CN104007259A - 胱抑素c检测试剂盒及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种胱抑素C检测试剂盒,所述试剂盒基于胶体金免疫比浊法,包括试剂R2,所述试剂R2为含有标记了胱抑素C抗体的金纳米颗粒的溶液,其特征在于,所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm,所述金纳米颗粒和抗体质量比为50:20–60。还本发明还提供该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒具有灵敏度高,特异性强,反应迅速,稳定性好的特点,反应后不产生沉淀,便于生化仪的清洗,延长了生化仪的使用寿命。
Description
技术领域
本申请涉及一种基于胶体金免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒及其制备。
背景技术
1983年首次在鸡蛋清中分离纯化得到高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,后被命名为胱抑素C,它是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂,也被称为γ-微量蛋白或γ-后球蛋白,广泛存在于各种组织的细胞内和体液中,是一种碱性的低分子量的非糖基化蛋白质,分子量为13.3kD,由122个氨基酸残基组成,可由所有有核细胞产生,产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除,是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物,并在近曲小管重吸收,但重吸收后被完全代谢分解,不返回血液,因此,其血中浓度同肾小球滤过决定,而不依赖任何外来因素,如性别、年龄、饮食的影响,是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物。
胱抑素C的常用检测有免疫比浊法和酶联免疫吸附法等。由于酶联免疫吸附法检测耗时且操作复杂,已经不能满足大型医院快速定量检测的要求,而免疫比浊法随着全自动生化仪的普及,已经发展出来多种快速免疫比浊检测技术。
乳胶增强免疫透射比浊法的基本原理是,首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上,当遇到相应的抗原时,抗原抗体结合而出现乳胶凝集。单个乳胶颗粒的大小在入射波长之内,光线可透过,当两个以上的乳胶颗粒凝集时,可阻碍光线透过,使得透射光减少,其减少程度与抗原的量成正比。此法提高了检测的灵敏度和准确度,得到了广泛的应用。然而,乳胶增强免疫比浊法反应后会产生沉淀,不利于生化仪的清洗,干扰试验结果,且乳胶制造成本较高,导致免疫比浊试剂盒价格和检测成本偏高。因此又出现了纳米颗粒增强的免疫比浊法,如专利CN101680890便公开了一种通过比浊法测量人抑半肮氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法和试剂组合,以及中国专利CN101819208中公开了一种利用微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒。专利CN101680890中具体公开了,表面修饰了抗体的由聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1,1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙稀酸酯、聚乙烯萘以及它们相应的共聚物制成的粒径在80-105nm的有机高分子胶体纳米颗粒。
本发明研究表明,许多纳米颗粒此范围之内并不满足试验的要求,比如:氧化铁等磁性纳米颗粒在40nm以上时由于顺磁性和比重等因素而容易聚沉无法达到应有的稳定性;金纳米颗粒在粒径80-150nm的范围内稳定性太差而不合适等。根据中国专利CN102749454的教导,本发明以直径为35nm-60nm的胶体金颗粒进行试验,发现,灵敏度较差,无法满足临床中对灵敏度小于1ng/mL的要求,和最低检测限5ng/mL的要求,且线性范围不覆盖临床中正常生理和病理情况的浓度区间,因此常常造成假阴性的结果;同时还存在反应时间长(平衡时间5-10min),无法达到快速检验的要求。
发明内容
