KR20130017309A

KR20130017309A - 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포 분화 촉진용 및 항암 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20130017309A
Application number: KR1020110079668A
Authority: KR
Inventors: 이진우; 백승일; 정호선
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2011-08-10
Filing date: 2011-08-10
Publication date: 2013-02-20
Also published as: KR101286154B1

Abstract

본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 연골 분화 촉진용 조성물을 포함하는 연골 손상 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 LEF-1의 단백질의 발현을 억제하는 물질로서 서열목록 제3서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 miR-449a에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 줄기세포(바람직하게는, 중간엽 중기세포)의 연골세포로의 분화를 촉진시킨다. 본 발명에서 발굴된 miR-449a의 타겟은 LEF-1으로서 광범위한 생물학적 신호 전달 경로에서 상당히 중요한 역할을 하는 전사 관련 인자이고, 연골세포 분화 및 연골형성에 있어서 중요한 역할을 하며, 이에 연골 손상 질환의 실질적인 치료 타겟이 될 수 있다. 본 발명에 따라 miR-449a에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 형질전환된 줄기세포는 연골세포로의 분화가 촉진되고 연골을 형성한다. 본 발명에서 발굴된 miR-449a는 직접적으로 LEF-1을 타겟팅하여 LEF-1의 발현을 억제한다. 이에 다양한 암에서 과발현되는 LEF-1을 억제할 수 있는 항암 약제학적 조성물로 활용이 가능하다.

Description

안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포 분화 촉진용 및 항암 약제학적 조성물{Composition for Promoting Chondrogenesis from Stem Cells and Anti-Tumor Composition Comprising Anti-sense Oligonucleotides}

본 발명은 줄기세포로부터 연골세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항암 약제학적 조성물에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포는 Frienstein에 의해 처음 알려진 섬유아세포-유사 세포로서, 플라스틱-부착능을 가지고 있는 세포이다¹. 초기 발견에 따르면 중간엽 줄기세포는 지방, 힘줄, 연골 및 뼈 등의 다양한 결합조직으로의 분화가 가능하다고 알려졌다² ^-6. N-카드헤린 신경세포 접착 물질(N-cadherin, neural cell adhesion moleucule; NCAM)과 피브로넥틴의 상향조절에 의해 세포 응집이 유발되고, 이로 인해 시작되는 복잡한 단계를 통하여 세포와 세포 및 세포와 세포외기질과의 상호작용이 촉진 되면서 연골 형성이 일어난다. 분화하는 세포들이 연골아세포기로 수임되는 동안, 세포들은 세포외 기질의 주요 구성물이 타입 Ⅰ Collagen으로부터 보다 연골질에 가까운 타입 Ⅱ, 타입 Ⅸ 및 타입 Collagen, Cartilage oligomeric matrix protein-1 (COMP-1) 및 아그레칸(aggrecan)으로 전환된다. 결국 연골세포는 연골형성 비대 단계에 특이적으로 발현하는 타입 X Collagen의 발현을 시작하는 비대 단계에 도달한다. 마침내 뼈의 자연적 성장과 발달의 부분으로, 비대성 연골세포는 세포사멸하고 뼈로 대체된다. 여러 종류의 연골형성에 관련된 인자들의 발현 패턴은 연골형성의 각 단계마다 다르게 나타난다⁷(도 1).

연골형성의 복잡한 과정은 TGFβ, FGF, Wnt 및 Indian hedgehog(Ihh) 신호를 포함하는 다양한 신호전달 경로에 의해 조절된다. 연골형성에 잠정적으로 관여하는 위와 같은 종류의 조절자들 가운데, Wnt 신호는 많은 연구자들의 특별한 관심을 받고 있다. 그 이유는 Wnt 신호는 배아 발달, 조직 형태 형성, 신체 완성(patterning) 및 종양 형성을 포함하는 광범위한 생물학적 과정에 개입하고 있기 때문이다⁸.

인간에게 알려져 있는 19개의 Wnt 유전자는 통상적인(canonical) 경로로 알려진 Wnt1, Wnt3a, Wnt7a 및 Wnt8과 비통상적인(non-canonical) 경로로 알려진 Wnt4, Wnt5a 및 Wnt11로 분류될 수 있다. 통상적인 경로로, β-카테닌 은 Wnt 신호 경로의 핵심적인 매개자이고, LEF-1(Lymphoid Enhancer Binding Factor 1)와 T-세포 인자(TCF) 단백질의 전사 공동 활성 인자로 활동한다. 통상적으로, Wnt는 세포막 수용체의 Frz family에 결합하여, 글리코겐 신타아제 카이나아제-3(GSK-3)의 β-카테닌을 인산화 하여, β-카테닌의 유비퀴틴화와 분해를 억제한다. 그 후 β-카테닌은 세포질에 축적되고, 핵 안으로 이동하여 전사 인자인 TCF/LEF family와 결합하고, 궁극적으로 하위 타겟 유전자의 발현을 유도한다⁹(도 2).

본 발명자들은 고효율 탐색방법(high throughput screening)과 함께 정량적 실시간 PCR을 사용하여, β-카테닌의 직접적인 타겟 단백질인 LEF-1이, 연골형성 과정 중 특이적인 발현 패턴을 보이고, 이 특정 유전자에 결합하는 microRNA를 연구하였다.

17-23 뉴클레오티드 길이를 가지는 miRNA는 세포 증식¹⁰ ^,11, 세포사멸¹² ^,13, 면역반응¹⁴, 단백질 발현¹⁵ ^-17 및 조직 발달¹⁸ ^-24을 포함하는 다양한 과정에 영향을 주고 있다. 기능을 할 수 있는 복합체인 RISC(RNA-induced silencing complex)²⁵단백질 복합체를 형성함으로써, miRNA는 타겟 단백질의 3’UTR의 상보적인 염기서열을 인식하고, mRNA 분해²⁶와 단백질해독(translation) 억제작용²⁷의 두가지 매커니즘으로 유전자 발현을 억제한다. 최근 연골형성에 있어 핵심적인 조절자로 소수의 miRNAs가 실험적으로 확인되었다. 한 연구에 따르면, miRNA-19a의 타겟이 연골 내 뼈 형성의 중요한 단백질인 CCN2/CTGF 라고 밝혀졌다²⁸. 분화 만능 C3H10T1/2 줄기세포의 펠렛 배양에 있어서, miRNA-199a는 초기 단계의 저해제로 알려졌다. mir-199a를 처리하면, 핵심적인 연골형성 마커인 COMP 단백질, SOX9 및 타입 Ⅱ Collagen의 의미 있는 감소가 관찰되는 반면, mir-199a의 억제는 상기 유전자들의 발현 증가가 나타난다²⁹. LEF-1과 함께 일반적인 Wnt 신호 경로는 광범위한 생물학적 신호 전달 경로에서 상당히 중요한 역할을 하고, 암세포의 증식, 성장 및 발달에도 관여하고 있기 때문에 연골형성 또는 발달 생물학의 분야에만 제한될 뿐만 아니라 LEF-1의 발현을 조절하는 잠정적인 microRNA에 대한 정보는 당업게에 인체 생리학의 전반적인 이해에 있어보다 깊은 통찰을 제공한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 촉진할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 miR-449a 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 LEF-1(Lymphoid Enhancer Binding Factor 1)의 발현을 유도함으로써 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 촉진하는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 줄기세포로부터 연골세포 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 연골 손상 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 줄기세포로부터 연골세포를 분화하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 LEF-1의 mRNA서열에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 항암 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 microRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 촉진할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 miR-449a 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 LEF-1(Lymphoid Enhancer Binding Factor 1)의 발현을 유도함으로써 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 촉진하는 것을 규명하였다.

본 발명의 조성물은 서열목록 제1서열의 microRNA-449a(miR-449a)에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 타겟으로 하는 microRNA(miRNA), 특히 miRNA의 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 “상보적 핵산-기반 억제제”로 기재될 수 있다.

