JPH1073594A - 金属コンジュゲートの安定化 - Google Patents
金属コンジュゲートの安定化Info
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- JPH1073594A JPH1073594A JP9148334A JP14833497A JPH1073594A JP H1073594 A JPH1073594 A JP H1073594A JP 9148334 A JP9148334 A JP 9148334A JP 14833497 A JP14833497 A JP 14833497A JP H1073594 A JPH1073594 A JP H1073594A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 表面に生体分子が吸着したコロイド粒子を安
定化させる。 【解決手段】 表面に生体分子が吸着したコロイド粒子
を含む組成物であって、チオールおよび／またはジスル
フィド基で置換されたポリエチレングリコールをさらに
含有する組成物。この組成物は免疫学的試験方法におい
て検出用試薬として使用することができる。
定化させる。 【解決手段】 表面に生体分子が吸着したコロイド粒子
を含む組成物であって、チオールおよび／またはジスル
フィド基で置換されたポリエチレングリコールをさらに
含有する組成物。この組成物は免疫学的試験方法におい
て検出用試薬として使用することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は生体分子が粒子の表
面に吸着されている、水溶液中のコロイド粒子の懸濁物
を含む組成物に関する。
面に吸着されている、水溶液中のコロイド粒子の懸濁物
を含む組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】タンパ
ク質または核酸などの生体分子とコロイド粒子で構成さ
れるコンジュゲートは、例えばイムノアッセイなどの検
出法におけるマーカーとして、または遺伝子転移のため
のミクロプロジェクタイル(microprojectile) として、
診断および治療法において広く使用されている。粒子と
して、金属および金属酸化物、金属水酸化物、金属塩な
どの金属化合物、ならびに金属または金属化合物で被覆
されたポリマー核物質で構成される粒子を使用すること
ができる（例えば、マーカーとしての適用に関して、米
国特許第-4,313,734号;Leuveringら、J.Immunoassay 1
(1980),77-91;Leuvering Dissertation(1984),Sol Part
icle Immunoassay(SPIA):各種のイムノアッセイにおけ
る標識抗体としての抗体被覆粒子の使用(The Use of An
tibody Coated Particles as Labelled Antibodies in
Various Typesof Immunoassay);Uda ら、Anal.Biochem.
218(1994),259-264, 独国公開公報第 41 32 133号,3ペ
ージ、16-18 行、および遺伝子転移のための適用に関し
て、Tangら、Nature 356(1992),152-154;Eisenbraun
ら、DNA and Cell Biology 12(1993),791-797;Williams
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),2726-2730 , 参
照）。さらに、炭素粒子などの非金属コロイド粒子(van
Amerongen,Anabiotic '92(1993),193-199) もまた使用
することができることも知られている。現在はコロイド
金粒子が最も頻繁に使用される。
ク質または核酸などの生体分子とコロイド粒子で構成さ
れるコンジュゲートは、例えばイムノアッセイなどの検
出法におけるマーカーとして、または遺伝子転移のため
のミクロプロジェクタイル(microprojectile) として、
診断および治療法において広く使用されている。粒子と
して、金属および金属酸化物、金属水酸化物、金属塩な
どの金属化合物、ならびに金属または金属化合物で被覆
されたポリマー核物質で構成される粒子を使用すること
ができる（例えば、マーカーとしての適用に関して、米
国特許第-4,313,734号;Leuveringら、J.Immunoassay 1
(1980),77-91;Leuvering Dissertation(1984),Sol Part
icle Immunoassay(SPIA):各種のイムノアッセイにおけ
る標識抗体としての抗体被覆粒子の使用(The Use of An
tibody Coated Particles as Labelled Antibodies in
Various Typesof Immunoassay);Uda ら、Anal.Biochem.
218(1994),259-264, 独国公開公報第 41 32 133号,3ペ
ージ、16-18 行、および遺伝子転移のための適用に関し
て、Tangら、Nature 356(1992),152-154;Eisenbraun
ら、DNA and Cell Biology 12(1993),791-797;Williams
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),2726-2730 , 参
照）。さらに、炭素粒子などの非金属コロイド粒子(van
Amerongen,Anabiotic '92(1993),193-199) もまた使用
することができることも知られている。現在はコロイド
金粒子が最も頻繁に使用される。
【０００３】生体分子−金コンジュゲートを製造するた
め、最初に、一般的に知られた方法にしたがって、テト
ラクロロ金酸を還元することによって、金ゾルを製造す
る。続いてこの金ゾルに、それぞれ所望の生体分子、例
えば抗体、プロテインＡ、タンパク質Ｇ、ストレプトア
ビジン等のタンパク質を添加する。それぞれの添加条件
