CN102147413A - 一种小粒径匀相溶胶颗粒型胱抑素c测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种小粒径匀相溶胶颗粒型胱抑素C免疫测定试剂盒及其制备方法。使用本发明的试剂盒能检测血清或血浆中胱抑素C的含量。所述的匀相溶胶颗粒型胱抑素C免疫测定试剂盒，其胶体金颗粒直径为26-32nm。本发明的试剂盒具有高灵敏度及高稳定性的特点。

Description

一种小粒径匀相溶胶颗粒型胱抑素C测定试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒及其制备方法，特别是小粒径的匀相溶胶颗粒型胱抑素C免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
1983年Anastasi等首次在鸡蛋清中分离纯化得到高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitor，CPI)，后被命名为胱抑素C(CysC)。胱抑素C是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，属非糖基化的碱性蛋白质，分子量约为13KD，几乎所有的有核细胞均能产生，经由肾小球滤过并几乎全部被近曲小管重吸收和分解，产生率多处在相对衡定状态。胱抑素C是一种比较接近理想的反映肾小球率过滤的内源性标志物，研究表明该物质不受生理、性别、年龄、炎症等因素影响，体内含量恒定，能早期敏感提示肾功能损害，是近几年新发现用来诊断肾脏疾病的一个理想指标。
研究资料已表明，胱抑素C较血清BUN、Cr有更高的敏感性和特异性，对于评价肾小球滤过率有非常重要的价值。目前对于胱抑素C的检测方法比较常用的有颗粒增强免疫比浊法和匀相溶胶颗粒型免疫测定法。由于颗粒增强免疫比浊法测定时间短，而且可以在自动生化分析仪上进行，所以成为胱抑素C检测的常规应用技术，但是上述方法反应后会产生沉淀，不利于生化仪的清洗。而后者不仅具有前者的那些优点，也不会产生沉淀，所以在胱抑素C的常规临床应用中可以优先选择匀相溶胶颗粒型免疫测定法。目前该技术已趋于成熟，而且操作简便，干扰因素少，对各种疾病的诊断及病情观察具有重要的临床意
匀相溶胶颗粒型免疫测定法的基本原理是：采用标记了抗胱抑素C抗体的胶体金，与待测标本中的胱抑素C发生凝聚反应使胶体金颜色发生变化，用540nm检测这种变化，以胱抑素C标准品的标准曲线测出样本中目标检测物胱抑素C的浓度。
发明内容
本发明要解决的问题是建立一种小粒径匀相溶胶颗粒型胱抑素C检测试剂盒，提供一种特异性的高稳定性的匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，可以测定0.027mg/L的胱抑素C含量。另外，本发明的目的还在于提供使用本发明匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒测定胱抑素C含量的方法。
为了解决上述问题，本发明采用26-32nm胶体金颗粒标记于抗胱抑素C抗体，通过匀相溶胶颗粒免疫测定法检测血清或血浆中胱抑素C含量。采用开瓶稳定性实验检测了该试剂盒与国际知名企业相关产品的的稳定性差异。
本发明提供以下的技术方案。
1.根据权利要求1-3记载的一种小粒径匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其用于测定胱抑素C的含量，该试剂盒包含试剂R1和试剂R2以及胱抑素C标准品，试剂R1和试剂R2的体积比为4∶1，所述试剂R1为含有多聚物的缓冲溶液，所述试剂R2为结合有抗人胱抑素C抗体的胶体金的缓冲溶液，其中胶体金颗粒的直径为26-32nm。
2.根据权利要求4-5记载的小粒径匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其特征在于，我们利用开瓶实验检测了本发明和某国际知名品牌试剂盒的稳定性相比较为优。
我们使用本发明的方法灵敏度高，能够检测极低水平(约0.027mg/L)的胱抑素C，具有很高的临床实用价值。另外，本发明的试剂盒为液体双试剂，因此具有特异性好，灵敏度高，准确性好及抗干扰能力强等优点，可用于检测血清或血浆中胱抑素C的浓度，适用于临床全自动生化分析仪。
附图说明
图1显示6种不同含量的胱抑素C参考标准的标准曲线，每个点代表不同含量的胱抑素C参考标准，其中，x轴表示胱抑素C的含量，y轴表示吸光度。
图2显示本发明的试剂和对照试剂(某国际知名公司胱抑素C试剂盒)的相关性。图中的X、Y轴均为测定值(胱抑素C含量mg/L)。
具体实施方式
实施例1
一种小粒径匀相溶胶颗粒型胱抑素C测定试剂盒及其制备方法。
1.本发明试剂R1的配制
按照常规方法进行制备。
2.本发明试剂R2的配制
I.胶体金溶液的制备
(1)用超纯水配制1％氯金酸和10％柠檬酸三钠；
(2)超纯水配制万分之四氯金酸500ml(20ml 1％氯金酸加480ml超纯水)；
(3)加热搅拌至微沸，快速加入与氯金酸质量比为1.2∶1的柠檬酸三钠(即4ml 10％柠檬酸三钠)；
(5)加热搅拌至颜色变为酒红色，继续加热搅拌5-8min后停止；
(6)用紫外分光光度计检测500nm-560nm处的吸光度值，根据吸光度值分析出波峰的位置，以此大致确定金颗粒的粒径。
II.抗体标记(以标记100ml胶体金为例)
(1)100ml胶体金加10ml 0.1M pH8.4硼酸盐缓冲液再加2mg 1mg/ml CysC多抗，混匀放置30min；
(2)加10ml 10％BSA，混匀放置30min；
(3)11000rpm离心30min；
(4)去上清，用含0.4％PEG8000的Tris缓冲液(10mM/L，PH7.5)重悬，离心30min；
(5)同上重复洗涤两次；