为了克服现有技术存在的错误教导,解决现有技术中存在的上述缺陷,本发明提供一种基于胶体金免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒。该试剂盒线性范围宽、灵敏度高,制造成本低,反应后不产生沉淀,方便生化仪清洗。
根据本发明的一方面,提供一种基于胶体金免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒,该试剂盒包括试剂R2,所述试剂R2为含有标记了胱抑素C抗体的金纳米颗粒的溶液,所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm,优选67.2nm-72.4nm;所述金纳米颗粒和抗体质量比在50:20–60,优选50:40-60。
具体来讲,所述试剂R2为PH值5.0-9.5,优选6.0-8.5的溶液。
进一步地,所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油,其中,促凝剂为重量体积比0.4%以内的PEG20000,稳定剂为重量体积比2%以内的BSA,蔗糖的重量体积比为20%以下,甘油的重量体积比为20%以下。
作为优选,上述R2为含有粒径为72.4±1.5nm且标记了胱抑素C的金纳米颗粒、重量体积比20%蔗糖、重量体积比0.2%PEG20000、重量体积比0.5%BSA和重量体积比5%甘油的,pH7.2的磷酸盐缓冲液,其中,金纳米颗粒和抗体的重量比为50:40-60。
更进一步地,所述基于胶体金免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒还包括起缓冲和稳定作用的试剂R1,所述试剂R1为含有重量体积比0.2%BSA、重量体积比0.1%的NaN3和重量体积比0.05%Tween20的,pH7.2的磷酸盐缓冲液。在本发明的试剂盒中,发明点主要在试剂R2,试剂R1也可以使用现有免疫比浊法中检测试剂盒的试剂R1。
上述试剂R2通过如下方法制备:
制备金纳米颗粒;
将抗体偶联到金纳米颗粒,得偶联抗体的纳米金颗粒溶液;
偶联抗体的纳米金颗粒溶液中加入稳定剂和促凝剂;
2800rpm离心2小时;
离心沉淀用含重量体积比20%蔗糖、重量体积比0.2%PEG20000、重量体积比0.5%BSA和重量体积比5%甘油,pH值7.2的磷酸盐缓冲液重悬,调整浓度至OD540nm为0.2。
抗体的活性容易受到蛋白酶的分解、高温变性、渗透压等影响,可加入稳定剂来稳定抗体的结构和活性。所述稳定剂可以是蛋白质、PEG、糖和可溶性的碱金属和碱土金属的无机盐中的一种或多种;其中,所述蛋白质优选牛血清白蛋白(BSA)或明胶;所述糖可以是单糖、二糖或者多糖,其中,单糖优选甘露糖、半乳糖和/或葡萄糖;二糖优选乳糖和/或蔗糖;多糖优选海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一种或多种;所述无机盐优选卤素碱金属和碱土金属的无机盐,更优选氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或多种。
本发明的试剂盒中,试剂R2还可以加入促凝剂,以增加抗原抗体反应速率。
本发明所提供试剂盒中R2可以是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种缓冲液体系;优选磷酸盐缓冲液体系。
本发明至少实现了如下有益效果:
本发明试剂盒具有灵敏度高,特异性强,稳定性好的特点,反应时间短,显色反应时间小于30s,平衡时间小于2min,可用于检测血清或血浆中胱抑素C含量,适用于临床全自动生化分析仪。本发明试剂盒检测胱抑素C的灵敏度可以达到0.002mg/L,检测线性范围达0~8.0mg/L。
本发明试剂盒反应后不产生沉淀,便于生化仪的清洗,延长了生化仪的使用寿命。
本发明的试剂盒采用胶体金标记抗体,降低了胶体金免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒的制造成本,具有较大的市场竞争力。
附图说明
图1:本发明实施例1-7检测的标准曲线。
图2:本发明实施例9-15检测的标准曲线。
具体实施方式
以下,将详细说明本发明的具体实施例,以便本领域技术人员能够更详细地理解本发明。
金纳米颗粒以类似胶体状态存在,又称胶体金。
