JP2002535678A

JP2002535678A - 粒子のカゼインコーティングを用いる免疫アッセイ

Info

Publication number: JP2002535678A
Application number: JP2000596372A
Authority: JP
Inventors: ウェイ−チャオニ，; ダニエルダブリュー．ユースタス，; スティーブチン−シェンチャン，
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-26
Publication date: 2002-10-22
Also published as: ATE286251T1; EP1064552B1; DE60017017D1; US20020090638A1; US6756234B2; US6461874B1; DE60017017T2; EP1064552A1; AU2736000A; WO2000045171A1

Abstract

(57)【要約】カゼインおよびカゼインの塩が、所望の分析物の分離のための免疫アッセイおよび他の結合アッセイにおいて用いられる固相、特に磁性粒子をコーティングするための材料としてのＢＳＡの置換物として、またはＢＳＡに加えて、有用であることが見出された。カゼインを用いることにより、改善された安定性およびより少ない不一致サンプルを有する免疫アッセイが開発された。磁性粒子１グラムあたり０．０５グラム〜４．０グラムの濃度で用いられるカゼイン（最適には、磁性粒子１グラムあたり約０．７８グラム〜約１．２グラムのカゼイン）によってこの利点が付与されることが見出された。さらに、固相をコーティングするためのプロセスが発明され、上記プロセスは、３０〜６０℃にて５〜１８０時間、カゼインを、磁性粒子と混合する工程を含み、上記プロセスは、カゼインでコーティングした常磁性粒子をもたらし、上記粒子は、（１）結合アッセイにおいて必要とされる活性成分とすでに結合しているか、または（２）結合アッセイにおいて必要とされる活性成分と反応し得るかのいずれかである。さらに、カゼインでコーティングした常磁性粒子を用いるためのプロセスが開発され、上記粒子は、免疫アッセイにおいて用いられる活性成分と直接的または間接的に結合する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の引用）本出願は、ＳＴＡＢＩＬＩＺＡＴＩＯＮＯＦＰＡＲＴＩＣＬＥＳＡＮＤ
ＲＥＤＵＣＴＩＯＮＯＦＤＩＳＣＯＲＤＡＮＴＳＡＭＰＬＥＳＩＮ
ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹＳＵＳＩＮＧＣＡＳＥＩＮＣＯＡＴＩＮＧＯＦ
ＰＡＲＴＩＣＬＥＳという表題の、１９９９年１月２７日に出願された米国仮
特許出願第６０／１１７，５７８号に対する、米国特許法第１１９条（ｅ）項の
下での優先権を主張する。

【０００２】（発明の分野）本発明は、結合アッセイに用いられる、コーティングされた粒子に関する。本
発明はまた、上記粒子を作製するためのプロセスおよび上記粒子を用いるための
プロセスに関する。

【０００３】（発明の背景）免疫アッセイを含む結合アッセイは、通常、種々の分析物の存在およびその濃
度を決定するための医療診断道具として用いられる。免疫アッセイ手順は、何年
もの間公知であり、そしてより初期の手動手順、その後のより近年の自動化手順
（例えば、ＢａｙｅｒＡＣＳ：１８０（登録商標）およびＡＤＶＩＡ（登録商
標）Ｃｅｎｔａｕｒ^TM Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓで行われる自動化手順）を含む
。

【０００４】免疫アッセイにおいて用いられる成分の１つは、固相（頻繁には常磁性粒子（
ＰＭＰ））であり、これは、磁性粒子を、磁性粒子と免疫アッセイにおいて用い
られる活性成分とのさらなる反応を可能にする材料でコーティングすることによ
り調製される。従来、磁性粒子は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で頻繁にコー
ティングされてきた。しかし、ＢＳＡでコーティングされた粒子は、時々、不安
定であり、そして信頼できないアッセイ結果を生じることが見出された。さらに
、ＢＳＡ単独での使用は、高い非特異的結合を生じる。

