CN111575372A - 长非编码rna letn作为肿瘤标志物及治疗靶点 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可用作癌症诊断靶标和治疗靶标的长非编码RNA(LETN)。特别地，本发明公开了lncRNA RP11‑196G18.22(LETN)在癌细胞中过表达，该过表达能够促进癌细胞增殖，并且与癌症病人的短的预后生存时间相关。降低该lncRNA表达导致癌细胞生长抑制，因此抑制该lncRNA表达代表了癌症治疗的一个新策略。

Description

长非编码RNA LETN作为肿瘤标志物及治疗靶点
技术领域
本发明涉及癌症领域。更具体地，本发明涉及长非编码RNA LETN作为肿瘤标志物及治疗靶点的应用。
背景技术
近些年随着测序技术的快速发展，研究发现人类基因组上大量的非编码区会转录出没有翻译活性的长链非编码RNA(lncRNA)，且数量远远超过蛋白。发现了数百种与人类各种疾病或生理功能相关的lncRNA。特别是在癌症中，越来越多的证据证明了lncRNA在肿瘤抑制或肿瘤发生中发挥协同作用[1]。然而，对于绝大多数lncRNA，其分子和生物学功能知之甚少。
肝癌是全球第六大常见癌症在全球癌症发病中排名第五，每年约有 841000新发病例和782000例死亡[2]，其中男性的发病率和死亡率要高出 2到3倍，在男性死亡中排名第二。中国属于肝癌发病的高危国家，其主要是由于慢性HBV感染和黄曲霉毒素接触引起。然而，尽管肝癌的发病率越来越高，但令人吃惊的是，治疗手段却少之又少。除了放射、移植和外科手术等物理治疗方法，只有一种被批准的治疗晚期肝细胞癌的药物，索拉菲尼，但其费用非常昂贵且平均只能延长2.8个月的寿命，并导致腹泻恶心等各种副作用[3]。
核仁是一个位于细胞核的非膜结构的亚核腔室，是进行rDNA转录和核糖体生物合成等基本过程的重要细胞器。NPM1(也称为B23)是核仁中表达丰富的蛋白质，其蛋白序列含有三个不同的结构域，N端结构域可以通过调控NPM1寡聚化和与其他蛋白质的相互作用来影响其生物学功能,大量研究表明NPM1通过形成五聚物来发挥相应的功能。NPM1中心区域是以高酸性区域的存在为标志的内在无序区，参与了与组蛋白的结合。C末端区域提供了一个足够的平台，使其能够与核酸结合[4]。NPM1是一种重要的细胞蛋白，已被证明参与核糖体的生物发生，染色质重构和中心粒复制等一系列生物学过程。当其异常表达或发生突变时会引起胚胎发育异常和肿瘤的发生。
发明内容
本发明人通过结合理论研究和实验手段，通过多组学数据挖掘工具，在癌症背景下对可能具有潜在功能的lncRNA进行全面分析探究。在肝细胞癌(LIHC)中，本发明人通过本实验室设计的算法，利用癌症基因组图谱 (TCGA)的数据对lncRNA进行功能调查，发现了一条之前未被研究的 lncRNA RP11-196G18.22(我们命名为LETN)，预测其调节191对转录因子和靶基因，可能在肝癌的发生发展中具有广泛而强大的调控潜力，并通过实验进行了验证。
因此，本发明涉及一种可用作癌症诊断靶标和治疗靶标的长非编码 RNA(lncRNARP11-196G18.22，在本文中命名为LETN)，其在癌细胞中过表达，该过表达能够促进癌细胞增殖，并且与癌症病人的短的预后生存时间相关，因此可以作为肿瘤标志物及诊断标记。降低该lncRNA表达导致癌细胞生长抑制，因此抑制该lncRNA表达代表了癌症治疗的一个新策略。本发明还对LETN的作用机制进行了研究，发现LETN通过与NPM1 结合来发挥功能，通过结合NPM1来影响rRNA的产生和核小体的装配功能来促进癌症(例如肝癌)的发生和发展。
根据本发明的一个方面，提供了检测lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 表达水平的试剂在制备癌症的诊断剂或诊断试剂盒中的应用。检测 lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达水平可以是检测其DNA或RNA 水平。
在一个实施方案中，本发明提供了诊断癌症的方法，所述方法包括检测受试者的样品中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平，其中相对于对照(健康或正常样品)，LETN在受试者的样品中的过表达指示受试者患有癌症的(高)风险或患有癌症。
在一个实施方案中，本发明提供了检测lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)表达水平的试剂，其用于诊断癌症。
在一个实施方案中，所述试剂为lncRNA RP11-196G18.22特异性探针、基因芯片或PCR引物。
在另一个实施方案中，所述癌症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺癌。
在另一个优选实施方案中，所述lncRNA RP11-196G18.22的核苷酸序列如SEQ IDNO:1(Ensembl登录号ENST00000564237.1)所示。
根据本发明的另一个方面，提供了降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达的试剂在制备治疗癌症的药物中的应用。
在一个实施方案中，本发明提供降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)表达的试剂，其用作药物，特别是用作治疗癌症的药物。
在另一个实施方案中，本发明提供治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)表达的试剂。
降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达的试剂的本质对于本发明来说并不重要，只要它降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 的表达即可。
根据一个优选实施方案，降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 表达的试剂选自由以下组成的组：gapmer、反义RNA、siRNA、esiRNA、 shRNA、miRNA、RNA适体、TALEN、CRISPR和锌指核酸酶。在特别优选的实施方案中，用于反义RNA、siRNA、shRNA和CRISPR的具体序列是本申请说明书实施例中使用的那些序列。