（ｐＨ，緩衝液、生体分子の濃度等）は、生体分子の当
電点、ＭＰＡ（最少保護量）および／またはそのコンジ
ュゲートの特定の用途に依存する（例えば、DeMey, 金
プローブの製造および使用（The Preparation and Use
of Gold Probes）：J.M.Polak and S.V.Noorden 編集:I
mmunocytochemistry,Wright,Bristol 1986,115-145ペー
ジ、ならびにJ.E.Beesley,コロイド金:A New Perspecti
ve for Cytochemical Marking,Microscopy Handbooks 1
7,Oxford University Press,1989, 特に1-14ページ参
照）。これらの文献の開示をここに明白に引用する。
め、最初に、一般的に知られた方法にしたがって、テト
ラクロロ金酸を還元することによって、金ゾルを製造す
る。続いてこの金ゾルに、それぞれ所望の生体分子、例
えば抗体、プロテインＡ、タンパク質Ｇ、ストレプトア
ビジン等のタンパク質を添加する。それぞれの添加条件
（ｐＨ，緩衝液、生体分子の濃度等）は、生体分子の当
電点、ＭＰＡ（最少保護量）および／またはそのコンジ
ュゲートの特定の用途に依存する（例えば、DeMey, 金
プローブの製造および使用（The Preparation and Use
of Gold Probes）：J.M.Polak and S.V.Noorden 編集:I
mmunocytochemistry,Wright,Bristol 1986,115-145ペー
ジ、ならびにJ.E.Beesley,コロイド金:A New Perspecti
ve for Cytochemical Marking,Microscopy Handbooks 1
7,Oxford University Press,1989, 特に1-14ページ参
照）。これらの文献の開示をここに明白に引用する。
【０００４】コロイド粒子にそれぞれ所望の生体分子を
添加した後、コンジュゲートを安定化する必要がある。
この安定化は、粒子の凝集を最少にすること、および吸
着の可能性を残している自由表面を飽和することを目的
としている。現技術水準において、安定剤として、例え
ばウシ血清アルブミン、血液置換混合物等の不活性タン
パク質、Tween （登録商標）20などの界面活性剤、ポリ
エチレングリコール（分子量 20,000 D ）、ポリビニル
ピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルスルフ
ェートなどの水溶性合成ポリマー、デキストランおよび
ゼラチンが使用されている（例えば De Mey,上記；Bees
ley,上記；Behnke,Eur.J.Cell Biol.41(1986),326-33
8；DE 24 20 531 C3；およびMeiselら、J.Phys.Chem.85
(1981),179-187参照）。さらに、ホスパン（phospane）
複合体リガンドによる金ゾルの安定化の可能性について
も述べられている（Schmidら、Z.Naturforsch.45b(199
4),989-994 ）。
添加した後、コンジュゲートを安定化する必要がある。
この安定化は、粒子の凝集を最少にすること、および吸
着の可能性を残している自由表面を飽和することを目的
としている。現技術水準において、安定剤として、例え
ばウシ血清アルブミン、血液置換混合物等の不活性タン
パク質、Tween （登録商標）20などの界面活性剤、ポリ
エチレングリコール（分子量 20,000 D ）、ポリビニル
ピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルスルフ
ェートなどの水溶性合成ポリマー、デキストランおよび
ゼラチンが使用されている（例えば De Mey,上記；Bees
ley,上記；Behnke,Eur.J.Cell Biol.41(1986),326-33
8；DE 24 20 531 C3；およびMeiselら、J.Phys.Chem.85
(1981),179-187参照）。さらに、ホスパン（phospane）
複合体リガンドによる金ゾルの安定化の可能性について
も述べられている（Schmidら、Z.Naturforsch.45b(199
4),989-994 ）。
【０００５】現技術水準において使用されている安定剤
は金属粒子の自由表面に吸着状態で結合する。この安定
剤は、長期の保存、または例えば試料（血液、血清、血
漿、尿）との接触、試験片フリースへのコンジュゲート
の組み込み等によって試験中に発生し得るものなどの環
境条件の変化の結果として、多かれ少なかれ表面から脱
着するかまたは置換される可能性がある。この結果とし
て、凝集に対する安定性の劣化および非特異的反応性の
増加がもたらされる。その上、使用する安定剤の大部分
が確定性に乏しい生成物であり、その中でも例えばウシ
血清アルブミンおよびゼラチンなどは変化しやすい特性
を有している。その結果、安定化効果の変化もまた生じ
ることがある。
は金属粒子の自由表面に吸着状態で結合する。この安定
剤は、長期の保存、または例えば試料（血液、血清、血
漿、尿）との接触、試験片フリースへのコンジュゲート
の組み込み等によって試験中に発生し得るものなどの環
境条件の変化の結果として、多かれ少なかれ表面から脱
着するかまたは置換される可能性がある。この結果とし
て、凝集に対する安定性の劣化および非特異的反応性の
増加がもたらされる。その上、使用する安定剤の大部分
が確定性に乏しい生成物であり、その中でも例えばウシ
血清アルブミンおよびゼラチンなどは変化しやすい特性
を有している。その結果、安定化効果の変化もまた生じ
ることがある。
【０００６】粒子表面への吸着過程は非常に複雑で、現
在のところ部分的にしかわかっていない。吸着は静電的
相互作用、ファンデルワールス力および疎水性相互作用
が組み合わされた結果として生じるものと仮定されてい
る（Beesely,上記）。この過程において、吸着される生
体分子の種類によって、結合の１つの型または別の型が
優勢となり得る。