서열목록 제1서열은 miR-449a의 성숙 서열을 나타낸다. 서열목록 제1서열에서 2번째부터 8번째까지의 뉴클레오타이드 서열은 miR-449a의 씨드 서열이다. 일반적으로 miRNA의 씨드 서열은 타겟 인지에 매우 중요한 서열로서, 다양한 종에 대하여 보존적(conserved)이다(Krenz, M. et al., J. Am. Coll . Cardiol . 44:2390-2397(2004); H. Kiriazis, et al., Annu . Rev . Physiol . 62:321(2000)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 2번째 내지 8번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열(즉, miR-449a의 성숙 서열)중 1번째 내지 22번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 명세서에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 언급하면서 사용되는 용어 “상보적”은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miR-449a 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다양한 분자를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA 분자이며, 보다 바람직하게는 RNA 분자이다. 선택적으로 , 본 발명에서 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드(RNA), 디옥시리보뉴클레오타이드(DNA), 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)이다. 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 2’-O-알킬 올리고뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 2’-O-C₁ _-3 알킬 올리고뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 2’-O-C₁ _-3 메틸 올리고뉴클레오타이드이다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-449a에 상보적인 서열을 가지는 핵산-기반 억제제를 포함하는 포괄적인 의미를 갖는다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 포함되는 것은, 예를 들어 좁은 의미의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안타고미어 및 억제 RNA 분자를 포함한다.

용어 “안타고미어”는 단일-가닥 화학적-변형 리보뉴클레오타이드로서 miR-449a에 적어도 부분적으로 바람직하게는 완전하게 상보적인 서열을 갖는다. 안타고미어는 하나 또는 그 이상의 변형 뉴클레오타이드(예컨대, 2'-O-메틸-당 변형)를 포함한다. 어떤 구현예에 따르면, 안타고미어는 변형 뉴클레오타이드만을 포함한다. 안타고미어는 하나 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하며 이에 부분적으로 또는 완전히 포스포로티오에이트 백본을 갖게 된다. 인 비보 운반 및 안정성을 개선하기 위하여, 안타고미어는 그의 3‘-말단에 콜레스테롤 또는 다른 부위를 결합시킬 수 있다. miR-449a을 억제하기 위하여 적합하여 안타고미어의 길이는 7-50 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10-40 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 20-25 뉴클레오타이드이다.

miR-449a 기능의 억제는 전형적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 달성될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 또는 그 이상의 LNAs(Locked nucleic acids)를 포함할 수 있다. LNA는 변형 리보뉴클레오타이드로서 리보오스 당 부위의 2‘ 내지 4’ 탄소 사이에 추가적인 브리지를 포함하여 잠금(locked) 형태를 가지게 되며 이에 LNA가 있는 올리고뉴클레오타이드는 개선된 열 안정성을 가지게 된다. 택일적으로, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 PNAs(peptide nucleic acids)를 포함할 수 있으며, 이는 당-포스페이트 백본 대신에 펩타이드-기반 백본을 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 포함할 수 있는 다른 화학적 변형은, 2'-O-알킬(예컨대, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸), 2'-플루오로 및 4'-티오 변형과 같은 당 변형; 포스포로티오에이트, 모포리노 또는 포스포노카복실레이트 결합과 같은 백본 변형(예컨대, 미국 특허 제6,693,187호 및 제7,067,641호)을 포함한다. 다른 구현예에서, 적합한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 2'-O-메톡시에틸 "갭머"이며 이는 5‘-말단 및 3’-말단에 2'-O-메톡시에틸-변형 리보뉴클레오타이드를 포함하며 중앙에 적어도 10개의 디옥시리보뉴클레오타이드를 갖는다. 이 "갭머"는 RNA 타겟의 RNase I 의존성 파쇄 기전을 촉발시킬 수 있다. 안틴센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 7-50 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10-40 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 20-25 뉴클레오타이드이다.

miR-449a의 기능을 억제하는 다른 접근 방식은 억제 RNA 분자를 투여하는 것이며, 상기 억제 RNA 분자는 miR-449a의 성숙 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 이러한 억제 RNA 분자는 이중가닥 siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 라이보자임을 포함한다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-449a와 상보적인 서열을 가지며 miR-449a를 억제하여 그 타겟 유전자인 LEF-1의 발현을 유도한다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 줄기세포로부터 연골세포 분화를 촉진한다. 상기 줄기세포는 당업계에 공지된 모든 줄기세포, 예컨대 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell) 및 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)를 포함한다. 바람직하게는, 줄기세포는 다능성 줄기세포이다. 보다 바람직하게는, 상기 다능성 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 근육 줄기세포, 조혈모 줄기세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 내피 줄기세포 및 표피 줄기세포이고, 보다 더 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 가장 바람직하게는 골수-유래 중간엽 줄기세포이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 microRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 형질전환된 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포 분화 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상기 연골세포 분화 조성물을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분화를 유도하는 단계는 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 LEF-1(Lymphoid Enhancer Binding Factor 1)의 발현을 증가시켜 실시된다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 miR-449a를 억제하여, 그 타겟 유전자인 LEF-1의 발현을 유도함으로써 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 촉진할 수 있다. LEF-1은 광범위한 생물학적 신호 전달 경로에서 상당히 중요한 역할을 하는 전사 관련 인자로, 연골형성 또는 발달 생물학의 분야에만 제한되지 않고, 인체 생리학 전체 영향을 준다는 것이 당업계에 지식을 가진 자에게 통상적으로 알려져 있다. 또한 LEF-1의 상위의 주요한 신호전달 경로는 Wnt-β-카테닌 신호전달 경로로 알려졌다. 통상적인 Wnt는 세포막 수용체의 Frz family에 결합하여, 글리코겐 신타제 키나제-3(GSK-3)의 β-카테닌을 인산화 하여, β-카테닌의 유비퀴틴화와 분해를 억제한다. 그 후 β-카테닌은 세포질에 축적되고, 핵 안으로 이동하여 전사인자인 TCF/LEF family와 결합하고, 궁극적으로 하위 타겟 유전자의 발현을 유도한다.결과적으로 LEF-1의 증가는 연골세포의 분화와 연골형성을 나타내는 마커인 타입 Ⅱ 세포, SOX9, 타입 X Collagen 및 MMP13을 증가시키므로 줄기세포를 연골세포로 분화시키며, 연골을 형성할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 microRNA-449a에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 형질전환된 줄기세포는 당업계에 공지된 다양한 형질전환 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 줄기세포 내로 주입할 수 있다.

상기 microRNA-449a에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 형질전환된 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 유도하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 연골세포 분화 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 분화 유도는 당업계에 공지된 통상적인 연골세포 분화용 배지(예컨대, DMEM-High Glucose, 인슐린 트렌스페린 셀레니움A, 아스코르브산 및 TGF-β3 포함)에서 줄기세포를 배양하여 실시할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 연골 분화 촉진용 조성물을 포함하는 연골 손상 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 연골세포 분화 조성물을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독 투여 또는 병용 투여 방식으로 투여 될 수 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기세포와 함께 연골 손상 부위에 국소 투여되어 연골 손상을 치료하는 효능을 발휘할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물을 이용하여 치료할 수 있는 연골손상 질환은 바람직하게는, 골 관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 및 외상에 의한 관절 손상을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 관절강내 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 투여되는 관절 내 부위에 있는 줄기세포 또는 병용 투여되는 줄기세포가 연골세포로 분화되는 것을 촉진시킴으로써, 연골 손상 관련 다양한 질환을 치료할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 LEF-1의 단백질의 발현을 억제하는 물질로서 서열번호 3에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 약제학적 조성물이다.

본 발명의 조성물에 포함되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 약제학적 조성물에 대한 설명은 상기 연골세포 분화 조성물과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 조성물은 서열목록 제3서열의 LEF-1의 mRNA 서열, 바람직하게는 LEF-1의 3'UTR 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 타겟으로 하는 LEF-1, 특히 LEF-1의 mRNA의 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 mRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항암 약제학적 조성물이다.