【０００５】（発明の簡単な要旨）カゼインおよびカゼインの塩が、所望の分析物の分離のための免疫アッセイお
よび他の結合アッセイにおいて用いられる固相、特に磁性粒子をコーティングす
るための材料としてのＢＳＡの置換物として、またはＢＳＡに加えて、有用であ
ることが見出された。カゼインを用いることにより、改善された安定性およびよ
り少ないサンプル不一致を有する免疫アッセイが開発された。磁性粒子１グラム
あたり約０．０５グラム〜４．０グラムの濃度で用いられるカゼイン（最適には
、磁性粒子１グラムあたり約０．７８グラム〜約１．２グラムのカゼイン）によ
ってこの利点が付与されることが見出された。

【０００６】さらに、固相をコーティングするためのプロセスが発明され、上記プロセスは
、３０〜６０℃にて５〜１８０時間、カゼインを、磁性粒子と混合する工程を含
み、上記プロセスは、カゼインでコーティングした常磁性粒子をもたらし、上記
粒子は、（１）結合アッセイにおいて必要とされる活性成分とすでに結合してい
るか、または（２）結合アッセイにおいて必要とされる活性成分と反応し得るか
のいずれかである。

【０００７】さらに、カゼインでコーティングした常磁性粒子を用いるためのプロセスが開
発され、上記粒子は、免疫アッセイにおいて用いられる活性成分と直接的または
間接的に結合する。

【０００８】（発明の詳細な説明）結合アッセイは、何年もの間、医学的診断試験を実施する場合に分析物の存在
およびその濃度を決定するための手段として用いられている。用語、結合アッセ
イは、広範囲のアッセイ（核酸アッセイ、遺伝子プローブアッセイ、免疫アッセ
イ、および膜結合を含む）を含むことが意図される。一般に、これらのアッセイ
は、溶液から分析物を分離するための、分析物（または分析物の濃度と相関させ
られ得る何か）と固相との反応、およびこの分析物の検出を可能にする標識との
反応を含んでいる。

【０００９】２つの主要な型の免疫アッセイは、競合アッセイおよび非競合アッセイである
。競合アッセイでは、測定されるシグナルは、分析物に結合しない特異的バイン
ダーから発するシグナルである。多数の形式の競合アッセイが存在する。例えば
、いくつかの競合アッセイでは、標識抗体が、分析物および固相に固定化された
分析物誘導体を含有するサンプルとともにインキュベートされる。分析物に結合
しなかった標識抗体はこの固相に結合し、そしてこの固相に結合した標識抗体か
ら発するシグナルが測定される。他の型の競合アッセイでは、標識されていない
抗体が、分析物および標識された分析物誘導体（または分析物模倣物）を含むサ
ンプルとともにインキュベートされる。標識された分析物誘導体は、占有されて
いない抗体結合部位に結合する。抗体に結合した標識された分析物誘導体に由来
するシグナルを測定することにより、化学者は実際に、分析物に結合しなかった
概算抗体部位濃度を得る。従って、両方の型の競合アッセイにおいて、分析物に
結合しなかった特異的バインダー部位の画分に関連したシグナルを測定する。競
合アッセイから生じたシグナルは、分析物の濃度が増加するにつれて減少する。
低レベルの分析物が高いシグナルに対応するので、低濃度の分析物の小さな変化
は、正確には測定することが困難である、大きな数の間の小さな差をもたらす。

【００１０】第２の型の結合アッセイは、非競合型である。このアッセイでは、標識された
特異的バインダー（例えば、標識抗体）は、サンプルと共にインキュベートされ
、そして分析物の一部に結合する。非競合アッセイの１つのバリエーションでは
、固相に固定化された、標識されていない特異的バインダーが同時にまたは次々
と添加されて、分析物上の別のエピトープに結合する。この場合、これは、「サ
ンドイッチ」アッセイと呼ばれる。例えば、固定化された分子は、分析物上の第
２のエピトープに対する抗体であり得、そしてこの分析物は、標識された抗体お
よび固定化された、標識されていない抗体と共に三次複合体を形成し得る。次い
で、固相は洗浄され、そして測定されるシグナルは、この分析物を含む三次複合
体に由来するシグナルである。この場合、シグナルは、分析物の濃度が増加する
に従って増加する。