在另一个实施方案中，所述癌症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺癌。
根据一个优选实施方案，所述lncRNA RP11-196G18.22的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示(Ensembl登录号ENST00000564237.1)。
在另一个实施方案中，所述药物还包含另外的抗癌剂例如化疗药，例如用于降低或抑制NPM1表达或突变的试剂或抑制LETN与NPM1的结合的试剂。或者所述药物与用于降低或抑制NPM1表达或突变的方法或者抑制LETN与NPM1的结合的方法组合使用。即使lncRNARP11-196G18.22(LETN)的抑制足以实现治疗癌症的效果，但是预期将降低或抑制lncRNARP11-196G18.22(LETN)表达的试剂与其他抗癌药物如化疗剂组合时，可以获得更强甚至协同的抗癌效果。由于本发明已经发现LETN是通过与NPM1结合来发挥功能，通过结合NPM1来影响rRNA 的产生和核小体的装配功能来促进癌症(例如肝癌)的发生和发展，因此这对于具有降低或抑制NPM1表达或突变的抗癌药或化疗剂而言更是如此。
根据本发明的另一个方面，提供了一种筛选抗癌药物的方法，所述方法包括下述步骤：
1)确定过表达lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的细胞中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平；
2)将候选化合物与步骤1)的细胞接触；
3)确定在步骤2)后细胞中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平；和
4)比较步骤1)和步骤3)中确定的lncRNA RP11-196G18.22(LETN) 的表达水平，其中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平降低指示所述候选化合物具有抗癌潜力，优选所述细胞为癌细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了鉴别一种肿瘤是否适合于以LETN 表达抑制剂治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
1)测定肿瘤或肿瘤细胞样品中LETN的表达相对于对照(正常或健康组织/细胞)是否增加；
2)确定所述肿瘤是否适合于治疗，其中增加的表达表示适合于以 LETN表达抑制剂治疗。
根据本发明的另一个方面，提供了评价药剂在治疗和/或预防癌症中的效果的方法，其中所述方法包括测试所述药剂是否能够降低肿瘤或肿瘤细胞样品中LETN的表达，如果能够降低，则说明所述药剂适合于治疗和/ 或预防癌症。在一个优选实施方案中，所述癌症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺癌。根据一个优选实施方案，所述LETN的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示(Ensembl登录号ENST00000564237.1)。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1中A至J所示的结果显示LETN能够促进肝癌的发生发展。
A显示LETN在TCGA数据库中各种癌症和相关癌旁的表达情况 (CHOL：胆癌；LIHC：肝癌；LUAD：肺腺癌；KIRC：肾透明细胞癌； BLCA：膀胱癌；BRCA：乳腺癌；PRAD：前列腺癌；READ：直肠癌； LUSC：肺鳞状细胞癌；UCEC：子宫内膜癌；PAAD：胰腺癌；HNSC：头颈部鳞癌；KIRP：乳头状肾细胞癌；COAD：结肠癌；STAD：胃癌； SARC：软组织癌；ESCA：食管癌；THCA：甲状腺癌；THYM：胸腺癌； KICH：肾嫌色细胞癌；PCPG：肾上腺癌；CESC：宫颈鳞状细胞癌)，观察到人类大部分癌症组织(实体瘤)中的LETN表达要高于相对应的癌旁组织；B显示在HUH7细胞系中对LETN进行CRISPR-Cas9敲除，观察发现 LETN敲除组(sgLETN)细胞增殖速率要远远低于对照(sgEV)；C所示为分别在肝癌细胞系HUH7、SMMC-7721，肺癌细胞系HCC827、前列腺癌细胞系PC3、DU145对LETN进行敲低，检测发现LETN敲低组细胞增殖速率要远远低于对照组细胞(siNC和siLMNA为两种不同的阴性对照。为防止脱靶效应，针对LETN设计两个siRNA敲低：siLETN-1和siLETN-2)； D，E所示为在HUH7和HCC827细胞中对LETN进行稳定敲低/敲除后其细胞克隆形成能力明显被破坏；F所示为在肝癌细胞系HUH7、SMMC-7721 中对LETN进行过表达，检测发现LETN过表达组细胞增殖速率要远远高于对照组细胞；G所示为在HUH7和SMMC-7721细胞中对LETN进行稳定过表达后其细胞克隆形成能力明显增强；H所示为在肝癌细胞系HUH7中对 LETN进行稳定敲低后观察到LETN敲低组其皮下成瘤能力显著降低；I所示为在肝癌细胞系HUH7中对LETN进行稳定过表达后观察到LETN过表达组其皮下成瘤能力明显增强(LETN-OE组为过表达LETN组，EV组为对照组)。
图2中A至E所示的结果证明了LETN通过与NPM1结合发挥功能。
具体地，A所示为通过原位杂交实验发现LETN主要位于细胞和中且成团出现；B所示为通过核质分离实验证实LETN大部分位于细胞核中， GAPDH和LaminA/C分别为细胞质和细胞核的标志物；C所示为通过对 LETN相互作用的蛋白进行质谱分析，发现两次实验中NPM1均是是结合能力最强的蛋白；D所示为通过细胞荧光共定位实验进一步证实了LETN 和NPM1相互结合且定位于核仁中；E所示为在甲醛交联或未交联状态下通过NPM1进行拉下(pull down)RNA,也发现NPM1确实能够拉下来 lncRNA LETN(图中MALAT1表示阴性对照)。
