JPS60111158A - 特異結合検定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 野に関し、さらに詳しくは試薬のあるものは固相に結合
し、そして妨害物質を含有する液体試料中のリガンドの
測定に使用する試薬に関する。

特異結合検定技術の発達により、液体媒質中に非常に低
濃度で現れる、診断上、医療上、環境上および産業上重
要な種種の有機物質を測定する極めて有用な分析方法が
提供された。特異結合検定法はりガンｒ１すなわち測定
すべき、結合し得る被分析物とこれに対する結合パート
ナ−すなわち受容体との特異的干渉に基づくものである
。リガンドとその結合パートナ−とのうち一つが抗体で
あり他の一つが対応するハプテンまたは抗原である場合
はこの検定は免疫検定として知られている。

これらの特異結合検定は、分析用素子または試験用細片
、被覆チューブ、粒子結合試薬等を含む種種の固体状の
形態として提供されてきた。凝集検定は固体状特異結合
検定のうち、通常免疫検定として、最も広く使用されて
いるものの一つであって、直接、間接（受動）または阻
害型凝集検定に分類し得る。直接凝集検定にお（・てし
ま、特異結合ペアの一つのメンバー（例えば受容体）で
ある表面成分を有する粒子を、特異結合ペアの他の一つ
のメンバー（例えばリガンド）を分析すべき試料と反応
させる。間接（受動）凝集形態にお（・では、特異結合
ペアの一つのメンバー（例えば受容体）を固体基質粒子
に結合し、この粒子に結合したメンバーを、そのペアの
もう一方のメン／々−（例えばリガンド）を分析すべき
試料と反応させる。阻害型凝集検定においては、結合ペ
アの一つのメンバーを測定すべき試料を、先ずその結合
ペアのもう一方のメンバーを含有する溶液と反応させ、
この予備処理した溶液を次に試料中に存在すると考えら
れる結合ペアのメンバーを含有する（直接）かそれを結
合した（間接）粒子と反応させる。凝集検定については
すでに文献に要約されている。例えばペランティ（　Ｂ
ｅｌａｎｔｉ　）著、「免疫学（　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ　）　Ｊ、ダブリュー、ビー、ソーンダス社（　Ｗ．
Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ．、　）フィラデルフィア
（１９７１年刊）、第１６９頁以降、およびフデンベル
グ（Ｆｕｃｌｅｎｂｅｒｇ　）ら、「基礎おび臨床免疫
学（Ｂａ５ｉｃ　＆　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ　）　Ｊ、ラングゞ、メディカル、パブリケー
ションズ、（Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ　）　、ロス　アルトス、カルホルニア
（１９７６年刊ン第３０８頁以降参照。また天井ら、米
国特許第４．１１８，１９２号明細書および４，２０８
．１’　８５号明細書は凝集検定に関している。同様に
凝集検定に関連のあるより以前の文献としてはシンガー
（Ｓｉｎｇｅｒ　）ら、Ｊ、　Ｃｏ１１ｏｉｄ　ａｎｄ
　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　＋　４５　＋
６０８−＋５１４（１９７３）およびフアツジ（ｐａｕ
ｒｅ　）ら、Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ｔＭ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌＦｌｕｉｄｓ　、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＣｏ１１ｏｑｕｉｕ　。

２０．５８９−５９３（１９７２）がある。

特定の被分析物またはリガンド用の多数の凝集検定用試
験キットが市販されており、また文献に記載されている
。例えばローズ（Ｒｏｓｅ　）も＠）嶌「臨床免疫学マ
ニュアル（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａ、ＩＩ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）　ｊ、アメリカ微生物学会（Ａ
ｍｅｒｌｃａｎＳｏｃｉθｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ　）ワシントンＤ、Ｃ。

