CN105974117A - Ck-mb校准品稀释液及其在临床ck检测中的应用 - Google Patents

Ck-mb校准品稀释液及其在临床ck检测中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105974117A
CN105974117A CN201610289544.3A CN201610289544A CN105974117A CN 105974117 A CN105974117 A CN 105974117A CN 201610289544 A CN201610289544 A CN 201610289544A CN 105974117 A CN105974117 A CN 105974117A
Authority
CN
China
Prior art keywords
calibration object
traditional chinese
chinese medicines
sigma
final concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610289544.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105974117B (zh
Inventor
肖智
李全
焦守恕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tarcine BioMed Inc
Original Assignee
Tarcine BioMed Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tarcine BioMed Inc filed Critical Tarcine BioMed Inc
Priority to CN201610289544.3A priority Critical patent/CN105974117B/zh
Publication of CN105974117A publication Critical patent/CN105974117A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105974117B publication Critical patent/CN105974117B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及医学检测试剂，特别是CK‑MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应用。用于CK‑MB校准品的稀释液，是在缓冲液中加入终浓度为0.01‑0.12g/ml的玉米蛋白、终浓度0.5‑4mM的谷胱甘肽、终浓度3‑20％V/V的胎牛血清和终浓度3‑20mM的EDTA配制而得。所述稀释液最大程度地提高了CK‑MB校准品的稳定性，解决了目前存在的CK‑MB校准品不稳定的问题，提高临床CK检测的准确性，为临床相关疾病的诊断提供更准确的依据。

Description

CK-MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应用
技术领域
本发明涉及医学检测试剂，特别是CK-MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应用。
技术背景
肌酸激酶(creatine kinase,CK)以二聚体的形式存在，在收缩组织高能磷酸键的产生和应用上具有重要作用。而且，在细胞浆内，线粒体产生的ATP通过磷酸肌酸传递到使用部位，肌酸激酶起到“穿梭运输”的作用。“穿梭假想”在一些组织得到证实，在肾脏远曲小管，尽管它并不收缩，但是需要大量ATP供给钠钾泵维持离子梯度。CK催化的化学反应为：肌酸(Creatine)+ATP在CK催化下生成磷酸肌酸(creatine phosphate,CP)和ADP。线粒体产生的ATP存储在CP中，经过转用到使用部位。
CK的分子量较大(>80kd)，不能通过肾脏排泄，一些研究表明CK是由网状内皮系统清除，如肝脏的网状内皮系统。总CK的升高可见于试验室分析的干扰、坏死组织的释放，总CK是骨骼肌、心肌损伤的非常敏感的指标，常见于各种骨骼肌损伤，一些临床药物如镇静药、抗抑郁药物可引起CK增高，蜜蜂叮咬等也可引起升高。杜氏肌营养不良患者早期轻度升高，在成人神经肌肉疾病也会升高。此时，心脏肌钙蛋白可作为不同来源损伤的鉴别指标。临床CK检查通过酶法检测，即检测CK催化磷酸肌酸转化的活性。
CK的同工酶，有四个基因编码CK亚基，M亚单位(19号染色体)，B亚单位(14号染色体)，另外2个线粒体亚单位。还有第5个B亚单位的假基因(16号染色体)。M和B亚单位结合形成三个同工酶CK-MM、CK-BB、CK-MB，分子量在86-89ku。尽管CK活性需要二聚体存在，各亚单位也存在催化活性。在不同组织，3种同工酶的分布是不一样的，骨骼肌组织(99％MM，1％MB)，心脏组织(77％MM，22％MB，1％BB)，脑组织(100％BB)，肠道、胃、膀胱等(0-6％MM、MB，92-96％BB)。由此可见，在不同的组织损伤产生的同工酶是不一样的。CK-MB同工酶问世后，一度成为AMI(Acute Myocardial Infarction，急性心肌梗死)诊断的“金指标”。同时，在血清中还存在CK的同工酶变异体，“巨大CK”1型、2型，尽管日常不检测它们，但是它们会影响CK-MB的检测，包括免疫抑制法和电泳法。
最早的检测CK-MB的方法是柱层析和电泳的方法，通过分离得到CK不同同工酶的条带。免疫抑制的方法最早开发于1975年，目前在全球广泛的使用。它是将M亚基的多克隆抗体抑制M亚基后，用传统的总CK方法检测剩余亚基的活性，由于BB亚基相对量少，可以忽略不计，CK-MM被完全抑制，CK-MB测定值为实际活性的一半，测定值乘以2就得到CK-MB的值。免疫抑制法的优点在于成本较低同时可以在生化分析仪上大量检测。缺点在于不特异，如果BB亚型增高会对结果产生较大影响，巨大CK也会对结果产生较大影响，甚至造成CK-MB超出总CK活性的情况。另外腺苷激酶(Adenylate kinase,AK)也会影响检测，AK在红细胞中含量较大，在溶血的标本，检测时AK会影响CK-MB的值。
