CN113528521A - 一种siRNA及其应用 - Google Patents

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耿照玉
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Abstract

本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体公开了一种siRNA及其应用，其siRNA抑制IHH基因表达，所述siRNA为双链，其核酸序列为：正义链：5’CCGACAUCAUCUUCAAGGATT 3’；反义链：5’UCCUUGAAGAUGAUGUCGGTT 3’。本发明通过siRNA影响IHH基因功能及信号通路基因的表达水平来影响鸡的匍匐性状，有助于我们更加深入地理解鸡匍匐性状形成的分子机理和调控机制，进一步开展匍匐鸡的保种和改良工作，对畜禽重要经济性状的分子育种和生产具有重要作用。

Description

一种siRNA及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种siRNA及其应用。
背景技术
鸡的匍匐性状是一些鸡品种中存在的一种特有的矮小表型，是鸡中特有的肢体异常 表型。匍匐性状是遗传学中的一个经典性状，个体表现为胫短身矮、翅膀短小、体躯匀称、骨骼发育异常，尤其是胫软骨发育不良。匍匐性状是由常染色体上显性纯合致死基 因Cp所控制(Landauer W,et al.,1930)，但国际上对其性状及基因的研究仍有待深入。
印度hedgehog基因(IHH)编码信号因子hedgehog家族的一员，最初在早期软骨骨骼元素的软骨细胞中表达(Bitgood MJ,et al.,1995)。IHH是最早发现的HH家族重要 成员，IHH主要表达于软骨组织和肠道中，参与软骨细胞的增殖、分化和造骨细胞分化 过程。研究发现在出生后来源于软骨细胞的IHH对于维持生长板、软骨表面及骨小梁的 形态是必不可少的。已有研究通过高通量测序定位了IHH是影响鸡匍匐性状的关键基 因，IHH基因的缺失是导致匍匐性状的突变原因(Jin et al.,2016)。据研究报道，鸡IHH 基因位于7号染色体上，由3个外显子与2个内含子组成，主要表达于软骨组织，在软 骨发育过程中起着重要作用(Bren-Mattison Y,et al.,2011)。IHH主要由前肥大软骨细 胞合成和分泌,调节生长板软骨细胞的肥大化和软骨内成骨的过程(St-Jacques B,et al., 1999)。此外，IHH是调控机体骨骼发育的重要因子，IHH信号通路是一个经典的生物 发育信号通路，在骨骼发育过程中起非常重要的作用，尤其与软骨细胞增殖和分化密切 相关。软骨细胞是成熟软骨组织内唯一的细胞类型，其主要起到维持关节软骨组织内环 境稳态的作用。在参与协调软骨细胞增殖、分化和造骨细胞的分化过程中IHH信号起到 关键调控作用，进而可通过调控IHH基因信号通路来改善鸡的匍匐性状。
基于上述内容，提出一种siRNA及其应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种siRNA及其应用，通过siRNA影响IHH基因功能及信号通路基因的表达水平来影响鸡的匍匐性状，有助于我们更加 深入地理解鸡匍匐性状形成的分子机理和调控机制，进一步开展匍匐鸡的保种和改良工 作，对畜禽重要经济性状的分子育种和生产具有重要作用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种siRNA，其抑制IHH基因表达，所述IHH基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述siRNA为双链，其核酸序列为：
正义链：5’CCGACAUCAUCUUCAAGGATT 3’；
反义链：5’UCCUUGAAGAUGAUGUCGGTT 3’。
本发明还提供了一种上述siRNA在鸡匍匐性状形成的分子机理和调控机制中的应用。
本发明还提供了一种上述siRNA在匍匐鸡的保种和改良工作中的应用。
本发明还提供了一种上述siRNA在畜禽重要经济性状的分子育种和生产中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种siRNA，该siRNA可有效抑制IHH基 因的表达，通过影响IHH基因功能及信号通路基因的表达水平来影响鸡的匍匐性状， 有助于我们更加深入地理解鸡匍匐性状形成的分子机理和调控机制，进一步开展匍匐鸡 的保种和改良工作，对畜禽重要经济性状的分子育种和生产具有重要作用。
附图说明
图1是FAM标记的siRNA转染效率示意图(100×)，其中A为暗场观察到的视 野，B为明场观察到的视野；
图2为siRNA干扰后IHH基因的mRNA表达量；
图3为siRNA在软骨细胞转染后的细胞周期检测图；
图4为siRNA在软骨细胞转染后的细胞凋亡检测图；
图5为siRNA干扰IHH基因后通路基因的mRNA表达量变化。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域 的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的 试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1siRNA序列设计