本发明所提供基于胶体金免疫比浊法的胱抑素C检测试剂盒中,试剂R1可以使用现有技术中免疫比浊法检测试剂盒中的试剂R1,即已有的商用品。具体来讲,试剂R1可以是含有0.2%BSA(w/v)作为稳定剂、0.1%NaN3(w/v)作为防腐剂和0.05%Tween20(w/v)作为促凝剂的,50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2),是一种促使抗原位点暴露促进抗原抗体反应的缓存液。
以下各实施例仅制备试剂R2。
实施例1
本实施例试剂R2的制备分为三步,首先制备胶体金溶液,然后将抗体偶联到金纳米颗粒上,最后和缓冲盐、促凝剂和防腐剂等混溶成完整的体系。
具体过程如下:
1)50nm的胶体金的制备按如下步骤:
在清洗干净的1000ml圆底烧瓶中放入磁力搅拌子1枚,加入500ml超纯水;
加入5ml浓度为1%(w/v)氯金酸,600rpm左右高速搅拌,并加热至溶液沸腾,然后迅速将6ml浓度为1%(w/v)柠檬酸钠溶液快速加入到烧瓶中,保持加热和剧烈搅拌10min,溶液颜色先变黑色,然后逐渐变紫红色;
关闭加热开关并继续搅拌10min,然后停止搅拌冷却至室温,用超纯水恢复到原体积500ml;
使用透射电镜观察制得的胶体金颗粒的大小,对1000粒进行统计后直径约为50.4±1.2nm,超滤除掉小分子后备用。
2)将抗体偶联到金纳米颗粒上,具体过程如下:
将待标记的抗体移入透析袋内,在10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中透析,以除去抗体溶液中的其他小分子物质;
透析后的抗体转移到离心管内,15000rpm离心60min,收集上清;
在紫外-可见分光度计上测量溶液OD260nm吸收值,计算出溶液中抗体的浓度,并用10mM磷酸盐缓冲液将抗体稀释至1mg/ml(w/v);
取10支1.5毫升的离心管,加入1毫升制备好的胶体金溶液;
用10%的碳酸钾溶液将离心管内的胶体金溶液调至pH9;
将1、2、4、8、10、20、40、60、80、100ul的抗体分别加到上述10支离心管中,震荡30分钟,此时每支试管中金纳米颗粒和抗体的质量比分别为50:1、50:2、50:4、50:8、50:10、50:20、50:40、50:60、50:80、50:100;
向上述溶液中加入100ul浓度为10%的NaCl溶液,混匀,静置2h后观察各管,发现在金纳米颗粒和抗体的质量比达到50:100时,有颜色改变和少量的沉淀析出,这表明当比例达50:100时,是标记蛋白的最大需求量,金纳米颗粒和抗体的质量比小于50:100无颜色改变和无沉淀析出,;
根据以上结果,将500ml胶体金溶液加入三角瓶中,边搅拌边用10%的碳酸钾调整溶液的pH值至9;
将小于50ml的抗体加入到上述溶液中,继续搅拌30分钟,在此过程中抗体同纳米颗粒在库仑力和范德华力的作用下,突破胶体颗粒表面的水化层实现接触,在静电力和范德瓦尔德力的相互作用,胶体颗粒同蛋白质分子实现偶联;
3)试剂R2的配制按如下步骤进行:
在偶联后的胶体金溶液中加入一定量的BSA作为稳定剂,终浓度为1%(w/v),搅拌5min使之完全溶解;
在上述溶液中加入一定量的PEG20000,终浓度为0.2%(w/v),搅拌10分钟;
将上述溶液移至离心管中,用2800rpm离心2h,弃上清,保留沉淀;
用浓度为20%蔗糖作为稳定剂、0.2%PEG20000作为促凝剂、0.5%BSA作为稳定剂、和5%甘油作为稳定剂的10mmol的磷酸盐缓冲液(pH7.2)重悬沉淀物,调整浓度至OD540nm为0.2;
得到R2溶液,分装备用。
实施例2
实施例2与实施例1的差别仅在于,通过调整所加入还原剂的量,使得实施例2制备的胶体金颗粒粒径为55nm。
制备55nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为5.6ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒,直径约为56.2±1.5nm。
实施例3
实施例3与实施例1的差别仅在于,通过调整所加入还原剂的量,使得实施例3制备的胶体金颗粒粒径为62.2nm。
制备62.2nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为5.4ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒,直径约为62.2±1.1nm。
实施例4
实施例4与实施例1的差别仅在于,通过调整所加入还原剂的量,使得实施例4制备的胶体金颗粒粒径为67nm。