图3中A至C所示的结果证明了LETN通过与NPM1结合影响rRNA 的产生和核小体的装配功能来促进肝癌的发生发展(检测用抗体：鼠抗人 NPM1抗体(ab10530,abcam)，Histone H2A(EPR17470,ab177308,abcam), Histone H2B(EP957Y,ab52599,abcam),Histone H3(17168-1-AP, proteintech),Histone H4(16047-1-AP,proteintech))。
具体地，A所示为在HUH7和HCC827细胞系中分别敲低LETN或 NPM1，均能明显降低各种rRNA的表达，LETN和NPM1功能具有一致性；B所示为敲低LETN可以减弱NPM1和组蛋白的结合能力，进而影响核小体的装配；C所示为对TCGA数据库中肝癌病人的临床资料分析生存期分析，单独分成LETN或NPM1高表达组病人预后生存时间要比低表达组病人短；当继续细分为NPM1-low+LETN-low、NPM1-low+LETN-high、 NPM1-high+LETN-low、NPM1-high+LETN-high四组时，发现NPM1和 LETN均高表达的病人其生存时间要远远低于NPM1和LETN均低表达的病人。
图4中A至D所示的结果证明了LETN的各种敲低和过表达效率。
A所示为通过siRNA对五种细胞系进行LETN敲低，通过RT-qPCR检测敲低效率；B所示为通过慢病毒shRNA对两种细胞系进行LETN敲低，通过 RT-qPCR检测敲低效率；C所示为通过CRISPR-Cas9技术进行敲除LETN，通过RT-qPCR检测敲低效率；D所示为通过慢病毒过表达系统对两种细胞系进行LETN过表达，通过RT-qPCR检测过表达效率。
图5表示敲低相应的lncRNA后对肝癌细胞系HUH7的增殖的影响。
具体实施方式
除非另外指出，本文中所用术语具有本领域技术人员理解的一般技术含义。对于本领域的定义和术语，特别推荐技术人员参考Sambrook等， Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor出版社，Plainsview，New York(1989)；以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，John Wiley&Sons，New York(1999)。
术语“长链非编码核糖核酸(英语：long non-coding RNAs，简称为 lncRNA)”指的是长于200核苷酸的不编码蛋白质的转录物。
术语“lncRNA RP11-196G18.22”或“LETN”是指Ensembl登录号为ENST00000564237.1的基因以及从该基因转录的mRNA。由于它是非蛋白编码基因，因此不存在蛋白产物。在本发明中，其序列可以由SEQ ID NO:1 表示(如下所示)。本发明还考虑上述基因可能存在的非编码外显子中的变异，这些变异被考虑为属于相应转录物，即除非另外说明，否则术语“lncRNA RP11-196G18.22”或“LETN”涵盖不同同种型。
AGAGTTCCGACTGAAATTTGAGAAGCTCTTTGCTATTCAAGTGGATATGTGCAGTTGACAGTTTGAGAGATGCATCTAGGGTTC AGTAAAGACAACACAAGCCTGTCTTTAGGGTCTACCTGTGAACTGTGAACACAGCAATGAGAATGATGGACATCACCTTTAAGT ATTTTTCTAGACTTTATTACTCATGTGTTTGTCATGAGGTGTAACTTAGTAGTTCATAGTCCTATAATGTATGTTATTGACTAG GTAGCATTTATTTTTCTAATTGTTTCTGTTATAGTGCTGCCACATGTGTTTCCCAGAAACGCATTTTACCCACAGTTCTTAGGG TTGGCCTGATTAGTTTAATTGCTGTCTGAACCTGCTTCTTACTGTGATTAGTTCAGGAATCTAGATCAAACTCATTGGCATTTA ACATTTCAGGAAGTGAACTGAGTAACAACTAACTCAGCAGGGGAGTGTAGTATGCTATTATCTTTTGGGAAAGCAGCTTATTTG CTTTCAAGAGGCAGCAGGAGGATGGACTGTCTTTAGGTATGAAGGCAAGAATGATTATAGACAATATGCAGAGGAGGACACAGT GTGGGAGAATCAGGGAACTGAGCCACTCATGGAGTTCAGCCAACCTTGGATCCCTGCTGCACCTTTGGACTTCCAGTTAAGCCA ATTTGTCTGACATATTTACTTATACCAGTTTGAATCTTGAAATATTTCAGGAATAATAATTTCCTAGATAAAAGGAAAGACCTT TCATGAAAGGTCTCAAGTCAAATAGGGTCAATTAGGACAGAGTTGCTCCAATTACATATTTGGAACAGATGTCCAAATGTTAAT ACTTGACTAAGGCTAAAGACTAATATTACCATCACAGGAAAAATGTCCAGGGTTTTTTTTCAGATGTGAAATTTTATTTAAAAA TTTTAAATAAACTAAATCAAAAAATTTTAGTAGTTGTACTAATTTCCTGGGGCTGTCAAAGTACCACAAACTGTATGGCGTAAA ACAACACAAAGTTATTCTTTCATGGTTTTAGAGGCTAGAAGTTTGAAATCAACGTGTTGGTAGGGCCATGCTCTCTCCAAACCC ACTAGGGGAAGACTCCTGTCTTTCAGTGTCTGGTAGCCCCACTTGTTCTTTGGTTTCTGGCAGCATAACTGTAATCTCTACCTC AGTTTTTTCATGTATGTCTCCATGTTTTTTTACTTTCTTTCTTGAGATGGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGT GGCATGATCTTGGCTTACTGCAACCTCTGTGCCCCGGGTTCAAGCAATTTTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTAGCTGGGATTACAGGCATGCGTCAGCACGCCCGGCTGATTTTGTATTTTTGGTAGAGATGGAGTTTCATCATGTTAGTCAGGCTGGCCTCGAACTGA CCTCAGGTGATCCACCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGATGTGAGCCACTGCACCCGGCTGTCTCCATGTCTTC TTATAAGGGTATCAGTCATACTGGATTAGGGCCCACCCTAAAGACCTCATTTTAACTTGATTACCTCTGTAAAGACCCTGTTTC CAAAGAAGGCAAAATTCTAAGCAACTAGGGGTTAGACTTCAACATATCTTTCGGGGGGACACAACTCAACCCATAACAGTAGTC AATGGCTGTGGCAGGCTAAATGTGGCTCCCAAATATGTCCATATCCTAATCCCTACAGCCTGTGAATATTACCTTATATAGCCA AGAGGATTTTGCAGATGTGATTCTGAGATTGAGAGATTATGCCAGATTATCCAGGTAGGCCCCAAATGTAATCACCACAGTCCT TATAGGAGAGGCAAGAAAGTCAAGTGTAGAAGGAGGCGATAGAAGGAGAGAGGGATTTGAAGATTAATAGGCTGCTTGCTTTGA AGACAGAGGGAAGGGACCATAAACCAGAAATAAACCTCTAGAAGCTGGAAAAGGCATGGAAATAGACCCTCCCTTAAGGTCTCT GGAGGGAGTGCAGCCTTGATTTCTACCGAGTAAAATTGATTTTGTACTTCAGACCTCCAAAACTGTAAGAGAATGACTGTTGTT TTAAAACCATTGAGTTTGTAGTAATTTGTTGCAGCAGCCACAAGAAACTAATACAACATCTATATAGAATTTTTTCAATAATTG GAGAAATTTGAATATGGATTGCATATTAATATTACTGAATCAGCATTAAATTTGTTAGGTGTAATAATGTGATTGTAGCTATTT AGGAGAATATCCTATTTTTAAGAGACATGCCACCATATTTAGGGAGAAGTGCCAACATATTTGCAGTTTATTTTCAAATGGTTC AGAGGCTGTCTGTGTACATGAGAAGACAAAGATAAGGCAAATGCAGCAAAATTGTAATAATTGGTGAATCCAGGTGAAGGGACT ATGGCTGGTCTTTGTACTTTTTTTTCCAACTTTTCTGTAGGTTTAAAATTTTCAAAATAAAAAAATGGGAAATACTTTAAAAAT TGTAATCAAAGACATTAGTACAGAAACTTTCATAATGTATTTTATTTTTACAGTAAAATTAATTTATGTAAATTGATAGAATTT TACTAATTTCACTCCCAAGTTACATTAAAAGGCTTACATATGTTTGATAATAGCATATGTAAACTAGAACTCTGAATGATATCC ATTGGTCATAATACGTACTATGTAGCGGTAATGGTGACTTTTGTGATTGCACAAGTCTAGAGATGCCCCAAATGACATTGACTTAGACATCTGGTTATTCTAAGGCTGAAACTGAAGTTGAATAGAAGGTTTTAGTCAAATACTGAGATGAAAACTGAGGCAGTCCTG GCGGGGGGGAGTGAGTGTGTGTGTATATATACACACATAGACATCATGCTTCTAAACATTTACAGAAAGAAAGGGTAGATTATC TACAAAAAAATAAGAATCAGACTGATATGAGATCTTACAAACCTAACCCCCTTCTCTTTCCTAAACTCCAGATTCTCATATTTC TGACTTCCTATTTGATATTTACACTTCGATATTTACCAGGAGTCTTCAACATTTTGTTCAAAACAGTACTCTTGGTTTTCTTCC TCCAAGACTACTCCTTACTCATATCAGCAAATAGCAGCTCTTTTCAAGTGCTCAGTGTAAAAACCTACAATTAATCCTTGATTT CTCTTTCAGTCAGCCTATACTAAATCAATTTCATTTAAAATATCTCGGCTACTACTCTGCATCTCCACTGCTACCATCGGCCTC TCCAGTCACATTCTCCAAGAGCACTCTATCTCATTTAAAAGACAAAATCTCTGCAGTGGCCTGTGATGCTCCTTAATGGCCTAC ATAATCCAGCCCTCAAGCACCTCCGTGATCTCTGTAAAACTTTCCCTTGGTCACTGTGCTTCAGCCACATTAACCAGCTTGCAT ATTTCTCACATTCACCAAGCTTGTTCCTGCCTTGGGGCCTTTGTACTTACCATGTTCTGTTCTGAGAATACTCTGCCTCAAGAT ATCCTACAACTATCTTACTGTATTCAGCTCTCTGCTCAAGTATTAACTGATGAAACCTGTCATCCCTACTCCACTCCATGTTCT GCTTTACTTAACAGCAATTGCACATATGGCCCCCTGAATAATATACATTTAGTCACTTATTTTTACTTATCTGCTAATTAAAAT GTAGACTTTTTCTATTCTGTTTACTGCTGTATTCCCAGCATGTTTTATCCGAATGTGCAGTGGTTTCTTTTCTTCTCCCTTATC GTGGGAAGTGATGTGCACAAATACACATAATGGAGCCTGAATGTCATATTGCTTTCATACCTGTGTGAATTTTGGTAAGAAAGG AAAAGTAGCGATTGACAGGTAATATAATTACATTAAGTCACTCTCATAGTTAGCTGTTTATTGCTTTCCTGCTCTTATTCTCAG TCCCCAGGACCAAATGTTGACCACTACCTTCCCCCACATATAATTAGGTTATTTACCGAACGCCATGCAGGTGGCTGTTAAAAG