CN106290876B - 一种肿瘤细胞检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤细胞检测方法，属于肿瘤细胞学技术领域。本发明的检测方法是利用酶标记的甲胎蛋白或甲胎蛋白异质体与肿瘤细胞表达的甲胎蛋白受体特异性结合，通过底物与酶的显色反应，使肿瘤细胞染色，从而区分出肿瘤细胞和正常细胞。本发明能特异性地识别肿瘤细胞，克服了传统染色方法的缺陷，适用于各种组织标本或者细胞标本，具有很广阔的应用前景。

Description

一种肿瘤细胞检测方法
技术领域
本发明属于肿瘤细胞学领域，具体涉及一种肿瘤细胞检测新方法。
背景技术
在临床上，甲胎蛋白(AFP)的检测是诊断原发性肝癌的一项重要的指标，同时也是评估疗效和预后的重要依据。研究显示，胚胎和胎儿细胞可以摄取甲胎蛋白，而这种摄取是具有选择性的，并且与细胞的分化程度密切相关。大量科学研究数据表明，特异性的甲胎蛋白的受体介导了甲胎蛋白的摄入，而这种机制是受细胞的分化所调节。
甲胎蛋白受体的概念首先由Μriel,J于1981年提出，可是更加早期的文献报道已经间接的表明甲胎蛋白受体-配体系统的存在，此后，相似的受体相继在YAC-1小鼠淋巴瘤、人U937和THP-1细胞株的表面被证实。体外的结合实验显示，甲胎蛋白不仅与细胞相结合，而且与细胞和癌组织的裂解物结合。有人认为这些恶性细胞来源于胎儿期与甲胎蛋白相互作用的组织，癌细胞与胚胎细胞的生物特性具有相似之处，当细胞发生癌变发生去分化时，甲胎蛋白受体再度表达，癌细胞就可以通过与甲胎蛋白特异性结合的受体去摄取甲胎蛋白。因此，可以以甲胎蛋白受体作为肿瘤细胞检测的一种标志物。
目前，在病理学实验室中最广泛采用的是苏木精-伊红染色方法(HE染色方法)。苏木精染色细胞核，伊红染色细胞质，任意一种染色效果不佳，均会影响病理诊断。在实际工作中，细胞核染色效果易发生波动，特别是肿瘤细胞异型核，其复染时间和程度不易掌握，易使细胞浆附着色，背景不干净，影响结果观察及判断。为解决这些问题，有必要寻找新的肿瘤细胞检测信号即甲胎蛋白受体，利用甲胎蛋白能与肿瘤细胞中表达的甲胎蛋白受体结合的原理，建立新的肿瘤细胞染色方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的肿瘤细胞染色试剂盒及其染色方法，提高肿瘤细胞染色效果，缩短染色时间，而且操作更简便，结果更易于观察。
为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：
一种肿瘤细胞检测方法，是利用酶标记的甲胎蛋白或甲胎蛋白异质体与肿瘤细胞表达的甲胎蛋白受体特异性结合，通过底物与酶的显色反应，使肿瘤细胞染色，从而区分出肿瘤细胞和正常细胞。
所述的肿瘤细胞检测方法，是将待测组织与含有酶标记的甲胎蛋白或甲胎蛋白异质体的标记液混合，冲洗除液后，用与酶对应的显色液显色，若有显色反应即待测组织含有肿瘤细胞。
所述的酶为过氧化物酶，包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
所述的肿瘤细胞检测方法在肿瘤细胞染色试剂盒中的应用。
所述的肿瘤细胞染色试剂盒，包括：
(1)肿瘤细胞标记液；
(2)阴性对照液；
(3)显色液。
其中，所述的肿瘤细胞标记液为含10～30μg/mL辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白/甲胎蛋白异质体的0.01mol/L pH 7.4PBS溶液，或者为含10～30μg/mL辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白/甲胎蛋白异质体和1.0～5.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH 7.4PBS溶液；
所述的阴性对照液为含10～30μg/mL辣根过氧化物酶标记的卵清蛋白的0.01mol/L pH 7.4PBS溶液，或者为含10～30μg/mL辣根过氧化物酶标记的卵清蛋白和1.0～5.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH 7.4PBS溶液。
所述的显色液即辣根过氧化物酶显色底物，包括邻苯二胺、四甲基联苯胺、2,2’-连氮-双-(3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸)、5-氨基水杨酸、邻联茴香胺、邻联甲苯胺、二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑或3,6-二氨基-9-乙基咔唑中的一种。