（１９７８年刊）を参照。

複雑な液体例えばヒト血清の分析の場合は、ある種のタ
ンパク質および他の物質は凝集反応に伴い非特異的干渉
をひき起こし得る。従ってリガンド濃度を正確に測定す
るためにはこれらのタンパク質を破壊しなければならな
いかあるいは試薬とのそれらの非特異的干渉を克服しな
ければならない。非特異的干渉を避けるための最も一般
的な方法はタンパク質分解酵素例えばペプシンを使用し
て先ずそのタンパク質を消化することによって克服する
ことができる。次いで酵素を検定前に不活性化または破
壊する。例えばコレット−カサ“−ル（Ｃｏ１１ｅｔ　
−Ｃａ５ｓａｒｔ　）ら、ＣＣ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、
　２７゜１２０５−０９（１９８１）：）は、ペプシン
で予備消化した試料中のジゴキシンの粒子計数免疫検定
を開示している。消化はペプシンを不活性化するトリス
（ヒドロキシメチル）メチルアミンの添加により停止さ
せた。なおチャタ（Ｃｈ、ａｕ　）ら、Ｊ、　ｃｌｉｎ
、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　Ｍｌｌｌｔａｂ１４２　
ｒ　１８９−１９２（１９７６）も参照されたい。

あるいは、非特異的干渉を引き起こす物質と相互作用が
ない粒子を使ってこれらの検定を行うことができる。例
えばホサカ（Ｈｏ５ａｋａ　）ら、（ＢＰＯ出願第５４
，２４９号〕は、アミン基を含む免疫化学製品で作られ
た免疫検定試薬例えばグリシジルアクリレートおよび（
または）グリシジルメタクリレートのくり返し単位をも
っポリマーがら成る粒子の表面上のエポキシ基に共有結
合した抗体を開示している。粒子はその表面上に他の疎
水性成分をもつべきではない。上記の免疫化学製品（・
てよる結合でエポキシ基がすべて消費されない場合、免
疫検定試薬渉しない親水性タンパク質例えばアルブミン
は残りのエポキシ基と反応することができる。これらの
粒子は非特異的に凝集しそうもなく、そしてセルに対す
る非特異的干渉もないことに注意されたい。

本発明によれば、非特異的タンパク質干渉の影響を新規
な型の同相、すなわち粒状体の試薬により防止ないし克
服する特異結合検定法が提供される。すなわちこれらの
試薬はこの干渉を克服しかつ自動分析系に使用するのに
特に適当な均一系免疫検定の形態、すなわち分離工程を
必要としない形態を提供することが可能である。

これらの利点は親水性特異結合検定試薬により達成され
、この試薬は特異結合ペアのパートナ−と固相の表面に
結合したハロアルキル部分をもつ少（とも一種の親水性
物質とを反応させ、そして任意の反応しなかった結合パ
ートナ−からこうして調製した試薬を回収する工程から
成る方法により調製される。好ましくは、α−ハロアル
キルはクロルメチルであり、そして少くとも一種の親水
性物質は少くとも一種のタンパク質例えばアルブミンと
固相が不浸透性である少くとも一種の非タンパク質性ア
ミン例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミ、ツメタン
とを含有して成る。

本発明の特異結合検定試薬は他の試薬と組合せることが
でき、検定用組成物を提供する。例えば、組成物は上記
の試薬および前記特異結合ペアの他方のパートナ−から
成ることができる。特異結合ペアの他方のパートナ−は
好ましくはりガンド−キャリア複合体である。組成物を
包含する、あるいは使用する種種の実施態様もまた考え
られる。

例えば、組成物の成分を組込んだ１個以上の容器または
装置の組合せセットから成る試験用キットの一部として
組成物を提供することができる。

試験対象の流体には生物学的、生理学的、産業的、環境
的等の液体が包含される。特に興味があるのは生物学的
流体例えば血清、血漿、尿１、脳を髄液、唾液、乳、肉
汁その他の培養菌およびこれらの上清ならびに両分であ
る。興味のある生理学的流体の例としては輸液、緩衝液
、保存剤または抗菌液等が挙げられる。産業的流体とし
ては発酵媒質その他の、例えば医薬、乳製品および麦芽
飲料の製造に使用される反応工程液が挙げられる。