【００１１】上記で議論したアッセイは全て、固相、およびこの固相に付着（すなわち、結
合または会合）する標識の使用に基づく。多くの型の標識（例えば、放射化学的
標識、発光標識、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、リポソーム標識、ならび
に種々の金属粒子および非金属粒子）が結合アッセイにおいて用いられている。
好ましくは、標識は化学発光標識（例えば、アクリジニウムエステル）である。
標識は、共有結合によってバインダーに直接的に付着し得るか、または結合対（
例えば、ビオチン／アビジン、ＤＮＰ／抗ＤＮＰまたは任意の他の結合対）を用
いて間接的に付着し得る。

【００１２】固相は一般に、プロセスの何らかの段階で反応混合物から分離され、そして上
記固相に付着した標識の量が決定される。固相は一般に、制御された孔径のガラ
スから作製される粒子、ポリマー粒子、ラテックス、コロイド状金属粒子もしく
はコロイド状金属酸化物粒子、不混和性液相、拡張（ｅｘｔｅｎｅｄ）表面、多
孔性紙、多孔性ゲル、リポソーム、セルロースビーズ、エマルジョン、静置もし
くは遠心分離によって容易には沈降しない非常に小さい粒子の系、常磁性粒子、
セルロースビーズ、架橋デキストラン、または任意の他の粒子から作製される。
これらは、サイズが直径１０ｎｍから数ミクロンまで変化し得る粒子、任意のサ
イズのより大きなビーズ、平坦な表面、試験管壁、計量棒の表面、繊維、膜、棒
、ディスク、固定化されたバインダーを保有し得る任意の拡張された表面もしく
は粒子状表面を含み得る。好ましい固相は、磁性粒子または拡張された表面であ
る。

【００１３】分離工程を含むアッセイにおける磁性粒子の使用は、かなり長い間公知である
（米国特許第４，５５４，０８８号を参照のこと）。磁性粒子を頻繁に、生物学
的に活性な成分を付着させるために、中間体（例えば、シランおよびグルタルア
ルデヒド）と反応させる。ウシ血清アルブミンは頻繁に、これらの結合成分のう
ちの１つとして用いられている。

【００１４】磁性粒子を生成する際に、不安定性が、ＰＭＰ上にＢＳＡの薄いコーティング
が存在すること（すなわち、ＢＳＡのＰＭＰに対する低いコーティング比）に起
因することが見出された。さらに、ＢＳＡでコーティングされた粒子は、いくつ
かのアッセイにおいて干渉およびサンプル不一致（すなわち、不適切なアッセイ
の結果）を引き起こした。

【００１５】不活性タンパク質であるカゼインをＢＳＡの置換物として、またはＢＳＡに加
えて用いた場合、これらの問題を排除することを助けることが見出された。カゼ
インを、１グラムのＰＭＰあたり０．０５グラム〜４．０グラムのカゼインの範
囲で、好ましくは１グラムのＰＭＰあたり０．１５グラム〜３．２グラムのカゼ
インの範囲で、そして最も好ましくは１グラムのＰＭＰあたり０．７８グラム〜
１．２グラムのカゼインの範囲で用いた場合、これらの問題はずっと低減された
。カゼインとＰＭＰとの混合は、約３０℃〜約６０℃にて５〜１８０時間で、好
ましくは約３７℃〜約５０℃にて１４〜１４４時間で起きた。（（フェリチンア
ッセイにおいて用いられる）カゼインでコーティングした粒子を作製するための
代表的なプロセスを実施例５に示す。このプロセスのバリエーションは、他のア
ッセイについて固相を作製する場合に用いられ得る。）粒子安定性は、ＡＤＶＩＡ（登録商標）Ｃｅｎｔａｕｒ^TM装置上で揺り動かす
前および後の粒子サイズ分布を評価することにより調べられた。揺り動かすこと
は、アッセイを装置上で実施する場合に試薬を混合するときに起きる。カゼイン
でコーティングした粒子は、粒子の相互作用に起因して、より少ない凝集または
脱凝集（ｄｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を示した。従って、カゼインは、この粒
子が凝集物を形成するのを防ぐクッション層として役立ったと考えられる。揺り
動かす場合対静置の場合であって、上記試薬が１．２グラムのＢＳＡ／１グラム
のＰＭＰでコーティングされた（図１ａ）または１．２グラムのカゼイン／１グ
ラムのＰＭＰでコーティングされた（図１ｂ）、フェリチンアッセイにおいて用
いられた固相の粒子サイズ分布を示す図１を参照のこと。