서열목록 제1서열은 miR-449a 서열로, 2번째부터 8번째까지의 뉴클레오타이드 서열은 miR-449a의 씨드 서열이다. 일반적으로 miRNA의 씨드 서열은 타겟 인지에 매우 중요한 서열로서, 다양한 종에 대하여 보존적(conserved)이다(Krenz, M. et al., J. Am . Coll . Cardiol . 44:2390-2397(2004); H. Kiriazis, et al., Annu . Rev . Physiol . 62:321(2000)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 볼 발명의 조성물인 올리고뉴클레오타이드에 의해 LEF-1(Lymphoid Enhancer Binding Factor 1)의 발현이 억제된다. 본 발명의 실시예에서 상술한 바와 같이, miR-449a는 LEF-1에 직접적으로 결합하여 그 발현을 억제한다. LEF-1은 Wnt 신호 전달의 하위 물질로 Wnt 신호에 의해 β-카테닌이 세포질에 축적되어 핵 안으로 이동하면, 전사인자인 TCF/LEF family와 결합하고, 궁극적으로 하위 타겟 유전자의 발현을 유도함으로써 세포의 성장, 분화 및 다양한 유전자 발현을 초래한다. 다양한 암세포에서는 LEF-1을 과발현하여 암세포의 성장을 위한 메커니즘으로 사용하고 있는 것은 당업계에 지식을 가진 자에게 통상적으로 알려져 있다. 특별히 대장암에서 LEF-1의 과발현 되었다는 보고가 많아 많은 연구자들이 관심을 갖고 있다(Karine H. et al., Nature. vol29. may 2011). LEF-1을 억제함으로써 대장암을 억제하려는 노력이 진행되고 있으며(Tony W. et al., Mol and Cel Biol. vol. 26. 2006. p5284-5299), 본 발명에서는 LEF-1을 억제하는 물질로 miR-449a를 규명함으로써, 다양한 암에서 과발현 된 LEF-1을 억제하여 암 치료에 응용이 가능함을 제시 한다.

본 발명의 조성물로 예방 또는 치료될 수 있는 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암이고, 가장 바람직하게는 대장암이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 대장암 질환에 대하여 예방 또는 치료 효능이 있는 것을 특징으로 하는 항암 약제학적 조성물이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명에 따르면 miR-449a에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 줄기세포(바람직하게는, 중간엽 중기세포)의 연골세포로의 분화를 촉진시킨다.

(b) 본 발명에서 발굴된 miR-449a의 타겟은 LEF-1으로서 광범위한 생물학적 신호 전달 경로에서 상당히 중요한 역할을 하는 전사 관련 인자이고, 연골세포 분화 및 연골형성에 있어서 중요한 역할을 하며, 이에 연골 손상 질환의 실질적인 치료 타겟이 될 수 있다.

(c) 본 발명에 따라 miR-449a에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 형질전환된 줄기세포는 연골세포로의 분화가 촉진되고 연골을 형성한다.

(d) 본 발명에서 발굴된 miR-449a는 직접적으로 LEF-1을 타겟팅하여 LEF-1의 발현을 억제한다. 이에 다양한 암에서 과발현되는 LEF-1을 억제할 수 있는 항암 약제학적 조성물로 활용이 가능하다.

도 1은 연골형성의 과정 중 중요한 연골형성 마커 유전자들의 발현 패턴을 나타내는 모식도이다.
도 2는 일반적인 Wnt 신호전달 경로와 Wnt와 LEF/TCF 전사인자와의 상호작용을 보여주는 모식도이다.
도 3은 미세배양을 통해 연골형성을 최적화한 데이터로, 연골형성의 마커인 타입 Ⅱ Collagen, SOX9, 타입 X Collagen의 증가를 보여준다.
도 4는 연골형성의 정도를 보여주는 데이터로, 연골분화를 하지 못하는 배양액에서 배양한 줄기세포와 비교하여 연골형성을 일으키는 배양액에서 배양한 중간엽 줄기세포에서 타입 Ⅱ Collagen의 증가를 보여준다.
도 5는 연골형성을 확인할 수 있는 연골형성 마커 유전자들의 발현 패턴을 보여주는 실시간 PCR 결과이다. (A)는 아그레칸(aggrecan), (B) SOX9 및 (C) 타입 X collagen에 관한 데이터로, 아그레칸과 SOX9는 중간엽 줄기세포에서 증가되었고, 연골세포 비대의 마커인 타입 X Collagen거의 변화되지 않았음을 보여준다.
오른쪽 패널은 연골형성이 유도된 군과 그렇지 않은 군에서 가장 큰 발현 패턴의 차이를 보이는 3개의 유전자를 보여주는 데이터로, (D) LEF-1, (E) c-Jun 및 (F) FOCO4의 발현 차이를 보여준다. Day 0 CT는 배양 0일째의 정상대조군이고, Day 10 CT는 연골형성이 되지 않는 배지에서 10일 배양한 정상대조군 나타태고, Day 10 CH는 연골형성이 되는 배지에서 10일 배양한 연골형성군을 나타낸다.
도 6은 발현 패턴의 변화가 유사한 것을 기준으로 6개 클러스터 그룹으로 분류한 모식도이다. (A) CT0은 배양 0일째의 정상대조군이고, CT10은 연골형성이 되지 않는 배지에서 10일 배양한 정상대조군 나타태고, CH10은 연골형성이 되는 배지에서 10일 배양한 연골형성군을 나타낸다. 연골형성이 유도된 중간엽줄기세포(MSC, mesenchymal stem cell)에서 증가하거나 감소한 유전자들의 스캐터 플롯을 보여준다. (B) LEF-1은 클러스터 6의 그룹에 존재하고 있다.
도 7은 3명의 기증자로부터 확보된 연골형성이 유도된 중간엽줄기세포에서 LEF-1의 발현 프로파일을 보여주는 데이터로 (A) 기증자 1, (B) 기증자 2 및 (C) 기증자 3 이다. 이전의 결과와 비교하여 보면, LEF-1은 분화의 초기 단계에서 발현이 증가하고, 이어 급격하게 감소한다.
도 8은 인간의 골수 유래 연골세포의 연골형성에서 LEF-1 역할을 보여주는 실험결과이다. 중간엽 줄기세포에 siLEF-1 형질전환 후 7일까지 중간엽 줄기세포에서 연골 분화 마커유전자인 타입 Ⅱ Collagen(Col2A1) 및 SOX9가 감소하였고, 연골성숙에 관련된 MMP13 및 타입 X Collagen의 감소를 보여준다.
도 9는 여러 microRNA의 과발현이 (A) SW1353 및 (B) JJ 세포주에서 세포내 LEF-1의 발현에 미치는 영향을 보여주는 데이터이다(^** p-value<0.01).
도 10은 miR-449a의 과발현이 세포내 LEF-1의 발현을 조절하는 것을 보여주는 데이터이다. miR-449a를 과발현 시키면 세포내 LEF-1의 발현이 줄어들고, 반대로 miR-449a를 억제하면 세포내 LEF-1의 발현이 증가함을 보여준다. (A) SW1353 및 (B) JJ 세포주에서 실험한 데이터이고, (C) 웨스턴 블롯 결과로 유사한 패턴 관찰되는 것을 보여주는 결과이다(^** p-value<0.01).
도 11은 miR-449a가 LEF-1의 3‘UTR의 시드 서열에 특이적으로 결합하는 것을 보여주는 데이터이다. pGL3 대조벡터와 miR-449a를 함께 형질전환시켜 miR-449a에 의해 서열 특이적 LEF-1의 발현 감소를 보여준다. (A) LEF-1 mRNA와 결합하는 miR-449a의 서열을 보여주는 모식도이고 (B) pGL3 벡터의 루시페라아제 뒷부분에 1.2 kb LEF-1의 3'UTR을 클로닝한 구조를 보여주는 모식도이고, (C) miR-449a의 존재로 루시페라아제의 기능이 80% 감소한 것을 보여주는 데이터이고, (D) miR-449a 농도 의존적으로 루시페라아제의 기능의 감소를 보여준다.
도 12는 LEF-1에 있어 miR-449a의 서열 특이적 기능을 보여주는 데이터이다. LEF-1의 3'UTR을 클로닝한 pGL3의 LEF-1 3'UTR 서열을 다양하게 변형시켜 LEF-1의 3'UTR에서 miR-449a의 정확한 씨드서열을 확인하였다(A). (B) JJ 세포주와 (C) HeLa 세포주 모두에서 씨드 서열의 돌연 변이로 인해, miR-449a에 대한 루시페라아제의 기능의 억제가 확연하게 회복되는 것을 보여준다(^** p-value<0.01).
도 13은 LEF-1의 직접적인 타겟으로 하는 miR-449a가 연골 형성에 미치는 영향을 나타내는 모식도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