(6)用上述缓冲液复溶至30ml。
实施例2工作曲线测定
本发明的用量：本发明试剂R1和本发明试剂R2用量分别为160ul和40ul，样本用量为2ul。
本发明采用终点法进行测定：160ul R1加入2ul样本，于37℃5min后加入40ul试剂R2，即开始读点，反应5min后再次读点，得到吸光度差值。
制作本发明的标准曲线：采用本发明的标准品(选择6点校准，校准品胱抑素C含量分别为0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/ml)，使用迈瑞BS300全自动生化仪，检测主波长为546nm，副波长为660nm；
按照上述测定步骤测得本发明胱抑素C标准品的标准曲线(如图1所示)。图1中曲线上的每个点代表一个含量的标准品。其中x轴表示胱抑素C的含量，y轴表示吸光度。
实施例3准确性、精密度测定
利用中国九强公司提供的质控品，选取了两个浓度(较低和较高浓度)，用本发明的试剂盒进行测定，结果如下表。
表1
Figure BSA00000384790500051
相关性实验：使用本发明的试剂和对照试剂(某国际知名公司胱抑素C试剂盒)。采用迈瑞BS300全自动生化分析仪对30份人血清进行测定，对测定值进行相关性分析。测定结果见图2，图中的X、Y轴均为测定值(胱抑素C含量mg/L)。
精密度测定：随机抽取一个正常血清样本和肾病病人血清样本连续进行20次测定，按照CV(％)＝SD/Mean×100进行计算。
表2
  测定   血清样本1   血清样本2
  1   0.78   1.95
  2   0.82   1.97
  3   0.83   1.94
  4   0.85   2.01
  5   0.77   1.99
  6   0.79   1.98
  7   0.79   1.97
  8   0.81   1.96
  9   0.82   1.96
  10   0.79   1.93
  11   0.81   1.97
  12   0.81   2.02
  13   0.78   1.96
  14   0.81   1.95
  15   0.78   1.99
  16   0.79   1.98
  17   0.79   1.96
  18   0.8   1.98
  19   0.8   1.95
  20   0.82   1.95
  MIN   0.77   1.93
  MAX   0.85   2.02
  RANGE   0.08   0.09
  SD   0.020   0.023
  MEAN   0.80   1.97
  CV(％)   2.48   1.15
结果显示本发明的试剂盒具有良好的特异性，准确性和精密度。
实施例4 灵敏度实验：
检测20次水和0.7mg/L的样本，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差，测定的灵敏度实验数据如表3所示。
下表中，ΔA表示吸光度的差值。
表3
Figure BSA00000384790500061
  7   15   1236
  8   27   1255
  9   29   1244
  10   24   1236
  11   35   1247
  12   33   1210
  13   30   1213
  14   19   1249
  15   20   1287
  16   19   1264
  17   25   1255
  18   32   1246
  19   36   1203
  20   38   1244
  均值   26.35   1232.15
  SD   6.998   26.360
本发明试剂的灵敏度＝0.70*47.344/1232＝0.027mg/L
最低检测限(LLD)＝26.35+3*6.998＝47.344
实施例5 稳定性实验
将实施例1中制备的本发明试剂和对照试剂(某国际知名公司胱抑素C试剂盒，胶体金颗粒直径约70nm)，分别进行了开瓶实验，对试剂盒的稳定性进行了检测。数据结果如表4和表5所示。
表4
Figure BSA00000384790500071
Figure BSA00000384790500081
表5
Figure BSA00000384790500082
结果显示本发明的稳定性高于对照试剂的稳定性，可见本发明实现了稳定性提高的效果。

Claims (5)

1.一种小粒径匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其用于测定胱抑素C的含量。
2.根据权利要求1记载的小粒径匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其特征在于，它是基于免疫胶体金法定量检测样本中胱抑素C含量的试剂盒。
3.根据权利要求1记载的小粒径匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其特征在于，其中胶体金颗粒直径为26-32nm。
4.根据权利要求1记载的小粒径匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒性能比国际上知名的匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒较优。
5.根据权利要求4记载的小粒径匀相溶胶颗粒型免疫测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒的优异性能包括但不限于试剂盒的稳定性等。
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