在のところ部分的にしかわかっていない。吸着は静電的
相互作用、ファンデルワールス力および疎水性相互作用
が組み合わされた結果として生じるものと仮定されてい
る（Beesely,上記）。この過程において、吸着される生
体分子の種類によって、結合の１つの型または別の型が
優勢となり得る。
【０００７】Prime およびWhitesidesによる公表文献
（Science 252(1991),1154-1167 ）において、疎水性
（メチル末端）および親水性（ヒドロキシル末端、マル
トース末端およびヘキサエチレングリコール末端）アル
カンチオールの混合物が平面状の金表面へのタンパク質
の吸着を抑制し得ることが開示されている。アルカンチ
オールによるタンパク質吸着の安定化については開示も
示唆もされていない。
（Science 252(1991),1154-1167 ）において、疎水性
（メチル末端）および親水性（ヒドロキシル末端、マル
トース末端およびヘキサエチレングリコール末端）アル
カンチオールの混合物が平面状の金表面へのタンパク質
の吸着を抑制し得ることが開示されている。アルカンチ
オールによるタンパク質吸着の安定化については開示も
示唆もされていない。
【０００８】驚くべきことに、チオールおよび／または
ジスルフィド基で置換されたポリエチレングリコールが
生体分子−粒子コンジュゲートの安定化に対して非常に
好適であることが今回見出された。現技術水準の安定剤
に比較して、置換ポリエチレングリコールが粒子表面に
より強く結合する結果、コンジュゲートの安定性に関し
て確実な改善が達成されることとなる。これによって、
溶液中での長期安定性の改善および低凝集傾向、環境条
件の変化に対するよりよい安定性、および例えばクロマ
トグラフィー特性などの試験性能の改善がもたらされ
る。置換ポリエチレングリコールによって生体分子が置
換される、または置換ポリエチレングリコールと生体分
子間に生じ得る相互作用（例えば、生体分子のＳＨ基お
よび置換ポリエチレングリコールのＳＨ基間の相互作
用）などによる、試験中のコンジュゲートの機能への悪
影響をともなわずにこれらの改善が達成されることは、
特に驚くべきことであった。対照的に、置換ポリエチレ
ングリコールを使用した場合、多くの試験形式におい
て、検出限界の低下および／または動力学的幅の強化
（検出曲線の急勾配化）が生じ得るという、改善された
試験性能すら見られる。これに適した安定剤は、例えば
２以上のエチレンオキサイド単位を有する短鎖の確定さ
れた置換ポリエチレングリコール、統計的なモル質量分
布を有する高分子量置換ポリエチレングリコール、およ
びこれらの混合物である。
ジスルフィド基で置換されたポリエチレングリコールが
生体分子−粒子コンジュゲートの安定化に対して非常に
好適であることが今回見出された。現技術水準の安定剤
に比較して、置換ポリエチレングリコールが粒子表面に
より強く結合する結果、コンジュゲートの安定性に関し
て確実な改善が達成されることとなる。これによって、
溶液中での長期安定性の改善および低凝集傾向、環境条
件の変化に対するよりよい安定性、および例えばクロマ
トグラフィー特性などの試験性能の改善がもたらされ
る。置換ポリエチレングリコールによって生体分子が置
換される、または置換ポリエチレングリコールと生体分
子間に生じ得る相互作用（例えば、生体分子のＳＨ基お
よび置換ポリエチレングリコールのＳＨ基間の相互作
用）などによる、試験中のコンジュゲートの機能への悪
影響をともなわずにこれらの改善が達成されることは、
特に驚くべきことであった。対照的に、置換ポリエチレ
ングリコールを使用した場合、多くの試験形式におい
て、検出限界の低下および／または動力学的幅の強化
（検出曲線の急勾配化）が生じ得るという、改善された
試験性能すら見られる。これに適した安定剤は、例えば
２以上のエチレンオキサイド単位を有する短鎖の確定さ
れた置換ポリエチレングリコール、統計的なモル質量分
布を有する高分子量置換ポリエチレングリコール、およ
びこれらの混合物である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明の１
主題は、表面に生体分子が吸着されたコロイド粒子を含
む組成物であって、好ましくはこの粒子の表面に複合吸
着されるチオールおよび／またはジスルフィド基で置換
されたポリエチレングリコールをさらに含有する組成物
である。
主題は、表面に生体分子が吸着されたコロイド粒子を含
む組成物であって、好ましくはこの粒子の表面に複合吸
着されるチオールおよび／またはジスルフィド基で置換
されたポリエチレングリコールをさらに含有する組成物
である。
【００１０】本発明による組成物は水性懸濁物として、
または例えば吸収性紙などのクロマトグラフィー材料上
に固定化させて存在させることができる。組成物が水性
懸濁物の形態の場合、緩衝液中の置換ポリエチレングリ
コールを粒子の表面に複合吸着させるとともに溶解形態
でさらに含有させるのが好ましい。粒子は金属性または
炭素粒子などの非金属性粒子とすることができる。金
属、金属酸化物、金属水酸化物、金属化合物の粒子、ま
たは金属若しくは金属化合物で被覆された粒子などの金
属性粒子が好ましい。金属の粒子が特に好ましい。
または例えば吸収性紙などのクロマトグラフィー材料上
に固定化させて存在させることができる。組成物が水性
懸濁物の形態の場合、緩衝液中の置換ポリエチレングリ
コールを粒子の表面に複合吸着させるとともに溶解形態
でさらに含有させるのが好ましい。粒子は金属性または
炭素粒子などの非金属性粒子とすることができる。金
属、金属酸化物、金属水酸化物、金属化合物の粒子、ま
たは金属若しくは金属化合物で被覆された粒子などの金
属性粒子が好ましい。金属の粒子が特に好ましい。
【００１１】金属の粒子は例えば金、銀、銅、白金、パ
ラジウムからなる群から選択される金属およびこれらの
混合物などの貴金属粒子が好ましい。金粒子が特に好ま
しい。粒子の平均直径は現技術水準において通常の1 〜
1000 nm の範囲であり、適用目的にしたがって変更する
ことができる。粒子の平均直径は好ましくは2-200 nmの
範囲であり、特に好ましくは2 〜100 nmである。