1. 초대 중간엽 줄기세포( MSC ) 배양

임상시험심사위원회(IRB)의 승인에 따른 20-69세의 10명의 성인 기증자로부터 후장 골능(posterior iliac crest)으로부터 골수를 추출하였다. 조형 배양 용기의 표면에 부착하는 타고난 성질을 따라 구체적으로 중간엽 줄기세포를 선별하였다. 세포들은 LG(low glucose)-DMEM (DMEM-LG, Invitrogen, Grand Island, NY, 미국), 10% (v/v)우태아 혈청(FBS) 및 1 x 항생-항진균제(Invitrogen)를 포함하는 배지에서 7일 동안 배양 후에 부유하는 세포들은 제거하고 부착된 세포들을 계속 배양하였다. 평균 약 10일 배양으로, 세포들이 70%의 콘플루언스에 도달하였을 때, 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen)를 이용해서 분리한 후, 1,300 rpm으로 3분간 원심분리 하였다. 초기 배양 세포의 배치를 1로 하였고, 세포들은 6-7세대까지 새로운 10 cm² 플라스크에 배양하였다.

2. 알지네이트 비드(Alginate bead)와 미세 배양 방법을 이용한 연골형성

3-5 세대 사이로 배양한 중간엽 줄기세포는 이전과 동일한 방법으로 수확하였다. 알지네이트 비드 배양으로는, 중간엽 줄기세포를 1.2% (w/v) 알지네이트 비드(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, 미국)로 캡슐레이션 하였다. 보다 구체적으로, 배양액에 존재하는 세포들을 드랍 방식으로 19-게이지 주사바늘에 통과시켜 캡슐레이션하고 102 mM CaCl₂ 용액이 존재하는 6 well 플레이트에 2×10⁶세포/㎖의 농도가 되게 하였다. 세포들을 약 5분 동안 중합 반응시키고, 알지네이트 비드를 염수로 세척하고, 10% 우혈청-DMEM-HG에서 배양하였다.

미세 배양으로는, 세포들은 8,000 세포/㎕의 농도로 10% 우혈청-DMEM-HG에 재부유 하였고, 부유하는 세포들 중 10㎕를 24 well 플레이트의 중앙에 떨어뜨렸다. 세포들의 과건조예방을 위해 1x 인산완충식염수(Thermo Scientific, Logan, Utah, 미국)를 한 방울 추가하였다. 세포들은 37℃에서 5％ CO₂를 포함하는 조건에서 2시간 동안 배양을 통해, 세포들이 플레이트에 부착하도록 자극하였다. 대조군으로 DMEM-High Glucose(DMEM-HG, Invitrogen) 1 ml 배양액에, 1 x 항생-항진균제, 1x 인슐린 트렌스페린 셀레니움A (Invitrogen) 및 50 μg/ml 아스코르브산을 첨가하였고, 연골형성 배양액에는 10 ng/ml TGF-β3(R&D systems, Minneapolis, MN, 미국)를 첨가하였다. 배양액은 2 내지 3일 마다 교체하였다. 인산 완충 식염수로 3번 세척 후, 캡슐레이션비드를 용해하기 위하여 40 mM EDTA를 10분 동안 처리하였다.

3. mRNA 레벨에서의 유전자 발현 분석

중간엽 세포로부터 RNA를 분리는 RNAiso plus(Takara, 일본)을 사용하였다. RNAiso plus 용액 1 ㎖을 수득된 세포에 첨가한 후 파이펫팅을 반복하면서 세포를 충분히 융해시켰다. 세포들은 실온에서 10분 배양한 뒤 클로로포름 200 ㎕를 첨가한 후 혼탁한 색을 나타낼 때까지 볼텍싱 하였다. 5분간 실온에서 배양한 후 4℃에서 15분간 13,000 rpm으로 원심분리를 하였다. 제일 상층부위를 새로운 튜브에 옮긴 후 100% 아이소프로파놀 500 ㎕를 첨가하였다. 볼텍싱 후에 용액을 실온에서 10분간 배양한 후 다시 4℃에서 10분간 13,000 rpm으로 원심분리를 하였다. RNA 펠렛이 잘 유지되게 하면서 상층액을 제거하고, 70% 에탄올을 첨가하여 4℃에서 5분간 10,000 rpm의 속도로 원심분리하였다. 마지막으로 RNA 펠렛을 디에틸피로카보네이트수용액(DEPC water) 30 ㎕에 용해시켰다. 각각의 RNA샘플의 전체적인 양과 농도의 정량은 스펙트로포토미터를 사용하였다. DNA의 역전사는 Omniscript reverse transcription Kit (Qiagen, Venlo, 네털란드)을 사용하였다. 특정한 유전자의 증폭을 위한 PCR 조건과 프라이머(primer) 리스트는 유전자은행과 제조업체로부터 확보하였다(표 1 및 표 2). 모든 유전자의 상대적인 발현보정을 위해 GAPDH을 사용하였다. microRNA 전구체(precursor) 역전사를 위해, NCode^TM miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCRKit 및 MIRC-50(Invitrogen, 미국)를 사용하였고, 그 방법은 제조업체의 설명서에 따랐다. 특정 pre-miRNA를 증폭하기 위한 프라이머 리스트는 Invitrogen 프라이머 데이터베이스(http://escience.invitrogen.com/ncode/)에서 확보하였다(표 3). 모든 pre-miRNAs의 상대적인 발현량 표준화를 위해 U6 snRNA를 사용하였다.

PCR 조건

유전자	조건	사이클
Cbfa1/runx2	94 °C 30초 - 59°C 30초 - 72 °C - 30초	34
SOX-6	94 °C 30초 - 58°C 30초 - 72 °C - 30초	30
SOX-9	94 °C 30초 - 58°C 30초 - 72 °C - 30초	30
타입 II Collagen	94 °C 30초 - 58°C 30초 - 72 °C - 30초	30
타입 X Collagen	94 °C 30초 - 60°C 30초 - 72 °C - 30초	29
GAPDH	94 °C 30초 - 57°C 30초 - 72 °C - 30초	31