由于CK-MB免疫抑制法的非特异性，临床常用它进行筛选，对于升高患者需要用其他方法来验证，在总CK<100U/L时，可以不用检测CK-MB，因为往往它们是正常的。这也适应于急性心肌梗早期，酶水平还没有升高的时候。同时通过CK指数(CK同工酶活性/总CK)可以间接判断CK来源，如CK-MB超出上限，而CK-MB/总CK<4％，往往是由于骨骼肌释放出来的可能性比较大；如CK-MB/总CK>25％，要考虑到CK-BB和巨大CK(1型和2型)的存在，因为AMI患者很少超出这个范围，如果在4％-25％，应该连续监测样本活性，诊断AMI的准确性>90％。
自从1960年以来，CK-MB成为AMI的金标准，不同的检测方法应用于临床，包括层析法、电泳法、免疫抑制法。然而，为了提高反应的特异性，缩短检测时间，开发出质量法(CK-MBmass)，单位ug/L,最高灵敏度为1ng/ml，比CK-MB特异，最小检测时间为7分钟。它使用双位点免疫分析技术，用抗M亚单位抗体、抗B亚单位抗体、抗MB特异性抗体检测抗原。它检测是抗原的量而不是活性，所以和CK总活性及CK-MB活性不同，不会受酶活力衰减的影响。
CK-MB的临床运用在于ACS(Acute Coronary Syndromes，急性冠状动脉综合征)的判断，总CK斜率结合CK-MB浓度可以在4h准确判断AMI；CK-MB在入院8h(胸痛12-16h)的浓度是最为有效的检测之一，计算变化的斜率更有价值。CK-MB质量法可以在一定的时间内增加AMI的诊断率，并快速筛选出需要再通治疗的患者，结合肌钙蛋白可以提高敏感性。并且，在经静脉溶栓、介入治疗后再通时，CK-MB质量法时间曲线达峰时间提前，可以作为再灌注的指标。
CK-MB质量可作为预后和危险度分层的指标，5％-20％的不稳定型心绞痛患者在第一年进展为AMI或死亡。尸检显示患者存在频繁的小梗死。CK-MB质量法能敏感的检测小的梗死并对患者的预后具有重要价值。对于儿科患者CK-MB的检测意义不大，因为从出生后CK同工酶谱的改变，从CK-BB到CK-MB到CK-MM变化。
由于CK-MB是二聚体的形态存在的，极其不稳定，大多数公司试剂盒的校准品均是以冻干品的形式保存的，在临床应用的过程中，带来很多的不便。因此探索一种稳定的CK-MB校准品在临床中有很大的意义。
发明内容
本发明根据上述领域存在的需求和空白，提供稳定性高的CK-MB校准品稀释液，可用于CK-MB校准品的配制。以下概括本发明要求保护的技术方案：
用于CK-MB校准品的稀释液，其特征在于，是在缓冲液中加入终浓度为0.01-0.12g/ml的玉米蛋白、终浓度0.5-4mM的谷胱甘肽、终浓度3-20％V/V的胎牛血清和终浓度3-20mM的EDTA配制而得，
所述缓冲液指以下任意一种：
100ml溶液中包含磷酸二氢钠0.0624g、磷酸氢二钠0.716g、氯化钠0.8g，pH值7.4的磷酸缓冲液；
100ml溶液中包含Tris碱1.21g,pH值8.0的Tris缓冲液；
100ml溶液中包含柠檬酸1.92g的柠檬酸缓冲液。
优选地，所述玉米蛋白的终浓度为0.025-0.1g/ml。
优选地，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽,其终浓度为1-3mM mM。
优选地，所述胎牛血清的终浓度为5-15％V/V。
优选地，所述EDTA的终浓度为5-15mM。
一种肌酸激酶体外检测试剂盒，其特征在于，包含CK-MB校准品以及权利要求1-5任一所述的CK-MB校准品稀释液。
本发明提供一种CK-MB校准品稀释液，能够显著提高CK-MB校准品的稳定性，从而提高临床检测CK活性的准确性，有利于相关疾病的准确诊断。是在缓冲液中加入玉米蛋白、谷胱甘肽、胎牛血清、EDTA配制而得。
其中，玉米蛋白粉也称玉米麸质粉,主要由玉米蛋白组成，含有少量的淀粉和纤维。由于玉米蛋白氨基酸组成独特，其支链氨基酸和中性氨基酸含量相当高，系植物蛋白中少有。在一些实施例中，添加玉米蛋白优选终浓度为0.01-0.12g/ml，进一步优选0.025-0.1g/ml，稳定性会明显提高。在另一些实施例中，玉米蛋白在稀释液中的浓度0.05g/ml时，能够最大程度地提高CK-MB校准品的稳定性。
谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞，谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。加入终浓度0.5-4mM谷胱甘肽可以防止缓冲液中成分的氧化作用，提高其稳定性，防止跳管现象的产生。在一些实施例中，还原型谷胱甘肽在稀释液中的浓度为0.5-3mM。在另一些实施例中，还原型谷胱甘肽的浓度为1mM时，CK-MB校准品的稳定性最高。
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，为蛋白提供一种稳定的微环境。加入3-20％V/V胎牛血清的基质液，可以避免基质效应，同时也可以降低本底的发光值，从而间接起到增加稳定性的作用。在一些实施例中，胎牛血清在稀释液中的浓度为5-15％。在另一些实施例中，稀释液中加入10％的胎牛血清能够最大程度地提高CK-MB校准品的稳定性。
EDTA是一种优良的钙、镁离子螯合剂，用作乳液聚合所用水的螯合剂，除去Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+等金属离子。加入终浓度3-20mM的EDTA后，可以避免其他金属离子对蛋白的干扰，从而增加了蛋白的稳定性。在一些实施例中，EDTA在稀释液中的浓度为5-15mM。在另一些实施例中，EDTA的浓度为10mM时，CK-MB校准品的稳定性最高。
采用这些实施例所提供的稀释液配制的CK-MB校准品制作标准曲线，相关系数r＝0.96以上，校准品在0-300ng/ml之间线性良好。