制备67nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为5.2ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒,直径约为67.2±1.5nm。
实施例5
实施例5与实施例1的差别仅在于,通过调整所加入还原剂的量,使得实施例5制备的胶体金颗粒粒径为72nm。
制备72nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为5.1ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒,直径约为72.4±1.5nm。
实施例6
实施例6与实施例1的差别仅在于,通过调整所加入还原剂的量,使得实施例6制备的胶体金颗粒粒径为79nm。
制备79nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为4.9ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒,直径约为79.1±1.6nm。
实施例7
实施例7与实施例1的差别仅在于,通过调整所加入还原剂的量,使得实施例7制备的胶体金颗粒粒径为83nm。
制备83nm颗粒加入还原剂1%柠檬酸钠为4.7ml。透射电镜观察制得的胶体金颗粒,直径约为83.5±1.6nm。
实施例8
基于胶体金免疫比浊的胱抑素C检测试剂盒的临床使用效果测定:
(1)本发明试剂盒的测试条件及参数如下
a)测定步骤:先加入240ul试剂R1,然后加入3ul样本,37℃孵育5min后加入60ul试剂R2,在540nm波长测量吸光度,三秒后读取第一点数据,反应5分钟后读取另一点,得到吸光度值的差值。
b)计算方法:6点定标法,以样条函数为计算模式。根据吸光度与参考血清的值做工作曲线,样品含量可根据其吸光度值在工作曲线上算出。
(2)检测标准曲线
通过本发明的方法,采用日立7180型自动分析仪检测6种不同含量的胱抑素C参考品,根据结果做标准曲线,X轴表示胱抑素C的含量,Y轴表示吸光度差值。
(3)通过上述的方法对上述实施例中制备的7个试剂盒测定标准曲线,分析最优粒径。结果如下:
金纳米颗粒大小为50.4nm时,y=-0.0012x+1.5876,R2=0.3735;
金纳米颗粒大小为56.2nm时,y=-0.0058x+1.6005,R2=0.9316;
金纳米颗粒大小为62.2nm时,y=-0.1228x+1.5824,R2=0.9838;
金纳米颗粒大小为67.2nm时,y=-0.1229x+1.5839,R2=0.982;
金纳米颗粒大小为72.4nm时,y=-0.1359x+1.6044,R2=0.9892;
金纳米颗粒大小为79.1nm时,y=-0.1283x+1.4942,R2=0.9423;
金纳米颗粒大小为83.5nm时,y=-0.1107x+1.0179,R2=0.3897。
(4)对上述结果,进行灵敏度、线性相关系数、线性范围和稳定性分析。
灵敏度定义为测试体系对不同浓度的标准样品测试值的差异,差异越大表明约灵敏,没有差异则表明体系过于稳定,不能引起比浊改变。灵敏度可以通过拟合后的标准曲线的斜率的绝对值表征。
线性相关系数即相关性方程的R值,表明试验测试结果和拟合曲线的重合度,R值越高,表明线性越好。
线性范围即测试对应的结果中呈线性关系的区间,线性范围宽有利于测试更大范围浓度的样品。
稳定性是指在该体系中胶体金稳定存在、不发生团聚或沉淀的程度,一般来讲颗粒越大越容易聚沉,引起浊度的改变,颗粒越小越稳定,对待测试剂浓度变化不敏感,即灵敏度差。将待测试剂放置在40℃的环境中,以稳定性时间的时间长短来表示稳定性的好坏,测试时间是12月。
通过上述四个参数的对比,我们可以从中选出最适合的粒径范围,将各种金颗粒尺寸条件下的结果汇总于表1。
表1
综合比较以上结果,可发现,粒径大于等于62.2nm的纳米颗粒,灵敏度才能达到要求,可以选择62.2nm-79.1nm胶体金纳米颗粒,而大于83.5nm的胶体金颗粒由于太大,稳定性较差。
实施例9
试剂R2的制备过程参照实施例1。根据实施例8的测试结果,选择具有较优性质的72.4nm的胶体金纳米颗粒作为本体系,改变胶体表面偶联的抗体量。将抗体偶联到直径约为72.4±1.5nm金纳米颗粒上,金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50:100。
实施例10