ラジウムからなる群から選択される金属およびこれらの
混合物などの貴金属粒子が好ましい。金粒子が特に好ま
しい。粒子の平均直径は現技術水準において通常の1 〜
1000 nm の範囲であり、適用目的にしたがって変更する
ことができる。粒子の平均直径は好ましくは2-200 nmの
範囲であり、特に好ましくは2 〜100 nmである。
【００１２】粒子の表面に吸着される生体分子は、好ま
しくはタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、核酸、ペ
プチド−核酸、糖類、抗原およびハプテンからなる群か
ら選択される。生体分子は特に好ましくは抗体、抗体断
片、レクチン、酵素、ストレプトアビジン、アビジン、
プロテインＡ、組み換えポリペプチドまたは多重抗原
（WO96/03652）、例えばポリハプテン（デキストランな
どの担体またはタンパク質に結合した数種のハプテンま
たはペプチド）などの抗原、ペプチドおよびハプテン
（好ましくはビオチン、フルオレセインまたはジゴキシ
ゲニンなどの MW≦1500の低分子量物質）からなる群か
ら選択される。これらの生体分子を金粒子に吸着させる
ための正確な条件については、De MeyおよびBeesley に
よる上記の参考文献を引用する。
しくはタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、核酸、ペ
プチド−核酸、糖類、抗原およびハプテンからなる群か
ら選択される。生体分子は特に好ましくは抗体、抗体断
片、レクチン、酵素、ストレプトアビジン、アビジン、
プロテインＡ、組み換えポリペプチドまたは多重抗原
（WO96/03652）、例えばポリハプテン（デキストランな
どの担体またはタンパク質に結合した数種のハプテンま
たはペプチド）などの抗原、ペプチドおよびハプテン
（好ましくはビオチン、フルオレセインまたはジゴキシ
ゲニンなどの MW≦1500の低分子量物質）からなる群か
ら選択される。これらの生体分子を金粒子に吸着させる
ための正確な条件については、De MeyおよびBeesley に
よる上記の参考文献を引用する。
【００１３】安定剤として好適なチオールで置換したポ
リエチレングリコールは、チオール基を鎖の少なくとも
１つの末端に有する基本的に直鎖状の分子が好ましい。
一方の末端がチオール基であって、他の末端はチオール
およびジスルフィド以外であるものが好ましい。安定剤
として好適なジスルフィドで置換されたポリエチレング
リコールもまた、鎖内に少なくとも１つのＳＳ架橋を含
有する基本的に直鎖状の分子が好ましい。この分子は、
ＳＳ架橋をただ１つのみ有し、末端はチオールおよびジ
スルフィド以外であるものが好ましい。ジスルフィド置
換およびチオール置換化合物の混合物もまた安定剤とし
て好適である。
リエチレングリコールは、チオール基を鎖の少なくとも
１つの末端に有する基本的に直鎖状の分子が好ましい。
一方の末端がチオール基であって、他の末端はチオール
およびジスルフィド以外であるものが好ましい。安定剤
として好適なジスルフィドで置換されたポリエチレング
リコールもまた、鎖内に少なくとも１つのＳＳ架橋を含
有する基本的に直鎖状の分子が好ましい。この分子は、
ＳＳ架橋をただ１つのみ有し、末端はチオールおよびジ
スルフィド以外であるものが好ましい。ジスルフィド置
換およびチオール置換化合物の混合物もまた安定剤とし
て好適である。
【００１４】したがって、チオール基および／またはジ
スルフィド基で置換されたポリエチレングリコールは好
ましくは下記の一般式の構造を有する：
スルフィド基で置換されたポリエチレングリコールは好
ましくは下記の一般式の構造を有する：
【００１５】
【化２】
【００１６】［式中、残基Ｒ1 ならびに残基Ｒ2 および
Ｒ3 の少なくとも１つが２以上 、好ましくは３以上
の（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）基を含有する有機残基であ
る］。エチレンオキサイド単位を含有する置換ポリエチ
レングリコールの残基Ｒ1，Ｒ2およびＲ3 は好ましくは
化合物が約50,000 Dの最大平均分子量、特に好ましくは
約25,000 Dの最大平均分子量を有するように選択され
る。残基Ｒ1，Ｒ2およびＲ3は所望のいずれの基でもよ
いが、好ましくはＯＨ基および／またはＯ−メチル若し
くはＯ−エチル基などのＯ−Ｃ1〜 Ｃ4 アルキル基など
のＯ−アルキル基である。
Ｒ3 の少なくとも１つが２以上 、好ましくは３以上
の（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）基を含有する有機残基であ
る］。エチレンオキサイド単位を含有する置換ポリエチ
レングリコールの残基Ｒ1，Ｒ2およびＲ3 は好ましくは
化合物が約50,000 Dの最大平均分子量、特に好ましくは
約25,000 Dの最大平均分子量を有するように選択され
る。残基Ｒ1，Ｒ2およびＲ3は所望のいずれの基でもよ
いが、好ましくはＯＨ基および／またはＯ−メチル若し
くはＯ−エチル基などのＯ−Ｃ1〜 Ｃ4 アルキル基など
のＯ−アルキル基である。
【００１７】好適な置換ポリエチレングリコールの好ま
しい例は、Shearwater Polymers Inc.から市販されてい
る平均分子量が約5,000 D のメトキシ−ポリエチレン−
グリコール−ＳＨである。他方、例えば2 〜10のエチレ
ンオキサイド単位を含有する短い確定されたチオール置
換またはジスルフィド置換ポリエチレングリコールを使
用することも可能である。
しい例は、Shearwater Polymers Inc.から市販されてい
る平均分子量が約5,000 D のメトキシ−ポリエチレン−
グリコール−ＳＨである。他方、例えば2 〜10のエチレ
ンオキサイド単位を含有する短い確定されたチオール置
換またはジスルフィド置換ポリエチレングリコールを使
用することも可能である。
【００１８】本発明による組成物は、検出用試薬とし
て、特に免疫学的検出用試薬として使用することができ
る。第１の好ましい態様において、検出用試薬はイムノ
アッセイ、すなわち試料液体中の被検体を免疫学的方