所述的辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白或甲胎蛋白异质体，或辣根过氧化物酶标记的卵清蛋白的制备方法包括以下步骤：
(1)用1mL 0.1～0.5mol/L pH4～5醋酸钠缓冲液溶解4～8mg辣根过氧化物酶，配成辣根过氧化物酶溶液；
(2)往辣根过氧化物酶溶液中加入0.1～0.5mL 0.1～0.2mol/L的高碘酸钠溶液，在室温下避光反应10～60min；
(3)将步骤(2)的反应液用G25凝胶柱层析，0.1～0.5mol/L pH 9～10的碳酸盐缓冲液洗脱，收集活化后的辣根过氧化物酶；
(4)将1～10mg甲胎蛋白或甲胎蛋白异质体或卵清蛋白，加入到活化后的辣根过氧化物酶溶液中，于室温下避光反应过夜；
(5)加入50～200μl新鲜配制的0.05～0.2mol/L硼氢化钠溶液，于室温下避光反应15～45min；
(6)将步骤(5)的反应液再次用G25凝胶柱层析，收集蛋白洗脱峰；
(7)将步骤(6)的溶液浓缩后，用G200层析柱进行纯化，最后获得高纯度的辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白，或辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白异质体，或辣根过氧化物酶标记的卵清蛋白。
所述的试剂盒的染色方法具体步骤如下：
(1)取2个组织标本或细胞标本，一个加入100～200μl肿瘤细胞标记液与标本中的细胞进行结合，另一个加入100～200μl阴性对照液作为阴性对照，反应30～120min后，用纯化水或0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液冲洗3～5遍，用吸水纸吸干；
(2)2个标本分别加入100～200μl显色液，反应5～15min后，用纯化水或0.01mol/LpH 7.4PBS缓冲液冲洗3～5遍，用吸水纸吸干；
(3)盖上盖玻片后，即可在显微镜下观察；
(4)结果判断：阴性对照的标本无色，证明操作过程正确；肿瘤细胞标记液处理的标本中的肿瘤细胞被染色，具体颜色由显色液决定，而正常细胞无色。
所述的肿瘤细胞检测方法在病理石蜡切片、快速冰冻切片、细胞穿刺涂片或痰涂片中的应用。
本发明的优点在于：
(1)只有当细胞发生癌变发生去分化时，甲胎蛋白受体再度表达，此时甲胎蛋白或甲胎蛋白异质体才可能结合到癌细胞上，所以本发明利用甲胎蛋白或甲胎蛋白异质体与甲胎蛋白受体结合的原理进行检测，特异性强，只针对肿瘤细胞进行染色。
(2)本发明采用一步法进行染色，简化了传统染色方法的步骤，克服了传统染色方法受人员技术熟练水平影响较大的缺陷。
(3)本发明大大缩短了染色时间，提高了工作效率，而且提高了染色效果，结果更易于观察，背景干扰小。
(4)本发明适用于病理石蜡切片、快速冰冻切片、细胞穿刺涂片、痰涂片等各种标本，具有很广阔的应用前景。
附图说明
图1为乳腺癌细胞的染色结果，(A)图为正常细胞，(B)图为乳腺癌细胞
图2为淋巴结癌细胞的染色结果
图3为前列腺癌细胞的染色结果
图4为胃癌细胞的染色结果
图5为乳腺癌细胞细针穿刺涂片的染色结果
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：乳腺癌细胞的检测
1.辣根过氧化酶(HRP)标记物的制备
(1)用1mL 0.2mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液溶解6mg HRP，配成HRP溶液；
(2)往HRP溶液中加入0.2mL 0.1mol/L的高碘酸钠溶液，在室温下避光反应30min；
(3)将步骤(2)的反应液用G25凝胶柱层析，0.2mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液洗脱，收集活化后的HRP；
(4)将5mg甲胎蛋白(AFP)或者卵清蛋白(OVA)加到活化后的HRP溶液中，于室温下避光反应过夜；
(5)加入100μl新鲜配制的0.1mol/L硼氢化钠溶液，于室温下避光反应30min；
(6)将步骤(5)的反应液再次用G25凝胶柱层析，收集蛋白洗脱峰；
(7)将步骤(6)的溶液浓缩后，用G200层析柱进行纯化，用0.01mol/L pH7.4PBS缓冲液洗脱，最后获得高纯度的辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白(HRP-AFP)或者辣根过氧化物酶标记的卵清蛋白(HRP-OVA)。