【００１６】熱安定性を、総ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＴｈＣＧ）、テストステロン、Ｃ
Ａ１９−９、および遊離のＴ３を用いて調べ、そしてカゼインでコーティングさ
れた粒子について有意に改善されたことが見出された。（図２および図６、表１
および表５、ならびに以下の実施例１を参照のこと。）積載安定性（ｏｎ−ｂｏ
ａｒｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ）および貯蔵検定安定性（ｓｔｏｒｅｄｃａｌｉ
ｂｒａｔｉｏｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）（下記の通りに実施された）はまた、Ｔ
４、Ｔ３、遊離Ｔ３、およびＴ取り込みについて改善されたことが見出された。
（実施例２（以下）、表２、および図３〜４を参照のこと。）貯蔵検定安定性を、以下の通りに調べた。０日目に、ＡＤＶＩＡ（登録商標）
Ｃｅｎｔａｕｒ^TMアナライザーで、２℃〜８℃にて貯蔵した試薬処方物からの検
定点をアッセイした。貯蔵した試薬を用いる時間経過研究は、２８日間続けられ
た。特定の日に、ＢＳＡでコーティングした粒子およびカゼインでコーティング
した粒子の両方を用いるアッセイを行った。各データ点を、対応する試薬に関し
て０日目の貯蔵検定点に対して比較した。０日目に関するコントロールおよび患
者サンプルのプールの用量回収パーセントを決定した。

【００１７】積載安定性試験を行うために、サンプルを連続的に揺り動かす、ＡＤＶＩＡ（
登録商標）Ｃｅｎｔａｕｒ^TMの冷蔵（２℃〜８℃）チャンバー中にサンプルを貯
蔵した。サンプルを、実験開始前に試験した（０日目の値）。さらなるサンプル
を、分析のために定期的に（２８日目まで）取り出した。結果を、０日目からの
データに対してプロットし、生成物の性能に対する積載貯蔵の効果を決定した。

【００１８】カゼインまたはその塩（例えば、カゼイン酸ナトリウムおよびカゼイン酸カリ
ウム）は、有用なコーティング剤であることが見出された。カゼインの形態の選
択は、一部、合成が行われる媒体に依存する。例えば、カゼイン自体は、疎水性
であり、そして水溶液中で比較的乏しい溶解度を有する。一方、塩であるカゼイ
ン酸ナトリウムは、水溶液中でさらに良好な溶解度を有し、このことは、それゆ
え、水溶液中でより高濃度のカゼイン酸塩を導き、続いて、固相上に沈着した、
カゼインのより厚いフィルムを導く。

【００１９】固相粒子をコーティングするために一般に用いられる材料であるＢＳＡの使用
は、干渉および非特異的結合の原因であった。ＢＳＡがリガンドに対する複数の
結合部位を有するので、ＢＳＡが内因性物質（すなわち、ヒトにおいて生成され
る内因性物質）（例えば、Ｌ−チロキシン、プロゲステロン、テストステロン、
エストラジオール、およびコルチゾール）による干渉を可能にすることが推測さ
れた。さらに、負に荷電した薬物（例えば、イブプロフェンおよびサリチレート
など）、中性薬物（例えば、ワルファリンおよびヨーパノエートなど）、正に荷
電した薬物（例えば、キニジン、プロカイン、およびリドカインなど）、ならび
に無機イオン（例えば、Ｃｕ⁺、Ｍｎ⁺²、Ｎｉ⁺²、Ｃｏ⁺²、Ｃａ⁺²、およびＭｇ⁺ ² ）は、干渉を引き起こすことが見出された。