その他の、従来の方法によって試験される試料液の源も
この用語の意味内（（含まれ、同様（Ｃ本発明によって
検定することができる。

本発明の記述において「リガンド」なる用語濡例えば上
記したような試料流体中におけるその存在を定性的にま
たは定量的に測定すべき任意の物質、または関連する物
質の分類を指す。本検定をま、それに対する特異的結合
性パートナ−が存在するりがンドの検出、およ−び逆に
、ある液体かりガン１を（通常試料中のそのリガンドに
対する結合性パートナ−の存在によって）結合する能力
の検出に適用することができる。リガンドは通常ペゾチ
ド、タンパク質、カルボヒドラーゼ、グリコプロティン
、ステロイド、あるいは、これに対する特異結合パート
ナ−が存在するかまたはこれを提供することができる有
機分子である。リガンドは、機能的に−・えは通常、抗
原およびこれに対する抗体、ハプテンおよびこれに対す
る抗体およびホルモン、ビタミン、中間代謝物および薬
理学的剤、ならびにそれらの受容体および結合性物質か
ら選ばれる。本発明を使用して検出し得るリガンドの具
体例としては、ホルモン例えばインシュリン、絨毛性ゴ
ナドトロピン、チロキシントリョードチロニン、卵胞刺
激ホルモン、黄体ホルモン、甲状腺刺激ホルモンおよび
エストリオール、抗原およびハプテン例えはフェリチン
、ゾラジキニン、プロスタグランジンおよび腫瘍特異性
抗原、ビタミン例えばピオチン、ビクミ’Ｂ１２葉酸、
ビタミンＥ１ビタミンＡおよびアスコルビン酸、中間代
謝物例えば３’、５’−アデノシンモノホスフェートお
ヨヒ３’、５’−グアノシンモノホスフェート、薬理学
的剤または医薬例えば、デンタマイシン、アミカシンお
よびシソマイシンのようなアミノグルコシド抗生物質、
または乱用性医薬例えばアヘンアルカロイドおよび変角
誘導体、抗体例えばミクロゾーマル抗体および肝炎の抗
体およびアレルゲン、さらに特異結合受容体例えばチロ
キシン結合性グロブリン、ナピジン、内因子およびトラ
ンスコバラミンが挙げられる。

「特異結合タンパク質」または「受容体」なる用語は、
他の物質には結合せずにリガンドに対して特異的に結合
する親和力を有する任意の物質、または物質分類を意味
する。本発明の具体的態様の多くにおいては、試料リガ
ンドまたはリガンドに対する試料の結合能力と互いに免
疫化学的に作用する特異結合検定試薬が組入れられてい
る。すなわち試薬および（または）試料リガン１または
リガンドに対する試料の結合能力との間には抗原−抗体
またはノ・ブテン−抗体の関係がある。従ってかかる検
定は免疫検定と名づけもれ。リガンドとその受容体また
は結合性パートナ−との間の特殊な相互作用は免疫化学
的結合である。ポリクローナルの、またはモノクローナ
ルの抗体のいずれかの使用が考えられる。さらに、リガ
ンドと結合性パートナ−との間のその他の相互結合作用
、例えばホルモン、ビタミン、中間代謝物および薬理学
的剤とそれらのそれぞれの受容体および結合性物質との
間の相互結合作用が特異結合検定法の基礎として役立つ
ことは、当業界においてよく理解し得るところである。

例えば結合性剤またはパートナ−としてのポリペプチド
ホルモン受容体についてはランガン（Ｌａｎｇａｎ　）
ら（編）、「りがンドアツセイ（Ｌｉｇａｎｄ　Ａｓ５
ａｙ　）　Ｊ、マラソンパブリッシング（Ｍａｅｓｏｎ
　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　）　ＵＳＡ社、ニューヨーク
、第２１１頁以降（１９８１年刊）に論じられている。

本発明における「固相」は種種の形状をとることができ
、従って広い意味を表わすも−のである。

これは、類似のまたは異なる吸収特性その他の物理的特
性を有する一種以上の適当な材料または媒質を含有して
成る単相または多相のものでありでよい。一つの態様に
おいては、固相は特異結合検定試薬と種種な方法で結合
するマ）ＩＪソックスたは表面である。その構造は化学
的および酵素的溶液分析に使用されるような多くの公知
の形をとることができる。例えば、要素は置換されてい
ないポリスチレンのような材料から一部分作らＪｌ、た
試験用スライドの形であることができる。最も効果的な
態様においては、固相は使用すべき特定の特異結合検定
系の特性に適合するよう注意深く調製される。

最も好ましい同相の形態は粒状体である。前記のよつ如
、粒子−結合凝集検定は表面成分として特異結合ペアメ
ンバーをもつ粒子、あるいは前記の成分が結合した粒子
を使う検定を包含している。