0.01mol/L pH7.4PBS缓冲液的配制：取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g或Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，硫柳汞钠0.5g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L，2～8℃保存备用。
2.肿瘤细胞染色试剂盒的组成
(1)肿瘤细胞标记液；
(2)阴性对照液；
(3)显色液，主要成分为邻苯二胺(OPD)。
邻苯二胺溶液：在0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH5.0)中含20mmol/L OPD和12mmol/L H2O2，或10mmol/L OPD和5.5mmol/L H2O2。
配方A：肿瘤细胞标记液为含10～30μg/mL HRP-AFP的0.01mol/L pH 7.4PBS溶液；阴性对照液为含10～30μg/mL HRP-OVA的0.01mol/L pH 7.4PBS溶液。
配方B：肿瘤细胞标记液为含10～30μg/mL HRP-AFP和3.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH 7.4PBS溶液；阴性对照液为含10～30μg/mL HRP-OVA和3.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH 7.4PBS溶液。
3.肿瘤细胞染色试剂盒的染色方法
(1)取2块乳腺癌细胞病理石蜡切片，二甲苯脱蜡至水；
(2)3％H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；
(3)加热法修复抗原；
(4)一块切片加入150μl肿瘤细胞标记液与标本中的细胞进行结合，另一块切片加入150μl阴性对照液作为阴性对照，反应30～120min后，用0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液冲洗5遍，用吸水纸吸干；
(5)2块切片分别加入150μl显色液，反应5～15min后，用0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液冲洗5遍，用吸水纸吸干；
(6)盖上盖玻片后，即可在显微镜下观察；
(7)结果判断：阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中乳腺癌细胞被染成棕黄色，而正常细胞无色。
4.染色结果判定标准
染色结果判定参照赵艺等(赵艺等.非小细胞肺癌中甲胎蛋白受体表达的临床意义.肿瘤.2006,26)的免疫组织化学染色评判标准，稍加调整，即任意观察5个视野，每个视野计数100个细胞，以各个视野中阳性细胞数的平均百分数作为该切片的阳性细胞百分比进行记分：0％～9％记为0分，10％～25％记为1分，26％～50％记为2分，51％～75％记为3分，>75％记为4分；染色呈淡黄色为1～2分，棕黄色为3～4分，棕褐色为5～6分。最后以阳性细胞数的百分比记分和染色强度记分之和进行结果判定：0～2分为阴性(-)，3～4分为弱阳性(+)，5～7分为中度阳性(++)，8～10分为强阳性(+++)。
5.实验结果
(1)HRP-AFP或者HRP-OVA的制备
研究发现，甲胎蛋白与受体的结合是通过特异性细胞表面的N-link糖基链而进行的。如果以胃蛋白酶破坏受体的蛋白结构，甲胎蛋白的结合完全不受影响，相反，如果以高碘酸钠破坏其糖基链，甲胎蛋白的结合将明显消失。
在制备结合物的过程中，必须彻底将高碘酸钠除去。采用两次G25凝胶柱层析，就是为了使小分子物质去除得更彻底，减少干扰。由于HRP分子量40KD，AFP分子量69KD，OVA分子量43KD，分子量差别不是太大，最后必须通过G200凝胶柱层析，将结合物与游离的蛋白分离开，达到纯化的目的。实验结果，纯化后得到的HRP-AFP、HRP-OVA在SDS-PAGE电泳图上均显示为单一条带。
(2)HRP-AFP的使用浓度、结合时间、显色时间的优选组合
以乳腺癌组织切片为对象，采用配方A进行实验，按照表1安排三因素三水平正交实验，以确定最优实验条件。
表1 三因素三水平正交实验考察表
正交实验结果见表2。采用极差分析法分析，结果显示，影响染色效果的因素从大到小的顺序是：结合时间、HRP-AFP浓度、显色时间。优水平组合为HRP-AFP浓度30μg/mL，结合时间120min，显色时间15min。
表2 L9(34)正交实验设计及实验结果评分表