【００２０】ＢＳＡ上の複数の結合部位は、患者に特定の薬物が薬物投与される場合、おそ
らく、サンプル不一致をもたらし得る。多くの薬物がアルブミンに強固に結合す
ることが公知である。（ＵｌｒｉｃｈＫｒａｇｈ−Ｈａｎｓｅｎ，３３Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ（１９９１）１７〜５３，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＡｓｐｅｃｔｓｏｆＬｉｇａｎｄＢｉｎｄｉｎｇｔｏ
ＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎを参照のこと。）薬物分子をＢＳＡに結合した際に
、予測される抗原−抗体結合反応に加えて、粒子上での副反応の誘発が存在し得
る。このことは、アッセイ系を複雑にし得、そしてサンプル不一致についての偽
のシグナルを生じ得る。粒子表面上でＢＳＡを不活性なカゼインで置換すること
により、この問題を排除し得る。たとえ、ＢＳＡが完全には除去されないが、カ
ゼインが主要なコーティング剤である場合（少なくとも７５％のカゼイン／ＢＳ
Ａ混合コーティングを含む）でも、改善が観察される。

【００２１】コーティング材料としてのカゼインへの変更は、甲状腺ホルモン、ステロイド
ホルモン結合、および他の非特異的結合からの干渉を除去した。例えば、Ｔ４ア
ッセイでは、ＢＳＡからカゼインへの変更は、０．２４μ／ｄｌから０．１８μ
／ｄｌへと減少した最少の検出可能な用量をもたらした。さらに、このアッセイ
の低い終点での精度（１．１２μ／ｄｌ）は有意に改善され、そして変動係数は
２６．５％から９．３％へと改善された。

【００２２】カゼインは、診断アッセイにおいて以前に用いられているが、粒子をコーティ
ングするため、および安定性を改善するためには用いられていない。Ｓｎｙｄｅ
ｒ（米国特許第４，８２８，９８０号）では、カゼインを用いて、膜構造をコー
ティングして、膜表面に対するタンパク質の非特異的結合を防止した。Ｗａｒｒ
ｅｎ（米国特許第４，８１２，４１４号）では、トレーサー（標識）を含む粒子
をカゼインと反応させて、正に荷電した材料および負に荷電した材料からのバッ
クグラウンドシグナルを低減させた（その中の第２欄、５〜１３行、５７−６０
行を参照のこと）。（すなわち、カゼインは、電荷−電荷相互作用を予防する場
合にのみいくらかの利益を示した。）カゼインは、非荷電レセプター分子を用い
て何らかの利益を示すことは実証されていなかった。さらに、Ｗａｒｒｅｎは、
標識層（その中の請求項１を参照のこと）上のカゼインを用い、そしてこのカゼ
インを抗体の添加と同時に添加した（’４１４の第１３欄、２４〜２９行を参照
のこと）。Ｆｒｅｉｔａｇ（米国特許第５，１３２，２０８号）は、試験条件下
でサンプル液において不溶性であるタンパク質で固体成分（ポリエステル織物）
がコーティングされたいくつかの免疫アッセイにおいて用いられる試験片を開示
する。カゼインは、これらのアッセイにおいて有用であることが見出された。な
ぜなら、カゼインはほぼ完全に不溶性であり、そして活性な試薬が、カゼインで
コーティングした布上に沈着するのを可能にすることが見出されたからである。

【００２３】カゼインの使用が全ての型の免疫アッセイにおける安定性（甲状腺関連アッセ
イ（例えば、Ｔ取り込み、サイロキシン（Ｔ４）、３，３’，５−トリヨードチ
ロニン（Ｔ３）、遊離３，３’，５−トリヨードチロニン（遊離Ｔ３））、貧血
アッセイ（例えば、フェリチン）、ホルモンアッセイ（例えば、総ヒト絨毛性ゴ
ナドトロピン、テストステロン）、ならびに癌マーカーアッセイ（例えば、ＣＡ
１９−９）についての安定性を含む）を改善すると考えられる。