在本发明的优选实施例中，所述玉米蛋白的浓度为每100ml稀释液中含有5g的玉米蛋白；所述谷胱甘肽的浓度为1mM；所述胎牛血清的浓度为10％V/V；所述EDTA的浓度为10mM；采用所述稀释液配制的校准品制作标准曲线，相关系数r＝0.99，校准品在0-300ng/ml之间线性良好。
综上所述，本发明CK-MB校准品稀释液中的玉米蛋白有很强的蛋白保护作用，还原型谷胱甘肽有抗氧化的作用，胎牛血清能够提供一个稳定的微环境，EDTA可以螯合缓冲液中的金属离子，从而最大程度地提高了CK-MB校准品的稳定性，解决了目前存在的CK-MB校准品不稳定的问题，提高临床CK检测的准确性，为临床相关疾病的诊断提供更准确的依据。
附图说明
图1各缓冲体系下校准品的稳定性比较；
其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
图2不同保护剂对校准品稳定性的影响；
其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
图3不同浓度EDTA对校准品稳定性的影响；
其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
图4不同浓度玉米蛋白对校准品稳定性影响；
其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
图5不同浓度胎牛血清对校准品稳定性影响；
其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
图6不同浓度还原型谷胱甘肽对校准品稳定性的影响；
其中纵坐标表示浓度点相对光单位P的降幅，横坐标表示测量的时间点第一天、第二天、第三天、第五天、第七天、第九天。
图7采用本发明稀释液配制的校准品制作的标准曲线；
图8临床样本测定结果；
其中纵坐标是本发明实施例4所述检测方法测定结果，横坐标是贝克曼CK-MB试剂盒测定结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行详细说明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何形式限制本发明的保护范围。
本实施例所用到的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制或商购获得，规格为实验室纯级即可。
实施例1.CK-MB校准品稀释液的pH值选择
1、不同缓冲体系的CK-MB校准品稀释液的配制
(1)100mlCK-MB校准品缓冲液(PBS)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(2)100mlCK-MB校准品缓冲液(Tris)
称取Tris碱(Amresco，ZA082601)1.21g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值8.0，定容至100ml。
(3)100mlCK-MB校准品缓冲液(柠檬酸)
称取柠檬酸(国药，10007192)1.92g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值6.0，定容至100ml。
2、CK-MB校准品的稳定性试验
用步骤1配制的三种稀释液分别制备300ng/ml的CK-MB(usbiological，货号#C7910-01D)抗原溶液，分别于37℃恒温培养箱中放置9天、7天、5天、3天、2天和1天，以2-8℃条件做对照，进行下列试验：
(1)包被：配制1μg/mL CK-MB抗体(Medix，货号#7501)10mM PB溶液，加入微孔发光板中，100μL/孔，4℃孵育21h；
(2)封闭：将微孔板中包被液甩干，加入5％BSA 10mM PB溶液，200μL/孔，4℃孵育21h；
(3)加样：将微孔板中封闭液甩干，加入待测样本，50μL/孔，37℃孵育30min；
(4)酶标抗体：将微孔板用洗涤液(含有0.05％(V/V)Tween-20(sigma，44112)的10mMPBS溶液)洗涤5次并甩干，加入50μL/孔HRP标记的CK-MB抗体(Medix，7502)，37℃孵育15min；
(5)底物：将微孔板用洗涤液洗涤5次并甩干，加入底物A和底物B(Thermo，34080)，各50μL/孔，避光反应5min，测定发光值(厦门天众达ECLIA-IIS型化学发光免疫分析仪)，发光强度以相对光单位(RLU)表示。
3、CK-MB校准品在不同pH值条件下的稳定性分析
本试验配制了不同缓冲体系，由此对pH6.0～8.0条件下CK-MB项目的稳定性进行研究。用pH6.0的柠檬酸弱酸体系、pH7.4的磷酸盐弱碱体系、pH8.0的Tris碱性体系这三种缓冲液配制校准品，分别放在37℃恒温培养箱中，进行稳定性试验。如表1-3，P点为300ng/ml校准品，N点为校准品缓冲液。验证在不同缓冲体系之下P点相对光单位(RLU)变化，变化越小表明校准品越稳定。结果表明，在pH7.4的弱碱条件下，P点降幅最低，在15％以下，校准品稳定性较高。(见表1-3)。
表1磷酸盐缓冲液
表2Tris碱缓冲液
表3柠檬酸缓冲液
实施例2.CK-MB校准品稀释液的保护剂选择
1、含有不同保护剂的CK-MB校准品稀释液的配制
(1)100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为玉米蛋白)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(2)100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为BSA)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、BSA(Roche,RD1073832)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(3)100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为casein)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、Casein(Sigam,SC589003)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(4)100ml CK-MB校准品缓冲液(保护剂为商品化蛋白保护剂)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、蛋白保护剂(国药，10758)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