法、例えば標識被検体類似体若しくは標識被検体−特異
的受容体、例えば抗体を使用する競合検定、または標識
被検体−特異的受容体若しくはこの被検体−特異的受容
体に結合することができる追加の標識受容体を使用する
サンドイッチ検定、によって測定するための方法、にお
いて使用される。好ましい例は、例えばヒトコリオゴナ
ドトロピン（ＨＣＧ）の検出試験などの妊娠試験、また
はコカイン若しくはアンフェタミンなどの薬物、ヒト血
清アルブミン、トロポニンＴ、ミオグロビンおよび抗Ｈ
ＩＶ抗体などの免疫グロブリンの検出方法である。特に
好ましい適用形態は、検出用試薬を含有する吸収性物
質、例えば試験片に判定すべき試料を適用するものであ
る。本発明による安定化組成物を使用することができ
る、第２の特に好ましい態様は、組織切片の染色であ
る。
て、特に免疫学的検出用試薬として使用することができ
る。第１の好ましい態様において、検出用試薬はイムノ
アッセイ、すなわち試料液体中の被検体を免疫学的方
法、例えば標識被検体類似体若しくは標識被検体−特異
的受容体、例えば抗体を使用する競合検定、または標識
被検体−特異的受容体若しくはこの被検体−特異的受容
体に結合することができる追加の標識受容体を使用する
サンドイッチ検定、によって測定するための方法、にお
いて使用される。好ましい例は、例えばヒトコリオゴナ
ドトロピン（ＨＣＧ）の検出試験などの妊娠試験、また
はコカイン若しくはアンフェタミンなどの薬物、ヒト血
清アルブミン、トロポニンＴ、ミオグロビンおよび抗Ｈ
ＩＶ抗体などの免疫グロブリンの検出方法である。特に
好ましい適用形態は、検出用試薬を含有する吸収性物
質、例えば試験片に判定すべき試料を適用するものであ
る。本発明による安定化組成物を使用することができ
る、第２の特に好ましい態様は、組織切片の染色であ
る。
【００１９】その他、本発明による組成物は、例えば遺
伝子転移などの生体分子−粒子コンジュゲートに関して
既知のその他のすべての適用に対してももちろん使用す
ることができる。本発明のさらに別の主題は、コンジュ
ゲートにチオール基および／またはジスルフィド基で置
換されたポリエチレングリコールを添加することからな
る、コロイド粒子および生体分子で構成されるコンジュ
ゲートの安定化方法である。この方法において、コンジ
ュゲートの長期安定性の増強（＞1.5 年）およびｐＨ安
定性の改善、そして他の物質の存在に対する安定性の改
善を達成することが可能である。
伝子転移などの生体分子−粒子コンジュゲートに関して
既知のその他のすべての適用に対してももちろん使用す
ることができる。本発明のさらに別の主題は、コンジュ
ゲートにチオール基および／またはジスルフィド基で置
換されたポリエチレングリコールを添加することからな
る、コロイド粒子および生体分子で構成されるコンジュ
ゲートの安定化方法である。この方法において、コンジ
ュゲートの長期安定性の増強（＞1.5 年）およびｐＨ安
定性の改善、そして他の物質の存在に対する安定性の改
善を達成することが可能である。
【００２０】置換ポリエチレングリコールは好ましくは
最終濃度が 0.1μM から 1 mM となるように、特に 1μ
M から 100μM となるような量を添加する。さらに、例
えばウシ血清アルブミンなどの不活性タンパク質および
／または非置換ポリエチレングリコールなどの現技術水
準において既知の安定剤を追加することができる。
最終濃度が 0.1μM から 1 mM となるように、特に 1μ
M から 100μM となるような量を添加する。さらに、例
えばウシ血清アルブミンなどの不活性タンパク質および
／または非置換ポリエチレングリコールなどの現技術水
準において既知の安定剤を追加することができる。
【００２１】最後に、本発明は検出用試薬として本発明
にしたがって安定化された組成物を含有する、免疫学的
検出方法のための試験用キットにも関する。図面および
以下の実施例によって本発明をさらに明らかにする。
にしたがって安定化された組成物を含有する、免疫学的
検出方法のための試験用キットにも関する。図面および
以下の実施例によって本発明をさらに明らかにする。
【００２２】
【発明の実施の形態】実施例１ チオール置換ポリエチレングリコール化合物の合成 テトラエチレングリコールモノメチルエーテル（Kodak
Co.）25 gをピリジン150 ml 中で塩化トシル 25 g と反
応させた。反応混合物を水で希釈し、続いて酢酸エチル
で抽出した。濃縮によって得られたトシル化物（13 g）
をＤＭＦ中でフタルイミドカリウム塩 15 g と150℃で
反応させた。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽
出した。ロータリーエバポレーションの後、得られた生
成物（10.2 g）をメタノール 50 ml中にとり、濾過し、
ヒドラジン水和物 1.83 mlと混合した。混合物を還流下
で２時間沸騰させ、冷却し、濃塩酸と混合し、析出した
沈殿を濾過によって除去した。
Co.）25 gをピリジン150 ml 中で塩化トシル 25 g と反
応させた。反応混合物を水で希釈し、続いて酢酸エチル
で抽出した。濃縮によって得られたトシル化物（13 g）
をＤＭＦ中でフタルイミドカリウム塩 15 g と150℃で
反応させた。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽
出した。ロータリーエバポレーションの後、得られた生
成物（10.2 g）をメタノール 50 ml中にとり、濾過し、
ヒドラジン水和物 1.83 mlと混合した。混合物を還流下
で２時間沸騰させ、冷却し、濃塩酸と混合し、析出した
沈殿を濾過によって除去した。
【００２３】濾液を 3N ＮａＯＨでアルカリ性にし、続
いてクロロホルムで抽出した。ロータリーエバポレーシ
ョンの後、粘性油状物 3.11 g を得た。この油状物 500
mg をＴＨＦ 10 ml中のトリエチルアミン 244 mg で溶
解した。この溶液に、ＴＨＦ 20 ml中のＳ−アセチルチ
オプロピオン酸−Ｏ−スクシンイミドエステル 591 mg
を滴下した。この溶液を室温で24時間撹拌し、ロータリ