【００２４】以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定するこ
とは意図されない。

【００２５】（実施例１：熱安定性）カゼインでコーティングした粒子の３７℃での熱安定性を、試薬のいくつかの
瓶をオーブンの中に配置し、そして各試験点で分析のために１つの瓶を取り出す
ことにより行った。カゼインでコーティングした粒子の使用は、時間の関数とし
て決定された分析物濃度を、実験開始時に見出された分析物濃度に対して比較す
ることにより示されるように、顕著な改善を示した。図２に示す結果は、カゼイ
ンでコーティングした粒子（「改変した」といわれる）について有意な改善が存
在することを示す。テストステロンおよびＦＴ３についてのアッセイにおける安
定性を図２に示し、一方、ＴｈＣＧアッセイにおける安定性についてのデータを
表Ｉに示す。ＣＡ１９−９についての熱安定性を、図６および表５に示す。

【００２６】（実施例２：積載安定性（自動化装置における混合のシミュレーション））積載安定性試験を行って、カゼインコーティングの影響を決定した。積載安定
性試験は、アッセイを行った場合にＡＤＶＩＡ（登録商標）Ｃｅｎｔａｕｒ^TM装
置により行われる連続混合をシミュレートする。遊離Ｔ３、Ｔ３、Ｔ４、および
Ｔ取り込みデータからのアッセイデータについて図３および図４ならびに表２に
おけるデータを参照のこと。Ｔ取り込みについてのアッセイの他の性能基準は、
図５および表３において示されるように、等価なままであった。

【００２７】（実施例３：Ｔ４性能試験）性能試験を、Ｔ４アッセイについての試薬を用いて行い、１つのバージョンは
、カゼインでコーティングしたＰＭＰ（表４における「改変した」）に対してＰ
ＭＰ上にコーティングされたＢＳＡを含む（表４における「現行」を参照のこと
）。最少検出可能用量および精度について表４において示された改善を参照のこ
と。他の特性において、ＢＳＡでコーティングした固相とカゼインでコーティン
グした固相との間での変化は示されなかった。従って、このことは、カゼイン含
有アッセイが信頼性があるままであることを示す。（「改変した」固相が、１ｇ
のＰＭＰあたり０．１ｇのＢＳＡおよび１．０ｇのカゼインを含んでいたことに
留意されたい。）（実施例４：ＣＡ１９−９安定性）癌マーカーであるＣＡ１９−９についてのアッセイにおける安定性は、このア
ッセイにおいて用いられる固相へのカゼインの添加によって有意に改善されてい
る。３つの分析物のレベル（２２．０ｍ／ｍＬ、８８．９Ｕ／ｍＬ、および１７
３Ｕ／ｍＬ）で有意に改善された安定性を示す、図６および表５を参照のこと。

【００２８】（実施例５：カゼインでコーティングした粒子を作製するための代表的プロセ
ス）１．ＰＭＰを、３．１２５％グルタルアルデヒド（０．０１Ｍ酢酸ナトリウム
、ｐＨ５．５中）の添加により活性化し、この混合物を室温で３時間混合する。

【００２９】２．抗体を、１４０ｍｇ抗体／ｇＰＭＰを添加し、そして混合しながら室温
にて１６．５時間反応させることにより、グルタルアルデヒド活性化ＰＭＰへと
カップリングする。

【００３０】３．未反応のアルデヒドを、エタノールアミンとの反応によりクエンチングす
る。ＰＭＰを、容器への磁気力の適用により磁気的に分離する。粒子を、０．１
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、次いで０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ８．０）中に再懸濁する。懸濁した粒子に、エタノールアミン
（最終反応混合物中で１．１Ｍ）を添加し、そしてこの混合物を室温にて１時間
攪拌する。

【００３１】４．シッフ塩基を、ボラン−ピリジンの添加により還元する。粒子を、磁界の
適用により分離し、そして０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗
浄し、次いで０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中に再懸濁する。
ボラン−ピリジン（４：１の容量／容量比でジメチルスルホキシドに対して混合
したボラン−ピリジン）（最終反応混合物中で５０〜１００ｍＭ）を添加し、そ
して室温にて１時間反応させる。