RT PCR용 프라이머 서열

유전자	나선	프라이머 염기서열	크기 ( bp )
Cbfa1/runx2	센스	5'-CCACCTCTGACTTCTGCCTC-3'	172
	안티센스	5'-GACTGGCGGGGTGTAAGTAA-3'
SOX-6	센스	5'-ACTGTGGCTGAAGCACGAGTC-3'	562
	안티센스	5'TCCGCCATCTGTCTTCATACC-3'
SOX-9	센스	5'-GAACGCACATCAAGACGGAG-3'	631
	안티센스	5'-TCTCGTTGATTTCGCTGCTC-3'
타입 II Collagen	센스	5'-TTCAGCTATGGAGATGACAATC-3'	472
	안티센스	5'-AGAGTCCTAGAGTGACTGAG-3'
타입 X Collagen	센스	5'-GCCCAAGAGGTGCCCCTGGA-3'	570
	안티센스	5'-CCTGAGAAAGAGGAGTGGAC-3'
GAPDH	센스	5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'	220
	안티센스	5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'

miRNA PCR 분석용 프라이머 서열

microRNA	나선	프라이머 염기서열	크기( bp )
Hsa-miR-449a	센스*	5'-TGGCAGTGTATTGTTAGCTGGT-3‘	약 70 bp
Hsa-miR-106a	센스*	5'-GAAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAG-3'
Hsa-miR-548c-5p	센스*	5'-AAAAGTAATTGCGGTTTTTGCC-3'
Hsa-miR-629	센스*	5'-TGGGTTTACGTTGGGAGAACT-3'
Hsa-miR-299-5p	센스*	5'-TGGTTTACCGTCCCACATACAT -3'
Hsa-miR-411	센스*	5'-CGTAGTAGACCGTATAGCGTACG-3'
Hsa-miR-218	센스*	5'-CGTTGTGCTTGATCTAACCATGT-3'
Hsa-miR-450b-5p	센스*	5'-GCTTTTGCAATATGTTCCTGAATA -3'
Hsa-miR-421	센스*	5'-AACAGACATTAATTGGGCGC-3'
Hsa-miR-149	센스*	5'-GCTCCGTGTCTTCACTCCC -3'
Hsa-miR-138	센스*	5'-GTGTTGTGAATCAGGCCG -3'
Hsa-miR-767-3p	센스*	5'-TGCTCATACCCCATGGTTTCT -3'
Hsa-miR-550	센스*	5'-CCTGAGGGAGTAAGAGCCC -3'
U6 snRNA	센스	5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'	94 bp

별표(*)는 microRNA PCR 반응에 사용된 센스 가닥

mRNA 레벨에서의 유전자 발현 분석에 사용된 실험방법으로서 RT-PCR 및 정량적 실시간 PCR을 사용하였고, 폴리머라아제로는 Takara Ex Taq^TM(Takara, Shiga, 일본)을 사용하였다. 정량적 실시간 PCR 실험 및 분석용 기계로 ABI7500(ABI, Carlsbad, 미국)을 사용하였고, 사용된 프라이머 및 유니버셜 프라이머(Bioneer, 한국)는 다음의 표 4 및 표 5와 같다:

정략적 실시간 PCR 분석용 프라이머 서열

Gene	Strand	Primer Sequence
β-actin	센스	5' GTCCTCTCCCAAGTCCACACAG 3'
β-actin	안티센스	5' GGGCACGAAGGCTCATCATTC 3'
LEF-1	센스	5' GCCACGGACGAGATGATCC 3'
LEF-1	안티센스	5' TGTCTGGCCACCTCGTGTC 3'
Aggrecan	센스	5' CCACTGTTACCGCCACTT 3'
Aggrecan	안티센스	5' GTAGTCTTGGGCATTGTTGT 3'
센스OX9	센스	5' CGACTACGCTGACCATCAGA 3'
센스OX9	안티센스	5' AGACTGGTTGTTCCCAGTGC 3'
타입 X collagen	센스	5' CCAGGACAGCCAGGCATCAA 3'
타입 X collagen	안티센스	5' ATGCCTTCTGGCCCTCGTTC 3'
cJUN		P155634 (Bioneer)
FOXO4		P269629 (Bioneer)

정략적 실시간 PCR 조건

과정	온도	시간
초기 변성단계	95°C	30 초
변성단계	95°C	5 초
어닐링/익스텐션	60°C	34 초
해리 단계

PCR 진행시 총 40 사이클 조건으로 수행하였고, 어닐링/익스텐션이 진행되는 동안 사이버그린 형광을 탐지하였다.

5. cDNA 와 microRNA 마이크로어레이 분석

배양된 중간엽 줄기세포의 RNA는 제조자의 설명서에 따라 RNAiso Plus(Takara, 일본)를 사용하여 분리하였고, 전체 RNA 샘플의 양과 농도 정량은 스펙트로포토미터를 사용하였다. cDNA 발현을 분석을 위해 Affymetrix GeneChipHuman Gene 1.0 ST Array(Affymetrix, Santa Clara, 미국)을 사용하였고, 피어슨 상관분석을 이용하여 연골 형성이 유도된 중간엽 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 유전자를 분석하였다. 분별적 발현 유전자(Differentially Expressed Genes; DEGs)는 관심 집단과 대조 집단의 차이에 대한 통상적인 식을 사용하였다: DEGs = [Day 10 연골형성군 (Day 0 대조군 + Day 10 대조군)]

적어도 두 배 이상의 발현 차이를 보이는 유전자만을 선별하는 엄격한 기준(cut-off threshold)을 사용하였다.

6. 면역 블로팅 분석

전체 세포 분해물의 준비를 위해 분해 버퍼(Promega, Madison, 미국), 프로테아제 10 ㎍/㎖ 및 포스파타아제 저해제를 사용하였다. 준비된 세포 분해물을 4℃에서 15분 동안 13,000rpm의 속도로 원심분리하여 투명한 셀 분해물을 수득하였고, 정량은 수정된 브레드포드 방법을 사용하였다. 세포 분해물은 총 30㎍씩 분주하여 10% SDS-PHAGE에 로딩하였다. 단백질을 PVDF(Amersham, Pharmacia, Piscataway, 미국)막으로 트랜스퍼하기 위하여 트랜스퍼 버퍼[글리신 1.4%, 메탄올 20% 및 Tris-HCL 25 mM(pH 8.3)]를 첨가한 후 50V에서 90분간 반응켰다. PVDF막을 꺼내어 1X TBST(Tris-HCl 50 mM, NaCl 150mM, Tween-20 0.1%)에 스킴밀크를 1%를 첨하한 블로킹 용액에 담근 후 실온에서 1시간동안 회전진탕배양 하였다. LEF-1의 일차 항체(Cell Signaling, Danvers, 미국)를 1:10,000 비율로 사용하여 4℃에서 하루 밤동안 배양하였고, 1X TBST로 워시한 후 안티-토키 겨자무과산효소(HRP) 2차 항체(Amersham Pharmacia, 미국)를 1:5,000 비율로 사용하여 단백질을 검출하였다. β-액틴의 항체(Santa Cruz, 미국)는 내부적 표준 정량물질로 사용하였다.

7. microRNA 의 과발현과 억제 및 LEF -1의 siRNA

검출된 microRNA 기능 분석과 타겟 유전자(LEF-1)에 미치는 영향 알기 위하여, microRNA-mimic(제놀루션, 한국)을 구입하여 microRNA를 과발현 시켰다. 구입한 microRNA는 이중가닥의 형태이고, 내부적인 메커니즘에 의해 성숙된 microRNA로 프로세싱 된다. miR-1은 타겟 유전자인 TWf-1을 억제하는 양성 대조군으로 사용하였고 음성 대조군으로 스크램블 microRNA를 사용하였다(표 6). Lipofectamine 2000(Invitrogen, 미국) 7㎕ 및 4㎕에 microRNA 구조물을 첨가하여 SW1353, JJ 세포주 및 중간엽줄기세포를 형질전환시켰다.