ーエバポレーションし、シリカゲルカラム上で精製し
た。
いてクロロホルムで抽出した。ロータリーエバポレーシ
ョンの後、粘性油状物 3.11 g を得た。この油状物 500
mg をＴＨＦ 10 ml中のトリエチルアミン 244 mg で溶
解した。この溶液に、ＴＨＦ 20 ml中のＳ−アセチルチ
オプロピオン酸−Ｏ−スクシンイミドエステル 591 mg
を滴下した。この溶液を室温で24時間撹拌し、ロータリ
ーエバポレーションし、シリカゲルカラム上で精製し
た。
【００２４】アセチル基を切断してチオール基を遊離さ
せるため、生成物 550 mg の水溶液に25％アンモニア溶
液 15 mlを添加した。調製物をカラムクロマトグラフィ
ーによって精製した。モノメトキシテトラエチレングリ
コールプロピオンアミド−ＳＨ化合物 300 mg を得た。実施例２ タンパク質−金コンジュゲートの製造 金粒子に吸着させるタンパク質の溶液を好適な添加用緩
衝液に対して透析するか、またはこの添加用緩衝液で希
釈した。続いて、凝集物が生成した場合には遠心分離ま
たは 0.2μm 濾紙を通した濾過によって除去した。
せるため、生成物 550 mg の水溶液に25％アンモニア溶
液 15 mlを添加した。調製物をカラムクロマトグラフィ
ーによって精製した。モノメトキシテトラエチレングリ
コールプロピオンアミド−ＳＨ化合物 300 mg を得た。実施例２ タンパク質−金コンジュゲートの製造 金粒子に吸着させるタンパク質の溶液を好適な添加用緩
衝液に対して透析するか、またはこの添加用緩衝液で希
釈した。続いて、凝集物が生成した場合には遠心分離ま
たは 0.2μm 濾紙を通した濾過によって除去した。
【００２５】Ｋ2ＣＯ3を使用して、コロイド金粒子を含
有する溶液のｐＨ値をタンパク質溶液のｐＨ値に調整し
た。その後、撹拌しながら、そのタンパク質にこのコロ
イド金溶液を添加した。この方法によって調製されたタ
ンパク質−金コンジュゲートを、現技術水準にしたがっ
て、最終濃度が 0.1％〜1％ (w/v)となるようにＢＳＡ
溶液を添加するか、または最終濃度が 0.01％〜0.1％(w
/v) となるようにポリエチレングリコール溶液を添加す
ることによって、安定化した。
有する溶液のｐＨ値をタンパク質溶液のｐＨ値に調整し
た。その後、撹拌しながら、そのタンパク質にこのコロ
イド金溶液を添加した。この方法によって調製されたタ
ンパク質−金コンジュゲートを、現技術水準にしたがっ
て、最終濃度が 0.1％〜1％ (w/v)となるようにＢＳＡ
溶液を添加するか、または最終濃度が 0.01％〜0.1％(w
/v) となるようにポリエチレングリコール溶液を添加す
ることによって、安定化した。
【００２６】続いて、このタンパク質−金コンジュゲー
トを精製し、濃縮して、所望の保存用緩衝液条件、例え
ば20 mM Ｔｒｉｓ、 100 mM ＮａＣｌ ｐＨ 8、１％Ｂ
ＳＡおよび／または0.01％〜0.1％ＰＥＧ，ＮａＮ3 、
を設定した。実施例３ ＰＥＧに比較したＰＥＧ−ＳＨによる金ゾルの予備飽和 20 nm の金粒子に対してモノクローナル抗ヒト血清アル
ブミンマウスＩｇＧ抗体を添加する前に、10-5M ＰＥＧ
−ＳＨ（Shearwater Polymers,Inc.からの市販ＰＥＧ−
ＳＨ MW 5000、または実施例１のＰＥＧ−ＳＨ）または
ＰＥＧを添加することによって、実施例２の金ゾルを予
備飽和した場合、ＰＥＧは金ゾルから抗体によって置換
されるが、ＰＥＧ−ＳＨは置換されないことがわかっ
た。
トを精製し、濃縮して、所望の保存用緩衝液条件、例え
ば20 mM Ｔｒｉｓ、 100 mM ＮａＣｌ ｐＨ 8、１％Ｂ
ＳＡおよび／または0.01％〜0.1％ＰＥＧ，ＮａＮ3 、
を設定した。実施例３ ＰＥＧに比較したＰＥＧ−ＳＨによる金ゾルの予備飽和 20 nm の金粒子に対してモノクローナル抗ヒト血清アル
ブミンマウスＩｇＧ抗体を添加する前に、10-5M ＰＥＧ
−ＳＨ（Shearwater Polymers,Inc.からの市販ＰＥＧ−
ＳＨ MW 5000、または実施例１のＰＥＧ−ＳＨ）または
ＰＥＧを添加することによって、実施例２の金ゾルを予
備飽和した場合、ＰＥＧは金ゾルから抗体によって置換
されるが、ＰＥＧ−ＳＨは置換されないことがわかっ
た。
【００２７】実施例４ ヒト血清アルブミンおよびＨＣＧの検出のための試験に
おける、本発明にしたがって安定化させたタンパク質−
金コンジュゲートの適用 実施例２に記載した方法によって、金粒子上にモノクロ
ーナル抗ヒト血清アルブミンおよび抗ＨＣＧ抗体のコン
ジュゲートを調製した。コンジュゲートを形成させた
後、ＰＥＧ−ＳＨを最終濃度が10-6M 〜10-4M となるよ
うに添加することによって安定化させた。
おける、本発明にしたがって安定化させたタンパク質−
金コンジュゲートの適用 実施例２に記載した方法によって、金粒子上にモノクロ
ーナル抗ヒト血清アルブミンおよび抗ＨＣＧ抗体のコン
ジュゲートを調製した。コンジュゲートを形成させた
後、ＰＥＧ−ＳＨを最終濃度が10-6M 〜10-4M となるよ
うに添加することによって安定化させた。
【００２８】抗体の添加直後にゾル安定剤としてＰＥＧ
−ＳＨを添加した場合、抗体添加直後に安定剤としてＰ
ＥＧ−ＳＨおよびＢＳＡを（順次または混合物として）
添加した場合、および保存用緩衝液に安定剤としてＰＥ
Ｇ−ＳＨを添加した場合（最終濃度10-4M ３〜10-5M
）、について試験した。試験は競合１段階試験とし
て、試験片上で実施した。
−ＳＨを添加した場合、抗体添加直後に安定剤としてＰ
ＥＧ−ＳＨおよびＢＳＡを（順次または混合物として）
添加した場合、および保存用緩衝液に安定剤としてＰＥ
Ｇ−ＳＨを添加した場合（最終濃度10-4M ３〜10-5M
）、について試験した。試験は競合１段階試験とし
て、試験片上で実施した。
【００２９】モノクローナル抗ＨＳＡ抗体および金粒子
で構成されたコンジュゲートの機能はＰＥＧ−ＳＨでの
安定化によって悪影響を受けないことがわかった。実施例５ ＰＥＧ−ＳＨによって安定化された金コンジュゲートの
安定性 実施例４において調製した抗体−金コンジュゲートを1.