2、CK-MB校准品的稳定性试验
用步骤1配制的四种稀释液分别制备300ng/ml的CK-MB抗原溶液，分别于37℃恒温培养箱中放置9天、7天、5天、3天2天、和1天，以2-8℃条件做对照，测试方法同实施例1。
3、CK-MB校准品在不同保护剂下的稳定性分析
本试验在pH7.4条件下采用了不同的蛋白保护剂，5％玉米蛋白，5％BSA，5％Casein，5％的蛋白保护剂分别配制成校准品稀释液，用这四种校准品稀释液配制校准品，进行稳定性试验。如表4-7，P点为300ng/ml校准品，N点为校准品稀释液。P点相对光单位(RLU)变化，变化越小表明校准品越稳定。结果表明，添加5％玉米蛋白的校准品缓冲液的P点降幅最低，稳定性最好(见表4-7)。
表4 5％玉米蛋白对校准品稳定性的影响
表5 5％BSA对校准品稳定性的影响
表6 5％Casein对校准品稳定性的影响
表7 5％蛋白稳保护剂对校准品稳定性的影响
实施例3.CK-MB校准品稀释液中各成分最适浓度的筛选
1、含不同浓度EDTA的CK-MB校准品稀释液的配制
(1)100ml CK-MB校准品缓冲液(未加EDTA)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(2)100ml CK-MB校准品缓冲液(5mM EDTA)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.146g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(3)100ml CK-MB校准品缓冲液(10mM EDTA)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(4)100ml CK-MB校准品缓冲液(15mM EDTA)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.438g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
2、含不同浓度玉米蛋白的CK-MB校准品稀释液的配制
(1)100mlCK-MB校准品缓冲液(未加玉米蛋白)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(2)100mlCK-MB校准品缓冲液(2.5％玉米蛋白)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)2.5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(3)100mlCK-MB校准品缓冲液(5％玉米蛋白)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(4)100mlCK-MB校准品缓冲液(10％玉米蛋白)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)10g。加入60ml超纯水，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
3、含不同浓度胎牛血清的CK-MB校准品稀释液的配制
(1)100ml CK-MB校准品缓冲液(未加胎牛血清)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(2)100ml CK-MB校准品缓冲液(5％胎牛血清)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)5ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(3)100ml CK-MB校准品缓冲液(10％胎牛血清)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(4)100ml CK-MB校准品缓冲液(15％胎牛血清)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽((Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)15ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
4、含不同浓度还原型谷胱甘肽的CK-MB校准品稀释液的配制
(1)100ml CK-MB校准品缓冲液(未加还原型谷胱甘肽)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(2)100mlCK-MB校准品缓冲液(1mM还原型谷胱甘肽)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0307g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(3)100mlCK-MB校准品缓冲液(2mM还原型谷胱甘肽)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0614g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(4)100mlCK-MB校准品缓冲液(3mM还原型谷胱甘肽)