과발현에 사용된 microRNA 미믹

microRNA	가닥	이합체 서열
hsa-miR-1	S	5’ UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU 3’
hsa-miR-1	AS	5’ AUACAUACUUCUUUACAUUCCA 3’
hsa-miR-SC	S	5’ UUACCAGACGUGUCUUCACUCCC 3’
hsa-miR-SC	AS	5’ GGGAGUGAAGACACGUCUGGUAA 3’
hsa-miR-138	S	5’ AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCG 3’
hsa-miR-138	AS	5’ CGGCCUGAUUCACAACACCAGCU 3’
hsa-miR-411	S	5’ UAGUAGACCGUAUAGCGUACG 3’
hsa-miR-411	AS	5’ CGUACGCUAUACGGUCUACUA 3’
hsa-miR-449a	S	5’ UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU 3’
hsa-miR-449a	AS	5’ ACCAGCUAACAAUACACUGCCA 3’
hsa-miR-548c-5p	S	5’ AAAAGUAAUUGCGGUUUUUGCC 3’
hsa-miR-548c-5p	AS	5’ GGCAAAAACCGCAAUUACUUUU 3’
hsa-miR-767-3p	S	5’ UCUGCUCAUACCCCAUGGUUUCU 3’
hsa-miR-767-3p	AS	5’ AGAAACCAUGGGGUAUGAGCAGA 3’

한편, miRNA449a의 기능을 억제하기 위하여 안타고미어로 상보적인 서열의 2’-OME RNA(ST pharm, 한국)를 사용하였다(표 3). 안타고미어의 5' 끝 쪽에는 형질전환 후 시각화를 위하여 FAM 형광물질을 부착된 변형된 형태의 안타고미어를 사용하였고 그 서열은 다음 표 7과 같다:

miR-449a와 안타고미어 염기서열

이름	나선	염기서열
hsa-miR-449a	센스	5’UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU 3
hsa-miR-449a	안티센스	5’ACCAGCUAACAAUACACUGCCA 3
anti-hsa-miR-449a	-	5' ACCAGCUAACAAUACACUGCCA 3'

실험에 사용된 siRNA 이합체는 형질전환 후 시각화를 위해 5’끝에 FITC 형광물질이 부착된 것을 사용하였고 그 서열을 다음 표 8과 같다.

siRNA 이합체 서열

siRNA	Strand	Duplex sequence
siControl	S	5' CCUACGCCACCAAUUUGGU 3'
siControl	AS	5' ACGAAAUUGGUGGCGUAGG 3'
siLEF-1	S	5' GUUAUUCCGGGUACAUAAU 3'
siLEF-1	AS	5' AUUAUGUACCCGGAAUAAC 3'

8. 루시페라아제 리포터 벡터의 제작

LEF-1의 3’UTR에 결합하는 microRNA와 상기 microRNA가 정확히 인식하는 염기서열을 확인하기 위하여, 다양한 형태의 LEF-1 3’UTR을 pGL3 대조 벡터(Promega, 미국)에 클로닝 하였다. 보다 구체적으로는, LEF-1 3’UTR의 1.2 kb와 microRNA-449a의 결합이 예측되는 약 100 bp의 지역을 Xba-I을 이용하여 루시페라아제 뒤쪽에 클로닝 하였고, 사용된 프라이머는 다음 표 9과 같고, Xba-I 제한효소의 인식 부위는 밑줄로 나타내었다:

miR-449a와 안타고미어 염기서열

이름	나선	염기서열
LEF-1 3‘UTR 클로닝용 프라이머	센스	5’ATGCTCTAGAGTGGAAAACGAAGCTCATTCC 3
LEF-1 3‘UTR 클로닝용 프라이머	안티센스	5’ATGCTCTAGATTAAAAAAATGCTCAGCACATTAACT 3

9. 통계적 분석

모든 데이터 분석에 적절한 통계적 분석방법을 사용하였고, 모든 도면 및 표에 통계적 유의성을 나타내는 값은 “*” 및 “**”로 기재하였고, “*”는 p-value<0.05 이고, “**”는 p-value<0.01을 의미한다.

결과

1. 중간엽 세포의 연골형성은 미세 배양 시스템에서 매우 효과적이었다.

이전 연구 결과의 보고에 의하면, 연골형성의 종합적인 과정이 진행되는 동안 타입 Ⅱ Collagen과 SOX9와 같은 핵심적인 마커 유전자의 발현 패턴이 밝혀졌다. 본 발명자들은 다른 배양 방법에 비교하여 미세배양으로 배양된 중간엽 줄기세포에서, 타입 Ⅱ Collagen 및 SOX9의 발현 비율이 상당히 증가한 것을 확인하였다. 미세 배양을 통해 중간엽 줄기세포에서 타입 X Collagen 유전자 발현은 관찰하였지만, 다른 대응 유전자 발현에 비해 타입 X Collagen 유전자 발현의 큰 변화는 관찰하지 못하였다(도 3).

다른 배양과는 다른 미세 배양을 통해, 볼 발명자들은 기존의 발현 프로파일에서 보고된 타입 Ⅱ Collagen 및 SOX9 같은 마커 유전자들의 발현 패턴을 구별할 수 있었다. 본 발명자들은 미세 배양 시스템으로 배양된 중간엽 줄기세포들에서, 보고된 마커 유전자들의 발현 프로파일을 RT-PCR을 통하여 정확하게 확인하였다(도 4).

종합해보면, a)다른 방법에 비하여 미세 배양 방법의 우세한 효용성을 타입 Ⅱ Collagen의 발현 프로파일을 통해 확인하였고, b)미세 배양 방법에 의한 연골형성이, 이전의 보고된 결과와 일치하는 발현 패턴을 보이는 것을 확인하였다.

아래에 언급되는 모든 실험은 미세 배양 방법을 사용하였다. 연골형성을 유도하는 가장 적합한 방법을 확립한 후에, 다양한 기증자로부터 받은 중간엽 줄기세포들은 대조 배양액 또는 연골형성 배양액에서 10일 동안 배양하였다. 이후 배양 첫날(0일)의 대조군, 배양 10일 후의 대조집단 및 연골형성 집단으로부터 추출한 RNA는, 고효율 탐색방법인 마이크로어레이를 사용하기에 앞서, 정량적 실시간 PCR을 통해 연골형성의 효능을 확인하였다. 연골형성이 진행되는 동안 증가되는 마커 유전자인 아그레칸 및 SOX9는 0일, 10일 중간엽 줄기세포 대조군에 비하여 상당히 증가된 발현을 확인하였고, 미세 배양 방법에 의해 유도된 연골형성의 효능도 확인할 수 있었다(도 5A-B). 연골 비대성 마커인 타입 X Collagen의 발현 변화가 없는 상태에서 연골형성이 유도된 중간엽 줄기세포에서 SOX9이 증가된 것을 확인 할 수 있었다. 마이크로 어레이 분석결과 연골형성 특이적으로 알려진 유전자들의 발현 패턴은 정량적 실시간 PCR을 통해 확인 하였다. LEF-1은 연골형성이 유도된 중간엽 줄기세포에서 인상적인 증가를 보였다. 모든 실험은 서로 다른 세명의 기부자에서 유래된 중간엽 줄기세포에서 3번 이상 반복 실험을 하였다.

2. 마이크로 어레이 분석을 통해 연골형성이 유도된 중간엽 줄기세포에서 특이적으로 증가하거나 감소한 발현 패턴을 보이는 유전자들의 클러스터를 규명하였다.

연골형성이 유도된 중간엽 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 유전자의 패턴을 확인하기 위하여, 상기 샘플에서 microRNA와 cDNA 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 피어슨 상관계수법과 그룹간의 적어도 두 배 이상의 발현의 차이를 보이는 유전자만을 선별하는 엄격한 기준을 사용하여, 계층적 군집 분석에서 보이는 바와 같이 발현패턴이 다른 유전자를 분류하였다. 연골형성이 유도되지 않은 대조군을 0일 배양한 군과 10일 배양한 군과 비교하여 연골형성이 유도된 그룹에서 발현이 유의하게 증가하거나 감소된 패턴을 보이는 총 418개의 유전자를 규명하였다. 보다 구체적으로 128개의 유전자들이 연골형성이 유도된 그룹에서 발현 패턴이 증가되었고, 290개의 유전자들은 발현이 감소된 것을 확인하였다. 그 발현 패턴의 변화가 유사한 것을 기준으로 분류해보면 6개 클러스터 그룹으로 분류되었다(도 6). 분별적 발현 유전자를 보다 자세하게 규명하기 위하여 10일간 연골형성이 유도된 그룹에서만 나타나는 유전자 발현 패턴을 분석하였고, 제공된 알고리즘을 사용하여 유전자들의 정보를 수집하였다. 그 중 상위 20개의 유전자들을 다음 표 10에 나타내었다:

