CN112877328B - 靶向atf5的小干扰rna及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种靶向ATF5的小干扰RNA序列，其正向引物序列如SEQ ID NO.24所示，其反向引物序列如SEQ ID NO.25所示。本发明还提供了上述的靶向ATF5的小干扰RNA序列在制备用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的药物中的用途。本发明提供了靶向ATF5的小干扰RNA，此小干扰RNA可以有效的降低ATF5基因的表达，从而用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病。

Description

靶向ATF5的小干扰RNA及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及线粒体未折叠蛋白反应中的转录因子ATF5，具体来说靶向ATF5的小干扰RNA及其用途。
背景技术
线粒体DNA3243A>G突变(以下简称mt.3243A>G突变)是最常见的一种单基因突变糖尿病，该疾病是由于编码线粒体亮氨酸tRNA基因——tRNALeu(UUR)发生突变、即线粒体DNA第3243位核苷酸序位发生A→G突变所致。
mt.3243A>G突变容易累及ATP阈值高的组织，主要临床特点表现为：40岁以前起病的早发糖尿病。患者多消瘦，病程中胰岛功能进行性衰退。超过75％患者有感觉神经性耳聋。其他临床症状包括线粒体脑肌病伴高乳酸血症和脑卒中样发作、视网膜色素变性、骨骼肌病、心肌疾病、肾病等，且病变呈母系遗传。该病在不同患者中的临床表现呈明显组织器官异质性，疾病严重程度不一，给临床防治带来巨大挑战。最近有研究发现mt.3243A>G突变和过早的骨老化相关，表现为骨重量降低，骨结构和力量受损。我们最近的研究也发现血液中mt.3243A>G的突变率越高，骨密度越低，这两者有密切的负相关性。
由于线粒体DNA突变的细胞杂胞质性(不同细胞之间线粒体DNA突变比例存在差异)，造成了多种临床表型的差异。以往研究表明高突变率会降低线粒体tRNALeu(UUR)的含量，降低其氨酰化，抑制转录后修饰。突变率高的细胞会造成蛋白合成及呼吸链受损。但由于致病机制不清楚，目前尚未找到治疗mt.3243A>G的特效药物。
研究表明，线粒体未折叠蛋白反应可以保护线粒体，使其减少突变蛋白造成的损伤。线粒体DNA缺失或者线粒体-核蛋白合成不平衡均会激活线粒体未折叠蛋白反应，造成线虫线粒体功能的提高和生存率的提升。值得注意的是，除了正面效应，在线粒体DNA缺失的线虫模型中，激活线粒体未折叠蛋白反应反而引发突变线粒体增加，造成线粒体功能紊乱的负面影响。提示，线粒体未折叠蛋白反应在线粒体DNA缺陷的发病机制中起到重要作用。其中，ATF5是一个线粒体未折叠蛋白反应中的转录因子，目标是和线粒体蛋白稳态相关的一系列蛋白。
小干扰RNA(siRNA)是RNA干扰发挥效应的必需因子，它可以干扰表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。
siRNA通常是一段21-23个碱基的双股RNA，其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸，每一股各有一个5'磷酸基末端与一个3'羟基末端。其作用机制是与含Argonauto蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体并被激活。在ATP功能情况下，激活的复合体将siRNA的双链分开，其中一条链去寻找互补的mRNA，然后对其进行切割。反义链先与同源mRNA配对结合，然后将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默。
ATF5是m.3243A>G突变治疗的潜在靶点，目前没有有效抑制ATF5基因表达的siRNA。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了靶向ATF5的小干扰RNA及其用途，所述的靶向ATF5的小干扰RNA及其用途要解决现有技术中没有合适的药物用于治疗线粒体DNA3243A>G突变引起的相关疾病的技术问题。
本发明提供了一种靶向ATF5的小干扰RNA序列，其正向引物序列如SEQ ID NO.24所示，其反向引物序列如SEQ ID NO.25所示。
进一步的，所述的靶向ATF5的小干扰RNA序列在制备用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的药物中的用途。
进一步的，所述的相关疾病为线粒体功能降低或者成骨能力的降低。
本发明通过自主设计SiRNA，能有效的敲低ATF5，从而抑制线粒体未折叠蛋白反应，增强线粒体功能，恢复成骨能力。
小干扰RNA(siRNA)是一种抵御外来基因和病毒感染的转录后基因调控方式，可以作为用于基因治疗及药物靶向研究的治疗方法。本发明提供了靶向ATF5的小干扰RNA，此小干扰RNA可以有效的降低ATF5基因的表达，从而用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明通过对线粒体m.3243A>G突变患者尿液干细胞中高突变细胞(突变率＞95％)和正常尿液干细胞的实验发现，本发明的siRNA可以显著降低ATF5的表达水平，在筛选或开发m.3243A>G突变相关疾病的药物上具有应用价值。
附图说明
图1显示了尿液干细胞提取过程。
图2显示了用4个siRNA序列分别对ATF5基因进行敲减后的ATF5的表达与未敲减前ATF5表达的比值图。