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0921g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
5、CK-MB校准品的稳定性试验
用步骤1-4配制的16种稀释液分别制备300ng/ml的CK-MB抗原溶液，分别于37℃恒温培养箱中放置9天、7天、5天、3天2天、和1天，以2-8℃条件做对照进行测试，测试方法同实施例1。
6、不同浓度的稀释液成分对CK-MB校准品稳定性的影响
(1)通过比较不同浓度EDTA(0mM、5mM、10mM、15mM)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品缓冲液中加入10mM EDTA，校准品的稳定性最好(见表8)。
表8 EDTA浓度筛选
(2)通过比较不同浓度玉米蛋白(0％、2.5％、5％、10％)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品缓冲液中加入5％玉米蛋白，校准品的稳定性最好(见表9)。
表9玉米蛋白浓度筛选
(3)通过比较不同浓度胎牛血清(0％、5％、10％、20％)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品缓冲液中加入10％胎牛血清，校准品的稳定性最好(见表10)。
表10胎牛血清浓度筛选
(4)通过比较同浓度还原型谷胱甘肽(0mM、1mM、2mM、3mM)条件下校准品的稳定性，结果表明，在校准品缓冲液中加入1mM还原型谷胱甘肽，校准品的稳定性最好(见表11)。
表11还原型谷胱甘肽浓度筛选
实施例4.CK-MB校准品临床检测应用
收集84例临床样本，选用贝克曼CK-MB体外诊断试剂盒(化学发光法)(注册号国食药监械(进)字2005第3400485号)进行方法学比较。
测定步骤：
(1)按照下列配方配制最佳稀释液：
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4)(国药，20040799)0.0624g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)(国药，100203008)0.716g、氯化钠(NaCl)(国药，10019308)0.8g、EDTA(Sigma，SE513402)0.292g、还原型谷胱甘肽(Sigma，G4251)0.0307g、胎牛血清(Sigma，S12003C01)10ml、玉米蛋白(国药，XW901066)5g。加入60ml超纯水中，完全溶解后，调节pH值7.4，定容至100ml。
(2)用上述步骤(1)得到的稀释液配制300ng/ml、100ng/ml、30ng/ml、10ng/ml、3ng/ml的合成校准品(CK-MB抗原(usbiological，货号#C7910-01D)，作标准曲线；
(3)测定方法：
a.包被：配制1μg/mL CK-MB抗体10mM PB溶液，加入微孔发光板中，100μL/孔，4℃孵育21h；
b.封闭：将微孔板中包被液甩干，加入5％BSA 10mM PB溶液，200μL/孔，4℃孵育21h；
c.抗原：将微孔板中封闭液甩干，加入待测样本，50μL/孔，37℃孵育30min；
d.酶标抗体：将微孔板用洗涤液(含有0.05％(V/V)Tween-20(sigma，44112)的10mM PBS溶液)洗涤3次并甩干，加入50μL/孔HRP标记的CK-MB抗体，37℃孵育15min；
e.底物：将微孔板用洗涤液洗涤3次并甩干，加入底物A和底物B(Thermo，34080)，各50μL/孔，避光反应5min，测定发光值(厦门天众达ECLIA-IIS型化学发光免疫分析仪)，发光强度以相对光单位(RLU)表示。
1.测定结果
采用本发明稀释液配制的校准品制作的标准曲线(logX-logY)如图7所示，相关系数r＝0.99，表明校准品在0-300ng/ml之间线性良好。
将本发明稀释液配制的校准品的测定结果与贝克曼CK-MB体外诊断试剂盒(磁颗粒化学发光法)进行方法学比较，结果如图8所示，相关系数r＝0.96，表明本发明稀释液配制的校准品的测定结果与贝克曼CK-MB试剂盒测定结果高度相关，一致性较高。

Claims (6)

1.用于CK-MB校准品的稀释液，其特征在于，是在缓冲液中加入终浓度为0.01-0.12g/ml的玉米蛋白、终浓度0.5-4mM的谷胱甘肽、终浓度3-20％V/V的胎牛血清和终浓度3-20mM的EDTA配制而得，
所述缓冲液指以下任意一种：
100ml溶液中包含磷酸二氢钠0.0624g、磷酸氢二钠0.716g、氯化钠0.8g，pH值7.4的磷酸缓冲液；
100ml溶液中包含Tris碱1.21g,pH值8.0的Tris缓冲液；
100ml溶液中包含柠檬酸1.92g的柠檬酸缓冲液。
2.根据权利要求1所述的稀释液，其中所述玉米蛋白的终浓度为0.025-0.1g/ml。
3.根据权利要求1所述的稀释液，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽,其终浓度为1-3mM。
4.根据权利要求1所述的稀释液，所述胎牛血清的终浓度为5-15％V/V。
5.根据权利要求1所述的稀释液，所述EDTA的终浓度为5-15mM。
6.一种肌酸激酶体外检测试剂盒，其特征在于，包含CK-MB校准品以及权利要求1-5任一所述的CK-MB校准品稀释液。
CN201610289544.3A 2016-05-04 2016-05-04 Ck‑mb校准品稀释液及其在临床ck检测中的应用 Active CN105974117B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610289544.3A CN105974117B (zh) 2016-05-04 2016-05-04 Ck‑mb校准品稀释液及其在临床ck检测中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610289544.3A CN105974117B (zh) 2016-05-04 2016-05-04 Ck‑mb校准品稀释液及其在临床ck检测中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105974117A true CN105974117A (zh) 2016-09-28