考察配方A中HRP-OVA在10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL这三种浓度下细胞的染色效果，结合时间120min，显色时间15min。结果显示，HRP-OVA在各个浓度下，均不与组织细胞结合，均不显色。为了方便，本试剂盒选择与HRP-AFP相同的浓度即30μg/mL作为阴性对照液。
(3)Ca2+对检测结果的影响
分别将配方A、配方B中HRP-AFP的浓度定为30μg/mL，显色时间15min，考察不同结合时间下肿瘤细胞标记液对乳腺癌细胞的染色效果，结果见表3。
表3 两种配方在不同结合时间下细胞染色结果评分
结合时间(min) 30 60 90 120
配方A 6 7 8 8
配方B 8 9 9 10
实验结果显示，用配方B对乳腺癌细胞的染色效果优于配方A。使用配方B可以缩短结合时间，30min即能呈现强阳性结果，且相同结合时间条件下，配方B的显色效果均好于配方A。用配方B染色的细胞形态更饱满，更易于观察。可见，Ca2+在AFP与乳腺癌细胞的结合过程中起到了重要的作用。甲胎蛋白受体介导作用的研究显示，一定浓度的AFP可以促进细胞内外Ca2+的交换，Ca2+在AFP与其受体结合的过程中起到了一定的作用。所以，本发明优选含有Ca2+的配方B作为本试剂盒的肿瘤细胞标记液、阴性对照液。
(4)染色结果
在优选的实验条件下，即配方B，其中HRP-AFP、HRP-OVA浓度均为30μg/mL，显色时间15min，结合时间选择30min，因为30min即能呈现明显的强阳性结果。
6例乳腺癌石蜡切片染色结果显示，加阴性对照液的切片显示为无色，说明实验过程操作正确，即HRP-OVA不与乳腺癌细胞结合；加肿瘤细胞标记液的切片上乳腺癌细胞显示为棕褐色，呈强阳性，说明HRP-AFP与乳腺癌细胞上的甲胎蛋白受体结合。
(5)正常乳腺细胞与乳腺癌细胞的染色结果比较
在上述实验条件下，正常乳腺细胞与乳腺癌细胞的染色结果如图1所示，左图(A)为HRP-AFP不与正常乳腺细胞结合，显示为无色，为阴性；右图(B为HRP-AFP与乳腺癌细胞上的甲胎蛋白受体结合，显示为棕褐色，为阳性。实验结果表明，HRP-AFP能特异地识别肿瘤细胞表面的甲胎蛋白受体。
实施例2：淋巴癌细胞的检测
1. HRP标记物的制备
(1)用1mL 0.1mol/L pH4醋酸钠缓冲液溶解4mg HRP，配成HRP溶液；
(2)往HRP溶液中加入0.1mL 0.15mol/L的高碘酸钠溶液，在室温下避光反应10min；
(3)将步骤(2)的反应液用G25凝胶柱层析，0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液洗脱，收集活化后的HRP；
(4)将1mg AFP或者OVA加入活化后的HRP溶液中，于室温下避光反应过夜；
(5)加入50μl新鲜配制的0.05mol/L硼氢化钠溶液，于室温下避光反应15min；
(6)将步骤(5)的反应液再次用G25凝胶柱层析，收集蛋白洗脱峰；
(7)将步骤(6)的溶液浓缩后，用G200层析柱进行纯化，最后获得高纯度的HRP-AFP或者HRP-OVA。
2.肿瘤细胞染色试剂盒的组成
(1)肿瘤细胞标记液：含20μg/mL HRP-AFP和1.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH7.4PBS溶液；
(2)阴性对照液：含20μg/mL HRP-OVA和1.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH7.4PBS溶液；
(3)显色液，主要成分为四甲基联苯胺(TMB)。TMB试剂购买自SurModics公司。
3.肿瘤细胞染色试剂盒的染色方法
(1)取2块肿瘤细胞病理石蜡切片，二甲苯脱蜡至水；
(2)3％H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；
(3)加热法修复抗原；
(4)一块切片加入100μl肿瘤细胞标记液与标本中的细胞进行结合，另一块切片加入100μl阴性对照液作为阴性对照，反应90min后，用纯化水冲洗3遍，用吸水纸吸干；
(5)2块切片分别加入100μl显色液，反应10min后，用纯化水冲洗3遍，用吸水纸吸干；
(6)盖上盖玻片后，即可在显微镜下观察；
(7)结果判断：阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中肿瘤细胞被染成蓝色，而正常细胞无色。
4.实验结果
淋巴癌细胞染色结果见图2。阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中淋巴癌细胞被染成蓝色，显示为强阳性，正常细胞无色，为阴性。说明HRP-AFP可以与淋巴癌细胞产生的甲胎蛋白受体特异性结合。