5 年間保存した後に測定した結果、抗体が流出せずに、
機能がそのまま完全に残っていることが示された。
で構成されたコンジュゲートの機能はＰＥＧ−ＳＨでの
安定化によって悪影響を受けないことがわかった。実施例５ ＰＥＧ−ＳＨによって安定化された金コンジュゲートの
安定性 実施例４において調製した抗体−金コンジュゲートを1.
5 年間保存した後に測定した結果、抗体が流出せずに、
機能がそのまま完全に残っていることが示された。
【００３０】実施例６ 抗体−金コンジュゲートのｐＨ安定性 実施例２に記載した方法にしたがって、モノクローナル
抗ＨＣＧマウスＩｇＧ抗体を 40 nmの金粒子に吸着させ
た。続いて、表１ａ，１ｂおよび１ｃに記載されたよう
にして、再飽和を実施した。
抗ＨＣＧマウスＩｇＧ抗体を 40 nmの金粒子に吸着させ
た。続いて、表１ａ，１ｂおよび１ｃに記載されたよう
にして、再飽和を実施した。
【００３１】ＨＣｌまたはＮａＯＨによって各種のｐＨ
に調整しておいた含浸用緩衝液（50mM ＨＥＰＥＳ ｐ
Ｈ7.0，100 mMＮａＣｌ，2.0％ショ糖、0.1％ＢＳＡ，
0.2％Brij 35）中で、これらのコンジュゲートの安定性
を試験した。 試験操作法：試験用金コンジュゲートの全部について 5
20 nm における実際のＯＤを測定した。その後、各バッ
チを各種ｐＨ値の５種の含浸用緩衝液でＯＤが約８にな
るまで希釈し、直後に、そして１時間後および６時間後
に光度計で再測定した。
に調整しておいた含浸用緩衝液（50mM ＨＥＰＥＳ ｐ
Ｈ7.0，100 mMＮａＣｌ，2.0％ショ糖、0.1％ＢＳＡ，
0.2％Brij 35）中で、これらのコンジュゲートの安定性
を試験した。 試験操作法：試験用金コンジュゲートの全部について 5
20 nm における実際のＯＤを測定した。その後、各バッ
チを各種ｐＨ値の５種の含浸用緩衝液でＯＤが約８にな
るまで希釈し、直後に、そして１時間後および６時間後
に光度計で再測定した。
【００３２】表１ａは、最終濃度が0.05％となるように
ＰＥＧ 20,000 を添加し、続いて最終濃度が 1μM とな
るようにＰＥＧ−ＳＨを添加することによって安定化し
た、本発明の抗体−金コンジュゲートに関する結果を示
している。表１ｂは、最終濃度が 1μM となるようにＰ
ＥＧ−ＳＨを添加することによって安定化した、本発明
の別の抗体−金コンジュゲートに関する結果を示してい
る。
ＰＥＧ 20,000 を添加し、続いて最終濃度が 1μM とな
るようにＰＥＧ−ＳＨを添加することによって安定化し
た、本発明の抗体−金コンジュゲートに関する結果を示
している。表１ｂは、最終濃度が 1μM となるようにＰ
ＥＧ−ＳＨを添加することによって安定化した、本発明
の別の抗体−金コンジュゲートに関する結果を示してい
る。
【００３３】表１ｃは、最終濃度が0.05％となるように
ＰＥＧで飽和することによって安定化した、現技術水準
の抗体−金コンジュゲートに関する結果を示している。
ＰＥＧで飽和することによって安定化した、現技術水準
の抗体−金コンジュゲートに関する結果を示している。
【００３４】
【表１】 これらの結果は、現技術水準の金コンジュゲートの場
合、酸性および中性ｐＨ範囲において、すでに１時間後
に注目すべき不安定性（ＯＤの減少）が観察されること
を示している。対照的に、本発明のコンジュゲートのＯ
Ｄは一定のままである。このことは、本発明のコンジュ
ゲートが現技術水準のコンジュゲートに比較してかなり
改善されたｐＨ安定性を有することを示している。
合、酸性および中性ｐＨ範囲において、すでに１時間後
に注目すべき不安定性（ＯＤの減少）が観察されること
を示している。対照的に、本発明のコンジュゲートのＯ
Ｄは一定のままである。このことは、本発明のコンジュ
ゲートが現技術水準のコンジュゲートに比較してかなり
改善されたｐＨ安定性を有することを示している。
【００３５】実施例７ 本発明の抗体−金コンジュゲートの試験機能の現技術水
準のコンジュゲートに対する比較 ポリクローナル抗アンフェタミンヒツジＩｇＧ抗体およ
び 20 nmの金粒子で構成されたコンジュゲートを調製し
た。0.1％ＢＳＡの添加によって再飽和を実施した。保
存用緩衝液に２％ＢＳＡを含有させた。
準のコンジュゲートに対する比較 ポリクローナル抗アンフェタミンヒツジＩｇＧ抗体およ
び 20 nmの金粒子で構成されたコンジュゲートを調製し
た。0.1％ＢＳＡの添加によって再飽和を実施した。保
存用緩衝液に２％ＢＳＡを含有させた。
【００３６】本発明のコンジュゲートを安定化するた
め、再飽和後または保存用緩衝液に 5×10-6M または10
-5M ＰＥＧ−ＳＨを添加した。競合１段階試験として、
試験片上でアンフェタミンの検出を実施した。この実験
の結果を図１に示す。ＰＥＧ−ＳＨを添加しなかった金
コンジュゲートの方がかなり緩やかな試験曲線を有し、
すなわち本発明にしたがってＰＥＧ−ＳＨで安定化した
コンジュゲートよりも試験機能が劣っていることがわか
る。 5×10-6M のＰＥＧ−ＳＨ添加よりも、10-5M のＰ
ＥＧ−ＳＨ添加の方がさらに大きな改善をもたらす。
め、再飽和後または保存用緩衝液に 5×10-6M または10
-5M ＰＥＧ−ＳＨを添加した。競合１段階試験として、
試験片上でアンフェタミンの検出を実施した。この実験
の結果を図１に示す。ＰＥＧ−ＳＨを添加しなかった金
コンジュゲートの方がかなり緩やかな試験曲線を有し、
すなわち本発明にしたがってＰＥＧ−ＳＨで安定化した
コンジュゲートよりも試験機能が劣っていることがわか
る。 5×10-6M のＰＥＧ−ＳＨ添加よりも、10-5M のＰ
ＥＧ−ＳＨ添加の方がさらに大きな改善をもたらす。
【図１】本発明にしたがって安定化させた抗体−金コン
ジュゲートの現技術水準のコンジュゲートとの試験性能
の比較を示す図である。
ジュゲートの現技術水準のコンジュゲートとの試験性能
の比較を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０８Ｌ 101/00 Ｃ０８Ｌ 101/00 Ｃ０９Ｃ 1/62 Ｃ０９Ｃ 1/62 3/10 3/10 // Ａ６１Ｋ 39/44 Ａ６１Ｋ 39/44 (72)発明者 ペーター スルカ ドイツ連邦共和国 ディー−82362 ヴァ イルハイム，シュトラーセ−アナ−ヴェク 17
Claims (15)
- 【請求項１】 表面に生体分子が吸着したコロイド粒子
を含む組成物であって、チオールおよび／またはジスル
フィド基で置換されたポリエチレングリコールをさらに
含有する組成物。 - 【請求項２】 置換ポリエチレングリコールが粒子の表