与实施例9的差别在于,金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50:80。
实施例11
与实施例9的差别在于,金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50:60。
实施例12
与实施例9的差别在于,金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50:40。
实施例13
与实施例9的差别在于,金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50:20。
实施例14
与实施例9的差别在于,金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50:10。
实施例15
与实施例9的差别在于,金纳米颗粒和抗体的浓度(w/v)比为50:1。
实施例16
采用实施例8中的方法,对实施例9至15中制备的试剂盒进行分析比较。测试结果如下。
金颗粒的量:抗体的量为50:1时,y=-0.00029x+1.58252,R2=0.31624
金颗粒的量:抗体的量为50:10时,y=-0.007x+1.5986,R2=0.4516
金颗粒的量:抗体的量为50:20时,y=-0.0555x+1.5943,R2=0.9618
金颗粒的量:抗体的量为50:40时,y=-0.1348x+1.5737,R2=0.9302
金颗粒的量:抗体的量为50:60时,y=-0.1327x+1.4899,R2=0.9134
金颗粒的量:抗体的量为50:80时,y=-0.1233x+1.1525,R2=0.5216
金颗粒的量:抗体的量为50:100时,y=-0.0999x+0.965,R2=0.3345
将上述七种试剂盒结果汇总比较到表2:
表2
综合以上结果,金纳米颗粒和抗体浓度之比在50:20-60之间时灵敏度高、线性关系好,同时线性范围广以及稳定性较好,可以选择,更优选是50:40-60。
实施例17
通过实施例8和实施例16,我们已经优化出了试剂盒R2的最佳条件,现在对R2中稳定剂、促凝剂的条件进行优化。
选用金纳米颗粒为72.4±1.5nm,金纳米颗粒和抗体的比例在50:60,试剂R2选择为磷酸盐缓冲液溶液,分别选择pH4.0、5.0、6.0、7.2、8.5、9.5、10.0七个点,表3为三个条件下灵敏度、线性相关系数、线性范围和稳定性试验结果。
表3
从上表中得数据可以看出,在pH为4.0和10.0时,该试剂盒无论在灵敏度、线性相关系数、线性范围还是稳定性上都不满足试验室的要求,因此pH的边界范围是5.0-9.5,其中在6.0-8.5范围内灵敏度、线性相关系数、线性范围和稳定性试验结果最好,且数值相近,表明该范围内pH影响不显著。
同上,选择金纳米颗粒为72.4±1.5nm,金纳米颗粒和抗体的比例在50:60,促凝剂选择PEG20000,浓度的范围为0~0.4%(w/v),选择0、0.1%、0.2%和0.4%4个水平,见表4。
表4
从上表中得数据可以看出,在凝剂选择PEG20000在0~0.4%(w/v)范围内灵敏度、线性相关系数、线性范围和稳定性试验结果相近,表且在0.2%最优。
同上,选择金纳米颗粒为72.4±1.5nm,金纳米颗粒和抗体的比例在50:60,稳定剂选择BSA、蔗糖和甘油,其中BSA浓度分别选择0、0.5%、和1%和2%4个水平;蔗糖选择0、5%、10%和20%4个水平;甘油选择0、5%、10%和20%4个水平;对以上进行3因素和4水平的正交试验,建立L16(45)正交表,进行16次试验,从中选出最优条件,见表5和表6。
表5:稳定剂的3因素和4水平表
表6:正交试验方案及正交试验结果
通过以上的正交试验,最佳的灵敏度和精密度以及线性范围出现在,金纳米颗粒为72.4±1.5nm,金纳米颗粒和抗体的比例在50:40-60,10mmol的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中含有20%蔗糖作为稳定剂、0.2%PEG20000作为促凝剂、0.5%BSA作为稳定剂和5%甘油作为稳定剂。
实施例18
试剂R2金纳米颗粒为72.4±1.5nm,金纳米颗粒和抗体的比例在50:60,10mmol的磷酸盐缓冲液(pH7.2)中含有20%蔗糖作为稳定剂、0.2%PEG20000作为促凝剂、0.5%BSA作为稳定剂和5%甘油作为稳定剂。
(1)灵敏度试验