实施例3：前列腺癌细胞的检测
1. HRP标记物的制备
(1)用1mL 0.5mol/L pH5醋酸钠缓冲液溶解8mg HRP，配成HRP溶液；
(2)往HRP溶液中加入0.5mL 0.2mol/L的高碘酸钠溶液，在室温下避光反应60min；
(3)将步骤(2)的反应液用G25凝胶柱层析，0.5mol/L pH9的碳酸盐缓冲液洗脱，收集活化后的HRP；
(4)将10mg AFP或者OVA加入活化后的HRP溶液中，于室温下避光反应过夜；
(5)加入200μl新鲜配制的0.2mol/L硼氢化钠溶液，于室温下避光反应45min；
(6)将步骤(5)的反应液再次用G25凝胶柱层析，收集蛋白洗脱峰；
(7)将步骤(6)的溶液浓缩后，用G200层析柱进行纯化，最后获得高纯度的HRP-AFP或者HRP-OVA。
2.肿瘤细胞染色试剂盒的组成
(1)肿瘤细胞标记液：含10μg/mL HRP-AFP和5.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH7.4PBS溶液；
(2)阴性对照液：含10μg/mL HRP-OVA和5.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH7.4PBS溶液；
(3)显色液，主要成分为3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)。AEC试剂购买自上海杰美基因医药科技有限公司。
3.肿瘤细胞染色试剂盒的染色方法
(1)取2块肿瘤细胞冰冻切片，室温放置30min后，入4℃丙酮固定10min，0.01mol/LpH 7.4PBS洗4次；
(2)3％H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；
(3)加热法修复抗原；
(4)一块切片加入200μl肿瘤细胞标记液与标本中的细胞进行结合，另一块切片加入200μl阴性对照液作为阴性对照，反应60min后，用0.01mol/L pH7.4PBS缓冲液冲洗4遍，用吸水纸吸干；
(5)2块切片分别加入200μl显色液，反应10min后，用0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液冲洗4遍，用吸水纸吸干；
(6)盖上盖玻片后，即可在显微镜下观察；
(7)结果判断：阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中肿瘤细胞被染成红色，而正常细胞无色。
4.实验结果
前列腺癌细胞染色结果见图3。阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中前列腺癌细胞被染成深红色，显示为强阳性，而正常细胞无色，为阴性。说明HRP-AFP可以与前列腺癌细胞产生的甲胎蛋白受体特异性结合。
实施例4：胃癌细胞的检测
1.HRP标记物的制备
(1)用1mL 0.4mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液溶解7mg HRP，配成HRP溶液；
(2)往HRP溶液中加入0.3mL 0.15mol/L的高碘酸钠溶液，在室温下避光反应40min；
(3)将步骤(2)的反应液用G25凝胶柱层析，0.4mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液洗脱，收集活化后的HRP；
(4)将8mg AFP或者OVA加入活化后的HRP溶液中，于室温下避光反应过夜；
(5)加入150μl新鲜配制的0.15mol/L硼氢化钠溶液，于室温下避光反应25min；
(6)将步骤(5)的反应液再次用G25凝胶柱层析，收集蛋白洗脱峰；
(7)将步骤(6)的溶液浓缩后，用G200层析柱进行纯化，最后获得高纯度的HRP-AFP或者HRP-OVA。
2.肿瘤细胞染色试剂盒的组成
(1)肿瘤细胞标记液：含15μg/mL HRP-AFP的0.01mol/L pH 7.4PBS溶液；
(2)阴性对照液：含15μg/mL HRP-OVA的0.01mol/L pH 7.4PBS溶液；
(3)显色液，主要成分为二氨基联苯胺(DAB)。DAB试剂购买自上海杰美基因医药科技有限公司。
3.肿瘤细胞染色试剂盒的染色方法
(1)取2块肿瘤细胞病理石蜡切片，二甲苯脱蜡至水；
(2)3％H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；
(3)加热法修复抗原；
