CN112553322B - 一种骨质疏松诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种骨质疏松诊断标志物及其应用。所述骨质疏松诊断标志物为长链非编码RNA SCARNA10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述长链非编码RNA SCARNA10在骨质疏松患者骨组织和正常人骨组织中均有表达，但是在骨质疏松患者骨质中的表达水平显著低于正常人，且表达差异具有统计学意义，能够作为骨质疏松诊断标志物。含有扩增长链非编码RNA SCARNA10的引物对的试剂盒，通过检测lncRNA SCARNA10的表达量，能够高灵敏度、高特异性地对患者进行诊断和预后追踪，有利于提高骨质疏松的诊断率和生存率，具有较高的临床应用价值。

Description

一种骨质疏松诊断标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种骨质疏松诊断标志物及其应用。

背景技术

骨质疏松症是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征，导致骨脆性增加和易发生骨折的一种复杂的、多因素的全身性慢性骨骼疾病。随着老龄化现象的加剧，骨质疏松症的发病人数逐年增加，这给患者带来了全身骨痛、骨折、身高变矮等痛苦和危害，同时也给社会和家庭带来沉重的经济和生活负担。

骨质疏松症早期发病隐匿，临床表现不典型，要依赖影像学检查和辅助血清/尿液生物化学指标检查才能发现，并且存在一定局限性，进而导致骨质疏松症初期诊断率并不高。如果不加以重视，反复骨折会导致致残、致死的严重后果。因此，早期发现骨质疏松的高危人群，并进行干预处理、防止骨质疏松症发生，从而预防骨折，是提高老年人群健康水平及生活质量，降低老年人死亡率的重要措施之一。

人类的基因中仅有2％的基因编码蛋白质，大部分基因转录形成非编码的RNA(ncRNA)。其中，长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸、缺少特异完整开放阅读框、无蛋白质编码功能的RNA。lncRNA参与了基因组印记、转录控制、转录后调控、蛋白功能调节等信号转导过程中的重要环节。

研究表明，lncRNA与人类疾病的发生发展和防治有密切关联，例如免疫系统疾病、心血管疾病和肿瘤等。lncRNA参与了成骨细胞的分化，在骨质疏松症中扮演着重要角色。然而，目前对骨质疏松症lncRNA的表达谱特征及生物学功能的研究却鲜有报道。

因此，利用高通量测序技术从lncRNA层面对骨质疏松症进行深入剖析，为临床上骨质疏松的早期诊断提供特异性标志物，将为疾病的分子诊断提供强有力的科研支持。对于本领域而言，寻找高灵敏度和高特异性的骨质疏松诊断分子标记物对提高骨质疏松的诊断率和生存率，有重大的临床意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种骨质疏松诊断标志物，所述骨质疏松诊断标志物为开发无创预测和诊断方法提供基础科学依据，也为寻找骨质疏松的治疗靶点提供了新的思路。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种骨质疏松诊断标志物，所述骨质疏松诊断标志物为长链非编码RNA SCARNA10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中，lncRNA SCARNA10用于作为骨质疏松诊断标志物的用途，其核酸序列(SEQ ID NO.1)为：

GGACCTTTGGCCTGTTAAAGGTCTGTAATCTTGGTGGGCGATACAGAGTTATGTGTGTTCACTGTAAGGGCAGACCAACAAGAACTTTTTCCTACTTTTGAGCTACCTCTTTTTAATAGGGGTGATTCTTCCAGTTGCTGGAGAGAAATTGTGGTAACTGGAGTGAGAGAGTAGGAACAGGGCATGTTCAGGGTATCAGGGCCAAGGGTCCTAAAGGACTTAGCTTGTGTTATGGCCACTGAGAGATG。

在骨质疏松症中，某些特定的lncRNA的表达水平会发生改变，这种表达水平的变化能够作为骨质疏松筛查的标志物，长链非编码RNA调控机制是骨质疏松发病机理研究中的一个新领域。

本发明中，lncRNA SCARNA10可作为一种骨质疏松诊断标志物，其表达量与成骨相关基因的表达量密切相关。因此，将其作为诊断标志物，能够准确的预测或者诊断骨质疏松症。同时，所述lncRNA SCARNA10在人和鼠中具有同源性，对进一步开发研究骨质疏松治疗、诊断和预后等试剂和方法提供了基础。