これらの粒子は一つ以上の層の形であることができ、そ
して核粒子を含んでいることができる。核または層の材
料が何でできているのかは、表面層の他は重要ではない
。多層−または均一組成物の場合、それらはモノマー例
えばスチレン、置換されたスチレン、ブタジェン、アク
リル酸、アクリル酸エステル、アクリルアミド、アクリ
ロニトリル、相当するメタクリロイルモノマー（官能性
エステル例えばグリコールエステルを含む）、および二
官能性モノマー（交差結合剤）例えばジビニルベンゼン
、メチレンＮ、Ｎ−ビスアクリルアミド等から作られた
不溶性のポリマーまたはコポリマーであるこ乏ができる
。これらの粒子のゴ（ぎさは好ましくは直径約０．０５
ないし約５ミクロンであって、ラテックスを形成し、例
えば前記微粒子が懸濁している流動自存液体を形成する
。

固相例えば粒子は、その中のハロゲン原子が攻撃すべき
基に対する反応性部位により活性化されるハロアルキル
部分をその表面にもつように選択あるいは合成される。

当業者にとって、電子供与性基例えばアリール基、カル
ボニル基、二）ＩＪル基、スルホン基およびスルホキシ
ド基がα−位のハロゲン原子を非常に反応性とすること
は公知である。本発明において、「ハロアルキル」とい
う語は低級アルキル鎖例えば０１〜ｃ４で置換されてい
る臭素原子または塩素原子を意味する。これらの基はハ
ロゲン原子が活性化基例えばフェニル基に対してα−位
であるような方法でポリマー表面に結合される。この種
の粒子およびその調製法は例えばＶｉ　ｔｕ　ｓｋｅら
の米国特許第３０７２５５８号明細書中に記載されてい
る。

結合パートナ−例えば抗体はアルキル部分のα−炭素原
子上のハライド基の置換により固相（（結合される。こ
の結合パートナ−は通常タンパク質、抗体または他のタ
ンパク質であるので、この置換に影響を与え得る多くの
アミノ基およびスルポヒ１リル基があり、それらにより
結合パートナ−は同相に共有的に結合する。固相上のα
−ハロアノヒキル部分および結合パートナ−の割合は、
ハロアルキル部分がすべて結合パートナ−と結合しない
ようなものである。

少くとも一種の親水性物質はハロアルキル部分の他の部
分と、結合パートナ−と連続しであるいはそれと同時に
反応させる。親水性物質を固相に連続的に結合する場合
、結合パートナ−の結合の前または後のどちらかにこれ
を行うことができる。

どちらの場合も親水性物質は十分な数の残った部分と結
合して結合パートナ−とともに固相の表面上に実質的（
Ｃ完全な親水性コーティングを形成する。

好ましくは、親水性物質は少くとも一種のタンパク質と
固相が実質的に不浸透性である少くとも一種の非−タン
パク質性アミン尼を包含する。好ましいタンパク質の例
はヒトおよび他の血清アルジミンおよびゼラチンである
。この目的のため、タームタンパク質を使用する場合、
ペプチドもまた使用できる。非−タンパク質性アミンの
例はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ジェタ
ノールアミン、トリエタノールアミン、グルコサミン、
グリシン、リジン、グルタミン、ε−アミノカプロン酸
またはポリグリコールアミンである。

前記の特異結合検定試薬は他の試薬と組合せて検定組成
物を提供することができる。通常、他の試薬は特異結合
ペアの他方のパートナ−を含み、検定を行うのに使うま
では本発明の固相試薬がら物理的に分離しておく。好ま
しくは固相に結合した特異結合ペアのパートナ−は抗体
であり、そしてペアの他方のパートナ−はりガン［Ｓで
あって、これはキャリアと結合してリガンド−キャリア
複合体を作る。キャリアの例は高分子量ポリマー例えば
デキストランまたはフィコル（Ｆｉｃｏｌ］、　）（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　、　
Ｉｎｃ、、　Ｎｅｖ　Ｍａｒｋｅｔ。

ＮＪ）である。含有することのできる他の試薬は例えば
タンパク質分解酵素例えばトリプシン、キモトリプシン
、ペプシン、カルボキシベフ０チダーゼおよびそれらの
混合物である。

組成物の成分を組込んだ１個以上の容器または装置の組
合せセットから成るキットの形で組成物を提供すること
ができる。例えば、本発明の固相試薬は好ましくはへこ
ませた反応くぼみを有する試験用スライド上にコーティ
ングされるがあるいは試験用スライーの一部を形成する
ことができる。