연골형성이 유도된 그룹에서 특이적으로 발현이 증가된 상위 20개 유전자

프로브 세트 ID	유전자 기호	유전자 설명	발현율 변화
8092169	TNFSF10	tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10	14.9
8095886	CXCL13	chemokine (C-X-C motif) ligand 13	13.8
8107722	MEGF10	multiple EGF-like-domains 10	11.5
8113666	SEMA6A	sema domain, transmembrane domain (TM), and cytoplasmic domain, (semaphorin) 6A	10.9
7924461	---	---	10.7
8102232	LEF1	lymphoid enhancer-binding factor 1	10.4
8129082	COL10A1	collagen, type X, alpha 1	9.1
8095043	RASL11B	RAS-like, family 11, member B	8.9
7952785	OPCML	opioid binding protein/cell adhesion molecule-like	8
7916654	KANK4	KN motif and ankyrin repeat domains 4	7.3
8055969	ERMN	ermin, ERM-like protein	7.3
8155754	MAMDC2	MAM domain containing 2	7.3
8020779	DSG2	desmoglein 2	6.7
8119974	SLC29A1	solute carrier family 29 (nucleoside transporters), member 1	6.6
8079931	SLC38A3	solute carrier family 38, member 3	6.2
7916667	---	---	5.6
7947184	---	---	5.5
8067233	PMEPA1	prostate transmembrane protein, androgen induced 1	5.3
8063634	MGC4294	hypothetical protein MGC4294	4.8
8054439	ST6GAL2	ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 2	4.7

3. LEF -1( Lymphoid Enhancer Binding Factor 1)은 연골형성의 과정에서 매우 중요한 역할을 한다.

본 발명자들은 초기단계의 고효율 탐색법으로 발견된 418개의 유전자들에서, 연골형성의 전체적인 과정에 영향을 줄 수 있는 각각의 유전자의 존재를 규명하였다. 분석된 유전자들 중에서, c-Jun, FOXO4 및 LEF-1는 Wnt 신호전달에서 다양한 발달 과정에서 보다 중요한 역할을 할 것으로 구별하였다. 본 발명자들은 분석된 유전자들의 발현 패턴에 대한 실험적 결과가 마이크로어레이 데이터와 부합하는지 확인하기 위하려 정량적 실시간 PCR을 수행하였고, 그 결과 두 실험의 데이터가 완벽하게 일치함을 확인하였다(도 5B-F).

중간엽 줄기세포의 연골형성에 있어 Wnt 신호전달의 중요한 역할에 대해 보고한 이전 연구에 기초하여, 본 발명자들은 Wnt 매개자로, β-카테닌 시그널링의 매개자인 LEF-1에 중점을 두고 연구하였다. 마이크로어레이 데이터 결과, LEF-1은 배양 10일 대조군에 비하여, 배양 10일 연골형성군에서 10.4배 높은 것을 확인하였고, 이는 418개의 유전자중 6번째로 높았다. 본 발명자들은 연골형성 진행 과정에서 나타나는 다양한 LEF-1의 발현 프로파일 확인하기 위하여, 연골형성이 진행되는 다양한 날짜 따라 세 명의 기증자의 RNA 샘플을 추출하였고, 실시간 PCR을 사용하여 발현 패턴을 확인하였다(도 7).

마이크로 어레이 데이터와 정량적 실시간 PCR 결과가 일치함을 확인한 후 본 발명자들은 연골형성이 진행되는 동안 LEF-1의 구체적인 역할을 규명하기 위하여 억제제 실험을 수행하였다. 인간의 골수줄기세포(BMSC, Bone Marrow Stem Cell) 세포주에 siControl 또는 siLEF-1 각각 100 nM 을 형질전환하여 연골형성이 가능한 배지에서 10일간 배양하였다. 전체 RNA는 0일, 1일, 3일, 5일, 6일, 7일 및 10일에서 수득하였고, 연골형성에서 LEF-1의 효능 분석을 위해 RT-PCR을 수행하였다(도 8).

LEF-1을 억제한 결과 LEF-1이 연골의 분화와 성숙의 두 과정에 관련이 있음을 보다 분명하게 확인할 수 있었다. 연골의 분화와 관련된 것으로 알려진 타입 Ⅱ Collagen과 SOX9의 발현이 감소되었을 뿐 아니라, 연골의 성숙에 관련된 MMP13 및 타입 X Collagen 역시 감소되는 것을 확인하였다. 이 결과는 LEF-1이 다양한 단계의 연골 전체적 진행과정에 있어서 중요한 역할을 하고 있다는 이전의 연구결과들과 일치 하였다^(30-37).

4. 중간엽 줄기세포의 연골형성이 진행되는 동안 LEF -1 특이적인 타겟 microRNA 의 탐색

연골형성 초기 단계에서 LEF-1의 특이적인 발현 패턴을 확인하였고, 중간엽 줄기세포의 전반적인 연골형성이 진행되는 동안 LEF-1의 중요한 역할을 확인 한 후, LEF-1의 발현을 조절하기 위하여 LEF-1에 특이적으로 결합하는 타겟 micoRNA를 확인하려고 예의 노력하였다. 가장 널리 사용되는 두 개의 microRNA 예측 데이터베이스인, TargetScan(www.targetscan.org)과 miRanda(www.microRNA.org)를 이용하여 LEF-1의 3’UTR에 결합하는 microRNA들을 탐색하였다. 본 발명자들은 상기 데이터베이스로부터 유래된 리스트에서, 마이크로어레이 데이터의 LEF-1의 발현 패턴과 반대되는 현상을 보이는 microRNA를 교차확인 하였다.

연골형성이 진행되는 동안 microRNA의 발현 프로파일을 관찰하였다. 발현 프로파일과 함께 생각해야할 중요한 사항은 miRNA가 타겟인 LEF-1에 직접적으로 결합을 하는지와, 만약 결합한다면 microRNA가 타겟 유전자 발현을 어떻게 조절하는지를 규명하는 것이었다. 이러한 취지에 맞추어 본 발명자들은 연골 분화의 과정에서 LEF-1에 반대되는 발현 패턴을 보이는 5개의 microRNAs를 규명하였다. 발견한 microRNA는 miR-138, -411, -449a, -548 및 -767이고, 이들의 microRNA 미믹을 인간의 연골육종 세포주인 SW1353 및 JJ에 형질전환하여 과발현을 유도하였다. 이후 microRNA가 내부의 LEF-1의 발현에 어떠한 영향을 주는지 정량적 실시간 PCR을 통하여 관찰하였다(도 9). 연골형성에 있어서 miR-449a의 영향을 가장 직접적으로 규명하기 위해서는 BMSC 세포주에서 기능 실험을 수행하는 것이지만, BMSC세포주에 microRNA 미믹 또는 안타고미어를 형질전환 시켜 충분한 시간만큼 형질전환된 물질들을 안정적으로 발현을 유도하도록 형질전환 하는 것은 상당히 난해하였다. 따라서 인간의 연골육종 세포주인 SW1353 및 JJ의 사용은 가장 최선의 대안이었다.

다양한 microRNA 서치 툴을 활용하여, 마이크로어레이 데이터 및 RT-PCR 데이터에서 LEF-1과 반대되는 발현 프로파일을 보이는 microRNA 중에서 LEF-1을 타겟으로 하는 상위 5개의 후보 microRNA를 시험하였고, 그 중 오직 miR-449a만이 인간의 연골육종 세포주인 SW1353 및 JJ에서 LEF-1의 세포내 발현을 유효하게 감소시켰다. 특히 LEF-1이 과발현된 경우 miR449-a는 LEF-1의 발현을 70%이상 감소시켰다.

5. miR -449a는 LEF -1의 3’ UTR 에 결합을 통해 직접적으로 LEF -1을 타겟팅 한다.

초기의 스크리닝 방법으로 miR-449a이 LEF-1의 조절 후보자임을 밝혔고, 본 발명자들은 LEF-1에 대한 miR-449a 기능을 규명하기 위하여 연골육종 세포주인 SW1353 및 JJ에 miR-449a의 안타고미어(antagomir)와 미믹(mimic)을 형질전환하였다. 형질전환 24시간 후, miR-499a가 존재 할 때 LEF-1은 통계적으로 유의한 감소를 보였고, anti-miR-a499a가 존재 할 때 LEF-1은 증가하였다(도 10).