本发明通过高通量测序，对绝经后骨质疏松症患者中成骨细胞形成和破骨细胞吸收稳态中lncRNA的调控机制进行研究，比较骨质疏松症患者和年龄性别相当的正常人群中差异表达的lncRNA，进一步明确显著差异表达的lncRNA在骨质疏松形成过程中的调控机制，靶向基因，分析lncRNA调控的靶基因的生物学功能及其重要性，深入探索骨质疏松症的致病机制，为开发无创预测、诊断型生物标志物及新的治疗靶点提供基础科学依据。

第二方面，本发明提供一种骨质疏松诊断试剂盒，所述骨质疏松诊断试剂盒中包含扩增长链非编码RNA SCARNA10的引物对。

作为本发明优选的技术方案，所述引物对的上游引物包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

优选地，所述引物对的下游引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO.2为：GGTCTGTAATCTTGGTGGGCG

SEQ ID NO.3为：AGGACCCTTGGCCCTGATAC。

作为本发明优选的技术方案，所述骨质疏松诊断试剂盒中还包括荧光探针。

优选地，所述骨质疏松诊断试剂盒中还包括阳性对照和/或阴性对照。

第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体上含有如第一方面所述的骨质疏松诊断标志物。

第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞中含有至少一个如第三方面所述的表达载体。

优选地，所述重组细胞包括MC3T3-E1细胞、人源BMSC细胞(人骨髓间充质干细胞)或大鼠BMSC细胞中的任意一种。

第五方面，本发明提供一种成骨相关基因表达促进剂，所述成骨相关基因表达促进剂为长链非编码RNA SCARNA10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明优选的技术方案，所述成骨相关基因包括Runx2、OCN、OPN、COL-1或ALP中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供一种wnt通路调节剂，所述wnt通路调节剂为长链非编码RNASCARNA10，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

通过在h-BMSC和MC3T3-E1两种细胞过表达SCARNA10后的qPCR检测成骨相关基因表达发现，过表达SCARNA10后能促进成骨相关基因表达并且这种促进作用可能是通过调控wnt5a-CK1D进而激活wnt信号通路实现。其具体作用机制需要进行RNA-RIP验证SCARNA具体结合的靶分子。

综上，可推测出SCARNA10可能通过调控wnt5a进而促进成骨相关基因的表达从而促进成骨。

第七方面，本发明还提供如第一方面所述的骨质疏松诊断标志物在制备诊断骨质疏松的试剂盒或治疗骨质疏松的药物中的应用。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供的长链非编码RNA SCARNA10可用作骨质疏松诊断标志物，达到骨质疏松早诊断、早治疗的用途，lncRNA SCARNA10在骨质疏松患者骨组织和正常人骨组织中均有表达，且在骨质疏松患者骨质中的表达水平显著低于正常人，同时在骨质疏松外周血中lncRNA SCARNA10含量显著低于正常骨量对照组，差异具有统计学意义，提示lncRNASCARNA10作为骨质疏松诊断标志物的可行性；

(2)本发明提供的骨质疏松诊断试剂盒，用于扩增lncRNA SCARNA10，通过检测lncRNA SCARNA10的表达量，高灵敏度、高特异性、快速、准确且无创的对患者进行诊断和预后追踪，有利于提高骨质疏松的诊断率和生存率，具有较高的临床应用价值。