キットの態別の容器からの結合パートナ−および分析す
べき試料を反応（ぼみの中に置き、そして結果として生
じる変化例えば凝集あるいは色変化を視覚的に観察する
。前記キットは家庭での使用に対して理想的であり、こ
れまでの技術的訓練を必要としない。

以下の実施例は本発明の開発に当って実施した実験を記
載するものである。可能な場合は常に、標準的な市販試
薬級薬品を使用した。

例　１ 全血清チロキシン（Ｔ４）の測定は甲状腺機能測定のた
めの唯一の最も重要な試１験である。正常なＴ４の範囲
は４．５−１２．０μｇ／ｄｌであるが、試験では１．
０μｇ／ｄ、ｌの低濃度から２４．０μｊｉ／ａ、ＩＪ
の高濃度まで測定可能でなければならない。これは甲状
腺障害を有する患者を正確に識別するために必要である
。本例は、本発明による非同位元素的均−系免疫検定を
説明する実験について報告する。

抗血清製造 Ｔ４に対する抗体は、ニューシーラントウサギに、等容
量のフロイントの完全補助液中に乳化したウシ血清アル
ジミン（ＢＳＡ　）にＴ４を共有結合的に結合した複合
体４００μＩを皮内に第一次注射を行って誘発させた。

第二次増強免疫は、等容量のフロインド不完全補助液中
に乳化したＴ４−ＢＳＡ複合体４００μｇを１月に１回
投与して行った。動物は週に６回採血した。

抗体精製 こうして調製した抗体を免疫吸着によって単離した。免
疫吸着剤はセファロース４Ｂ　（７ア／ｌ／マシアフア
インケミ力ルズ社、Ｉｅｃａｔａｗａｙ　、　＝ニーシ
ャーシー）に共有結合的に結合したＴ４から成る。この
材料はサンドパーグおよびポラス（Ｓｕｎｄｂｅｒｇａ
ｎｄ　Ｐｏｒａｔｈ　）がＪ、　Ｃｈ、ｒｏｍａｔｏｇ
、。

叉四、８７−９８　（ｉ　９７４）に記載したビスオキ
シラン法によって製造した。免疫吸着剤５　ｔｎ（！を
、２Ｘ２０ｃｍのガラス製クロマトカラム中のセファデ
ックス（）−２５（ファルマシア社、上記）２５ｔｎ１
９／ｎＬ−１ｙ＝ｌン；」噌−１＋、ｒ−＝Ｌ１．４−
１−し一、＋１．−５’ｍｌをカラムに加え、その赤色
または琥珀色が免疫吸着剤とセファデックスの境界に達
するまで流入させたのち、抗血清をさらに３０分間室温
で弓１続き吸着剤と接触させた。次に免疫吸着剤をカラ
ム容量の２倍量のパルピタール緩衝食塩水（／々ルビク
ール０．０５　Ｍ、　ＮａＣ１０，１５Ｍ　、　Ｎａ、
Ｎ３０．１　％。

ＰＨ８，６）で洗浄し、次で流出液の２８０ナノメート
ル（ｎｍ）における吸光度を０．０１以下とする尾十分
な量のホウ酸塩緩衝食塩水（ホウ酸塩Ｑ、０４Ｍ　−、
ＮａＣ１ｏ、ｉ　５　Ｍ　％　ＮａＮ３０．１％、ｐＨ
８，１）で洗浄した。次に、吸着された抗体を１．０Ｍ
酢酸溶液で溶離した。溶出液をフラクションコレクター
により１尻ｅずつのアリコートとして採取した。２８０
ｎｍにおける吸光度が０．１より太きくＰＨ７，０より
大きい両分を合一し、使用する迄−２０℃で貯蔵した。