面に複合吸着している、請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】 粒子が貴金属粒子である、請求項１また
は２記載の組成物。 - 【請求項４】 粒子の平均直径が1 nm〜1000 nm の範囲
である、請求項１〜３のいずれか１つに記載された組成
物。 - 【請求項５】 生体分子が、タンパク質、糖タンパク
質、ペプチド、核酸、ペプチド−核酸、糖類、抗原およ
びハプテンからなる群から選択される、請求項１〜４の
いずれか１つに記載された組成物。 - 【請求項６】 生体分子が、抗体、抗体断片、レクチ
ン、酵素、ストレプトアビジン、アビジン、プロテイン
Ａ、組み換えポリペプチド、ペプチド、ハプテンおよび
ポリハプテンからなる群から選択される、請求項５記載
の組成物。 - 【請求項７】 置換ポリエチレングリコールが下記の一
般式の構造： 【化１】 ［式中、残基Ｒ1 ならびに残基Ｒ2 およびＲ3 の少なく
とも１つが２以上、好ましくは３以上の（ＣＨ2−ＣＨ2
−Ｏ）基を含有する有機残基である］を有する、請求項
１〜６のいずれか１つに記載された組成物。 - 【請求項８】 置換ポリエチレングリコールが約50,000
Dの最大平均分子量を有する、請求項１〜７のいずれか
１つに記載された組成物。 - 【請求項９】 残基Ｒ1 、Ｒ2 およびＲ3 が末端基とし
てＯＨ基および／またはＯ−アルキル基を有する、請求
項７記載の組成物。 - 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１つに記載の
組成物の検出用試薬としての使用。 - 【請求項１１】 組織切片の染色のための、請求項10記
載の使用。 - 【請求項１２】 コンジュゲートにチオールおよび／ま
たはジイルフィド基で置換されたポリエチレングリコー
ルを添加することからなる、コロイド金属粒子および生
体分子で構成されるコンジュゲートの安定化方法。 - 【請求項１３】 置換ポリエチレングリコールを最終濃
度が 0.1μM〜1 mMになるように添加する、請求項12記
載の方法。 - 【請求項１４】 さらに別の安定剤を追加する、請求項
12または13記載の方法。 - 【請求項１５】 検出用試薬として請求項１〜９のいず
れか１つに記載の安定化組成物を含有する、免疫学的検
出方法のための試験用キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19622628A DE19622628A1 (de) | 1996-06-05 | 1996-06-05 | Stabilisierung von Metallkonjugaten |
| DE19622628:7 | 1996-06-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1073594A true JPH1073594A (ja) | 1998-03-17 |
Family
ID=7796257
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9148334A Pending JPH1073594A (ja) | 1996-06-05 | 1997-06-05 | 金属コンジュゲートの安定化 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5972720A (ja) |
| EP (1) | EP0811846B1 (ja) |
| JP (1) | JPH1073594A (ja) |
| DE (2) | DE19622628A1 (ja) |
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| JP2001522818A (ja) * | 1997-11-10 | 2001-11-20 | サイティミューン サイエンシーズ， インコーポレイテッド | 生物学的に活性な因子の標的化された送達のための組成物および方法 |
| JP2004532850A (ja) * | 2001-04-30 | 2004-10-28 | サイティミュン サイエンス， インコーポレイテッド | コロイド状金属組成物および方法 |
| WO2005005548A1 (ja) * | 2003-07-09 | 2005-01-20 | Tokyo University Of Science, Educational Foundation | 多孔質粒子とポリマー分子のコンジュゲートならびにその使用 |
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| US7851149B2 (en) | 1998-10-27 | 2010-12-14 | Erez Braun | Method for gold deposition |
| JP2011520769A (ja) * | 2007-09-21 | 2011-07-21 | サイトイミューン サイエンシズ インコーポレイテッド | ナノ治療コロイド金属組成物および方法 |
| JP2011528054A (ja) * | 2008-07-15 | 2011-11-10 | シュテファン・バルチコウスキー | 金属含有有機化合物の製造のための方法および装置 |
| WO2013141122A1 (ja) | 2012-03-22 | 2013-09-26 | 田中貴金属工業株式会社 | イムノクロマトグラフィー検出方法 |
| JP2014515009A (ja) * | 2011-03-02 | 2014-06-26 | イムラ アメリカ インコーポレイテッド | 安定コロイド状金ナノ粒子の制御可能な表面修飾及び官能化 |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20010055581A1 (en) | 1994-03-18 | 2001-12-27 | Lawrence Tamarkin | Composition and method for delivery of biologically-active factors |
| US6833275B1 (en) * | 1997-07-22 | 2004-12-21 | Roche Diagnostics Gmbh | Gold conjugates containing detergent |
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