附图说明

图1为实施例2中SCARNA10在骨质疏松骨组织和正常骨组织的表达量对比图。

图2(A)为实施例2中使用钙茜素红染色后过表达SCARNA10的BMSC细胞的显微图。

图2(B)为实施例2中使用钙茜素红染色后转染空白质粒的细胞的显微图。

图2(C)为实施例2中使用钙茜素红染色后对照细胞的显微图。

图3为实施例2不同h-BMSC细胞中成骨相关基因Runx2、OCN和OPN的表达量柱状图。

图4为实施例2不同MC3T3-E1细胞中成骨相关基因Runx2、OCN、OPN、COL-1、COL-2和ALP的表达量柱状图。

图5(A)为实施例3中卵巢切除一个月的Balb/C小鼠和正常小鼠外周血中SCARNA10表达量柱状图。

图5(B)为实施例3中卵巢切除一个月的Balb/C小鼠和正常小鼠骨组织中SCARNA10表达量柱状图。

图6(A)为实施例3中卵巢切除一个月Balb/C小鼠和正常小鼠股骨中成骨相关基因Runx2表达量柱状图。

图6(B)为实施例3中卵巢切除一个月Balb/C小鼠和正常小鼠股骨中成骨相关基因ALP表达量柱状图。

图6(C)为实施例3中卵巢切除一个月Balb/C小鼠和正常小鼠股骨中成骨相关基因OCN表达量柱状图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均可购自本领域常规试剂厂商，所用实验方法均为本领域技术人员熟知的常规技术方法和实验手段。

实施例1

本实施例提供一种lncRNA SCARNA10的筛选方法，具体分为三个阶段进行，包括：

(1)收集样品并进行高通量测序

收集150位45～70岁区间绝经妇女的血液样本，通过Dx双能射线检测骨密度(髋关节及腰椎)，T值≤-2.5归类为骨质疏松组，T值≥-1归类为骨量正常组，骨转换代谢指标P1NP，CTX值作为参考，得到60位骨质疏松症患者血液样本和90位正常女性的血液样本；

收集血液样本，分离从下层的血细胞中分离出外周血单核细胞(peripheralblood monouclear cell，PBMCs)，提取总RNA，去除核糖体RNA；

得到的RNA随机打断成为短片段，再以打断后的RNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链；

经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，然后通过UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二条链，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增；

建好的150bp PE文库在BGISEQ500上进行高通量测序；

(2)数据过滤、样本定量、计算差异表达及差异lncRNA的靶基因预测

对下机数据去除杂质，去除rRNA得到clean data，然后利用clean data构建转录本、non-coding RNA库注释、蛋白库比对、CPC(Coding Potential Calculator)预测、表达量统计等；最后，结合样本的临床信息找出患者和对照样本中表达显著差异的lncRNA，并对其进行功能分析；

具体步骤如下：

将下机数据通过SOAP(参数：-m 0-x 1000-s 28-l 32-v 5-r 2)与核糖体数据库比对，去除序列中核糖体RNA数据；

然后，去除接头污染、低质量reads(质量值Q≤5的碱基数占整条read的10％以上)、含N碱基reads，得到clean data，每个样本产生不少于6G clean data；

将每个样本的clean data通过hisat2比对回hg19(参数：--phred64--sensitive--no-discordant--no-mixed-I 1-X 1000-N 1)，然后对得到的bam文件通过htseq-count(参数：-r name-s no-a 10-m union)计算每个转录本和基因的raw readcount；

过滤掉80％样本中read count≥0的基因，然后同时采用DESeq2、EdgeR和limma计算骨质疏松组和骨量正常组的组间差异基因；

另外，将clean data通过bowtie2(参数：-q--phred64--sensitive--dpad 0--gbar99999999--mp 1,1--np 1--score-min L,0,-0.1-I 1-X 1000--no-mixed--no-discordant-p 4-k 200-N 1)比对到RNA序列上，通过rsem计算每个基因的TPM值和FPKM值；

通过DEGseq分别计算骨质疏松组和骨量正常组的组间差异；

使用RNAplex，来预测反义lncRNA与mRNA之间的互补结合，根据其热力学结构计算最小自由能来预测最佳碱基配对关系；

同时，计算每个lncRNA与mRNA的皮尔逊相关系数及其显著性水平，相关系数绝对值大于等于0.6且p-value值小于0.05的lncRNA-mRNA对判定为候选的lncRNA及其靶基因对；