１　ｗｅの抗血清から通常１−２＃ｌ＆の精製抗体が単
離された。

抗体感作ラテックスの製造 この試薬調製はＶｉｔｋｕｓｋｅらの米国特許よムフｎ
７０ｃ０ＯＢ、１．ｌＲ皿−ｉｔｗ＝−ａａ−ｑ÷１＋
−＞＋よｈｙ実質的に調製したポリ（クロルメチルスチ
レン）ラテックスを使用して行う。Ｔ４に対する抗体、
ヒト血清アルブミンおよびトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタンを以下のよう眞してポリ（クロルメチルス
チレン）粒子に結合する。水中の１０％（Ｗ／Ｖ　）ポ
リ（クロルメチルスチレン）粒子１ｍ／！を０−２　ｍ
ｇ／　ｒｔｔｌ　Ｆデシル硫酸ナトリウム水溶液１　ｍ
ｌと混合してラテックス懸濁液を作る。この懸濁液を３
０．０００　ｇで２０分間遠心分離して懸濁液から粒子
の（レットを作る。このペレットヲ０．０１ｍ１；／／
ｌ１ｌｌドデシル硫酸ナトリウムを含むホウ酸塩緩衝食
塩水（ｐＨ９，０）　２　ｙｄ中に音波により視覚的に
均質に再懸濁する。この再懸濁液２πｌを抗Ｔ、−抗血
清７００μｇおよび木炭処理したヒト血清アルブミン１
５ｍ９を含む水溶液２ｔｎｌと組合せる。

こうして調製した懸濁液４罰を次に３０’Ｃで４時間イ
ンキュベートする。インキュベートの後、懸濁液を３０
，０００ｇで２ｏ分間遠心分離して懸濁液から抗体およ
びアルブミンでコーティングした粒子のペレットを作る
。このコーティングした粒子のペレットを次にＩＭ）リ
ス（辷ドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ１０）５ｄ
中に音波により再懸濁する。これは前もって抗体または
アルブミンと結合しなかったクロル−メチル部分と結合
して親水性表面を完成する。懸濁液を３０℃で１６時間
インキュベートする。次に懸濁液を３０．００　ＤＩで
２０分間遠心分離してペレットを作る。ペレットを木炭
ストリングしたウシ血清アルブミン０．１％（Ｗ／Ｖ、
）およびＴｖｔｅｅｎ　２［１界面活性剤（ＩＣＩＵｎ
ｌｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｗｉｌｍｎｇｔ
ｏｎ　ＤＥ　）　Ｄ−１％（ｗ／ｖ）を含む炭酸塩緩衝
食塩水６−中に再懸濁する。前記のように炭酸塩緩衝液
中で６回以上遠心分離および再懸濁を行ってペレットか
ら結合していない抗体をなくする。こうして調製した懸
濁液を以下のように使用する。

Ｔ４−デキストラン複合体の調製 Ｔ４を臭化シアンで活性化したデキストランＴ５００（
ファルマシア社、前出）に共有結合的に結合した。デキ
ストラン１０１００ｒｎをＱ、４　Ｍ　Ｋ２ＣＯ３溶液
６　ｍｌ中に溶解しＰＨを１１．０に調節した。溶液を
急速Ｋかきまぜ、臭化シアン溶液（Ｎ、Ｎ〜デジメチル
ホルムアミド中　’ｒ　３ｍｇ／ｒｙｔｌ　）　５０μ
ｌを６回添加した。デキストラン溶液の−１は２　Ｎ　
ＮａＯＨ溶液を添加して１１．０に保った。臭化シアン
の添加は毎回、前回の添加から１分以内に行い、最終添
加後溶液を４分間インキュベートした。次尾２ＮＨＣｆ
Ｉ）滴加ニよツ”ＣＸヲ１０．０　トシ、Ｔ４溶液Ｑ、
５ｒｄを加える（　０．４Ｍ　Ｋ２ＣＯ３１１−１５滴
によってアルカリ性としたＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド中ＢＯｍ９／ａｌｌ）。反応混合物を室温で２時間か
きまぜた後Ｑ、Ｑ　１Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ９
，０）により徹底的に透析した。通常、デキストラン１
モル当りＴ４６０−７０モルが結合された。Ｔ４−デキ
ストラン複合体の濃度は１０１ｎ９　／　ｒｒｔｌであ
る。これはバルピタール０．０５　Ｍ　Ｎ　ＮａＣｌ［
１，１５Ｍおよびアジド０．１％を含むｐＨ８，６の緩
衝溶液（ベロナール緩衝液）により以下に記載の検定方
法に使用する直前に１０μ９／ｗｔｌに希釈される。