GAAGATATATACTTACCTTATAAACTCAACTTTTCCCTGTTGTCTTTCTGTCTCACCCCTACCTCCATGCTTTAAATTAACTTT TCAGGCTTAGGCCTTATCTCTCAGTAGAGCCATATAAGGTATGTGTAAAAGCAGGAAAATGTTTCCTGGGGATGAAGCTTTGAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTCTTTTGGCAATAAAATAAGGTAGATTCAGCACAATACCTAATAACTAAAAAATCTGTTTTTAATTG GGTGGGGCAGACAGCAAGTGTGTCATCCTGGAAGATACTATTTGGGATTTTATGTAGGTACATAAGAGAAAAAAGTGAACAAAA GCAAGGGGCTACCAGGACGCCGCAGTATGCTTAACATGTATTTTCTAAGTTTGTATTATGCCTTTATCTTGGTACTTTTATCTT CTGTTCTCACTTGATCTTTTTGAAATGTATTTTAAATCCTAATAAAAATATATAAAGTCTGGAATTAATAAAGGA (SEQ ID NO:1)
关于lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达，意指其两个水平上的表达：一为DNA水平上的表达；二为RNA水平上的表达。
术语“过表达”是指当基因表达(转录)的严格控制被打乱时，基因可能不恰当被“关闭”，或以高速度进行转录。高速转录导致大量mRNA 产生。对于本发明的“lncRNA RP11-196G18.22”或“LETN”的过表达而言，是指其DNA或RNA表达水平比对照(正常或健康组织/细胞)至少高 30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、 140％、150％、200％或300％，或者甚至是对照中LETN的表达水平的4、5、 6、7、8、9、10倍或以上。
用于检测基因表达水平的技术和试剂是本领域技术人员公知的。在本发明中，优选该试剂选自lncRNA RP11-196G18.22的特异性探针(优选核酸探针，带有检测标记，通常与目的基因互补)、基因芯片或用于PCR特异性扩增反应的PCR引物。
术语“降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达”是指将lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平降低至原来的表达水平的 80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、15％以下或10％以下，例如5％以下、2％以下、1％以下或甚至0％。在一个实施方案中，通过基因敲除或敲减可以降低或抑制lncRNARP11-196G18.22(LETN)的表达。
术语“敲除(knock out)”是指一种遗传工程技术，其中利用外源的已突变的基因通过同源重组的方法替换掉内源的正常同源基因，从而使内源基因失活而表现突变体的性状。
术语“敲减(knock down)”是指通过降解具有同源序列靶基因的 mRNA，达到阻止基因表达的作用。其利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。它不同于基因敲除使目标基因永久性的表达沉默，而是通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。
基因敲除或敲减的技术是本领域公知的，包括但不限于，逆转录病毒基因转移，造成突变，例如点突变、插入、删除、移码、或错义突变。可以将基因敲除的另一方式是，使用锌指核酸酶。锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制性酶。可以对锌指结构域进行改造以靶向目的DNA序列，这可使锌指核酸酶靶向复杂基因组中的独特序列。其它可用来敲除基因的基因组定制技术有TAL效应物核酸酶(TALENs)。另一种技术是基因组编辑技术CRISPR/Cas系统，其可以被用来实现RNA引导的基因组改造。
实现“降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达”的技术还可以包括使用gapmer、反义RNA、siRNA、esiRNA、shRNA、miRNA或 RNA适体。
“反义RNA”是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA 特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。可以例如作为表达质粒来递送反义构建体，其中当所述表达质粒在细胞中表达时，产生与细胞 lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的至少一个独特部分互补的RNA。
反义RNA策略的另一特殊形式是gapmer。Gapmer是嵌合的反义寡核苷酸，其包含长度足以诱导RNase H切割的脱氧核苷酸单体的中心区段 (central block)。Gapmer的设计和合成是本领域技术人员公知的并且可以由商业公司(例如，Exiqon，Isispharmaceuticals)完成。
“小干扰RNA(siRNA)”，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度约为20-25个碱基对，其通过RNA干扰(RNAi)途径发挥作用。它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的 mRNA，从而防止翻译。本发明的siRNA可以靶向lncRNARP11-196G18.22 (LETN)靶序列中约19至25个连续核苷酸的任何区段，在本申请中提供了其实例。用于选择siRNA的靶序列的技术在本领域公知的。
“短发夹RNA”(short hairpin RNA，缩写shRNA)是包括两个短反向重复序列的RNA序列，可以经由RNA干扰(RNAi)使基因表现沉默化。