(4)一块切片加入150μl肿瘤细胞标记液与标本中的细胞进行结合，另一块切片加入150μl阴性对照液作为阴性对照，反应120min后，用纯化水冲洗4遍，用吸水纸吸干；
(5)2块切片分别加入150μl显色液，反应5min后，用纯化水冲洗4遍，用吸水纸吸干；
(6)盖上盖玻片后，即可在显微镜下观察；
(7)结果判断：阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中肿瘤细胞被染成棕色，而正常细胞无色。
4.实验结果
胃癌细胞染色结果见图4。阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中胃癌细胞被染成棕色，显示为强阳性，正常细胞无色，为阴性。说明HRP-AFP可以与胃癌细胞产生的甲胎蛋白受体特异性结合。
实施例5：乳腺癌细针穿刺涂片的检测
1.HRP标记物的制备
(1)用1mL 0.3mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液溶解6mg HRP，配成HRP溶液；
(2)往HRP溶液中加入0.4mL 0.1mol/L的过碘酸钠溶液，在室温下避光反应20min；
(3)将步骤(2)的反应液用G25凝胶柱层析，0.3mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液洗脱，收集活化后的HRP；
(4)将3mg AFP或者OVA加入活化后的HRP溶液中，于室温下避光反应过夜；
(5)加入100μl新鲜配制的0.1mol/L硼氢化钠溶液，于室温下避光反应40min；
(6)将步骤(5)的反应液再次用G25凝胶柱层析，收集蛋白洗脱峰；
(7)将步骤(6)的溶液浓缩后，用G200层析柱进行纯化，最后获得高纯度的HRP-AFP或者HRP-OVA。
2.肿瘤细胞染色试剂盒的组成
(1)肿瘤细胞标记液：含25μg/mL HRP-AFP和4.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH7.4PBS溶液；
(2)阴性对照液：含25μg/mL HRP-OVA和4.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH7.4PBS溶液；
(3)显色液，主要成分为二氨基联苯胺(DAB)。DAB试剂购买自上海杰美基因医药科技有限公司。
3.肿瘤细胞染色试剂盒的染色方法
(1)取2块处理后的乳腺癌细针穿刺涂片，一块切片加入150μl肿瘤细胞标记液与标本中的细胞进行结合，另一块切片加入150μl阴性对照液作为阴性对照，反应100min后，用0.01mol/L pH 7.4PBS冲洗5遍，用吸水纸吸干；
(2)2块切片分别加入150μl显色液，反应15min后，用纯化水冲洗5遍，用吸水纸吸干；
(3)盖上盖玻片后，即可在显微镜下观察；
(4)结果判断：阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中肿瘤细胞被染成棕色，而正常细胞无色。
4.实验结果
乳腺癌细针穿刺涂片的染色结果见图5，图中(A)、(B)为纤维腺瘤细胞，(C)、(D)为乳腺癌细胞。涂片中纤维腺瘤细胞、乳腺癌细胞均与肿瘤细胞标记液中的HRP-AFP结合，被显色液染成棕色，显示为强阳性，而正常细胞无色，为阴性。
实施例6：试剂盒的性能
1.试剂盒组成
(1)肿瘤细胞标记液：含30μg/mL HRP-AFP和3.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH7.4PBS溶液；
(2)阴性对照液：含30μg/mL HRP-OVA和3.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH7.4PBS溶液；
(3)显色液：主要成分为OPD。
2.试剂盒的使用方法
(1)取2块病理石蜡切片，二甲苯脱蜡至水；
(2)3％H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；
(3)加热法修复抗原；
(4)一块切片加入150μl肿瘤细胞标记液与标本中的细胞进行结合，另一块切片加入150μl阴性对照液作为阴性对照，反应60min后，用0.01mol/L pH7.4PBS缓冲液冲洗5遍，用吸水纸吸干；
(5)2块切片分别加入150μl显色液，反应15min后，用0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液冲洗5遍，用吸水纸吸干；
(6)盖上盖玻片后，即可在显微镜下观察；