抗体感作ラテックス試薬の調製 抗体感作ラテックス試料調製品５　ｒＪを以下のように
して調製する。前記のようにして調製した抗体感作ラテ
ックスの原溶液１．６６ｒｕｌをＴ４を含まない０．１
チウシ血清アルグミンを含むベロナール緩衝液（Ｖｅｒ
ｏｎａｌ　／　ＢＳＡ　）中に８−アニリノ−１−ナフ
タリンスルホン酸（ＡＮＳ　）　（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋ
ｏａａｋｃｏ、、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ　、　ＮＹ　）
　０．５５　ｍｇ／ｒｕｇを含有する溶液５６６μｍ３
　、ｌ　ｔｒｙ　ＨＣｌ水溶液中にトリプシン２０ｍ９
／ｒｕｅを含有する溶液２．０８　ｍｌ、　Ｖｅｒｏｎ
ａｌ　／ＢＳＡ中の１０係トウイーン２０　（ＩＣＩ　
ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓ　、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ
　、　ＤＥ　）　６２−５μｌおよびＶｅｒｏｎａｌ　
／　ＢＳＡ　６５４μｌと混合する。最終濃度は固体ラ
テックス０．１１　％　（ｗ／ｙ　）、（ＡＮＳ　）０
．０５９　ｍ９　／　ｍｅおよびトリプシン８．ろｍｙ
／罰である。

検定方法および結果 ６個のヒト血清試料のパネルを本発明による粒子を使う
検定方法により、通常のラテックス試薬粒子、カルボキ
シル化したポリスチレン（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ
　Ｐａｒｉｓ　、　Ｆｒａｎｃｅ　）を使う同一の検定
法により、そして参考法により、Ｔ４レベルに対して試
験した。前記のそして通常の粒子を使う凝集方法もまた
Ｔ４標準血清（Ｋａｌｌｅｅｔａｄ　Ｌａｂｏｒａ−ｔ
ｏｒｉｅ　、　Ｉｎｃ、、　Ａｕ５ｔｉｎ　、　ＴＸ　
）　ノ’ｌ［ｌ１ｌＪ］　Ｙ：行ツタ。

本発明の粒子および通常の粒子を使う方法においては、
各標準血清または血清試料のアリコート１２．８μｌを
希釈のためＴ４−デキストラン複合体１２．８μｌを含
む分離チューブ（水中に包まれたもの）中に導入する。

その後、抗体感作ラテックス試薬１２０μｌを各チュー
ブ中に導入する。こうして作られた完全な反応混合物を
含むチューブ各各をかきまぜ、そして次に３７℃で１５
分間インキュベートする。氷水中に浸づ−ことによりイ
ンキュベーションを終了する。各反応混合物をベロナー
ル緩衝液０．８ｍｌを加えることにより希釈し、そして
希釈した混合物を１−０ｃｍの石英セル中に導入する。

各各の場合、セルをＢｅｃｋｍａｎ　ＤＢＧ分光光度計
（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ
、、−Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ　ＣＡ）中に置いてから６０
０　ｎｍの波長の吸光度を読む。吸光度値はＴ４濃度値
に非常に正確に換算される。

参考法は製造業者の指示に従って行われるＧａｍｍａｆ
ｌ’Ｏ検定（Ｅ、Ｒ，５ｑｕｉｂｂ　Ｆｔ、　５ｏｎｓ
、　Ｉｎｃ、。

Ｐｒ１ｎｓｔｏｎ　、　ＮＪ　）法である。

参考法、通常の粒子を使う方法および本発明のクロルメ
チル置換された粒子を使う方法によりこれらの血清試料
に対して観察されたＴ４濃度を第１表に記載する。

第　１　表 ５．６（μ帥ｄ）　４．７　７．５ ６．８　３．９　７．７ ７．６　８．２　７．７ ８．０　＞２５．１　５．７ ９．５　６．９　８・８ １０．６　＞２５．１　１０．に れらのデータかられかるように、通常のラテックス方法
では試験した６個の試料のうち２個が干渉を受ける。干
渉は明らかに誤った濃度の報告を生じるが、参考法と本
発明のラテックス方法により観察された上記の濃度は良
好である。誤った値は最も高い市販の標準血清試料のラ
ン（２５，１μｌ／／ｄｌ）（これはこれらの結果を無
益にする）に関しては良好である。これに対して、本発
明による粒子を使って観察されたＴ４濃度は参考法によ
り得られた値と良好に関係づけられる。このことは通常
の方法を悩ます非特異的干渉が本発明により避けられた
かあるいは克服されたことを証明する。