LEF-1에 대한 miR-449a의 염기서열 특이적 조절을 확인하기 위하여, LEF-1 3’UTR을 pGL3 컨트롤 벡터에 클로닝 하였다(도 11A 및 11B). HeLa 세포주에 miR-449a를 형질전환 함에 따라 루시페라아제 기능이 약 70% 감소하였다(도 11C). 게다가, 루시페라아제 기능은 LEF-1을 타겟으로 하는 miR-449a의 농도 의존적으로 감소하였다(도 11D). 실험 결과에 따르면, miR-449와 LEF-1 3’UTR 씨드 서열을 정확하게 알 수 있다. miR-449a 씨드 서열로 예측되는 자리에 특이적인 돌연변이를 가진 구조물을 포함하는 LEF-1 3’UTR의 다양한 구조물을 만들어 리포터 분석을 하였다(도 12A). HeLa 및 JJ 세포주에서 실험한 결과, LEF-1 3’UTR을 포함하는 구조물과 miR-449a의 씨드 서열의 측면 서열을 가진 구조물에서 miR-449a 미믹 transfetion은 루시페라아제 기능을 약 50% 및 60% 감소시켰다(도 12B 및 12C). 게다가 LEF-1의 3’UTR의 miR449a 결합 예측 자리가 돌연변이 되면, 구조물의 루시페라아제 기능이 완벽하게 회복되었고, 이로 인하여 miR-449a 씨드 서열은 정확히 예측되었음을 확인하였다.

고찰

이전 연구에 따르면, Wnt 신호와 LEF-1은 연골형성의 전반적인 과정에서 중요한 역할을 한다(도 12)³⁰. Wnt4 및 Wnt9a는 관절의 발달 과정에서 높은 발현을 보이는 반면, Wnt7a 및 Wnt8a는 연골의 발달 과정에서 발견되었다. Wnt5a 및 Wnt11은 연골막에서 발현이 확인되는 반면, Wnt5b는 전 비대 연골세포에서만 한정적으로 관찰된다. Wnt4, Wnt8 및 Wnt11와 같은 Wnt 구성원은 연골형성 분화를 억제하고 연골 비대를 촉진하는 연골형성 억제 기능을 하지만, Wnt3a, Wnt5a 및 Wnt5b 같은 다른 Wnt 구성원은 연골형성을 증진시키는 것으로 알려졌다³¹ ^{-36, 38}.

다른 연구에 의하면, C3H10T1/2 세포의 고농도 배양에서 chondro-stimulatory factor(BMP-2)의 처리로 Wnt3a의 증가를 보고하였다³⁰. 게다가 Wnt3a 및 GSK-3β가 과발현 되면, 핵 속의 LEF-1 및 β-카테닌의 주목할 만한 증가를 보였고, 이는 LEF-1 및 β-카테닌이 연골형성 과정에서 BMP-2와의 활발한 상호작용이 일어남을 보여준다³¹. 결과적으로 이런 발견은 Wnt3a같은 Wnt 구성원은 연골형성 과정에서 중요한 역할을 하고, 보고된 β-카테닌/LEF-1 상호작용을 통하여 이루어짐을 보여준다.

Fumiko Yano의 연구에 따르면, C3H10T1/2, ATDC5 및 primary 연골세포주에서 LEF-1의 과발현이 연골형성 마커 유전자인 SOX9의 발현을 유도한다는 보고와 일치한다³⁷. 그러나 항상 활성화되는 LEF-1 과발현 벡터를 이용한 LEF-1의 지속적 존재는 중간엽 줄기세포가 급속하게 비대 단계에 들어가게 하였다⁴¹. Tamamura의 연구에 따르면, 타입 Ⅱ Collagen 프로모터에 의한 형질전환된 LEF-1의 과발현은 연골세포의 성숙을 오히려 불완전하게 하고, 닭 배아에서 돌연 변이된 β-카테닌의 과발현은 연골 발달과 비대를 억제하였다. 이 결과는 통상적 Wnt 신호가 발달 단계에 따라 연골의 분화와 비대에 영향을 준다는 것을 제시한다⁴².

결과적으로 이전의 연구결과에 따르면, LEF-1은 연골형성의 적절한 단계에서 중요한 역할을 하고, 중간엽 줄기세포의 연골형성의 초기단계뿐만 아니라, 연골 비대의 시작과 조절에서 매우 중요한 영향을 주고 있음을 보여준다. 이와 동시에, 본 발명자들은 마이크로어레이를 통한 고효율 탐색법과 RT-PCR 및 정량적 실시간 PCR을 사용하여 확인한 데이터를 통해, 중간엽 줄기세포의 연골형성이 진행되는 동안 LEF-1 유전자의 발현 증가를 보여주었다.

LEF-1의 잠정적인 타겟 microRNA를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 널리 사용되는 타겟 예측 데이터베이스(TargetScan 및 miRanda)를 사용하였고, LEF-1 발현의 조절자로 miR-449a를 밝혔다. 두 개의 연골 육종 세포주(SW1353 및 JJ)에서 테스트한 결과, miR-449a는 LEF1의 발현을 유의하게 감소시켰고, miR-449a의 안타고미어를 형질전환하여 miR-499a를 억제함으로, LEF-1의 발현이 다시 회복되는 것을 관찰하였다(도 10). 게다가 miR-449a mimic과 pGL3-LEF-1 구조물을 공동-형질전환하면, 루시페라아제 기능이 농도 의존적으로 감소하는 현상을 관찰함으로써, LEF-1의 miR-449a의 조절 기능을 확인하였다(도 11). 결과적으로, miR-449a 결합 예측 자리의 돌연변이를 통하여, LEF-1에 대한 mi-449a의 정확안 염기서열을 성공적으로 확인하였고, miR-449a는 LEF-1의 음성 조절자라는 사실을 제시하였다(도 12).

요약해보면, 본 연구는 a) LEF-1이 이전에 보고된 내용처럼, 인간의 BMSC의 연골의 적절한 분화와 성숙에 관여하는 중요한 인자이고, b) miR-449a가 LEF-1의 3‘UTR에 직접적으로 결합하여 LEF-1의 발현을 효과적으로 억제한다는 것을 성공적으로 규명하였다(도 13).

궁극적으로 본 연구는 LEF-1이 연골형성에 국한될 뿐 아니라 종양 형성과 발달 이르기까지 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였고, LEF-1을 타겟으로 하는 내부의 microRNA를 완벽하게 실험적 규명함으로써, 인간 생리학 분야에 전반적으로 큰 밑거름이 될 수 있는 발견임이 틀림없다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

서열목록 제1서열의 microRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포 분화 촉진용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 2번째 내지 8번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 다능성 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 근육 줄기세포, 조혈모 줄기세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 내피 줄기세포 또는 표피 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 다능성 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수-유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
상기 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 연골 분화 촉진용 조성물을 포함하는 연골 손상 치료용 약제학적 조성물.
서열목록 제1서열의 microRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로 형질전환된 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 연골세포 분화 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 분화를 유도하는 단계는 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 LEF-1(Lymphoid Enhancer Binding Factor 1)의 발현을 증가시켜 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 1번째 내지 22번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 줄기세포는 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 상기 다능성 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 근육 줄기세포, 조혈모 줄기세포, 신경 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 내피 줄기세포 또는 표피 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 다능성 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수-유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
LEF-1의 단백질의 발현을 억제하는 물질로서 서열목록 제3서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 항암 약제학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 항암 약제학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 LEF-1(Lymphoid Enhancer Binding Factor 1)의 발현을 억제되는 것을 특징으로 하는 항암 약제학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 조성물은 대장암 질환에 대하여 예방 또는 치료 효능이 있는 것을 특징으로 하는 항암 약제학적 조성물.