“esiRNA”的英文全名是Endoribonuclease-prepared siRNAs，是通过大肠杆菌的RNase III(一种核糖核酸酶)切割长双链RNA(dsRNA)而生成的siRNA混合物，长度在18-25bp之间，可以用于高效敲除靶标基因的表达水平。
本发明是基于以下出人意料的发现：即lncRNA RP11-196G18.22 (LETN)可以用作肿瘤标志物及治疗靶点。因此，本发明提供了检测 lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达水平的试剂在制备癌症的诊断剂或诊断试剂盒中的应用。本发明还提供了降低或抑制lncRNARP11-196G18.22(LETN)表达的试剂在制备治疗癌症的药物中的应用。另外，本发明还提供了一种筛选抗癌药物的方法，所述方法包括确定候选化合物是否能够降低或抑制lncRNARP11-196G18.22(LETN)表达的步骤。
本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了举例说明的目的，而不是用来限制本发明的范围。以下反应中所用的化学物质都是可商购的产品，除非另外指明。
在本发明中使用未配对的学生t检验作为统计分析。使用Microsoft Excel进行统计学计算。当P<0.05时，P值显著。
实施例1 lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的筛选
在肝细胞癌(LIHC)中，我们利用癌症基因组图谱(TCGA)的数据 (https:// www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)对lncRNA进行功能调查，通过本实验室设计的算法，预测具有调控转录因子和其靶基因功能的lncRNA。我们通过从调控对数多少，癌与癌旁是否有表达差异以及基因组拷贝数变异这三个因素综合筛选最终选择了22条lncRNAs(UBE2SP2，BMS1P8，RP11-443P15.2，LINC01296/DUXAP10，LL22NC03-N14H11.1，RP11-284F21.10，DUXAP8， CRNDE，CTD-2227E11.1，LINC00853，LINC00665，RP11-196G18.22， GOLGA2P7，RP11-14N7.2，PVT1，LINC00511，RP11-396C23.2， MIR4435-2HG，AL450992.2，HCG25，PCAT6，LINC00152)。去除一些非特异序列的lncRNA(其序列完全位于某个基因的外显子内，无法设计特异的的siRNA进行功能性验证)，还剩下16个lncRNAs，随后我们通过实验对这些lncRNA进行表型验证。具体来说就是设计针对其转录本特异的 siRNA(见以下表1)，通过脂质体Lipofectamine 2000(Thermo Fisher， 11668019)转染肝癌细胞系HUH7(中科院上海细胞库)，检测敲低相应的lncRNA后其对细胞增殖的影响，结果(见图5)发现只有7条lncRNA (DUXAP8，PCAT6，LINC00511，LINC00152，RP11-198G18.22， PVT1，CRNDE，图5中右侧7条lncRNA)能够抑制HUH7细胞的增殖，而在这7条lncRNA中只有1条目前没有被研究报道，即lncRNA RP11-196G18.22(我们命名为LETN)，它也是我们之前在算法预测中发现的调节转录因子和靶基因数目最多的lncRNA，这提示其可能在肝癌的发生发展中具有广泛而强大的调控潜力。基于上述发现，我们对TCGA数据库中肝癌和癌旁中LETN的表达量进行分析，发现LETN在肝癌组织中的表达量远远高于癌旁组织；进而扩展到其他癌症组织分析发现在大多数癌症中，其LETN的表达量均高于癌旁组织(图1，A)。
表1
Figure BDA0002312782650000121
实施例2 lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的细胞水平研究
选取HUH7(中科院上海细胞库)和SMMC-7721(中科院上海细胞库) 两种肝癌细胞系，通过对LETN进行siRNA敲低(siRNA引物如下所示)(将细胞接种于35mm培养皿中待细胞贴壁后进行转染，取250ml培养基分别稀释2ul脂质体Lipofectamine 2000(ThermoFisher，11668019)和20nM的 siRNA，然后将其混匀，静止孵育20min，然后将其缓慢滴入含有细胞的培养皿中，48小时后通过RT-qPCR检测(引物对序列见以下表2)敲低水平，敲低效率见图4，A，结果发现敲低LETN能明显降低细胞的增殖(图1，C) (siNC和siLMNA为两种不同的阴性对照。为防止脱靶效应，针对LETN 设计两个siRNA敲低：siLETN-1和siLETN-2)。
siLETN-1 Sense 5′-3′GCUGUCUCCAUGUCUUCUU(SEQ ID NO:34)
Antisense 5′-3′AAGAAGACAUGGAGACAGC(SEQ ID NO:35)
siLETN-2 Sense 5′-3′GCUCUCUGCUCAAGUAUUA(SEQ ID NO:36)
Antisense 5′-3′UAAUACUUGAGCAGAGAGC(SEQ ID NO:37)
siNC(negative control)Sense 5′-3′ACGUGACACGUUCGGAGAA(SEQ ID NO:38)
Antisense 5′-3′UUCUCCGAACGUGUCACGU(SEQ ID NO:39)
siLMNA Sense 5′-3′AUCUCAUCCUGAAGUUGCUUC(SEQ ID NO: 40)
Antisense 5′-3′GAAGCAACUUCAGGAUGAGAU(SEQ ID NO:41)
表2
Figure BDA0002312782650000131
Figure BDA0002312782650000141
因为需要持续敲低两周时间来检测克隆形成，我们构建LETN敲低的稳筛细胞株(方法详见实施例3)。通过RT-qPCR检测(引物对序列见以下表3)敲低水平，敲低效率见图4，B，结果发现敲低LETN能明显降低细胞的克隆形成(图1，D，E)。shNC为阴性对照组。
表3
Figure BDA0002312782650000142