【００３２】５．粒子を、磁気力の適用により分離し、そして１ＭＮａＣｌ溶液で洗浄す
る。この粒子を０．０１リン酸ナトリウム緩衝液で洗浄する（ｐＨ８．０）。
粒子を、熱ストレス緩衝液で洗浄し、次いで熱ストレス緩衝液中に再懸濁し、そ
して混合物を５０℃にて１６．５時間インキュベートする。（熱ストレス緩衝液
は、０．２２０ｇ／Ｌリン酸ナトリウム（一塩基性）、４．０３ｇ／Ｌリン
酸ナトリウム（二塩基性）、８．７５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｇ／Ｌスル
フヒドリル修飾ＢＳＡ、０．０１０ｇ／Ｌウシγグロブリン（ＢｇＧ）、およ
び３９ｇ／Ｌカゼイン（ナトリウム塩）からなり、ｐＨ８．０である。）６．粒子を、磁界の適用により分離し、そして１ＭＮａＣｌで洗浄し、磁気
的に分離し、そしてタンパク質緩衝液で洗浄する。（タンパク質緩衝液は、０．
２２０ｇ／Ｌリン酸ナトリウム（一塩基性）、４．０３ｇ／Ｌリン酸ナトリ
ウム（二塩基性）、８．７５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、１ｇ／Ｌスルフヒドリ
ル修飾ＢＳＡ、および０．０１０ｇ／ＬＢｇＧからなり、ｐＨ８．０である。
）得られる粒子を、固相緩衝液（１０ｍＭバルビタールナトリウム、８．７５
ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０９５％アジ化ナトリウム、０．３７２ｇ／Ｌ
ＥＤＴＡ二ナトリウム、２．５ｇ／Ｌゼラチン、１．０ｇ／ＬＢｇＧ、３
．０ｇ／Ｌスルフヒドリル修飾ＢＳＡ、０．０２ｇ／Ｌマウス免疫グロブリ
ンＧ（ＩｇＧ）、０．０２ｇ／ＬカプリンＩｇＧ、０．２ｍＬ／Ｌアンホテ
リシンＢ、０．４８ｍＬ／Ｌ硫酸ゲンタマイシン、０．２％コール酸ナトリ
ウム、および０．０５ｇ／ＬアンチフォームＢ（ａｎｔｉｆｏａｍＢ）、ｐ
Ｈ８．５に調整）中に再懸濁する。

【００３３】本発明と矛盾しない改変物は、当業者に明らかである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、１グラムのＰＭＰあたり１．２グラムのＢＳＡまたはカゼインを用い
て固相をコーティングした場合のフェリチンアッセイにおける固相の粒子サイズ
の分布を（容量の変化％対粒子サイズで）示す。

【図２】図２は、ＢＳＡでコーティングした磁性粒子（現行）およびカゼインでコーテ
ィングした粒子（改変した）の両方についてテストステロンおよびＦＴ３の両方
についての３７℃での安定性を（用量回収％対日数での時間で）示す。

【図３】図３は、ＢＳＡでコーティングした磁性粒子（現行）およびカゼインでコーテ
ィングした粒子（改変した）の両方についてＦＴ３、Ｔ３、およびＴ４について
シミュレートした積載安定性（ＳｉｍｕｌａｔｅｄＯｎ−ＢｏａｒｄＳｔａ
ｂｉｌｉｔｙ）を（用量回収％対日数での時間で）示す。

【図４】図４は、ＢＳＡでコーティングした磁性粒子（現行）およびカゼインでコーテ
ィングした粒子（改変した）の両方についてＴ取り込みについてシミュレートし
た積載安定性（ＳｉｍｕｌａｔｅｄＯｎ−ＢｏａｒｄＳｔａｂｉｌｉｔｙ）
を（ＴＵ比回収％対日数での時間で）示す。

【図５】図５は、１００個の患者サンプルについてのＴ取り込み％を示す相関研究であ
り、各々、カゼインでコーティングした固相（改変した）をＢＳＡでコーティン
グした固相（現行）に対して用いて試験した。