根据生物信息学方法在GeneBank获取IHH基因序列(NM_204957.2)，如SEQ IDNO.1所示，根据siRNA序列设计原则，利用相关生物网站(http://sidirect2.rnai.jp/；http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html)设计出若干对siRNA干扰序列，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行比对，确保无同源性。共涉及筛选 出3对siRNA，分别命名为siRNA1、siRNA2和siRNA3：
siRNA1序列：正义链为5’CCGACAUCAUCUUCAAGGATT 3’，
反义链为5’UCCUUGAAGAUGAUGUCGGTT 3’。
siRNA2序列：正义链为5’CAUGCUGCUAUUUGUGUGUTT 3’，
反义链为5’ACACACAAAUAGCAGCAUGTT 3’。
siRNA3序列：正义链为5’GGAGGCCGGCUUUGACUGGTT 3’，
反义链为5’CCAGUCAAAGCCGGCCUCCTT 3’。
2.2siRNA干扰后IHH基因mRNA表达量检测
2.2.1对照试验
将软骨细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞融合度为80％时进行转染，转染方法为脂质体转染(LipofectamineTM2000Transfection Reagent)，方法按照产 品说明，转染试剂与siRNA的转染比例为5:1(μL/μg)。
将siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA阴性对照(NC)及siRNA荧光对照 (siRNA-FAM)转染生长状态良好的鸡软骨细胞，利用FAM标记的siRNA进行转染效 率的评估。在荧光显微镜下观察，通过荧光判断转染效率，转染效率可达到80％，结果 见图1。
siRNA阴性对照(NC)：正义链为5’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3’，反义 链为5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT 3’。
siRNA荧光对照(siRNA-FAM)：正义链为5’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3’， 反义链为5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT 3’。
2.2.2qPCR检测
转染48h后，收取细胞，PBS洗涤后，离心去上清，采用Trizol方法提取细胞总 RNA，保存于-80℃，用于cDNA的合成。逆转录后进行PCR反应，具体如下：
提取总RNA：使用Trizol法提取siRNA转染后的软骨细胞总RNA，步骤如下：
(1)样品中加入TRIzol Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5min， 使蛋白核酸复合物完全分离；
(2)以每1mL TRIzol Reagent加入200μL氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈 振荡15s，室温放置2min；
(3)4℃12000rpm离心10min，RNA水相转移至新离心管中，加入等体积的70％ 乙醇(无RNase水配制)，颠倒混匀；
(4)将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中；
(5)向吸附柱中加入350μL Buffer RW1，12000rpm离心20s，倒掉收集管中的 废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)配制DNase I混合液，向吸附柱中直接加入80μL DNase I混合液，20-30℃ 孵育15min；
(7)向吸附柱中加入350μL Buffer RW1，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附 柱重新放回收集管中；
(8)向吸附柱中加入500μL Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心20s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，重复此步骤1次；
(9)12000rpm离心2min，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温晾干后放于一 个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30-50μL RNase-FreeWater，室温 放置1min，12000rpm离心1min，收集RNA溶液，-80℃保存RNA。
逆转录：使用Transgen反转录试剂盒操作。利用提取的总RNA反转录cDNA，反 转录的cDNA保存于-20℃。
表1 cDNA合成体系
Figure BDA0003153169810000041
cDNA合成反应程序：42℃1h，95℃3min。
PCR条件：采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR(相对定量)进行qPCR检测， 反应体系为20μL，每体系检测2μL cDNA模板。
表2 qPCR反应体系
Figure BDA0003153169810000051
反应程序为：(1)94℃，30s，(2)94℃，5s，(3)61℃，35s，(4)65℃， 60s，(2)-(4)40个循环。同时以GAPDH为内参，结果如图3所示，使用的qPCR 引物如表3所示：
表3 qPCR引物序列
Figure BDA0003153169810000052
2.2.3结论
如图2所示，经siRNA转染的软骨细胞中，IHH基因的mRNA表达水平与未转染 siRNA的软骨细胞相比显著下降(P<0.01)，且siRNA1干扰序列下调最为显著，因此 以siRNA1为最佳干扰序列进行IHH基因功能及下游基因的检测。
2.3siRNA干扰IHH基因的下游实验
2.3.1细胞周期检测
将鸡软骨细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔培养板中，待细胞融合度为80％时进行转染(步骤参照2.2)，转染48h后收集细胞。细胞消化后用PBS洗涤一次，离心 1500rpm，5min，去上清，加入1mL 75％乙醇固定于-20℃；取固定的细胞离心8000 g，4min，用PBS洗涤一次8000g，4min；加入100μg/mL的RNase A 100μL重悬细 胞，37℃，30min。加入400μL PI(50μg/mL)染色液混匀，置4℃，避光孵育30min， 上机检测。
检测结果如图3所示，转染48h后，siRNA组S期细胞占比为3.83％，相较于NC 组S期细胞占比为8.98％，siRNA组S期细胞占比明显降低，干扰IHH基因表达，细胞 增殖减少。结果表明利用siRNA干扰IHH基因表达，细胞增殖减少。
2.3.2细胞凋亡检测
将鸡软骨细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔培养板中，待细胞融合度为80％时进行转染(步骤参照2.2)，转染48h后收集细胞。将细胞培养液吸出至一离心管内， PBS洗涤贴壁细胞一次，用不含EDTA的胰酶消化细胞；细胞消化下来后，加入刚收集 至离心管中的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5min，弃上清，收 集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数；取1～5×105重悬的细胞，1000g离心5min， 弃上清，加入500μL结合液轻轻重悬细胞；然后加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混 匀后再加入5μL碘化丙啶，轻轻混匀；室温避光孵育10min；直接进行流式细胞仪检测。
检测结果如图4所示，转染48h后，NC组细胞凋亡率为13.66％，siRNA组为37.95％，IHH基因干扰后细胞凋亡增加。结果表明siRNA干扰IHH基因表达，导致细胞数量减 少。
2.3.3下游基因的qPCR检测
将软骨细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞融合度为80％时进行转染，转染方法为脂质体转染(LipofectamineTM2000Transfection Reagent)，方法按照产 品说明，转染试剂与siRNA的转染比例为5:1(μL/μg)。
qPCR检测：转染48h后，收取细胞提RNA，逆转录后进行PCR反应，具体如下： 提取总RNA：使用Trizol法提取siRNA转染后的软骨细胞的总RNA。
逆转录：使用Transgen反转录试剂盒操作。
PCR条件：采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR(相对定量)进行qPCR检测， 反应体系为20μL，每体系检测2μL cDNA模板。反应程序为：(1)94℃，30s，(2) 94℃，5s，(3)61℃，35s，(4)65℃，60s，(2)-(4)40个循环。同时以GAPDH 为内参，使用的qPCR引物如表4所示：
表4下游基因qPCR引物序列
Figure BDA0003153169810000061
Figure BDA0003153169810000071
如图5所示，本发明的siRNA干扰IHH基因后，与对照组相比，ALP、ColⅩ、TGF-β1、Wnt5a、Wnt11、PTHrP、JAK2、BMP6的表达量均下调，其中PTHrP的表达量下调显 著(P<0.05)，ALP、ColⅩ、TGF-β1、Wnt11、JAK2的下调极显著(P<0.01)；Col Ⅱ的表达量上调极显著(P<0.01)；Wnt5a、BMP6基因表达量虽然下调，但与对照组 相比没有显著性差异(P>0.05)。
以上实施例中细胞周期、细胞凋亡及通路基因mRNA表达量结果表明：本发明的siRNA能够显著抑制软骨细胞的增殖，增加细胞的凋亡，通过影响IHH信号通路基因的 表达水平来影响鸡的匍匐性状，有助于我们更加深入地理解鸡匍匐性状形成的分子机理 和调控机制，进一步开展匍匐鸡的保种和改良工作，对畜禽重要经济性状的分子育种和 生产具有重要作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发 明的保护范围。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种siRNA及其应用
<141> 2021-07-08
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1227
<212> DNA
<213> 鸡(CHICKEN)
<400> 1
atgaagccgg cgcggctgct gctgctgctg agcgggtgcg cgctgctgct ggcgccggcc 60
gtgcgctgct gcgggccggg cagggttgtg ggcagccgcc gccggccgcc ccgcaagctc 120
atcccgctcg cctacaagca gttcagcccc aacgtgcccg agaagacgct gggggccagc 180
gggcgctacg agggcaagat cgcgcggaac tcggagcgct tcaaggagct cacgcccaac 240
tacaaccccg acatcatctt caaggacgag gagaacaccg gcgccgaccg gctcatgacc 300
cagcgctgca aggaccgcct gaactccctg gccatctccg tcatgaacca gtggccgggg 360
gtgaagctgc gggtgacgga gggctgggat gaggacggcc accactcgga ggagtcgctg 420
cattacgagg gccgagccgt ggacatcacg acgtcagaca gggaccgcaa caagtacggc 480
atgcttgccc gcctggctgt ggaggccggc tttgactggg tctactacga gtccaaggcg 540
cacatccact gctccgtcaa gtcagagcac tcggctgccg cgaagacggg cggctgcttc 600
cccgggcggg cgctggcgac gctggagaac ggtgcccgga cgccactgtg ggcactgcgg 660
ccgggccagc gggtgctggc gatggacggg gcgggccggc ccacctacag cgacttcctg 720
gccttcctgg acaaggagcc gcgcgccctc actgccttcc acgtcatcga gacgcggcag 780
ccgccccggc gcctggccct gacgcccacc cacctgctct tcgtggccga caacgcctcg 840
gcgcccgccg cccaattccg ccccaccttc gccagccacg tgcagcccgg acacttcgtg 900
ctggtggcgg tgggctcggg ggggctgcag cccgccgaag tggtgggggt gaggggccgg 960
acggacgtgg gggcttacgc cccgctgacg cgacacggga cgctggtggt ggacgacgtg 1020
gtggcctcgt gcttcgccct ggtgcgggag cagcagctgg cgcagatggc cttctggccg 1080
ctgcggctgt accacagcct gctggggggg ccgggggtgc agggcgacgg tgtgcactgg 1140
tactcggggc tgctctaccg cctgggcagg atgctgctgc cccccgacag cttccacccg 1200
ctgggggcgc cccgggccga gagctga 1227

Claims (5)

1.一种siRNA，其特征在于，其抑制IHH基因表达，所述siRNA为双链，其核酸序列为：
正义链：5’CCGACAUCAUCUUCAAGGATT 3’；
反义链：5’UCCUUGAAGAUGAUGUCGGTT 3’。
2.根据权利要求1所述的一种siRNA，其特征在于，所述IHH基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
3.一种如权利要求1所述的siRNA在鸡匍匐性状形成的分子机理和调控机制中的应用。
4.一种如权利要求1所述的siRNA在匍匐鸡的保种和改良工作中的应用。
5.一种如权利要求1所述的siRNA在畜禽重要经济性状的分子育种和生产中的应用。
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