JPH0315759A - 免疫学的測定方法 - Google Patents
免疫学的測定方法Info
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- JPH0315759A JPH0315759A JP15074389A JP15074389A JPH0315759A JP H0315759 A JPH0315759 A JP H0315759A JP 15074389 A JP15074389 A JP 15074389A JP 15074389 A JP15074389 A JP 15074389A JP H0315759 A JPH0315759 A JP H0315759A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、新しいＢ／Ｆ分離方法を用いて抗原又は抗体
を特異的に測定するようにした免疫学的測定方法に関す
る。
を特異的に測定するようにした免疫学的測定方法に関す
る。
抗原抗体反応を利用した免疫測定方法としてＥＩＡ法が
近年急激に行われるようになった。ＥｒＡ法においては
、通常ビーズ、プレート、磁性粒子、シリコン、ガラス
、ディスク、濾紙等の不溶性担体に固定化した抗原又は
抗体を用いて検体中の微量威分、例えば、ＣＥＡ，イン
シュリン、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体を正確に測定できる
ようになった． このようなビーズ等の不溶性担体を用
いた測定法は、抗原抗体反応によって結合した物質（Ｂ
ｏｕｎｄ）と結合していない物質（Ｆｒｅｅ）の分Ｍ
（Ｂ／Ｆ分離）の操作を行った後に、試料中の微量成分
を測定する．よく使われている２ステップサンドイッチ
法では、これはあらかじめ抗原又は第一抗体を固定化し
た不溶性担体に試料中の抗体又は抗原を反応させ、洗浄
後、酵素標識第二抗体を加え反応させる。この不溶性担
体を十分に洗浄することによってＢ／Ｆ分離を行い、基
質を加え酵素活性測定することによって試料中の抗原又
は抗体を測定することができる。
近年急激に行われるようになった。ＥｒＡ法においては
、通常ビーズ、プレート、磁性粒子、シリコン、ガラス
、ディスク、濾紙等の不溶性担体に固定化した抗原又は
抗体を用いて検体中の微量威分、例えば、ＣＥＡ，イン
シュリン、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体を正確に測定できる
ようになった． このようなビーズ等の不溶性担体を用
いた測定法は、抗原抗体反応によって結合した物質（Ｂ
ｏｕｎｄ）と結合していない物質（Ｆｒｅｅ）の分Ｍ
（Ｂ／Ｆ分離）の操作を行った後に、試料中の微量成分
を測定する．よく使われている２ステップサンドイッチ
法では、これはあらかじめ抗原又は第一抗体を固定化し
た不溶性担体に試料中の抗体又は抗原を反応させ、洗浄
後、酵素標識第二抗体を加え反応させる。この不溶性担
体を十分に洗浄することによってＢ／Ｆ分離を行い、基
質を加え酵素活性測定することによって試料中の抗原又
は抗体を測定することができる。
また、第一抗体、第二抗体ともにモノクロナール抗体を
用いれば、同時に第一抗体を固定化した不溶性担体に検
体と酵素標識第二抗体を同時に加えることができ、抗原
抗体反応を一段階で済ませることができるので、操作時
間が２ステダブサンドインチより短くて済み、手間も省
ける。
用いれば、同時に第一抗体を固定化した不溶性担体に検
体と酵素標識第二抗体を同時に加えることができ、抗原
抗体反応を一段階で済ませることができるので、操作時
間が２ステダブサンドインチより短くて済み、手間も省
ける。
最近、酸化鉄等の磁性粒子を用いて磁石によってＢ／Ｆ
分離を迅速に行う方法がＥｒＡ自動分析装置に応用され
るようになった。
分離を迅速に行う方法がＥｒＡ自動分析装置に応用され
るようになった。
本発明は、従来のように抗原抗体反応を固相上で行わせ
るのではなく、液相での反応を用いかつＢ／Ｆ分離を容
易に行うことによって、操作性、時間短縮をはかり、さ
らには自動化を容易に行う目的で発明されたものである
。
るのではなく、液相での反応を用いかつＢ／Ｆ分離を容
易に行うことによって、操作性、時間短縮をはかり、さ
らには自動化を容易に行う目的で発明されたものである
。
本発明は、吸着体、例えば澱粉のアミラーゼに対する特
異的な結合性に着目しＢ／Ｆ分離を容易かつ迅速に行う
ことが可能となることを見出し完成されたものである． 本発明は、抗原抗体反応時において液層での反応が可能
であることにより反応時間で短縮でき、試料中の微量戒
分と抗原抗体反応によって生じたアミラーゼ標識抗体一
抗原一非アミラーゼ標識抗体の抗原抗体反応複合物をア
ミラーゼを介して澱粉等の吸着体に吸着してＢ／Ｆ分離
を容易かつ迅速に行い、当該微量或分を極めて効率的に
測定できるようにし、また自動化を容易に行うための免
疫学的測定方法を提供することを目的とする。