【図６】図６は、ＢＳＡでコーティングした磁性粒子（カゼインなし）およびカゼイン
でコーティングした粒子（カゼイン）の両方について、３つの異なる分析物レベ
ルでのＣＡ１９−９アッセイについて３７℃での固相安定性を（用量回収％対
日数での時間で）示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/553 Ｇ０１Ｎ 33/553 33/566 33/566 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ユースタス，ダニエルダブリュー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02760，ノースアトルボロ，ウエストストリート 115 (72)発明者チャン，スティーブチン−シェンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02038，フランクリン，ミラーストリート 65 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QQ01 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR55 QR82 QS03 QS15 QS34 QS36 QX02 【要約の続き】した常磁性粒子を用いるためのプロセスが開発され、上記粒子は、免疫アッセイにおいて用いられる活性成分と直接的または間接的に結合する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】カゼインでコーティングした固相を結合アッセイにおいて用
いるためのプロセスであって、該固相が、該結合アッセイにおいて用いられる活
性成分と直接的または間接的に結合する、プロセス。
【請求項２】前記固相が、常磁性粒子であり、そして前記結合アッセイが
、免疫アッセイまたは遺伝子プローブアッセイである、請求項１に記載のプロセ
ス。
【請求項３】前記活性成分が、抗原、抗体、核酸、核酸ポリマー、および
他のレセプターからなる群より選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】前記カゼインが、カゼイン酸ナトリウムまたはカゼイン酸カ
リウムの形態である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】結合アッセイにおいて用いられる活性成分を含有する、カゼ
インでコーティングした常磁性粒子を作製するためのプロセスであって、該プロ
セスが、カゼインを、常磁性粒子および活性成分と混合する工程を包含し、該混
合する工程を、３０℃〜６０℃にて５〜１８０時間行って、カゼインでコーティ
ングした常磁性粒子を形成し、該粒子は必要に応じて、中間反応性実体として作
用して該結合アッセイにおいて必要とされる活性成分の添加を補助する１以上の
成分を含有する、プロセス。
【請求項６】前記常磁性粒子が、前記活性成分と予めカップリングされて
いる、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】前記成分が、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジ
ンからなる群より選択される、請求項５に記載のプロセス。
【請求項８】前記活性成分が、抗原、抗体、核酸、および核酸ポリマーか
らなる群より選択される、請求項５に記載のプロセス。
【請求項９】前記カゼインが、カゼイン酸ナトリウムまたはカゼイン酸カ
リウムの形態である、請求項５に記載のプロセス。
【請求項１０】前記混合する工程が、３７℃〜５０℃にて１４〜１４４時
間行われる、請求項５に記載のプロセス。
【請求項１１】結合アッセイにおいて用いるための、カゼインでコーティ
ングされた常磁性粒子であって、該コーティングされた粒子が、常磁性粒子１グ
ラムあたり０．０５グラム〜４．０グラムのカゼインを含む、常磁性粒子。
【請求項１２】常磁性粒子１グラムあたり０．１５グラム〜３．２グラム
のカゼインを含む、請求項１１に記載の常磁性粒子。
【請求項１３】常磁性粒子１グラムあたり０．７８グラム〜１．２グラム
のカゼインを含む、請求項１１に記載の常磁性粒子。
【請求項１４】前記カゼインが、カゼイン酸ナトリウムまたはカゼイン酸
カリウムの形態である、請求項１１に記載の常磁性粒子。
【請求項１５】前記結合アッセイが、フェリチン；Ｔ−取り込み；チロキ
シン；３，３’，５−トリヨードチロニン；遊離３，３’，５−トリヨードチロ
ニン；総ヒト絨毛性ゴナドトロピン；ＣＡ１９−９；およびテストステロンから
なる群より選択される分析物についてである、請求項２に記載のプロセス。
【請求項１６】非特異的結合により引き起こされる干渉が減少している、
請求項２に記載のプロセス。
【請求項１７】サンプルの不一致により引き起こされる干渉が減少してい
る、請求項２に記載のプロセス。
【請求項１８】安定性が、カゼインの添加に起因して改善されている、請
求項２に記載のプロセス。
【請求項１９】前記常磁性粒子がまた、ウシ血清アルブミンでコーティン
グされる、請求項２に記載のプロセス。