(7)结果判断：阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中肿瘤细胞被染成棕黄色，而正常细胞无色。
3.试剂盒的性能考察实验结果
(1)准确性
本发明的肿瘤细胞检测方法及其染色试剂盒能检测出18/18乳腺癌，6/6胃癌，4/4前列腺癌，15/16肺癌和8/8结肠癌，结果见表4。
本发明能明显的区分出恶性肿瘤细胞与良性肿瘤细胞或者正常细胞：恶性肿瘤细胞被深度染色，显示为强阳性(+++)；良性肿瘤细胞被轻度染色，显示为弱阳性(+)；正常细胞无色，显示为阴性(-)。
表4 几种组织标本检测结果
(2)稳定性
将本试剂盒分别储存于2～8℃和37℃，考察试剂盒对乳腺癌细胞组织切片的染色效果。在2～8℃条件下，每2个月进行一次实验；在37℃条件下，每3天进行一次实验。
实验结果表明，本试剂盒在2～8℃条件下，12个月内乳腺癌细胞染色结果为强阳性(+++)，第14个月结果为中度阳性(++)；在37℃条件下，第3天、第6天乳腺癌细胞染色结果为强阳性(+++)，第9天结果为中度阳性(++)。说明本试剂盒在2～8℃条件下储存，有效期为一年。
4.结论
利用本发明的肿瘤染色试剂盒可以明显区分肿瘤细胞与正常细胞。特别是含有甲胎蛋白受体的恶性肿瘤细胞被深度染色，显示为强阳性结果，这种特征使得临床医生更好地去对那些着色的细胞进行形态学分析，最终做出正确的诊断。
实施例7：利用甲胎蛋白异质体检测肝癌细胞
1.HRP标记物的制备
(1)用1mL 0.4mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液溶解5mg HRP，配成HRP溶液；
(2)往HRP溶液中加入0.3mL 0.1mol/L的高碘酸钠溶液，在室温下避光反应20min；
(3)将步骤(2)的反应液用G25凝胶柱层析，0.4mol/L pH10的碳酸盐缓冲液洗脱，收集活化后的HRP；
(4)将6mg AFP异质体或者OVA加入活化后的HRP溶液中，于室温下避光反应过夜；
(5)加入150μl新鲜配制的0.1mol/L硼氢化钠溶液，于室温下避光反应20min；
(6)将步骤(5)的反应液再次用G25凝胶柱层析，收集蛋白洗脱峰；
(7)将步骤(6)的溶液浓缩后，用G200层析柱进行纯化，最后获得高纯度的HRP-AFP异质体或者HRP-OVA。
2.肿瘤细胞染色试剂盒的组成
(1)肿瘤细胞标记液：含20μg/mL HRP-AFP异质体和2.0mmol/L CaCl2的0.01mol/LpH 7.4PBS溶液；
(2)阴性对照液：含20μg/mL HRP-OVA和2.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH7.4PBS溶液；
(3)显色液，主要成分为DAB。
3.肿瘤细胞染色试剂盒的染色方法
(1)取2块肿瘤细胞病理石蜡切片，二甲苯脱蜡至水；
(2)3％H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；
(3)加热法修复抗原；
(4)一块切片加入100μl肿瘤细胞标记液与标本中的细胞进行结合，另一块切片加入100μl阴性对照液作为阴性对照，反应90min后，用0.01mol/L pH7.4PBS缓冲液冲洗3遍，用吸水纸吸干；
(5)2块切片分别加入100μl显色液，反应10min后，用0.01mol/L pH 7.4PBS缓冲液冲洗3遍，用吸水纸吸干；
(6)盖上盖玻片后，即可在显微镜下观察；
(7)结果判断：阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中肿瘤细胞被染成棕色，而正常细胞无色。
4.实验结果
甲胎蛋白异质体是一种具有单链糖基化的甲胎蛋白，是AFP的亚型或变异体。依据其与凝集素的亲和力不同，被分为三种类型：AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3，其中，AFP-L3只能由肿瘤细胞产生。
有研究表明，AFP和AFP异质体会被肿瘤细胞从细胞表面受体摄取进去，AFP上的糖并不参与细胞对AFP的摄取，AFP与细胞表面受体的结合已知来自于特定的氨基酸链序列和细胞表面特异性的N-link多糖链的结合。
(1)不同AFP异质体的比较