上述试剂盒的最佳灵敏度达0.002mg/L。
(2)线性测定
取病人的异常高值血清1份(①)和正常人血清1份(⑤),取等体积的①和⑤混合构成③,取等体积的①和③混合构成②,取等体积的③和⑤混合构成④。测定①~⑤血清中胱抑素C的含量。测定结果表明,上述试剂盒血清稀释效应不明显,具有良好的线性。
(3)精密度试验
用检测蛋白定值质控、正常人混合血清和肾功异常病人混合血清一份,连续测定20天,每天测定三次,计算日内及日间精密度。测定结果表明定值质控的平均值为1.2mg/L,其日内不精密度为2.0%,日间不精密度为1.8%。正常人混合血清的平均值为2.2mg/L,日内不精密度为3.1%,日间不精密度为2.7%。肾功异常病人血清的平均值为6.7mg/L,日内不精密度为1.7%,日间不精密度为0.9%。这些测定结果表明此试剂盒的精密度可满足临床要求。
(4)干扰试验
在正常人血清中各自添加一定量的胆红素、牛血红蛋白、脂肪乳剂和类风湿因子,使其达到表7中所示的浓度,同时加入同等体积的去离子水作为无干扰物血清,同时测定这些标本的浓度,结果见表7。表7的结果表明以干扰程度为10%作为该测定系统对干扰物的最高忍受限,血清中抗坏血酸在4.5g/L,胆红素在500M以下,血红蛋白在5g/L以下,脂肪乳剂在0.3%以下,肝素钠在62.5U/ml以下,类风湿因子在100IU/mL以下,不影响测定,结果见表7。
表7
尽管已参照优选实施例表示和描述了本发明,但本领域技术人员应该理解,在不脱离由权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下,可以对这些实施例进行各种修改和变换。
Claims (10)
1.一种胱抑素C检测试剂盒,所述试剂盒基于胶体金免疫比浊法,包括试剂R2,所述试剂R2为含有标记了胱抑素C抗体的金纳米颗粒的溶液,其特征在于,所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm,所述金纳米颗粒和抗体质量比为50:20–60。
2.权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述金纳米颗粒的粒径为67.2nm-72.4nm。
3.权利要求1所述试剂盒,其特征在于,所述金纳米颗粒和抗体质量比为50:40-60。
4.权利要求2或3任意一项所述试剂盒,其特征在于,所述试剂R2为PH值5.0-9.5的溶液。
5.权利要求4所述试剂盒,其特征在于,所述试剂R2为PH值6.0-8.5的溶液。
6.权利要求5所述试剂盒,其特征在于,所述试剂R2还含有促凝剂、稳定剂、蔗糖和甘油,其中,所述稳定剂为蛋白质、PEG、糖和可溶性的碱金属和碱土金属的无机盐中的一种或多种;所述蛋白质为牛血清白蛋白或明胶;所述糖为单糖、二糖或者多糖;所述无机盐为卤素碱金属和碱土金属的无机盐;试剂R2为是磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种的组合。
7.权利要求6所述试剂盒,其特征在于,所述促凝剂为重量体积比0.4%以内的PEG20000,所述稳定剂为重量体积比2%以内的牛血清白蛋白,所述蔗糖的重量体积比为20%以下,所述甘油的重量体积比为20%以下。
8.权利要求7所述试剂盒,其特征在于,所述试剂R2为含有粒径为72.4±1.5nm且标记了胱抑素C抗体的金纳米颗粒、重量体积比20%蔗糖、重量体积比0.2%PEG20000、重量体积比0.5%BSA和重量体积比5%甘油,pH7.2的磷酸盐缓冲液,其中,金纳米颗粒和抗体的重量比为50:40-60。
9.权利要求7所述试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括试剂R1,所述试剂R1为含有重量体积比0.2%BSA、重量体积比0.1%的NaN3和重量体积比0.05%Tween20的,pH7.2的磷酸盐缓冲液。
10.制备权利要求1-9任意一项所述试剂盒的方法,其特征在于,所述 方法包括:
制备金纳米颗粒;
将抗体偶联到金纳米颗粒,得偶联抗体的纳米金颗粒溶液;
偶联抗体的纳米金颗粒溶液中加入稳定剂和促凝剂;
2800rpm离心2小时;
离心沉淀用含重量体积比20%蔗糖、重量体积比0.2%PEG20000、重量体积比0.5%BSA和重量体积比5%甘油,pH值7.2的磷酸盐缓冲液重悬,调整浓度至OD540nm为0.2。
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