１ｔｅｄ　）　ｋ含イ■）に含有する検定管に４
’Ｊｌ数本作り、各検定管には３７〜４５％　ｖ／ｖの
商業ＰｅｒＣｏｌｌ　　懸ｚａｉｉ％きざみで異るよう
にして含有せしめた。各管の内容ゲ１辰とうし、試験管
ラックに静置した。４８＃間鏝各管孕検査したところ、
３９％　ｖ／ｖ以下のＰｅｒｃｏｌｌ　　ケ含む管にお
いては、’Ｓ　ｅ　ｐ　＋＋　ａ　ｃ　ｒ　ｙ　ｌ　　
は−東方の作用にエリ沈降していた。４１％　ｖ／ｖ以
上のＰｅｒｃｏｌｌ　　ケ含む管においては、５ｅｐｌ
＋ａｃｒｙｌ　は浮揚していた。４０％Ｐｅｒｃｏｌｌ
　’（含む管においてｒｉＳ　ｅ　ｎ　＋＋　ａ　ｃ　
ｒ　ｙ　＋　　は懸陶状態で維持されていた。

これらの実験は１代表的な検定液中のＳ　ｅ　ｐ　ｈ　
ａ　−ｃｒｙ１８−３００混合物のインキュベーション
のための適当なｌ’ｅｒｃｏ目　濃＃は約４０％ｖ／ｖ
であることケ示している。

アルファフィートゾ【〕ティン（ＡＦＰ）決定のｆｔめ
モノクローナル／ポリクローナル抗体ＩＩＬＭＡケ実験
した。妊娠中の胎児の異常音検知するために血清および
羊水中に含まれるこのタン白質の側型が行われる。この
実験はインキュベーショノ中攪拌を行う検定法と攪１′
ｌニゲ行わない検定法（比較例）の差異ケ示すために行
われた。インキュベーション中の密度制御の効果？示す
ために本発明の結合検定法ケ用いた。

濃度既知のＡＦＰ標準＠液ケ用いて０〜６００ＫＵＩ−
１の範囲の４本の検定管ケ調整し、　　ＩｌｔＭＡ法で
検定した。このＩ　ＲＭＡ法は、以下の比較実験Ｎ　２
　（ａ）においては、インキュベーション中高密度媒体
ケ使用せず攪拌ケ行い比較実験例２ｉｂｌｖｃおいては
、インキュベーション中高密度媒体ケ使用せず攪拌も行
わず、比較実験例２（ｃ）Ｖｃおいてはイ／キュペーシ
ョン中高密度媒１；［ＨＤＭ）全使用し攪拌を行わなか
った。

検定管ケ４本用意した。各検定管１’（はＡＦＰｌ’Ｊ
準液、トレーサおよび同相試薬の各５０μ！アリコツト
會各検定管に順にピペットで注入した。

ＡＦ’Ｐ標準溶液はＯＩＣおいて既知濃度で、かつ希釈
液しての５０％子ウシ血清（０，２５Ｍ　　ＴＲｌ５緩
関液、ｐＨ８，５，０６１％　ｗ／ｖアジ化ナトリウム
＋５０％子ウシつ清？含；［Ｉｉ″ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏ　−ｒｉｅｓ　、　Ｆｌｏｗ子ウシ血つＭ−２９
０５３１０４）　）の中でＯ１６〜６００　ＫＵ＃　の
範囲のＡＦＰのｍ液からなるものであった。ト１ノ−サ
としては、１２５■標識モノクローナル抗−ＡＦＰであ
るＡＦＰｌ　４４　（Ｖ　、　Ｖａｎ　Ｈｅｙｎｉｎｇ
ｅｎ　ｅｔ　ａｌ、０ｈｕｒｃ−ｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎ
ｇｓｔｏｎｅ　ｌ　９８３年発’ｆＴＩｍ＋ｎｕｎｏａ
　−５ｓａｙｓ　ｆｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｏｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　　５０９〜５１５頁）會３％　ｖ／ｖヒツ
ジ血清希釈液（０，２５Ｍ　　ＴＲ，Ｉｓ　　緩衝液、
ｐＨ８，５、Ｏ１％ｗ／ｖアジ化ナトリウム＋３％　ｖ
／ｖヒツジ血清）中４００　ｎｇ　／ｍｌ　　の濃度で
使用した。固相試姑は３％　ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ　　希
釈液（０，２５Ｍ　　ＴＲｌ５緩衝液、ｐＨ８，５，０
１％　ｗ／ｖ　アジ化ナトリウム＋３％　ｖ／ｖ　Ｔｗ
ｅｅｎ　２０　Ｌ　Ｂ　Ｄ　ＨｃｈｅｍｉｒａｌＣｏ、
　Ｌｉｍ１ｔｅｄ　）　）中に未修正の５ｅｐｈａｃｒ
ｙｌＳ　−３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）の静置ゲル
Ｉｃ　８　ｍｇ、ｌ／−のカギ抗−ＡＦＰガンマグロブ
リン（５ｃｏｔｔｉｓｈＡｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏ（ｌ
ｕｃｔｉｏｎ　Ｕｎｉｔ　Ｆ＋ｄｉｎｂｕｒｇｈ供給）
會結合させたもの１２．５％　ｖ／ｖ　ｐ含ませた懸濁
液紮有していた。

上記標準液、トレーサおよび固相試薬を添加した後、各
検定管の内容ゲゼルテツクス混合によって混合し、各検
定管ケオービタルシェーカー（１５０ｒｐｍ、軌道径１
　ｔｒｎ’）にエリたえず攪拌しつつ室温で２時間イン
キュベートとした。インキュベーション完了時に洗浄緩
衝液（０，２５ＭＴ几Ｉｓ緩衝液、ｐＨ８，５、（＋、
　１％　ｗ／ｖ　　アジ化ナトリウム＋１％子ウシ血清
＋１％Ｔｗｅｅｎ　２０　）１５−ケ各管に添加しｆｃ
。

次いで英国特許第１，５６６，０９８号による分離方法
全使用して固相？残余のインキュベーション混合物から
分離した。蔗糖層形成溶液（０，１％ｗ／ｖアジ化ナト
リウムと１％　ｖ／ｖ　’［’ｗｅｅｎ　　２０紮含む
ｌ　０％　ｗ／ｖ庶糖水浴液）ケ各管内のインキュベー
ション混合物の基底部に管状の金ｖＡプローブによって
添加し、インキュベーション混合物の下に分離層音形成
させた。次いで各管ケ室温で２０分間静置した。この間
に固相は車力によりインキュベーション混合物から蔗糖
層ケ通って検定管の底部に沈降した。同相沈降部をかく
乱しない゛ように注慧しながら吸引管ゲゆっくり検定管
の上からおろして吸引することにより、インキュベーシ
ョン混合物中の液体部分と蔗糖層の上部を各肯から取除
いた。吸引後約（）５−の蔗糖層が容管に残り、この中
に沈殿した固相全部が含まれていた。

次いで各′ｇＩＶＣさらに洗浄緩衝液１．５　ｍｌ　ｋ
添加し、さらに蔗糖層形酸浴ｉ２−ケ添加して蔗糖分離
工程？繰返した。次いで各管内の固相に結合した放射能
カウント’ｒガンマ計数器ケ使用して計数した。

インキュベーション中攪拌ケ行わなかった以外は上記Ａ
ＦＰ　　ＩＲＭＡ工８ヶ行った。

高密度媒体であるＰｅｒｃｏｌｌ　　ｆ固相ケ懸濁状態
に維持するのに丁度充分な濃度てインキュベート物に含
ませたこと以外は、インキュベーション中攪拌ケ行うこ
とケ省略して上記と同様にＡ　［ｉ’　ＰＩ　ＲＭＡ工
稈を行った。ＰｅｒＣｏｌｌ　　（５１Ｆ！！品番号Ｊ
’ａＰ１６４４、米国Ｓｔ、　ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ
　Ｏｈｅｍｉ−ｃａｌ　Ｏｏｍｐａｎｙ供給）は非迫析
性のポリビニルピロリジンヶ塗付したシリカ粒子のコロ
イド懸濁水？含む。このポリビニルピロリジンは、密度
１、１３０±０．００５５／／ｍ！、電導Ｋ　１．　Ｏ
ｍｓ／　ｔｍ。

重量オスモルｔＷ％ｆｆ１２０　ｍｉｓ　／ｋｐＨ２０
、帖厖１０士５ｃＰ（２０℃）、ｐＨ８，９±（０，３
（２０℃）、屈折率１．３５４０±（１，０００５（２
０℃）である。

この１組の検定法において使ったト１／−プおよび固相
試薬には商業Ｐｅｒｒｏｌｌ　　懸副液が含まれていた
。ト１／−サはＰｅｒｃｏＩＩ８４％　ｖ／ｖ、　　ま
た固相ｕ　Ｐｅｒｒｏｌｌ　４０％　ｖ／ｖ　ｋ含み、
これらの試薬のその他の成分は、前の検定の最終インキ
ュベーション混合物におけるこれら成分の濃度と同じに
なるようにその濃［？ｒ適当に調節したす、固相試薬に
おけるＰｅｒｃｏ目　濃度は固相孕懸濁状態に保持し、
長時間にわたりアリコットヶ均一な組成に維持すること
ケ助ける。トレーサと固相のＰｅｒｃｏｌｌ　　０世は
、最終インキュベーション混合物巾約４１３９どの濃度
がインキュベーション中固相を懸濁状態に維持するため
に必要なＩ７１・度である。

インキュベーショノ完了時に洗ζす緩衝（Ｉｔ　１．５
　ｍｅ　ｆ添加することＶＣよＶ）　Ｐｅｒｃｏｌｌ　
　ケ希沢し、５ｅｐｌ＋ａＣｒｙｌ　Ｓ　−３００固相
ケ蔗糖層分−Ｗの間にヰ（力にエリ沈降させた。

得られた結果は、第１図において、偉■五浴液に使用し
たΔＦ　Ｉ’儂度（ＫＵＡ’）ｖｃ対１−る全結合カウ
ント（［１分当りカウント）の百分率の標イ■曲線の形
で示される。全カウントは１１ノ−サ単独の５０１１、
ｅアリコツトＶＣよって与えられるカウントを測定する
ことにより決定された。第１図において、曲、！Ｊ！ａ
）はインキュベーンヨ／中搦、拌ゲ行いかつＰｅｒｒｏ
ｌｌ　　ｋ使用しない通常のＡＦＰＩＲＭＡについて得
られた結果ケ示す曲線である。曲線ム）は攪指：金行わ
ずかつＰｅｒｃｏｌｌ　　ゲ１史用しない結果ケ示す曲
線であり、曲線Ｃ）はインキュベーション中攪拌ケ省略
したがＰｅｒｃｏｌｌ　　ｋ使用した修正検定法につい
て得られた曲線である。曲線ａ）とＣ）は４Ｍ測定の手
段としての結果ケ示す。曲線ｂ）は２爪測定の手段とし
ての結果ケ示す。曲線ａ）と１〕）の比較は通常のＩＲ
ＭＡのインキュベーション中の攪拌の重便性ケ示す。曲
線ａ）とＣ）の比較は、）’ｅｔｃａｌｌ　　’、（使
用し攪「１：ヶ省略した時得られる結果はインキュベー
ション中Ｈｌ”ｌ’　ｋ使用する通常のＩ）ＬＭＡｖｃ
おいて得られる結果より優ると１では言えないまでも劣
らないことケ示している。

未知濃度の試料中のΔＥ’Ｐを決定するｆｃめ、試料の
５０μＢアリコツ１ｒ１９準溶液の代りＶＣ使用し、Ａ
Ｆ’Ｐ儂蛭は得られた結果ケ適当な標準曲線と比較する
ことによって決定された。

実施例 血清中のヒト成長ホルモン（ｈＧｌｌ）の決定のため２
車モノクロ一ナル抗体ＩＲＭＡが試験びれた。

コノ方法は英国特許第１．５６６，０９８号明＃ＩＩ　
＊　Ｋ記載された顆粒状粒子固相の密度分離ケ使用する
ものである。この検矩法は標識モノクローナル抗体と固
相モノクローナル抗体の双方を含む２時間のインキュ４
−ジョン時間？用いるものである。

このため固相紫懸濁状態に維持するためこのインキュ４
−ジョン時間中攪拌が必要である。インキュベーション
混合物中に高密度媒体？含ませることにより攪拌の必要
がなくなり、しかも検定結果には影響ケ与えない。２つ
の実１験が行われた。比較実験例３　（ａ）においては
インキュベーション中攪拌？行った。比較実験例３（ｂ
）においては、攪拌は行わず、高密度媒体を添加するこ
とにより検定混合物の密度ケ綿密に制御した。

通常の医療研究室の患者試料受入れ物からランダムに３
８の患者試料ケとり次の方法ケ用いてｈＧＨに関する検
定全行った。検定管は２重に調整し、検定管の各対には
患者試料またはｈＧＨ標準溶液のいずれ刀”ｋ５０ｍｌ
含ませた（標準曲線？作成するために使用された標準は
０，０．３１２５．１）、　６２５．１２５．２５．５
．１０．２０，４０゜８０．１６０．３２０．６４０　
ｍ［Ｊ　ｈＧＨ／Ａ　Ｔある）。また各検定管は、１％
　ｖ／ｖの通常のマウス血清？含有する希釈液中の４０
ｍｇ／ｇ、ｅの１２１１１１標識ｈＧＨ（ＥＳ　３　）
　モノクローナル抗体１００　ｔｔ、ｅおよび２．５　
％　　ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ　　２　Ｑ　ｐ含有する希釈
液中の固相（ＥＳ　７−８ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ７３＋
）０　）上に固定されたｈＧＨモノクａ−ナル抗体の１
０％（ＴＯ＠　ｖ／ｖ　）　懸濁液ケ含んでいた。モノ
クローナル抗体−固相ば、０５〜／　ｍｌのモノクロー
ナル抗体（＋−標準方法（Ｗｒｉｇｈｔ、　Ｊ、Ｆ、お
よびＨｕｎｔｅｒ、Ｗ、Ｍ、Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９ｇ２年）４８　３１１〜３２
５頁）により固相に連結された。希釈液は（１，１ＭＴ
几ｌ５Ｈｅｌ　ｐＨ８，０および２％ｖ／ｖ子ウシ血清
であった。検定管の内容ケ混合し、オービタルシェーカ
（３００ｒｐｍ、　　２ｔｒｎ軌道）によＶ室温で２時
間攪拌し、次いで２つの蔗糖分離液（英国特許第１、．
５６６，０９８号明細書）紮使って分離した。各検定管
の分離同相に結合している放射能カラントゲ測定した。

１２８１　　ｆｆ１ｊＨ識モノクロ一ナル４冗体浴液中
［８１％ｖ／ｖ　Ｐｅｒｃｏｌｌ　’ｚ含ませ、かつ同
定したモノクローナル抗体の懸濁液に４（）５％　ｖ／
ｖ　Ｐｅｒｃｏｌｌを添加した点會除き比較実験例３（
ａ）の方法に従った。混合後生成液体混合物はモノクロ
ーナル抗体−固相の密度とほぼ等しい密度ケ有し、その
結果室温で２時間のインキュペーンヨン中千７＋１件な
しで固相は懸濁状態に留まっていた。

第２図は比較実験例３（ａ）の方法を使用して得た標準
曲線（曲線（ａ））と比較実施例３（ｂ）の方法紮使用
して得た標準曲線（曲線（ｂ）　）　？示す。これらの
結果は、比較実験例３　（ｂＪにおいて攪拌紮行わなか
ったにもかかわらず、はとんど差がないことケ示してい
る。

！！３図は比較実験例３（ａ）および３（ｂ）の検定法
の結果の相関関係ケ示す図である。相関係数は０、９９
７である。

実施例４ 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の決足のため２重モノク
ローナル抗体Ｉ　）ＬＭＡが試験された。この実験は、
検定の成功のために必要なインキュベーン３フ時間ケ減
小させ、かつ密度修正がインキュ４−ジョン中の攪拌を
不必要とすることケ示すために行われた。これは、同相
モノクローナル抗体をアビジンに結合した抗体とビオチ
ン紮支持する固相で置換することにより達成きれた。こ
の方法で３つ絹の免疫複合体ｋ　ｆａ　Ｈ中に形成する
ことができ、この複合体ケ次いでビオチン−アビジン相
互作用全弁して固相へ刺着することにより取除くことが
できる。

次の方法を使用してＴ　Ｓ　ＨＩ　１１．　Ｍ　Ａ　［
関する標準曲線ケ作成した。検定管は、希釈液（０，０
，１５６，０，６２５，２，５，１０，４０，１６０ｒ
ｎ［ＪＴｓＨ／Ａ　　）中の３５％　Ｖ／Ｖ　子ウシ血
清中のＴＳＨ標準浴液１００μ！と、希釈液中の２０ｎ
ｇ／ｍ／　　”５Ｉ　標識モノクローナルＴ　Ｓ　Ｈ（
３２３）抗体１００μ！を含むようにして調整した。各
管の内容ケ混合し、室温で２時間静置した。この時間経
過後３％　ｙ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ　　２０會含む希釈液中
の固相（４２−５ｅｐｈａＣｒｙｌ　Ｓ　−３００）上
に固定されたＴＳＨ１’Ｃ対するモノクローナル抗体の
１０％（静置　ｖ／ｖ　）懸舖液を添加した。各希釈液
は０．　Ｉ　Ｍ　　Ｔ　ＲＩ　Ｓ　　ＨｃＡ　ｐＨ８，
０および２％ｖ／ｖ　　子ウシ血清からなるものであっ
た。各前音オービタルシェーカー（３００ｒｐｍ、　１
３ｔｍ軌道）で１時間攪拌した。次いで２つの蔗糖分離
液（英国特許第１，５６５．０９８号明細書）を使って
固相を液体成分から分離した。容管の分離固相に結合し
た放射能力ウノトケ計数した。

比較実験例４（ｂ） 次の方法全便ってＴＳＨＩ）ＬＭＡＩＣ関する標準曲線
全調整した。比較実験例４（ａ）と同様ＴＳＨ標準ｍ液
ケ含むようにして検定管？調整した。各検定管に希釈液
中＋７）　２０　ｍＷ／　ｍｅ”　Ｉ　標識Ｔ　８　■
１（３２３）モノクローナル抗体１００μｊ、ビオチ：
ｙ　ｖＣ共！結合Ｌ　Ｌ　２０００　ｒｎｇ／　ｒｎｌ
！　Ｔ　Ｓ　Ｈ（３２３）モ）りｏ−ナル抗体および希
釈液中の６０％１’ｅｒｒｏｌｌ　　（ｖ／ｖ）　ｋ添
加した。希釈液ｔｊ：　１１．　］　Ｍ１’　ＩもＩ　
Ｓ　　ＨＯｌｐｌ’＋　８．０および２９６　　ｖ／ｖ
子ウシ血清であった。モノクローナル抗体は、　ｐ［１
７，５させることによってビオチ／に何）ηした。反応
終了ｆ＆ｎ、　２　ｓ　Ｔｌ（Ｉ　Ｓ　　ｘ］ｏｐ　ｐ
ｌＩ　８．５中のｔ’ｈ：ｑｒｎ：＋ｃｆＰＤＩ　Ｏカ
ラムで、また次に０．２５　’ロロＳ　　ＨＯＩ−ｐＨ
８，５中の２０ｔｍ　　５ｅｐｈａｄｅｘ　　０５０　
８Ｆ’カラムで初期分１？ＩＵ　？ｒ行うことＶＣより
未反応のビオｆ−ノケ除去した。室温で２時ｌ１ｌ１１
４０分の間検定管ケ静１賀した、この時間が経過しｔ俵
、希釈液中の５ｅｐｈＲｃｒｙｌ　Ｓ　−３００固相に
付着したアビジノの１０％（静Ｒｖ／ｖ　）　ＭＧ液Ｊ
　００　ｔｔｌｋ　、：（％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅａｎ　２
０お工び６０９６ｖ／ｖ　Ｐｅｒｒｏ目？ｌ肯に添加し
た。アビジンは、５ｍＭ過゛３−素酸でａｔ化した８ｅ
ｐｂａｃｒｙｌ　Ｓ　−３００ＩＣＤ、　ｌ　ＭＮ　ａ
　Ｈ２Ｏ２中において８ｍｇ／−の初期６閣でかつｐＨ
９，０で付着し７ｔ　（Ｗｒｉｇｈｔ　、　Ｊ　、　Ｆ
　、　お工び１−１ｕｎｔｅｒ　　Ｗ　　、　　Ｍ　　
、、　　　Ｊ　　、　　１＋ｒ＋ｍｕｎｏ１．　　　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ（１９８２）４８　３１１−３２５員）５
各管ゲさら［２０分間静置した。次いで２つの蔗糖分離
液（英国特許第１，５６６．０９８号明細書）を使用し
て液体成分から固相荀分離した。次いで各検定管の分Ｎ
ＩＬ固相に結合した放射能カウント’（ｒ測定した。

第４図は比較実験例４　（ａ）　（曲線（ａ））および
比較実験例４　（ｂｌ　（曲線（ｂ））の方法を使って
得た標準曲線？示す。これらの結果は、ｌ几ＭＡ結合検
定の固相反応時間の減小は、アビジン／ビオチン等の結
合活性の強い結合試薬ゲ使用することによって、検定法
の感度の有意な減小なしに達成することができることを
示している。

【図面の簡単な説明】

第１図はアルファフィートプロティン免疫放射分析検定
に関する除重曲線ケ示す図（曲線（Ｃ）は本発明の検５
ｊＥ−法による結果、曲線（ａ）　、　ｔｃ）は比較実
験の結果？示す）、第２図はヒト成長ホルモンに対する
２車モノクロ一ナル抗体免疫放射分析検定に関する標準
曲線？示す図（曲線ｔｂ）ｕ本発明の検定法による結果
、曲線（ａ）は比較実験の結果ケ示す）。 第３図は本発明により行われたヒト成長ホルモンに関す
る検定の結果（Ｙ軸）と診療試料について行った比較実
験（ｘｌａｌ＋）の相関関係會示す図、第４図は甲状ｌ
尿刺激ホルモンＶＣ関する２車モノクロ−カル抗体免疫
放射分析検定に関する標準曲線ケ示す図（曲線（ｂ）は
本発明の検定法の結果、曲＃（ａｌは比較実験例の結果
ケ示す）である。 出願人　代理人　　坂　本　　徹Ｉ゛　　、（ほか１名
）″−゛ 図面の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ ＦＩＧ、　４ ｍｕ　　丁ＳＨ／ｌ ン イギリス国バークシア・ウオー キンガム・エンプルツク・ウラ ドパ−スト・レイン１番 ＠）発　明　者　ジョン・フレデリック・ライトイギリ
ス国アールジー５３エ イニス・リーディング・ウッド レイ・セルコート・クローズ９ 番 ０発　明　者　マイケル・ジョゼフ・パラエルイギリス
国ニスエル６３エイ チキュー・バークシア・メイド ンヘッド・ホリーポート・エイ スガース・パーク８９番 千　牟ダｉ　ン山−ｔし￥！ｉ’＊　　’（ｊ）式）％
式％ １、事件の表示　　　　　　　　　　　　　　　　匹る
昭和５９年　特晶′］願　第　ミ５０１３２　　シー）
２、発明の名称 不均一系結合検定法 ３、補正をりる者 事件との関係　　特許出願人 ブーツ・セルデック、ダイ）７グノスーアイツクス。 リミテッド ４、代理人 ６、補正の対象 図面 ７、補正の内容 図面の浄ド）（内容に変更なし） 手　　続　　補　　正　　書 昭和５９年６月／／Ｅ＋ ２　発明の名称 不均一系結合検定法 ４　代　Ｊ星　人　　（郵便番号１０５）東京都港区西
新橋−丁口１８番６号　童宝ヒル５　補正命令の１」伺 −・　　　　　　　− ８、補正の内容 （１）　　明細書第１２頁第１］竹１約４０％」を１約
４０係（ｖ／ｖ月に訂正する。 （２）　　同第２７頁第１９１’ｉ　ｒ　５１Ｊ　１ｎ
ｆｌ　Ｊを「Ｓ刀μＩＩＪに訂正する。 （３）同第２）１エｍ　４　”ｆｉ　ｒ’４０ａ９　／
＋＋ｆＪ　ｋ　１４０　ｎｆＡｎＲＪに訂正する。 （４）　　同第３１　頁第　６　　Ｔ丁　ｒ　Ｈｃｌ！
　Ｊ　　ｋ　　ｒ　ＨＣｌＪ　　Ｋ、ｎ１正する。 （５１同第３１頁第１７行ｒ　２１＋　ｑｇ／　燻Ｊ　
？　ｒ　２（ｌ　ｎ’ｚ’／’ｎＪに打面する。 （６１同第３２負第７行および第８付「０．２５」をｒ
Ｏ，２５ＭＪに訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　液体成分と顆粒状粒子固相と會Ｆフ「定時間イノキ
   ュベートする不均一系結合検定法において、少くとも該
   所定時１４１０間該液体成分の密度ゲ該゛顆粒状粒子同
   相の密度に実質的に等しい値［維持することケ特徴とす