異的な結合性に着目しＢ／Ｆ分離を容易かつ迅速に行う
ことが可能となることを見出し完成されたものである． 本発明は、抗原抗体反応時において液層での反応が可能
であることにより反応時間で短縮でき、試料中の微量戒
分と抗原抗体反応によって生じたアミラーゼ標識抗体一
抗原一非アミラーゼ標識抗体の抗原抗体反応複合物をア
ミラーゼを介して澱粉等の吸着体に吸着してＢ／Ｆ分離
を容易かつ迅速に行い、当該微量或分を極めて効率的に
測定できるようにし、また自動化を容易に行うための免
疫学的測定方法を提供することを目的とする。
上記目的を達戒するため、本発明の免疫学的測定方法に
おいては、アミラーゼ標識抗体又はアミラーゼ標識抗原
を用いてアミラーゼに結合性の強い吸着体によりＢ／Ｆ
分離を行うものである。
おいては、アミラーゼ標識抗体又はアミラーゼ標識抗原
を用いてアミラーゼに結合性の強い吸着体によりＢ／Ｆ
分離を行うものである。
該アミラーゼに結合性の強い吸着体、即ち不溶性の担体
として、好ましいのは澱粉である．この吸着体の形態と
しては、粉末、ディスク、濾紙、カラム等自由に威形し
たものを用いることができる。
として、好ましいのは澱粉である．この吸着体の形態と
しては、粉末、ディスク、濾紙、カラム等自由に威形し
たものを用いることができる。
試料中の抗原に特異的な非アミラーゼ標識抗体とア稟ラ
ーゼ標識抗体を反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行えば、非
アミラーゼ標識抗体の標識活性により試料中の抗原を測
定することができる。即ち、試料中の抗原を測定する場
合には、アミラーゼ標識抗体と非アミラーゼ標識抗体と
を試薬に用いる． 試料中の抗体に特異的な非アくラーゼ標識抗原とアくラ
ーゼ標識抗原を反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行えば、非
アミラーゼ標識抗原の標識活性により試料中の抗体を測
定することができる。即ち、試料中の抗体を測定する場
合には、アミラーゼ標識抗原と非アよラーゼ標識抗原と
を試薬に用いる． 試料中の抗原と競合する非アミラーゼ標識抗原とアミラ
ーゼ標識抗体を反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行えば、非
アミラーゼ標識抗原の標識活性により試料中の抗原を測
定することができる．試料中の抗体と競合する非アミラ
ーゼ標識抗体とアミラーゼ標識抗原を反応させた後、Ｂ
／Ｆ分離を行えば、非アミラーゼ標識抗体の標識活性に
より試料中の抗体を測定することができる．本発明の非
アミラーゼ標識抗体及びアミラーゼ４ｌ識抗体に用いる
抗体は、モノクロナール抗体、またはポリクロナール抗
体を問わず使用できる．また、モノクロナール抗体とポ
リクロナール抗体を組み合わせてもよい。好ましくは、
エビトープの異なる抗体を用いることが望ましい．本発
明のアミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミラ
ーゼ、グルコアミラーゼ、タカアミラーゼ等の各種のア
ミラーゼを用いることができる。本発明において、安定
性や澱粉に対する吸着性のよい微生物由来のＢａｃｉｌ
ｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ （液化型）が好ましい。
ーゼ標識抗体を反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行えば、非
アミラーゼ標識抗体の標識活性により試料中の抗原を測
定することができる。即ち、試料中の抗原を測定する場
合には、アミラーゼ標識抗体と非アミラーゼ標識抗体と
を試薬に用いる． 試料中の抗体に特異的な非アくラーゼ標識抗原とアくラ
ーゼ標識抗原を反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行えば、非
アミラーゼ標識抗原の標識活性により試料中の抗体を測
定することができる。即ち、試料中の抗体を測定する場
合には、アミラーゼ標識抗原と非アよラーゼ標識抗原と
を試薬に用いる． 試料中の抗原と競合する非アミラーゼ標識抗原とアミラ
ーゼ標識抗体を反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行えば、非
アミラーゼ標識抗原の標識活性により試料中の抗原を測
定することができる．試料中の抗体と競合する非アミラ
ーゼ標識抗体とアミラーゼ標識抗原を反応させた後、Ｂ
／Ｆ分離を行えば、非アミラーゼ標識抗体の標識活性に
より試料中の抗体を測定することができる．本発明の非
アミラーゼ標識抗体及びアミラーゼ４ｌ識抗体に用いる
抗体は、モノクロナール抗体、またはポリクロナール抗
体を問わず使用できる．また、モノクロナール抗体とポ
リクロナール抗体を組み合わせてもよい。好ましくは、
エビトープの異なる抗体を用いることが望ましい．本発
明のアミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミラ
ーゼ、グルコアミラーゼ、タカアミラーゼ等の各種のア
ミラーゼを用いることができる。本発明において、安定
性や澱粉に対する吸着性のよい微生物由来のＢａｃｉｌ
ｌｕｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓ （液化型）が好ましい。
さらに、アミラーゼの吸着体に利用する澱粉にはトウモ
ロコシ、小麦、米、ジャガイモ、サツマイモ等のものが
使用できる。これら澱粉の吸着性は、加圧加熱法や加熱
法により増強させることができる． 非アミラーゼ標識抗体に用いる標識物質にはアミラーゼ
以外の酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、補酵素
、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、磁性物質
等の直接、間接的に測定可能な検知物質であれば使用可
能である。
ロコシ、小麦、米、ジャガイモ、サツマイモ等のものが
使用できる。これら澱粉の吸着性は、加圧加熱法や加熱
法により増強させることができる． 非アミラーゼ標識抗体に用いる標識物質にはアミラーゼ
以外の酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、補酵素
、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、磁性物質
等の直接、間接的に測定可能な検知物質であれば使用可
能である。
（作用）
抗原又は抗体の測定方法のＢ様について以下に述べる。
抗原の測定
■試料中の抗原に、特異的な非アミラーゼ標識抗体とア
ミラーゼＰＪ識抗体を加え、一定時間抗原抗体反応を行
わせた後、この反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接
触又は通過させる．ついで、洗浄によって残存の非アミ
ラーゼ！！識抗体を除去し、Ｂ／Ｆ分離を行い、抗原抗
体反応を起こした非アミラーゼ標識抗体の標識活性を測
定する。
ミラーゼＰＪ識抗体を加え、一定時間抗原抗体反応を行
わせた後、この反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接
触又は通過させる．ついで、洗浄によって残存の非アミ
ラーゼ！！識抗体を除去し、Ｂ／Ｆ分離を行い、抗原抗
体反応を起こした非アミラーゼ標識抗体の標識活性を測
定する。
■試料中の抗原に非アミラーゼ標識抗原とアミラーゼ標
識抗体を加え、一定時間抗原抗体反応を行わせた後、こ
の反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触又は通過さ
せる。ついで、洗浄によって残存の非アミラーゼ標識抗
原を除去し、Ｂ／Ｆ分離を行い、抗原抗体反応を起こし
た非アミラーゼ標識抗原の標識活性を測定する。
識抗体を加え、一定時間抗原抗体反応を行わせた後、こ
の反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触又は通過さ
せる。ついで、洗浄によって残存の非アミラーゼ標識抗
原を除去し、Ｂ／Ｆ分離を行い、抗原抗体反応を起こし
た非アミラーゼ標識抗原の標識活性を測定する。
抗体の測定
■試料中の抗体に、特異的な非アミラーゼ標識抗原とア
ミラーゼ標識抗原を加え、一定時間抗原抗体反応を行わ
せた後、この反応液をアミラーゼ桔合性の吸着体に接触
又は通過させる。ついで、洗浄によって残存の非アミラ
ーゼ標識抗原を除去し、Ｂ／Ｆ分離を行い、抗原抗体反
応を起こした非アミラーゼ標識抗原の標識活性を測定す
る。
ミラーゼ標識抗原を加え、一定時間抗原抗体反応を行わ
せた後、この反応液をアミラーゼ桔合性の吸着体に接触
又は通過させる。ついで、洗浄によって残存の非アミラ
ーゼ標識抗原を除去し、Ｂ／Ｆ分離を行い、抗原抗体反
応を起こした非アミラーゼ標識抗原の標識活性を測定す
る。
■試料中の抗体に非アミラーゼ標識抗体とアミラーゼ標
識抗原を加え、一定時間抗原抗体反応を行わせた後、こ
の反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触又は通過さ
せる．ついで、洗浄によって残存の非アミラーゼ標識抗
体を除去し、Ｂ／Ｆ分剤を行い、抗原抗体反応を起こし
た非アミラーゼ標識抗体の標識活性を測定する． （実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
． 試薬 ■抗原（ＣＥＡ）の各種濃度の標準液（０，２．５５．
１０，２０，４０．８０ ｎｇ／ｍｌ ）■アミラーゼ
標識抗体 ■ベルオキシダーゼ標識抗体 ■トウモロコシ澱粉 ■基質液（５０ｍＭクエン酸緩衝液、５ｍＭ過酸化水１
’、１０ａＭオルトフェニレンジアミン、ｐＨ５）■停