CN105974117B CN105974117B (zh) 2017-09-01

Family

ID=56993655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610289544.3A Active CN105974117B (zh) 2016-05-04 2016-05-04 Ck‑mb校准品稀释液及其在临床ck检测中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105974117B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107561287A (zh) * 2017-08-30 2018-01-09 潍坊市康华生物技术有限公司 一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒及其制备和使用方法
CN108107224A (zh) * 2017-12-18 2018-06-01 郑州安图生物工程股份有限公司 一种ProGRP含量测定用液态校准品
CN111848775A (zh) * 2020-08-05 2020-10-30 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种NT-proBNP重组蛋白的保存液及其制备方法
CN112858678A (zh) * 2019-11-12 2021-05-28 上海奥普生物医药股份有限公司 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒、制备方法及用途

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57122796A (en) * 1980-12-09 1982-07-30 American Hospital Supply Corp Stabilized creatinekinase control
US5298406A (en) * 1992-09-14 1994-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Formulation for stabilizing enzymatic activity and immunoreactivity of creatine kinase and creatine kinase isoenzymes
JPH10327895A (ja) * 1997-06-04 1998-12-15 Nippon Shoji Kk 安定なクレアチンキナーゼ活性測定用液状試薬
CN101824405A (zh) * 2009-03-06 2010-09-08 上海复星医药（集团）股份有限公司 一种肌酸激酶稀释剂
CN102680689A (zh) * 2011-03-10 2012-09-19 王迎峰 检测肌酸激酶同功酶的试剂盒及其制备和使用方法
CN102809651A (zh) * 2012-07-26 2012-12-05 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57122796A (en) * 1980-12-09 1982-07-30 American Hospital Supply Corp Stabilized creatinekinase control
US5298406A (en) * 1992-09-14 1994-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Formulation for stabilizing enzymatic activity and immunoreactivity of creatine kinase and creatine kinase isoenzymes
JPH10327895A (ja) * 1997-06-04 1998-12-15 Nippon Shoji Kk 安定なクレアチンキナーゼ活性測定用液状試薬
CN101824405A (zh) * 2009-03-06 2010-09-08 上海复星医药（集团）股份有限公司 一种肌酸激酶稀释剂
CN102680689A (zh) * 2011-03-10 2012-09-19 王迎峰 检测肌酸激酶同功酶的试剂盒及其制备和使用方法
CN102809651A (zh) * 2012-07-26 2012-12-05 博奥赛斯（天津）生物科技有限公司 肌酸磷酸激酶同工酶化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱朝辉，赵宏伟，贾胜德: "玉米蛋白组分的研究进展", 《黑龙江农业科学》 *
陈列芹，李云捷: "玉米蛋白的研究进展", 《中国食物与营养》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107561287A (zh) * 2017-08-30 2018-01-09 潍坊市康华生物技术有限公司 一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒及其制备和使用方法
CN108107224A (zh) * 2017-12-18 2018-06-01 郑州安图生物工程股份有限公司 一种ProGRP含量测定用液态校准品
CN112858678A (zh) * 2019-11-12 2021-05-28 上海奥普生物医药股份有限公司 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒、制备方法及用途