此外，我们还通过CRISPR-Cas9技术进行敲除LETN(将细胞接种于 35mm培养皿中待细胞贴壁后进行转染，取250ml培养基分别稀释2ul脂质体Lipofectamine 2000(ThermoFisher，11668019)和2ug px458-sgRNA质粒 (在px458(Addgene，catalog no.48138)质粒基础上加入了sgLETN序列, 具体方法见参考文献[5])，然后将其混匀，静止孵育20min，然后将其缓慢滴入含有细胞的培养皿中，48小时后通过RT-qPCR检测敲低水平，敲低效率见图4，C。发现明显抑制细胞的增殖(图1，B)。
sgLETN-1 Sense 5′-3′TCAAATTTCAGTCGGAACTC(SEQ ID NO:70)
sgLETN-2 Sense 5′-3′GAGACGATATGCTACGGGTG(SEQ ID NO:71)
sgEV-1 Sense 5′-3′GAACGTTGGCACTACTTCAC(SEQ ID NO:72)
sgEV-2 Sense 5′-3′GCGCCTTAAGAGTACTCATC(SEQ ID NO：73)
反之对其进行LETN过表达(将细胞接种于35mm培养皿中待细胞贴壁后进行转染，取250ml培养基分别稀释2ul脂质体Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher，11668019)和2ug LETN过表达质粒plv-LETN(由无锡青兰生物科技有限公司构建，表达质粒为plv-mCherry，catalog no.36084)，然后将其混匀，静止孵育20min，然后将其缓慢滴入含有细胞的培养皿中，48 小时后通过RT-qPCR检查其过表达效率(见图4，D)。发现能促进细胞的增殖和克隆形成(图1，F、G)。
随后我们又选取了肺癌细胞系HCC827(
Figure BDA0002312782650000151
CRL-2868)和前列腺癌细胞系DU145(
Figure BDA0002312782650000153
HTB-81)、PC3(
Figure BDA0002312782650000152
CRL-1435)，也发现了类似的效果，当使用siRNA敲低LETN后(方法同之前在肝癌细胞系 HUH7中所操作，敲低效率见图4，A)细胞的增殖速度明显减弱，克隆形成能力也被破坏(图1，C)。
实施例3 lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的动物水平研究
我们进一步探究LETN对肿瘤细胞成瘤能力的影响。首先利用病毒包装的shRNA构建LETN敲低的稳筛细胞株(shRNA序列见表3。首先进行包装病毒，将293T细胞(中科院上海细胞库)接种于100mm平皿，第二天进行转染，取1ml培养基稀释12ul脂质体Lipofectamine2000(Thermo Fisher， 11668019)，取1ml培养基稀释包装载体7.1ugΔ8.9(清华大学文库平台) 和3.55ug VSVG(清华大学文库平台)，和表达载体3ug plv-LETN，然后将其混匀，静止孵育20min，然后将其缓慢滴入含有细胞的培养皿中，加培养基补充至10ml，48小时后收取上清，3000rpm离心10min，此上清即为病毒液，分装放-80℃备用。对于构建LETN敲低的稳筛细胞株，首先将细胞种于35mm培养皿中，第二天加入500ul病毒液，加培养基补充至2ml，48小时后加入嘌呤霉素进行去除没有表达病毒的细胞，三天加一次嘌呤霉素，如此就得到我们需要的稳转细胞系)，我们把LETN敲低的HUH7细胞系(通过RT-qPCR检测其敲低效率，敲低效率见图4，B)注射到无胸腺裸鼠(BALB/c裸鼠，雄性，来源于清华大学动物中心)的皮下，培育5周后用游标卡尺每周进行肿瘤块大小的测量。将肿瘤取出测量其重量和体积，结果发现LETN敲低的细胞形成的肿瘤块要明显小于对照组，其肿瘤的体积和重量远远小于对照组(图1，H)。相应地，我们选取HUH7构建LETN过表达的稳筛细胞株，注射到上述无胸腺裸鼠的皮下，培育5周后进行相同操作处理，结果发现LETN过表达的细胞形成的肿瘤块要明显高于对照组，其肿瘤的体积和重量也远远大于对照组的肿瘤(图1，I)。总之，通过细胞增殖，克隆形成以及皮下成瘤等肿瘤指标进行详细的实验验证，我们认为 lncRNA LETN具有明显的抑制肝癌发生发展的功能，是一个潜在的治疗靶点。
实施例4 LETN的作用机制探究
首先通过RNA原位杂交[6]和细胞核质分离技术(Nuclear/CytosolFractionation Kit(Biovision，K266-25))鉴定发现LETN主要定位于细胞核中，且是成团分布。说明LETN很有可能通过结合蛋白发挥功能。通过RNA pull down将拉下来的蛋白进行质谱分析找出与LETN相互作用的蛋白，最终找出NPM1是与其结合的功能蛋白。随后我们通过RNA pull down技术[7] 利用NPM1抗体Anti-NPM1(Abcam，ab10530)进行pull down，也发现 NPM1确实能够拉下来lncRNA LETN。细胞荧光共定位实验也进一步证明了LETN和NPM1相互结合且定位于核仁中。
NPM1是一类非常重要的核仁功能蛋白，能够结合rDNA启动子促进 rDNA转录；参与rRNA剪切成熟；与组蛋白结合参与核小体装配等等。我们发现LETN确实也参与了这些功能，对LETN敲低后发现能明显降低各种 rRNA的表达，过表达LETN可以促进rRNA的表达。此外，敲低LETN也可以减弱NPM1和组蛋白的结合能力，进而影响核小体的装配。核仁是由三种基本结构组分组成的，由内到外即纤维中心、致密纤维组分和颗粒组分。 NPM1主要位于最外层，是颗粒组分最主要的组成部分，有研究表明当敲低NPM1可以使核仁的形态受到破坏。
我们研究发现当敲低LETN时核仁有规则致密的圆球形变得不规则散乱，说明LETN也影响着核仁的结构。通过我们的算法，对TCGA数据库中肝癌病人的临床资料分析生存期分析，单独分成LETN高表达组和低表达组或NPM1高表达组和低表达组，发现NPM1或LETN高表达组病人预后生存时间要比低表达组病人短；当继续细分为NPM1-low+LETN-low、 NPM1-low+LETN-high、NPM1-high+LETN-low、NPM1-high+LETN-high 四组时，发现NPM1和LETN均高表达的病人其生存时间要远远低于NPM1 和LETN均低表达的病人。
本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。
参考文献
1.Schmitt AM,Chang HY:Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways.CancerCell 2016,29(4):452-463.
2.Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,Siegel RL,Torre LA,Jemal A:Globalcancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortalityworldwide for 36 cancers in 185countries.CA:A Cancer Journal for Clinicians2018, 68(6):394-424.
3.Scudellari M:Drug development:Try and try again.Nature 2014,516:S4.
4.Box JK,Paquet N,Adams MN,Boucher D,Bolderson E,O′Byrne KJ,RichardDJ: Nucleophosmin:from structure and function to disease development.BMC MolBiol 2016,17(1):19.
5.Ran FA,Hsu PD,Wright J,Agarwala V,Scott DA,Zhang F:Genomeengineering using the CRISPR-Cas9 system.Nat Protoc 2013,8(11):2281-2308.
6.Kawaguchi T,Tanigawa A,Naganuma T,Ohkawa Y,Souquere S,Pierron G,Hirose T:SWI/SNF chromatin-remodeling complexes function in noncoding RNA-dependent assembly of nuclear bodies.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 2015,112(14):4304-4309.
7.Li X,Wang X,Song W,Xu H,Huang R,Wang Y,Zhao W,Xiao Z,Yang X:Oncogenic Properties of NEAT1 in Prostate Cancer Cells Depend on the CDC5L-AGRN Transcriptional Regulation Circuit.Cancer Res 2018, 78(15):4138-4149。

Claims (10)

1.检测lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达水平的试剂在制备癌症的诊断剂或诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述试剂为lncRNA RP11-196G18.22特异性探针、基因芯片或PCR引物。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述癌症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺癌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其中所述lncRNA RP11-196G18.22的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(Ensembl登录号ENST00000564237.1)所示。
5.降低或抑制lncRNARP11-196G18.22(LETN)表达的试剂在制备治疗癌症的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中降低或抑制lncRNA RP11-196G18.22(LETN)表达的试剂选自由以下组成的组：gapmer、反义RNA、siRNA、esiRNA、shRNA、miRNA、RNA适体、TALEN、CRISPR和锌指核酸酶。
7.根据权利要求5所述的应用，其中所述癌症为实体瘤，优选选自由以下组成的组：肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、软组织癌、胆癌、膀胱癌、直肠癌、子宫内膜癌、头颈癌、结肠癌、食管癌和甲状腺癌。
8.根据权利要求5所述的应用，其中所述lncRNA RP11-196G18.22的核苷酸序列如SEQID NO:1所示(Ensembl登录号ENST00000564237.1)。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的应用，其中所述药物还包含另外的抗癌剂例如化疗药，例如用于降低或抑制NPM1表达或突变的试剂或抑制LETN与NPM1的结合的试剂。
10.一种筛选抗癌药物的方法，所述方法包括下述步骤：
1)确定过表达lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的细胞中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平；
2)将候选化合物与步骤1)的细胞接触；
3)确定在步骤2)后细胞中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平；和
4)比较步骤1)和步骤3)中确定的lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平，其中lncRNA RP11-196G18.22(LETN)的表达水平降低指示所述候选化合物具有抗癌潜力，
优选所述细胞为癌细胞。
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