止液（ ４ Ｎ ｇ酸） 操作方法 ■試験管に各種濃度の標準液又は検体１００μｌとアミ
ラーゼ標識抗体及びベルオキシダーゼ標識抗体各２００
μｌづつ加え３７゜ＣＩＯ分間反応させる。
識抗原を加え、一定時間抗原抗体反応を行わせた後、こ
の反応液をアミラーゼ結合性の吸着体に接触又は通過さ
せる．ついで、洗浄によって残存の非アミラーゼ標識抗
体を除去し、Ｂ／Ｆ分剤を行い、抗原抗体反応を起こし
た非アミラーゼ標識抗体の標識活性を測定する． （実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
． 試薬 ■抗原（ＣＥＡ）の各種濃度の標準液（０，２．５５．
１０，２０，４０．８０ ｎｇ／ｍｌ ）■アミラーゼ
標識抗体 ■ベルオキシダーゼ標識抗体 ■トウモロコシ澱粉 ■基質液（５０ｍＭクエン酸緩衝液、５ｍＭ過酸化水１
’、１０ａＭオルトフェニレンジアミン、ｐＨ５）■停
止液（ ４ Ｎ ｇ酸） 操作方法 ■試験管に各種濃度の標準液又は検体１００μｌとアミ
ラーゼ標識抗体及びベルオキシダーゼ標識抗体各２００
μｌづつ加え３７゜ＣＩＯ分間反応させる。
■反応液にトウモロコシ澱粉２ ０ｍｇを加え３７℃１
０分間吸着させる。
０分間吸着させる。
■２０００Ｇ以上で１分間遠心後上澄みを捨てる■洗浄
液（生理食塩水） １ｍｌで３回洗浄する。
液（生理食塩水） １ｍｌで３回洗浄する。
■沈渣に基質液５００μｌを加え、３７゜Ｃ３０分間反
応後停止液２００ｔｔｌを加える．■２０００Ｇ以上で
１分間遠心後上澄み２００μｌをマイクロプレートに移
し、マイクロプレートリーダーで波長４９２／６３０ｎ
ｍで吸光度を測定する． 結果 ＣＥＡｆｉ度８０ｎｇ／ｍｉ！．以下で良好な検量線が
得られた（第１図）。
応後停止液２００ｔｔｌを加える．■２０００Ｇ以上で
１分間遠心後上澄み２００μｌをマイクロプレートに移
し、マイクロプレートリーダーで波長４９２／６３０ｎ
ｍで吸光度を測定する． 結果 ＣＥＡｆｉ度８０ｎｇ／ｍｉ！．以下で良好な検量線が
得られた（第１図）。
実施例２
実施例１と同様の試薬を用い、澱粉充填力ラムによるＢ
／Ｆ分離を行った場合を説明する。
／Ｆ分離を行った場合を説明する。
操作方法
■試験管にＣＥＡｅｔ度Ｏと８０ｎｇ／ｍ／２の標準液
１００μｌとアミラーゼ標識抗体及びベルオキシダーゼ
標識抗体各２００μｉづつ加え３７゜Ｃ１０分間反応さ
せる。
１００μｌとアミラーゼ標識抗体及びベルオキシダーゼ
標識抗体各２００μｉづつ加え３７゜Ｃ１０分間反応さ
せる。
■反応液をトウモロコシ澱粉２ ０ｍｇ充填力ラムに流
し吸着させる． ■洗浄液（生理食塩水）５ｍｌを流し洗浄する。
し吸着させる． ■洗浄液（生理食塩水）５ｍｌを流し洗浄する。
■カラムの下方をコックで止める。
■カラムに基質液５００μｌを加え反応させる。
■発色の強さを目視判定する．
結果
ＣＥＡ８０ｎｇ／ｍ＋ｊｌ！のものは強く黄色に発色し
ＣＥＡ濃度Ｏと８０ｎｇ／ｍｊ２との間に有意な差があ
った。
ＣＥＡ濃度Ｏと８０ｎｇ／ｍｊ２との間に有意な差があ
った。
以上のように、本発明によれば、抗原抗体反応時におい
て液層での反応が可能であることにより反応時間が短縮
でき、試料中の微量威分と抗原抗体反応によって生じた
アミラーゼ標識抗体一抗原−標識抗体の抗原抗体反応複
合物をアミラーゼを介して澱粉等の吸着体に吸着してＢ
／Ｆ分離を容易かつ迅速に行い、当該微量戒分を極めて
効率的に測定できるという効果が達威される。
て液層での反応が可能であることにより反応時間が短縮
でき、試料中の微量威分と抗原抗体反応によって生じた
アミラーゼ標識抗体一抗原−標識抗体の抗原抗体反応複
合物をアミラーゼを介して澱粉等の吸着体に吸着してＢ
／Ｆ分離を容易かつ迅速に行い、当該微量戒分を極めて
効率的に測定できるという効果が達威される。
第１図は実施例ｌによって得た検量線を示すグラフであ
る．
る．
Claims (7)
- （１）試料中の抗体又は抗原を免疫学的に測定する方法
において、アミラーゼ標識抗体又はアミラーゼ標識抗原
を用いてアミラーゼに結合性の強い吸着体によりＢ／Ｆ
分離を行うことを特徴とする免疫学的測定方法。 - （２）該アミラーゼに結合性の強い吸着体が澱粉である
ことを特徴とする請求項（１）記載の免疫学的測定方法
。 - （３）試料中の抗原に特異的な非アミラーゼ標識抗体と
アミラーゼ標識抗体を反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行い
非アミラーゼ標識抗体の標識活性により試料中の抗原を
測定することを特徴とする請求項（１）記載の免疫学的
測定方法。 - （４）試料中の抗体に特異的な非アミラーゼ標識抗原と
アミラーゼ標識抗原を反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行い
非アミラーゼ標識抗原の標識活性により試料中の抗体を
測定することを特徴とする請求項（１）記載の免疫学的
測定方法。 - （５）試料中の抗原と競合する非アミラーゼ標識抗原と
アミラーゼ標識抗体を反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行い
非アミラーゼ標識抗原の標識活性により試料中の抗原を
測定することを特徴とする請求項（１）記載の免疫学的
測定方法。 - （６）試料中の抗体と競合する非アミラーゼ標識抗体と
アミラーゼ標識抗原を反応させた後、Ｂ／Ｆ分離を行い
非アミラーゼ標識抗体の標識活性により試料中の抗体を
測定することを特徴とする請求項（１）記載の免疫学的
測定方法。 - （７）非アミラーゼ標識抗原又は抗体を用いる際、標識
がアミラーゼ以外の酵素であることを特徴とする請求項
（３）（４）（５）又は（６）記載の免疫学的測定方法
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1150743A JP2714143B2 (ja) | 1989-06-14 | 1989-06-14 | 免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1150743A JP2714143B2 (ja) | 1989-06-14 | 1989-06-14 | 免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0315759A true JPH0315759A (ja) | 1991-01-24 |
| JP2714143B2 JP2714143B2 (ja) | 1998-02-16 |
Family
ID=15503448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1150743A Expired - Fee Related JP2714143B2 (ja) | 1989-06-14 | 1989-06-14 | 免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2714143B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8333154B2 (en) | 2007-08-09 | 2012-12-18 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Inflator |
| US8393639B2 (en) | 2007-08-09 | 2013-03-12 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Inflator and vehicle airbag device using the same |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59224562A (ja) * | 1983-03-15 | 1984-12-17 | ブ−ツ・セルテツク，ダイアグノステイツクスリミテツド | 不均一系結合検定法 |
| JPS6339895A (ja) * | 1986-05-15 | 1988-02-20 | イ−・アイ・デユポン・ド・ネモア−ス・アンド・コンパニ− | 液体支持体を用いるバイオアフイニテイ−およびイオン交換分離 |
-
1989
- 1989-06-14 JP JP1150743A patent/JP2714143B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59224562A (ja) * | 1983-03-15 | 1984-12-17 | ブ−ツ・セルテツク，ダイアグノステイツクスリミテツド | 不均一系結合検定法 |
| JPS6339895A (ja) * | 1986-05-15 | 1988-02-20 | イ−・アイ・デユポン・ド・ネモア−ス・アンド・コンパニ− | 液体支持体を用いるバイオアフイニテイ−およびイオン交換分離 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8333154B2 (en) | 2007-08-09 | 2012-12-18 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Inflator |
| US8393639B2 (en) | 2007-08-09 | 2013-03-12 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Inflator and vehicle airbag device using the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2714143B2 (ja) | 1998-02-16 |
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