本发明分别采用AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3这三种甲胎蛋白异质体与HRP偶联制备标记物，进行标记实验。实验结果显示，阴性对照的切片无色，证明操作过程正确；加肿瘤细胞标记液的切片中肝癌细胞被染成棕色，以HRP-AFP-L3标记的肝癌细胞显示为强阳性(+++)，以HRP-AFP-L1或HRP-AFP-L2标记的肝癌细胞显示为中度阳性(++)；正常细胞无色，为阴性(-)。由此可见，虽然AFP异质体的糖链结构与AFP有略微差别，但不影响其与肝癌细胞产生的甲胎蛋白受体特异性结合，所以，可以采用HRP-AFP异质体来标记肝癌细胞，从而检测出肝癌细胞。其中，AFP异质体中以AFP-L3的结合效果最好。
(2)AFP与AFP异质体的比较
分别以HRP-AFP或HRP-AFP-L3为肿瘤细胞标记液，对肝癌细胞病理切片、乳腺癌细胞病理切片、肺癌细胞病理切片进行检测，实验结果见表5。
表5 AFP与AFP-L3对几种癌细胞的检测结果
实验结果表明，在对乳腺癌细胞和肺癌细胞的检测中，AFP与AFP-L3标记物没有明显差别。对肝癌细胞的检测中，AFP有2例显示为中等阳性，按照实施例1的评分标准可以评7分，即中等偏强，而AFP-L3中10例均为强阳性。由此可见，AFP-L3对肝癌细胞的检测效果优于AFP。这可能是由于AFP-L3是肝癌细胞所特有的，AFP-L3对肝癌细胞的特异性好于AFP。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一种肿瘤细胞染色试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括：
（1）肿瘤细胞标记液：含10~30μg/mL辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白/甲胎蛋白异质体和1.0~5.0mmol/L CaCl2的0.01mol/L pH 7.4 PBS溶液；
（2）阴性对照液：含10~30μg/mL辣根过氧化物酶标记的卵清蛋白和1.0~5.0mmol/LCaCl2的0.01mol/L pH 7.4 PBS溶液；
显色液：即辣根过氧化物酶显色底物，包括邻苯二胺、四甲基联苯胺、2,2’-连氮-双-（3-乙基苯噻唑啉-6-磺酸）、5-氨基水杨酸、邻联茴香胺、邻联甲苯胺、二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑或3,6-二氨基-9-乙基咔唑中的一种。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞染色试剂盒，其特征在于：所述的辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白/甲胎蛋白异质体，或辣根过氧化物酶标记的卵清蛋白的制备方法包括以下步骤：
（1）用1mL 0.1~0.5mol/L pH4~5醋酸钠缓冲液溶解4~8mg辣根过氧化物酶，配成辣根过氧化物酶溶液；
（2）往辣根过氧化物酶溶液中加入0.1~0.5mL 0.1~0.2mol/L的高碘酸钠溶液，在室温下避光反应10~60min；
（3）将步骤（2）的反应液用G25凝胶柱层析，0.1~0.5mol/L pH 9~10的碳酸盐缓冲液洗脱，收集活化后的辣根过氧化物酶；
（4）将1~10mg甲胎蛋白或甲胎蛋白异质体或卵清蛋白，加入到活化后的辣根过氧化物酶溶液中，于室温下避光反应过夜；
（5）加入50~200μl新鲜配制的0.05~0.2mol/L硼氢化钠溶液，于室温下避光反应15~45min；
（6）将步骤（5）的反应液再次用G25凝胶柱层析，收集蛋白洗脱峰；
（7）将步骤（6）的溶液浓缩后，用G200层析柱进行纯化，最后获得高纯度的辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白，或辣根过氧化物酶标记的甲胎蛋白异质体，或辣根过氧化物酶标记的卵清蛋白。
3.根据权利要求1所述的肿瘤细胞染色试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒的染色方法具体步骤如下：
（1）取2个组织标本或细胞标本，一个加入100~200μL肿瘤细胞标记液与标本中的细胞进行结合，另一个加入100~200μL阴性对照液作为阴性对照，反应30~120min后，用纯化水或0.01mol/L pH 7.4 PBS缓冲液冲洗3~5遍，用吸水纸吸干；
（2）2个标本分别加入100~200μL显色液，反应5~15min后，用纯化水或0.01mol/L pH7.4 PBS缓冲液冲洗3~5遍，用吸水纸吸干；
（3）盖上盖玻片后，即可在显微镜下观察；
（4）结果判断：阴性对照的标本无色，证明操作过程正确；肿瘤细胞标记液处理的标本中的肿瘤细胞被染色，具体颜色由显色液决定，而正常细胞无色。
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