图3显示了不同突变率细胞的ROS。
图4显示了敲低ATF5后，不同突变率细胞的ROS。
图5显示了不同突变率细胞的膜电位。
图6显示了敲低ATF5后，不同突变率细胞的膜电位。
图7显示了ATF5相关的基因在不同突变率细胞的表达。其中，A显示了在高突变细胞中，ATF5，HSP70，HSP60，LONP1均表达升高。B显示了在高突变细胞中，WNT7B的表达显著降低。
图8显示了ATF5相关的蛋白在不同突变率细胞的表达。
图9显示了敲低ATF5后，ATF5相关的基因在不同突变率细胞的表达。其中，A显示了在高突变细胞中，ATF5，HSP70，HSP60，LONP1均表达降低。B显示了在高突变细胞中，WNT7B和GSK3B的表达显著上升。
图10显示了敲低ATF5后，成骨标志物基因在不同突变率细胞的表达。
图11显示了敲低ATF5后，钙结节在不同突变率细胞中的染色情况。
具体实施方式
实施例1mt.3243A>G突变患者尿液干细胞的单克隆分离培养(图1)
1)将青霉素、链霉素和两性霉素B的混合溶液5ml(其中青霉素含量10kU/ml，链霉素含量10mg/ml，两性霉素B含量25μg/ml)加入T75瓶子，将T75瓶口周围喷上消毒水；
2)选择线粒体mt.3243A>G突变人群的尿液，采用步骤1)的T75瓶子进行尿液收集；
3)打开T75瓶子，在4个50ml离心红管中各加50ml尿液样本，离心机离心；
4)每个红管中用移液管吸去上清至5ml以下，第一个红管加入15ml～20ml PBS，吹打混匀，然后将重悬液转移至下一个红管中，再次吹打混匀，以此类推，直至最后所有管的沉渣汇集于一管，1500转离心10min；吸去上清，留至少于5ml的溶液，得到沉渣红管；
5)吸去上清，留至少于5ml的溶液，得到沉渣红管；
6)采用质量百分比浓度为0.1-1％的明胶包被过的96孔培养板；
7)将步骤6)的96孔板放入超净台，吸净明胶，吸取培养基加入步骤5)的沉渣红管，加入15ml～20ml的PBS溶液吹打混匀，形成重悬液，然后加入96孔板，100ul/孔，在第3天或第4天，每孔再加100ul培养基；
8)第5或第6天半量换液；
9)第11天左右将出现密集成单克隆集簇细胞的96孔板内的培养基吸去，孔内加入PBS缓冲液冲洗，若孔内出现2个或以上克隆则弃去不要。
10)加入100ul胰酶，立即在显微镜下观察细胞是否消化分离，若细胞分离，吸去胰酶。在孔内先加入200ul培养基，吹打混匀使细胞重悬，传代为P1代。
11)后续细胞培养每2～3天换液，待细胞达80％～90％融合时进行消化传代。并在P3代对样本DNA做浓度测定。
12)对抽提到的DNA进行PCR扩增。
13)正向引物ttcacaaagcgccttccccc；反向引物ccattgcgattagaatgggtaca。
14)焦磷酸测序，96孔板，每孔各加70uL binding buffer mix，各孔对应PCR产物10uL，振荡器打开，25℃，1300rpm震荡15Min，加入引物(ggtttgttaagatggcag)和缓冲液，24孔圆板置于振荡器，80℃，5min，0rpm。记录A>G的突变率。
15)建立定量焦磷酸测序分析拟合曲线方程：
Y＝0.0000737578382X3+0.010544978865X2+0.71548332X-0.63357639446
Y是:实际的突变率，X是:检测到的突变率。
16)根据拟合方程计算出每个克隆的突变率，确认正常对照细胞、低突变细胞、高突变细胞，对这些已知突变率的单细胞进行扩增。
实施例2 RNA oligo设计合成
为了实现本发明的上述目的，我们采用以下技术方案：
通过检索NCBI获得ATF5的基因序列(Gene ID:22809)，从网站下载靶向mRNA序列(>NM_012068.6ATF5[organism＝Homo sapiens][GeneID＝22809][transcript＝1](SEQID NO.32所示))。根据此mRNA序列设计了4条siRNA序列，正义链和反义链都为21nt，通过Genbank的BLAST查询，确保siRNA编码不与其它基因同源。
序列1(正向引物gcgaguugauuucacagcutt,反向引物agcugugaaaucaacucgctt)，
序列2(正向引物cacggaaucgcgagcugaatt,反向引物uucagcucgcgauuccgugtt),
序列3(正向引物caccugaccuggaagcuautt,反向引物auagcuuccaggucaggugtt),
序列4(正向引物ccccugucuuggauacucutt,反向引物agaguauccaagacaggggtt)
交由上海吉玛制药技术有限公司化学合成。
实施例3 siRNA转染敲低ATF5实验
1.转染混合物的准备：合成的siRNA每管10D(光密度值)，配制成20umol/L的溶液，需要在每一管中加入140pL的0.1％DEPC-H20，20uM siRNA＝20umol/ul。在4个EP管中分别用100uL无血清培养液稀释2.0、3.0、4.0、5.0、6.0pL的siRNA。使每50uL培养基中分别含有20、30、40、50、60pmol ATF5 siRNA。在2个EP管中分别用250ul无血清培养液稀释5.0、7.5uLlipofectaminTM 2000试剂，使每50ul培养基中分别含有1.0、1.5ul的lipofectamineTM 2000，轻轻混匀后在室温下孵育5min。不同含量的lipofectamineTM 2000在稀释后30min内分别同相对应的已稀释的ATF5 siRNA混合于新的EP管中，制备成相对应的转染混合物，室温静置20min。
2.转染：在加入混合物前移去含血清的细胞培养液，PBS洗涤细胞3次，加入0.5mL无血清培养液，直接将混合物加人到相应的细胞孔中。摇动培养板，轻轻混匀，在37℃、5％CO2培养箱中孵育。
3.对正常细胞、高突变细胞、低突变细胞3组细胞转染完成后48小时进行siRNA沉默效果检测，主要是ATF5的mRNA水平的检测(图2)。结果表明，序列1对ATF5的敲低效果最好，筛选为针对ATF5这个治疗mt.3243A>G突变药物靶点的药物。
实施例4 ROS检测
1.收集正常细胞、低突变细胞、高突变细胞3组细胞并装载探针：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10umol/L。
2.细胞600g，4min(或3000rpm/5min)离心，去上清，将细胞悬浮于稀释好的DCFH-DA(1ml)中，细胞浓度为10^6-2*10^7/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。将细胞600g，4min离心，用无血清细胞培养液洗涤(离心、弹散、吹打)细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。加入约500ul(视细胞密度而定)培养液吹打混匀后进行检测。
3.实验结果发现：高突变细胞的ROS显著高于正常细胞(P<0.05)。通过小干扰RNA(正向引物GCGAGUUGAUUUCACAGCUTT,反向引物AGCUGUGAAAUCAACUCGCTT)敲低ATF5后，高突变细胞的ROS显著降低至正常细胞水平(图3，4)。
实施例5尿液干细胞膜电位检测
1.取适量JC-1(200X)，按照每50μl JC-1(200X)加入8ml超纯水的比例稀释JC-1。剧烈Vortex充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2ml JC-1染色缓冲液(5X)，混匀后即为JC-1染色工作液总液，分配JC-1染色工作液的量为1ml。
2.对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml间充质干细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
3.加入1ml JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。
4.在孵育期间，按照每1ml JC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。
5. 37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。
6.加入2ml细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。
7.实验结果发现：高突变细胞的膜电位显著低于正常细胞(P<0.05)。通过小干扰RNA小干扰RNA(正向引物GCGAGUUGAUUUCACAGCUTT,反向引物AGCUGUGAAAUCAACUCGCTT)敲低ATF5后，高突变细胞的膜电位显著升高(图5，6)。
实施例6尿液干细胞中目标基因RT-qPCR实验
1.正常细胞、低突变细胞、高突变细胞3组细胞总RNA提取及cDNA合成:使用trizol抽提样本总RNA，NANODROP光谱分析仪(Thermo，美国)测定RNA浓度及纯度。每份样本取1μg总RNA按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR试剂盒(Vazyme，南京)说明书反转录合成cDNA第一链。
2.实时荧光定量PCR:采用AceQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，南京)和Roche Light Cycler 384Real-time PCR仪(Roche，德国)在384孔板上进行PCR反应。反应体系：2×AceQ SYBR qPCR Master Mix 10μL，cDNA模板(浓度为0.2ng/μL)用量4μL，反向引物(10μM)各0.2μL，补充超纯水至10μL。qPCR程序：95℃、5min，(95℃、10s，60℃、30s)×40cycles，在延伸阶段检测荧光强度收集信号；熔解曲线程序(95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s)，每个样品设3个重复，取平均值进行分析。每次运行包括一个阴性对照，以检测反应体系是否污染。
3.数据分析：将原始Ct值转换为相对表达量：2-△Ct，其中△Ct＝所有样品Ct值-最小Ct值。
实施例7尿液干细胞中目标基因Western blot:
对正常细胞、低突变细胞、高突变细胞3组细胞分别加入适量蛋白裂解液(每20mg组织加入150～250灿蛋白裂解液)，充分裂解后将标本离心10min，吸取5uL上清进行BCA蛋白定量，剩余上清液水浴锅中煮沸进行蛋白变性。选取10％的分离胶，5％浓缩胶制胶后进行上样，每个上样孔加入12ul蛋白样本，后以100V恒压模式下进行电泳60min，电泳结束后以“三明治结构”在350mA、70min恒流模式进行下进行转膜，封闭结束后将抗体(以GAPDH作为内参)以1：1000浓度稀释后进行孵育，4℃过夜，将洗好的膜放在二抗中室温孵育1小时，洗涤后进行ECL化学发光和曝光显影，用QualityOne软件进行灰度值分析。结果发现，在高突变细胞中ATF5、HSP60、HSP70、LONP1的表达均比正常升高，p-GSK3β的表达比正常降低(图8)。
实施例8尿液干细胞中线粒体未折叠蛋白反应及Wnt通路的检测
1.对正常细胞、低突变细胞、高突变细胞3组细胞每种各3个克隆进行ATF5、HSP60、HSP70、LONP1、WNT7B的RT-PCR检测。结果发现高突变细胞的ATF5、HSP60、HSP70、LONP1表达升高，WNT7B表达降低(图7)。
2.对这些克隆进行ATF5、HSP60、HSP70、LONP1、p-GSK3β的western blot检测。结果发现高突变细胞的ATF5、HSP60、HSP70、LONP1蛋白表达升高，p-GSK3β表达降低(图8)。
3.应用ATF5的小干扰RNA序列(正向引物GCGAGUUGAUUUCACAGCUTT，反向引物AGCUGUGAAAUCAACUCGCTT)，干预三组细胞48小时后，对ATF5、HSP60、HSP70、LONP1、WNT7B、GSK3B进行RT-PCR检测。结果发现敲低ATF5后、ATF5、HSP60、HSP70、LONP1表达降低，WNT7B、GSK3B表达上升(图9)。
实施例9尿液干细胞成骨能力的检测
将正常细胞、低突变细胞、高突变细胞3组细胞每组各3个克隆进行成骨分化。分别置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，当细胞融合度达到60％-70％时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2mL成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化完全培养基(Cyagen，HUXMA-90021)。每2～3天换用新鲜的成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化完全培养基(使用前需预热至37℃)。应用ATF5的小干扰RNA序列(正向引物gcgaguugauuucacagcutt，反向引物agcugugaaaucaacucgctt)，放到培养基中48小时后，加入成骨培养基培养48小时后进行RNNX2，OCN，BMP2基因的RT-PCR检测(图10)。培养21天后进行茜素红染色(图11)。结果表明，高突变细胞ATF5敲低后，RNNX2，OCN，BMP2的表达均上升，钙结节显著增加，成骨能力增强。
下表为上述实施例RT-PCR检测使用到的引物序列：
Forward Reverse
ATF5 ctggctccctatgaggtccttg gagctgtgaaatcaactcgctcag
mtHSP70 caagcgacaggctgtcaccaac caacccaggcatcaccattgg
HSP60 gatgctgtggccgttacaatg gtcaattgactttgcaacagtcacac
Lonp1 cattgccttgaaccctctc atgtcgctcaggtagatgg
Runx2 ccaacccacgaatgcactatc tagtgagtggtggcggacatac
BMP2 gagaaggaggaggcaaagaaa agcagcaacgctagaagacag
OCN ccccctctagcctaggacc accaggtaatgccagtttgc
GSK-3g ccttaacctggtgctggact agctctggtgccagta
Wnt-7b caacgagtgccagtaccagttcc atctcccgagcgtccacgaag
β-actin catgtacgttgctatccaggc ctccttaatgtcacgcacgat
序列表
<110> 上海市第四人民医院
<120> 靶向ATF5的小干扰RNA及其用途
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcacaaagc gccttccccc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccattgcgat tagaatgggt aca 23
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtttgttaa gatggcag 18
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggctccct atgaggtcct tg 22
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagctgtgaa atcaactcgc tcag 24
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caagcgacag gctgtcacca ac 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caacccaggc atcaccattg g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatgctgtgg ccgttacaat g 21
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtcaattgac tttgcaacag tcacac 26
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cattgccttg aaccctctc 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgtcgctca ggtagatgg 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccaacccacg aatgcactat c 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tagtgagtgg tggcggacat ac 22