   る不均一系結合検定法。 ２　該液体成分の密度ゲ、該顆粒状粒子固相の密度より
   も大きい密度ケ有する密度修正媒体ケ硲力日することに
   よって、該顆粒状粒子固相の密度に実質的に等しい値に
   維持するようにした特許請求の範囲第１項記載の不均一
   系結合検定法。 ３、該顆粒状粒子同相はＮ　、　Ｎ’−メチ１／ノピス
   −アクリルアミドで架橋したアリルデキストラン？含み
   、該密度修正媒体はポリビニルビルリジンで被榎したシ
   リカ粒子のコロイド懸副液ケ含む特許請求の範囲第２項
   記載の不拘−系検合倹定法。 ４　該液体成分の密度は、該す［定時間の経過後、該液
   体成分と密度修正媒体との混合物紮該混合物よりも小さ
   い密度の液体で希釈するζ、とりこよって減小し、該顆
   粒状粒子同相が重力にエリ分離することを許容する特Ｆ
   ｌ′Ｉ′請求の範囲第２狽捷たけ第３項記載の不均一系
   結合検定法。 ５、　ビオチンが共有結合する結合相手ｒ含む検定成分
   ケ含有する溶液と、アビジンが共有結合する顆粒状粒子
   固相とｒ使用し、次の工程ゲ備える特許請求の範囲第１
   項〜第４項のいずれかに記載の不均一系結合検定法 （イ）該顆粒状粒子固相の不存在下ｖｃ該溶液検定成分
   會・インキュベートする工程 （Ｏ）　　該インキュベートした浴液１ｊ１５分ゲ該顆
   粒状粒子固相と接触させることにＬリアビジンとビオチ
   ンの会合ケ許容する工程 （ハ）該顆粒状粒子固相紮該爵奴ＩｊＺ分から分離する
   工程。 ６　検定法は免疫分析検定法である特許請求の範囲第１
   項ないし第５項のいずれかに記載の不均一系結合検定法
   。 ７．１または複数の検定試薬容器を含むΦノドであって
   、密度修正媒体が別個の容器または該検定試薬の容器の
   １または複数によって提供されることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記載の不均
   一系結合検定法を実施するためのキット。 ８　試料中の抗原性被分析物のための免疫分析検定法ヶ
   実施するためのキットであって、該被分析物に対する１
   ９１された抗体と、該被分析物に対する抗体であって顆
   粒状粒子同相に結合した抗体と、密度修正媒体とを含み
   、これらの試薬２ｉまたは複数の容器に別個［またはい
   ずれかの組合せで含む、特許請求の範囲第６項記載のキ
   ット。 ９　該被検出物に対する抗体であって該顆粒状粒子固相
   に結合した抗体紮、液体の密度が該顆粒状粒子固相の密
   度と実質的［等しくなるように密度修正媒体？含む液体
   中ＶＣ懸濁状態で含有する第１の容器と、第１の容器の
   試薬と第２の容器の試薬？試料と混合した時該液体成分
   の密度が該顆粒状粒子固相の密度と実質的に等しくなる
   よｌ：＞ＶＣ，被分析物に対する標識抗体と密度修正媒
   体とを含有する第２の容器と？含む特許請求の範囲第８
   項記載のキット。 １０　被分析物に対する標識抗体と、ビオチンが共有結
   合する被分析物に対する抗体と、アビジンが共有結合す
   る顆粒状粒子固相と、密度修正媒体とを含み、これらの
   試楽ゲｌまたは複数の容器に別個にまたはいずれかの組
   合せで含む、試料中の抗原性被分析物の免疫分析検定法
   を実施するためのキットであって、特許請求の範囲第５
   項にかかる場合の特許請求の範囲第６項記載の検定法ケ
   実施するためのキット。