第１頁の続き ０発　明　者　バースオラミュー、バ ージティ ０発　明　者　ネイル、ウオズアスプ ーン アメリカ合衆国ニューヨーク州１０６０６．ホワイト・
プレインズ、エドナ・ストリート　１旙− アメリカ合衆国ニューヨーク州１０００３．ニューヨー
ク、ワシンタン・ブレイス　１４番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）特異結合ペアＣ対）のパートナ−（片方）と固相
   の表面に結合したハロアルキル部分をもつ少くとも一種
   の親水性物質とを反応させ、こうして得られた試薬を未
   反応結合パートナ−がら分離して製造した、親水性の特
   異結合検定用試薬。 （２）　ハロアルキルとしてクロルアルキルを使った前
   項（１）に記載の試薬。 （３）　固相として粒状体を使った前項（１）に記載の
   試薬。 （４）　粒状体固相として重合体を使った前項（１）Ｉ
   ｃ記載の試薬。 （５）　同相としてハロアルキル置換されたポリスチレ
   ンがら成るものを使った前項（３）九記載の試薬。 （６）％異結合ペアのパートナ−として抗体を使った前
   項（１）に記載の試薬。 （７）抗体としてポリクローナル（多クローンの）また
   はモノクローナル（単一クローンの）抗体を使った前項
   （６）に記載の試薬。 （８）　少くとも一種の親水性物質として少くとも一種
   のタンパク質と固相に対して実質的に非浸透性である少
   くとも一種の非タンパク質性アミンとを含んで成るもの
   を使った前項（１）に記載の試薬。 （９）　少くとも一種のタンパク質としてアルブミンを
   使った前項（８）九記載の試薬。 ｔｌＯ）　少くとも一種の非タンパク質性アミンとして
   トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを使った前項
   （８）に記載の試薬。 ａυ　特異結合ペアのパートナ−と固相の表面に結合し
   たハロアルキル部分をもつ少くとも一種の親水性物質と
   を反応させ、こうして得られた試薬を未反応結合パート
   ナ−から分離することがら成る、特異結合検定用試薬の
   製造方法。 （１り　固相を抗体、少（とも一種の他のタンパク質お
   よび前記固相に対して実質的に非浸透性であるの方法。 囮　液体試料中のリガンド（配位子）の測定に使用する
   特異結合検定試験用組成物であって、（ａ）特異結合ペ
   アのパートナ−と固相の表面に結合したハロアルキル部
   分をもつ少（とも一種の親水性物質とを反応させ、こう
   して得られた試薬を未反応結合パートナ−から分離して
   製造した親水性特異結合検定用試薬および （ｂ）　前記特異結合ペアの他方のパートナ−を含んで
   成る、前記組成物。 Ｏａ　ハロアルキルとしてクロルメチルを使つ六二前項
   （１３）に記載の組成物。 ０ω　固相として粒状体を使った前項（１３１Ｍｃ記載
   の組成物。 ０６）特異結合検定用試薬としてラテックスを使った前
   項（１つに記載の組成物。 ａｎ　特異結合検定用試薬としてラテックス中の粒子に
   結合した抗体を含んで成るものを使った前項（１６）に
   記載の組成物。 Ｑａｌ　抗体としてポリクロナールまたはモノクロナー
   ル抗体を使った前項σηに記載の組成物。 （Ｉ９　少くとも一種の親水性物質として少（とも一種
   のタンパク質と固相−に対して実質的に不浸透性である
   少くとも一種の非タンパク質性アミンとを含んで成るも
   のを使った前項（１３）に記載の組成物。 （２０少くとも一種のタンパク質としてアルブミンを使
   った前項（１，９１に記載の組成物。 Ｃυ　少（とも一種の非タンパク質性アミンとしてトリ
   ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを使った前項け９
   に記載の組成物。 （２り　固相尾結合した特異結合ペアのパートナ−とし
   て抗体をそして特異結合ペアの他方のパートナ−として
   リガン１またはその特異結合類似体を使った前項０３）
   に記載の組成物。 （２３）　液体試料を前項（１３１、（１（イ）、ａ印
   または＠のいずれかに記載の組成物と反応混合物中で組
   合せ、特異結合ペアのパートナ−の結合状態を検知する
   ことから成る、液体試料中のリガンドを測定する特異結
   合検定方法。