另外，认为lncRNA的功能与其相邻的蛋白编码基因相关，位于编码蛋白上下游的lncRNA可能与启动子或者共表达基因的其他顺式作用元件有交集；

计算lncRNA与mRNA在染色体上的相对位置，mRNA上游10k和下游20k的lncRNA，存在可以作为lncRNA候选的靶基因；

通过上述筛选步骤，得到lncRNA SCARNA10为其中一种与骨质疏松相关的lncRNA。

实施例2

本实施例用于验证lncRNA SCARNA10与骨质疏松的相关性。

(1)qPCR验证

设计SCARNA10引物并合成，利用其扩增骨质疏松小鼠股骨(Femur)组织细胞中DNA，并以正常小鼠为对照组；

所得结果如图1所示，lncRNA SCARNA10在骨质疏松骨组织和正常骨组织中均有表达，且在骨质疏松患者骨组织中的表达水平均显著低于骨量正常组，差异具有统计学意义。

(2)细胞功能验证

1、将lncRNA SCARNA10构建至T载体后转入h-BMSC细胞中，转化后，挑取单克隆提取质粒，测序验证转化成功；

诱导培养转化后的h-BMSC成骨，并转染空白质粒和过表达SCARNA10质粒培养7天后，使用钙茜素红染色；

所得结果如图2(A)、图2(B)和图2(C)；

其中，图2(A)为过表达lncRNA SCARNA10的BMSC细胞，图2(B)为转染空白质粒细胞，图2(C)为对照细胞，说明过表达lncRNA SCARNA10对诱导细胞成骨有明显效果。

同时，通过高通量测序检测h-BMSC中过表达的基因；

结果如图3所示，由图可知，h-BMSC过表达后与成骨相关基因包括Runx2、OCN、OPN、wnt5a的表达量均明显上升。

2、将lncRNA SCARNA10构建至T载体后转入MC3T3-E1细胞中，转化后，挑取单克隆提取质粒，测序验证转化成功；

通过高通量测序检测MC3T3-E1中过表达的基因；

结果如图4所示，由图可知，MC3T3-E1过表达后与成骨相关基因包括Runx2、OCN、OPN、COL-1、ALP、wnt5a、的表达量均明显上升。

实施例3

本实施例中，以骨质疏松小鼠模型为基础研究SCARNA10和成骨相关基因的相关性。

1、检测卵巢切除一个月的Balb/C小鼠(OVX)和正常小鼠外周血和骨组织中SCARNA10的含量；

外周血中的检测结果如图5(A)所示，骨组织中的检测结果如图5(B)所示，由图可知，卵巢切除一个月的Balb/C小鼠其SCARNA10表达量明显降低；

2、检测卵巢切除一个月Balb/C小鼠和正常小鼠股骨中成骨相关基因表达量；

其中，图6(A)为Runx2的表达量，图6(B)为ALP的表达量，图6(C)为Runx2的表达量；

由图可知，卵巢切除一个月的Balb/C小鼠的成骨相关基因Runx2和ALP的表达量也明显降低；说明SCARNA10表达量降低会导致成骨相关基因表达量的降低。

综上所示，lncRNA SCARNA10与骨形成有关，能够诱导成骨相关基因的表达，在成骨过程中具有明显的作用；以lncRNA SCARNA10作为骨质疏松诊断标志物，能够准确的对患者的症状进行诊断。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市人民医院

<120> 一种骨质疏松诊断标志物及其应用

<130> 20201221

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 248

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ggacctttgg cctgttaaag gtctgtaatc ttggtgggcg atacagagtt atgtgtgttc 60

actgtaaggg cagaccaaca agaacttttt cctacttttg agctacctct ttttaatagg 120

ggtgattctt ccagttgctg gagagaaatt gtggtaactg gagtgagaga gtaggaacag 180

ggcatgttca gggtatcagg gccaagggtc ctaaaggact tagcttgtgt tatggccact 240

gagagatg 248

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggtctgtaat cttggtgggc g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aggacccttg gccctgatac 20

Claims (6)

1.定量检测长链非编码RNA SCARNA10表达水平的试剂在制备骨质疏松诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA SCARNA10的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨质疏松诊断试剂盒中包含扩增长链非编码RNA SCARNA10的引物对。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物对的上游引物包括如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物对的下游引物包括如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述骨质疏松诊断试剂盒中还包括荧光探针。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述骨质疏松诊断试剂盒中还包括阳性对照、阴性对照。

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