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagaaggagg aggcaaagaa a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agcagcaacg ctagaagaca g 21
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccccctctag cctaggacc 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
accaggtaat gccagtttgc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccttaacctg gtgctggact 20
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agctctggtg ccagta 16
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caacgagtgc cagtaccagt tcc 23
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atctcccgag cgtccacgaa g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
catgtacgtt gctatccagg c 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctccttaatg tcacgcacga t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcgaguugau uucacagcut t 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agcugugaaa ucaacucgct t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cacggaaucg cgagcugaat t 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
uucagcucgc gauuccgugt t 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
caccugaccu ggaagcuaut t 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
auagcuucca ggucaggugt t 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccccugucuu ggauacucut t 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agaguaucca agacaggggt t 21
<210> 32
<211> 2070
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agaggcagaa agagaaagaa accagagctt agagtcagga ggaggaaacc agaccccgga 60
gccacaagga gagggctgga tccccggctc agagggaaga gtgtcgccgc ctctgcctgc 120
gtagccccgg ccatggctct gtagcctcga cccctttgtg cccccggccc gtctccgcgc 180
tcaccacgcc tgcgctctcc gctcccacct tctttcttca gccgaggccg ccgccgcctc 240
tccttgctgc agccatggag tcttccactt tcgccttggt gcctgtcttc gcccacctga 300
gcatcctcca gagcctcgtg ccagctgctg gtgcagcctc tcctgttgcc atcagtgccc 360
agcacctgtg ctacagccat gtcactcctg gcgaccctgg ggctggagct ggacagggcc 420
ctgctcccag ctagtgggct gggatggctc gtagactatg ggaaactccc cccggcccct 480
gcccccctgg ctccctatga ggtccttggg ggagccctgg agggcgggct tccagtgggg 540
ggagagcccc tggcaggtga tggcttctct gactggatga ctgagcgagt tgatttcaca 600
gctctcctcc ctctggagcc tcccttaccc cccggcaccc tcccccaacc ttccccaacc 660
ccacctgacc tggaagctat ggcctccctc ctcaagaagg agctggaaca gatggaagac 720
ttcttcctag atgccccgcc cctcccacca ccctccccgc cgccactacc accaccacca 780
ctaccaccag ccccctccct ccccctgtcc ctcccctcct ttgacctccc ccagccccct 840
gtcttggata ctctggactt gctggccatc tactgccgca acgaggccgg gcaggaggaa 900
gtggggatgc cgcctctgcc cccgccacag cagccccctc ctccttctcc acctcaacct 960
tctcgcctgg ccccctaccc acatcctgcc accacccgag gggaccgcaa gcaaaagaag 1020
agagaccaga acaagtcggc ggctctgagg taccgccagc ggaagcgggc agagggtgag 1080
gccctggagg gcgagtgcca ggggctggag gcacggaatc gcgagctgaa ggaacgggca 1140
gagtccgtgg agcgcgagat ccagtacgtc aaggacctgc tcatcgaggt ttacaaggcc 1200
cggagccaga ggacccgtag ctgctagaag ggcaggggtg tggcttctgg gggctggtct 1260
tcagctctgg cgccttcatc cccctgcctc taccttcatt ccaaacccct ctcggccggg 1320
tgcagtggct tatgcttgta atcccagcac tttgggaggc caaggcagga ggatcgtttg 1380
aggccaggag gtcaatacca gcctgggcaa catagtaaga ccctgtctct attaaaaaaa 1440
aaaaatcaac ccttcttccc caccaaacca cccaactcct ctctactctt atccttttat 1500
cctctgtctc tgcttatcac ctctcttgcg tatttctgga tctccttccc tcctttctcg 1560
tccaaatcat gaaatgtttg gccttagtca atgtctatgc ccgtcacata acagccgagg 1620
caccgaggcc cacagggaag cagctgggag cttggaaacc tggtctcttg aatttcaaac 1680
ctggtttctt acaggtggtt gtctggggtg ggtggagtgg cgacaggata gagctgaagg 1740
actatgcaaa tgaggaagta agtcagggcg ggctttgaga aggggaccca tatcctacag 1800
gcaaaaagca ggctaggtga ccttgggaca ctacgctaag ggagggaggc taaaggcggc 1860
caggtttgca gtgcgggaag atgagcaggc cagtgggagg aggggcaggg cagggctgta 1920
gttggtgact gggtgttcat tttagctcta agaaaaaaaa tcagtgtttc gtgaaggtgt 1980
tggagagggg ctgtgtctgg gtgagggatg gcggggtact gatttttttg ggaggttatg 2040
agcaaaaata aaacgaaaca tttcctctgg 2070

Claims (1)

1.靶向ATF5的小干扰RNA在制备用于治疗线粒体m.3243A>G突变相关疾病的药物中的用途，所述的相关疾病为线粒体功能降低或者成骨能力的降低，所述的靶向ATF5的小干扰RNA的正向引物序列如SEQ ID NO.24所示，其反向引物序列如SEQ ID NO.25所示。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN109554335A (zh) * 2018-12-04 2019-04-02 上海市第六人民医院 线粒体mt3243AG突变人群的尿液中分离培养正常的干细胞的制备方法和应用
CN111269883A (zh) * 2020-02-27 2020-06-12 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种线粒体mt.3243A>G突变人群中高突变尿液干细胞的制备方法

Patent Citations (2)

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Non-Patent Citations (2)

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Title
Accession No. NM_012068.6，Homo sapiens activating transcription factor 5 (ATF5), transcript variant 1, mRNA;Gaither K等;《GenBank》;20201029;第4页ORIGIN部分 *
Mitochondrial Nuclear Retrograde Regulator 1;Siddhesh Aras;《Proc Natl Acad Sci U S A》;20201215;第115卷(第50期);全文 *

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