CN112858678B (zh) * 2019-11-12 2023-10-27 上海奥普生物医药股份有限公司 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒、制备方法及用途
CN111848775A (zh) * 2020-08-05 2020-10-30 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种NT-proBNP重组蛋白的保存液及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105974117B (zh) 2017-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105974117A (zh) Ck-mb校准品稀释液及其在临床ck检测中的应用
US8227603B2 (en) Modulating skeletal muscle
Dwivedi et al. Modulation in activation and expression of phosphatase and tensin homolog on chromosome ten, Akt1, and 3-phosphoinositide-dependent kinase 1: further evidence demonstrating altered phosphoinositide 3-kinase signaling in postmortem brain of suicide subjects
HU176133B (en) Process and reagent for determining mb-creatinase-activity in body-liquid-samples
Pasiakos et al. Molecular responses to moderate endurance exercise in skeletal muscle
Roberts Elevated plasma MB creatine phosphokinase activity: A specific marker for myocardial infarction in perioperative patients
Sato et al. Studies on ascorbic acid related to the genetic basis of scurvy
Duchêne et al. Involvement of the ERK1/2 MAPK pathway in insulin-induced S6K1 activation in avian cells
POLLAK et al. Enzyme Activity in the Nephron: Quantitative Study by Ultramicrochemical Techniques
Raman et al. Metabolic changes and myocardial injury during cardioplegia: a pilot study
JP5194000B2 (ja) 薬剤誘導肝臓損傷及び中毒性物質誘導肝臓損傷の同定及び早期同定並びに治療の同時観察のためのｉｎｖｉｔｒｏ方法
Roughead et al. Qualitative and quantitative assessment of flavins in cow's milk
CN112362649A (zh) 一种rhGH中和抗体的检测方法
Bouly et al. Aging increases circulating BH2 without modifying BH4 levels and impairs peripheral vascular function in healthy adults
CN108490195A (zh) 一种维生素b12免疫法测定方法及其试剂
Bender et al. SERUM TRYPTOPHAN BINDING IN CHLORPROMAZINE‐TREATED CHRONIC SCHIZOPHRENICS
Vieira et al. Methemoglobinemia and dapsone levels in patients with leprosy
Engelking et al. Evaluation of hepatobiliary disorders in the horse
CN106324234A (zh) 修饰的n‑乙酰神经氨酸醛缩酶及其制备方法和应用
Burlina Improved electrophoretic separation of creatine kinase isoenzymes.
Mosbah et al. Serum level of circulating xanthine oxidase in healthy and chronic hepatitis B patients
Zhen et al. A novel assay of cell rubidium uptake using graphite furnace atomic absorption: application to rats on a magnesium-deficient diet
Jiménez-Alonso et al. Salivary?-Glutamyl Transferase Activity in Internal Diseases
Baker et al. Cardiac carnitine leakage is promoted by cardiomyopathy
Liu et al. Effects of Zinc Supplementation on Metabolomic Profiles in Tanzanian Infants: A Randomized Trial

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant