KR101854407B1

KR101854407B1 - 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR101854407B1
Application number: KR1020160094858A
Authority: KR
Inventors: 이진우; 박기원; 이경미; 윤동석; 김성환
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-07-26
Filing date: 2016-07-26
Publication date: 2018-05-03
Also published as: KR20180012072A

Abstract

본 발명은 miRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 이는 연골분화를 촉진하거나 연골손상의 방지를 통하여 염증성 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 또한, 염증 반응이 유도된 연골세포에 각각 항-miR449a 및 후보물질을 투여하여, SIRT1의 발현이 후보물질을 투여한 세포에서 항-miR449a를 투여한 세포보다 SIRT1의 발현이 높은 경우, 상기 후보물질을 연골분화촉진 또는 연골손상방지제로 판단할 수 있으며, 연골변성에 대한 적합한 후보 물질을 선별할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPISITION COMPRISING ANTI-SENSE OLIGONUCLEOTIDES}

본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 miRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

관절 연골의 파괴는 고령, 유전적 요인 등의 다양한 요인과 관련된 관절염뿐만 아니라, 염증을 유발시킬 수 있다. 관절염은 염증 또는 비염증으로 구분된다. 골관절염 (osteoarthritis; OA)은 가장 일반적인 비염증 관절염이지만, 일반적으로 골관절염의 진행에 따라 염증이 수반되며, 연골변성 (cartilage degradation)이 악화된다. 골관절염은 동화작용(anabolic) 및 이화작용(catabolic) 활성 간의 불균형으로 야기되는 연골변성으로서, 골관절염의 매개체 중 하나인 인터류킨-1β(IL-1β)가 핵전사인자인 NF-κB 신호전달 경로를 활성화시켜 염증을 유발시키고, 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloprotenase, MMP) 및 ADAMTSs (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs)와 같은 연골변성을 일으키는 이화작용 유전자를 발현시키는 것으로 알려져 있다.

NF-κB 신호전달 경로는 NAD-의존적 탈아세틸화효소 SIRT1에 의해 억제되며, 이는 상기 효소가 NF-κB 전사복합체의 서브유닛인 p65를 탈에세틸화시켜 NF-κB 신호전달 경로를 억제한다. SIRT1은 보호효과를 가지며, 연골세포의 세포사멸을 조절하고 연골세포의 생존을 강화시킨다. 골관절염에서 SIRT1 발현이 감소되며, 이에 따라, SIRT1의 발현 조절이 골관절염 치료에 대한 타켓 유전자로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

마이크로RNA (이하 "miRNA"라 칭함)는 20-25개의 뉴클레오티드로 구성되며, 타켓 유전자의 3'-UTR에 결합하여 mRNA 분해와 단백질 해독 (translational) 억제작용을 통하여 유전자 발현을 억제한다. miRNA가 다양한 질환에 관련된 유전자의 발현을 조절하는 작용이 밝혀져 있다.

한국등록특허 1286154호에서는 miRNA의 조절을 통하여, 골수유래 줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 촉진시킨다는 내용이 기재되어 있으며, 이 외에도 다양한 마이크로 RNA를 이용한 다양한 질환의 치료 용도에 관한 연구가 활발히 되고 있으나, 아직까지 골관절염에서 miRNA-449a의 역할에 대해서는 아직 연구된 바가 없다.

골관절염에 대한 효과적인 치료법은 아직 개발이 미미한 실정이며, 이에 따라 효과적인 예방 또는 치료법에 대한 개발이 절실한 상황이다. 이에 따라, 본 발명자들은 연골세포에서 IL-1β에 대한 miRNA-449a의 역할 및 효과를 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, miRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 염증 반응이 유도된 연골세포에 각각 항-miR449a 및 후보물질을 투여하여 SIRT1의 발현에 따라, 후보물질의 연골분화촉진 또는 연골손상방지제로서의 사용 여부를 판단하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 설명된다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명은 miRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, miRNA (micro RNA)는 20-25개의 뉴클레오티드 길이를 가지는 세포증식, 세포사멸, 면역반응, 단백질 발현 및 조직발달을 포함하는 다양한 과정에 영향을 주는 물질을 의미한다. 기능을 할 수 있는 복합체인 RISC(RNA-induced silencing complex) 단백질 복합체를 형성함으로써, miRNA는 타겟 단백질의 3'UTR의 상보적인 염기서열을 인식하고, mRNA 분해와 단백질해독(translation) 억제작용의 두 가지 매커니즘으로 유전자 발현을 억제한다.

본 발명에서, miRNA-449a를 처리하면, 대표적인 이화작용 유전자인 제 II형 콜라겐의 발현이 감소되는 반면, miRNA-449a에 대한 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 miRNA-449a의 억제는 상기 유전자의 발현을 증가시킨다.

본 발명에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드란, 타겟으로 하는 miRNA, 특히 miRNA의 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 miRNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상보적 핵산-기반 억제제로 기재될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드이지만, miRNA-449a에 결합할 수 있다면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, miRNA-449a의 서열은 서열번호 1로 나타내어지며, 일반적으로 miRNA의 시드 서열은 타겟 인지에 매우 중요한 서열로서, 다양한 종에 대하여 보존적(conserved)이다. 본 발명에서 이용되는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2로 기재되며, 상기 서열번호 1로 나타나는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.

본 명세서에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 언급하면서 사용되는 용어 상보적이란, 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miRNA-449a 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

miRNA-449a 기능의 억제는 전형적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 달성될 수 있다. 보다 구체적으로는, miRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 항-miRNA-449a에 의해 miRNA-449a를 억제한다.

본 발명에 있어서, SIRT1은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 Sir2 유전자의 상동체(homologs)로 시르투인 (sirtuin) 패밀리 단백질의 한 멤버이다. SIRT1은 히스톤의 탈아세틸화를 통해 밀집화된 크로마틴으로 유지시키는 데 핵심적인 기능을 수행한다. 또한, SIRT1은 스트레스 저항성, 대사과정, 골격근 이상(dysfunction), 세포사멸 (apoptosis), 노화(senescence 또는 aging) 및 분화를 포함하는 다양한 생리학적 과정들에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 SIRT1의 활성화는 이화작용 유전자의 발현을 mRNA 또는 단백질 수준에서 감소시키고, 동화작용 유전자의 발현을 mRNA 또는 단백질 수준에서 증가시킨다. 보다 구체적으로는, 이화작용 유전자인 MMP-13 및 ADAMTS의 mRNA 또는 단백질 레벨을 감소시키는 반면에, 동화작용 유전자인 제 II형 콜라겐 또는 아그레칸의 발현을 증가시킨다.

본 발명은 (a) 염증 반응이 유도된 제 1 연골세포에 항-miR449a를 투여한 후 SIRT1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1)의 발현을 측정하는 단계; (b) 염증 반응이 유도된 제 2 연골세포 에 후보물질을 투여한 후 SIRT1의 발현을 측정하는 단계; 및 (c) 제 2 연골세포에서의 SIRT1의 발현이 제 1 연골세포에서의 SIRT1의 발현보다 높은 경우, 상기 후보물질은 염증성 질환 치료용 물질로 판단하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 염증 반응 유도는 IL-1β에 의한 것인 스크리닝 방법이다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 발현 정도는 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학분석법(immunohistochemical analysis), 실시간 PCR (Real-Time PCR), qRT-PCR, 웨스턴 블롯팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, SIRT1은 활성화 유전자 발현이 증가할 때 동화작용 유전자의 발현을 mRNA 또는 단백질 수준에서 증가시키며, 상기 동화작용 유전자는 제 II형 콜라겐 또는 아그레칸이다.

본 발명의 일 구체예에서, SIRT1은 유전자 발현이 증가할 때 이화작용 유전자의 발현을 mRNA 또는 단백질 수준에서 감소시키며, 상기 이화작용 유전자는 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloprotenase, MMP)-13 및 ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) 중 하나이다.

본 발명의 예방 또는 치료 대상 질환인 염증성 질환이란, 연골 관련 염증성 질환을 의미하는 것으로, 보다 구체적으로는 인터루킨-1 베타 (IL-1β)의 자극에 의해 유발되는 질환을 말하며, 연골, 연골 조직, 관절 조직 (활막, 관절포, 연골하골 등) 등이 염증 반응에 의해 상해됨으로써 발생하는 질환을 의미한다. 그 예로는 골관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 라임관절염, 석회화근염, 상완골외과염, 족저근막염, 박리성 골연골염, 반월상 연골판 손상 후 관절염 및 이단성 골연골염 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 염증성 질환 예방 또는 치료란, 상기 조성물의 투여에 의해 염증성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하며, 보다 구체적으로는 연골분화를 촉진하거나 연골손상을 방지하여 염증성 질환을 개선하는 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명에 따른 miRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용할 경우, 연골분화를 촉진하거나 연골손상의 방지를 통하여 염증성 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 염증 반응이 유도된 연골세포에 각각 항-miR449a 및 후보물질을 투여하여, SIRT1의 발현이 후보물질을 투여한 세포에서 항-miR449a를 투여한 세포보다 SIRT1의 발현이 높은 경우, 상기 후보물질을 연골분화촉진 또는 연골손상방지제로 판단할 수 있으며, 연골변성에 대한 적합한 후보 물질을 선별할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 OA 연골세포, IL-1β-유도 연골세포 및 연골세포주 SW1353에서의 항-miRNA-449a의 실시간 PCR 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 OA 연골세포 및 IL-1β-유도 연골세포를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 SIRT1-과발현 연골세포에서 항-miRNA-449a의 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 SIRT1 녹다운 연골세포에서 항-miRNA-449a의 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 IL-1β-유도 및 OA 연골세포에서 항-miRNA-449a에 의한 이화작용 및 동화작용 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 6은 연골세포에서 miRNA-449a 활성에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 IL-1β-유도 연골세포의 조건하에서 이화작용 유전자의 발현 패턴을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

SW1353 세포배양

연골세포주로 알려진 인간 연골육종 (chondrosarcoma) 세포주 SW1353를 10% 소태아혈청 (FBS; 깁코) 및 1% 항생제-항진균제 용액 (깁코)을 함유하는 둘베코 변형 이들 배지-고 글루코스 (DMEM-HG; 깁코, 칼스배드, 캘리포니아)에서 배양하였다. 그리고 80% 성장치 (confluence)에서 세포를 0.05% 트립신-EDTA (깁코)를 사용하여 수확하였다. 수확된 세포는 원심분리하여 세척하고, 새로운 배지를 이용하여 재부유 (resuspended)시켜 새로운 플레이트에 접종 (seed)하였다. 배지는 2-3일 마다 교체하며 배양하였다.

관절연골 및 연골세포 배양

기관감사위원회 (institutional review board) 승인 환자의 무릎 관절에서 인간 관절연골을 얻었다. 정상 관절연골을 OA 기록이 없는 10명의 외상 환자로부터 얻었다. OA 관절연골을 슬관절 전치환술 (total knee arthroplasty)이 시행된 7명의 환자로부터 얻었다. 정상 연골 기증자의 평균 연령은 60.6세 (연령대 24-65세)이며, OA 연골 기증자의 평균 연령은 62.7세 (연령대 45-73세)이다. 연골세포를 분리하기 위해서, 연골 샘플을 연속적으로 0.1% 콜라게나아제 (워싱턴 바이오케미컬, 레이크우드, 뉴저지) 및 0.065% 히알루로니다아제 (워싱턴 바이오케미컬)로 절단 (digest)시키고, 1,200rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 모든 배양 조건을 SW1353 세포 배양과 동일하게 하였다.

miRNA를 이용한 실험의 진행

마이크로RNA를 이용한 실험을 진행하기 위하여 miRNA-449a 모방체 (제놀루션, 서울, 한국) 및 항-miRNA-449a 모방체 (에스티팜, 서울, 한국)를 주문하여 구입하였다. 상기 miRNA-449a 모방체 및 항-miRNA-449a 모방체의 서열은 각각 5'- UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU-3' (서열번호 1) 및 5'-ACCAGCUAACAAUACACUGCCA-3' (서열번호 2)이다. SW1353 세포 또는 연골세포를 1x10⁵세포 6-웰 플레이트 내 1x10⁵개의세포로 시드하였다. 배양 24시간 후, 세포를 제조사의 지침에 따른 리포펙타민 LTX & Plus 시약 (인비트로겐, 칼스배드, 캘리포니아)을 사용하여 100nM miRNA-449a 모방체 또는 항-miRNA-449a 모방체로 형질감염하였다. 6-8시간 동안 형질감염 후, 배지를 10ng/㎖에서 IL-1β (R&D 시스템즈, 미니애폴리스, 미네소타)를 포함하거나 포함하지 않는 신선한 배지로 교체한 후 24시간까지 배양하였다. 세포를 0.05% 트립신-EDTA를 사용하여 수확하였다.

실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR )

총 RNA를 수확한 세포로부터 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 Trizol (인비트로겐)을 사용하여 추출하였다. cDNA 합성을 위하여, 2㎍ RNA를 Omniscript 역전사 키트 (키아겐, 힐덴, 독일)를 사용하여 역전사하였고, 80ng cDNA를 사용하여 2x qPCRBIO SyGreen Mix (PCR Biosystems, London, UK)로 실시간 PCR을 수행하였다. 타켓 유전자의 정량화를 위하여, 18S 리보좀 RNA (18s rRNA)를 상대 발현 (relative expression)에 대한 대조군으로 사용하였다. miRNA cDNA 합성을 위하여, 0.25-8㎍ RNA를 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 Mir-X^TM miRNA 제1가닥 (First-Strand) 합성 키트 (클론테크, 마운틴뷰, 캘리포니아)를 사용하여 역전사하였다. U6 소형 핵 RNA (snRNA)를 상대 발현에 대한 대조군으로 사용하였다. 모든 실시간 PCR 실험을 ABI7900 (어플라이드 바이오시스템즈, 칼스배드, CA) 장비를 사용하여 수행하였다.

웨스턴 블롯팅 (Western blotting)

단백질 추출을 위하여, 세포 펠렛을 50mM Tris (pH 7.4), 150mM NaCl, 1% NP-40 및 0.1% 소듐 도데실 설페이트 (SDS)로 이루어진 용해 버퍼에 부유시킨 후, 부드럽게 피펫팅 (pipetting)하고, 3분마다 와류혼합 (vortex mixing)하면서 10분 동안 100℃에서 가열하였다. 용해물을 13,000rpm에서 5-10분 동안 원심분리하고 상등액을 회수하였다. 추출된 단백질의 농도를 측정하기 위해서, 바이신코닉산 (BCA) 단백질 분석 키트 (피어스, 락포드, 일리노이)를 이용하였다. 웨스턴 블롯팅 전에, 30㎍ 단백질과 5x 로딩 염료 (피어스)를 혼합하였고, 100℃에서 7분 동안 가열하였다. 제조된 단백질 샘플에 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 겔을 실시하였다. 이어서 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막 (하이본드, 에스콘디도, 캘리포니아)으로 90분 동안 전사 (transfer)시켰다. 5% 탈지 우유 (BD 바이오사이언스, 산호세, 캘리포니아)로 90분 동안 차단한 후, 상기 막을 4℃에서 밤새 일차 항체와 배양하였다. 사용된 항체는 항-COX2 (BD 바이오사이언스, 산호세, 캘리포니아, 1% 탈지 우유 내 1:1,000); 항-SIRT1 및 항-β-액틴 (산타크루즈 바이오테크놀로지, 산타크루즈, 캘리포니아, 1% 탈지 우유 내 1:1,000); 및 항-COL2A1 (산타크루즈 바이오테크놀로지, 1% BSA 내 1:500)이다. 마지막으로, 막을 강화된 화학발광 (ECL) 용액 (아머샴, 버킹엄셔어, 영국)을 사용하여 발달시켰다

바이러스 감염

SIRT1을 타켓하는 렌티바이러스 인코팅 SIRT1 또는 shRNA를 연골세포에 형질도입 (transduction)하였다. 바이러스 상등액을 제조하기 위해서, 제조사의 지침에 따라 리포펙타민 LTX & Plus 시약 (인비트로겐)을 사용하여 293 FT 세포를 렌티바이러스로 형질감염 (transfection)시켰다. 형질감염 6시간 후, 배지를 교체하였다. 상등액을 배지 교체 48시간 후 수확하고, 0.45㎛ 실린지 필터 (밀리포어, 빌레리카, 메사추세츠)로 여과하고, 원심분리하여, 4℃에서 밤새 교반하였다. 연골세포를 퓨로마이신 (5㎍/㎖) 선택 후, 정제한 렌티바이러스로 24시간 동안 감염시키고, 상기 렌티바이러스-감염 연골세포를 실험에 사용하였다.

조직학적 분석 ( Histological analysis)

인간 무릎관절로부터 관절연골을 3.7% 포름알데히드로 고정시키고, 파라핀에 임베디드 (embedded)하여, 절단 (sectioned)하였다. 절편을 연속적으로 크실렌에서 탈파라핀화 (deparaffinized)하고, 에탄올 계열에서 재수화 (rehydrated)하여, 염색하였다. 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색의 경우, 절편을 3분 동안 헤마톡실린으로, 30초 동안 에오신으로 염색하였다. 사프라닌 O 염색의 경우, 절편을 1분 동안 헤마톡실린으로, 5분 동안 패스트 그린으로, 30분 동안 사프라닌 O로 염색하였다. 마지막으로 마운팅 용액과 커버 슬립을 적용시켰다.

통계학적 분석

적어도 3명 이상의 기증자로부터의 샘플을 사용하여 모든 실험을 세 번 수행하였다. 독립 표본 t-검정을 두 군 간의 차이의 검출을 위해 사용하였다. 세 개 이상의 군 간 차이의 통계적 유의성은 일원분산분석 (ANOVA)과 투키 사후분석 (Tukey's post hoc analysis)을 사용하여 계산하였다. 모든 데이터를 평균과 군별로 서로 다른 기증자의 값의 95% CI로 나타내었다.

실험결과

연골세포 및 SW1353 세포 내 miRNA -449a의 발현

정상 연골 및 골관절염 연골 유래 연골세포에서 miRNA-449a의 발현을 조사하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 정상 연골세포에 비하여 OA 연골세포에서의 miRNA-449a 발현이 대략 7배 증가하였다 (도 1A). miRNA-449a의 발현이 연골세포 내 IL-1β의 조절에 의한 것인지 확인하기 위해서, 연골세포를 IL-1β (10ng/㎖)와 24시간 동안 처리한 후, miRNA-449a의 발현 수준을 확인하였다. 연골세포 SW1353 세포주를 IL-1β와 다양한 농도에서 처리한 결과, 10ng/㎖의 농도에서 MMPs, ADAMTSs 및 COX-2와 같은 이화작용 유전자 (catabolic gene)가 효과적으로 유도된 것을 확인하였다 (도 7). IL-1β로 자극한 결과, 정상 연골세포와 비교하여 miRNA-449a의 발현이 대략 6배 증가하였다 (도 1B). 추가적으로, SW1353 세포에서 miRNA-449a 발현의 지속적인 시간-의존적 증가가 관찰되었다 (도 1C). 상기 결과는 miRNA-449a의 발현 증가가 연골 파괴의 IL-1β 유도 진행과 관련이 있다는 것을 시사한다.

miRNA -449a 및 SIRT1의 발현 간의 역상관 (Inverse correlation) 및 SIRT1 mRNA의 3'- UTR에서 miRNA -449a의 시드 서열의 생물정보학적 예측 결과

첫 번째로, 환자로부터 획득된 샘플이 정상 또는 OA 연골 특성을 보이는지 확인하기 위해서, H&E 및 사프라닌 O 염색을 이용하여 인간 관절연골의 조직학적 분석을 수행하였다. H&E 염색을 이용하여 OA 연골에서는 표면 균열, 표면-소섬유 형성 (surface-fibrillation) 및 연골세포 클러스터 등의 증상이 나타났으며, 이를 화살표로 식별하였다. 또한, 사프라닌 O 염색을 이용하여 세포-소섬유 형성뿐만 아니라 삼각형으로 표시된 프로테오글리칸의 감소가 정상 연골에 비하여 OA에서 증가한 것을 확인하였다 (도 2A).

두 번째로, 이화작용 및 동화작용 기능에 대한 주요 연골 관련 유전자의 발현을 확인하였다. IL-1β-유도 연골세포와 OA 연골세포에서 대표적인 연골-분해 콜라게나아제인 MMP-13의 발현은 현저하게 증가한 반면에, 연골 형성 기여하는 주요 연골성 세포외 매트릭스 단백질인 제 II형 콜라겐은 감소된 것을 확인하였다 (도 2B). 또한, 연골변성과 관련되어 있는 것으로 알려져 있는 SIRT1의 발현은 OA 연골세포 및 IL-1β-유도 연골세포에서 감소하였다. SIRT1의 발현은 IL-1β 처리 SW1353 세포에서 시간 의존적으로 감소하였다 (도 2C). 상기 결과들을 통해, OA 연골세포 및 IL-1β-유도 연골세포에서는 miRNA-449a 및 MMP-13의 발현은 증가하고, 제 II형 콜라겐 및 SIRT1의 발현은 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

연골 세포들에서 miRNA -449a의 역할

IL-1β-유도 연골 파괴의 조건하에서 miRNA-449a의 역할을 확인하기 위해서, 다양한 조건의 조합을 실험하였다. SIRT1은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 연골세포 내에서 과발현시켰다. 연골세포를 렌티바이러스 벡터 인코딩 SIRT1으로 감염시키고, 퓨로마이신 선택 후, 상기 세포를 miRNA-sc (대조군) 또는 miRNA-449a로 형질감염시켜 IL-1β로 처리하였다. 웨스턴 블롯팅 및 실시간 PCR을 사용하여 SIRT1의 주요한 과발현 및 miRNA-449a의 효과적인 형질감염을 각각 확인하였다 (도 3A 및 도 3B). MMPs 및 ADAMTSs와 같은 이화작용 유전자의 발현은 연골세포의 IL-1β 자극에 의해 증가되었다 (도 3C). 그러나, 상기 증가는 SIRT1 과발현에 의해 억제되었고, SIRT1 과발현 효과는 miRNA-449a에 의해 억제되어, 이화작용 유전자의 발현이 다시 증가된다는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, miRNA-449a가 골관절염 관련 유전자의 발현을 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 miRNA-449가 골관절염을 유발할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

항- miRNA -449a의 IL- 1β -유도 연골 파괴 억제 효과

항-miRNA-449a를 관절염 치료 용도로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, 항-miRNA-449a의 IL-1β- 유도 연골 파괴 억제 효과를 확인하였다. 실험을 위하여, 연골세포에서 shRNA 매개 SIRT1 녹다운을 수행하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이, 웨스톤 블롯팅으로 SIRT1의 효과적인 녹다운을 확인하였다. 대조군 및 SIRT1 녹다운 연골세포를 항-miRNA-sc (대조군) 또는 항-miRNA-449a로 형질감염시킨 후, IL-1β를 처리하였다. 그 결과, 일차 동화작용 유전자 (anabolic gene)인 제 II형 콜라겐의 발현이 IL-1β 자극에 의해 감소된 반면에, IL-1β 유도에 의해 감소되었던 제 II형 콜라겐 발현은 항-miRNA-449a에 의해 복원되었다 (도 4B). SIRT1 녹다운 연골세포에서는 제 II형 콜라겐 발현에 어떠한 증대 효과를 보이지 않았다. 반면에, IL-1β에 의해 유도된 이화작용 유전자의 발현 증가는 항-miRNA-449a에 의해 감소되는 것을 확인하였다. 상기 결과들을 통하여, 항-miRNA-449a가 IL-1 β 유도에 의한 동화작용 유전자 억제 효과 및 이화작용 유전자 발현 증가 효과를 억제하여 연골 파괴 효과를 억제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

항- miRNA -449a에 의한 IL- 1β -유도 연골세포에서 이화작용 유전자의 조절 및 OA 연골세포에서 동화작용 유전자 발현 및 SIRT1의 복원

IL-1β-유도 연골세포에서 miRNA-449a의 억제에 의한 이화작용 유전자의 조절을 확인하였다. 그 결과, 연골세포의 IL-1β 유도에도 불구하고 MMPs 및 ADAMTSs와 같은 이화작용 유전자의 발현은 항-miRNA-449a에 의해 감소된 것을 확인하였다 (도 5A). 또한, IL-1β 유도 연골세포에서 대표적인 이화작용 유전자인 MMP-13의 발현이 IL-1β 자극에 의해 증가되었지만, 항-miRNA-449a에 의해 감소된 것을 확인하였다 (도 5B). 반대로, 대표적인 동화작용 유전자 제 II형 콜라겐 및 SIRT1의 발현은 IL-1β 자극에 의해 감소되었지만, 항-miRNA-449a에 의해 복원되었다. 마지막으로, 항-miRNA-449a에 의한 miRNA-449a의 효과를 확인하기 위해서, OA 연골세포를 항-miRNA-449a로 형질감염시켰다. 도 5C에 나타난 바와 같이, OA 연골세포에서 MMp-13의 발현은 항-miRNA-449a에 의해 급감한 반면에 SIRT1 및 제 II형 콜라겐의 발현은 복원된 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 항-miRNA-449a가 효과적으로 IL-1 β 유도에 의한 이화작용 유전자 및 동화작용 유전자의 발현을 조절하여 연골 및/또는 관절의 염증을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> PHARMACEUTICAL COMPISITION COMPRISING ANTI-SENSE OLIGONUCLEOTIDES <130> DPB162815 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-449a <400> 1 uggcagugua uuguuagcug gu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miRNA-449a <400> 2 accagcuaac aauacacugc ca 22

Claims

miRNA-449a에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는,
염증을 가지는 연골 내 염증성 질환 예방 또는 치료와 함께 연골분화를 촉진하거나 연골손상을 방지하고,
상기 염증성 질환은 골관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 라임관절염, 석회화근염, 상완골외과염, 족저근막염, 박리성 골연골염, 반월상 연골판 손상 후 관절염 및 이단성 골연골염 중 하나인, 약학 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 miRNA-449a는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 염증성 질환은 인터루킨-1 베타 (IL-1β)의 자극에 의해 유발되는, 조성물.
삭제
삭제
(a) 시험관내에서 염증 반응이 유도된 제 1 연골세포에 항-miR449a를 첨가한 후 SIRT1(silent mating type information regulation 2 homolog 1)의 발현을 측정하는 단계;
(b) 시험관내에서 염증 반응이 유도된 제 2 연골세포에 후보물질을 첨가한 후 SIRT1의 발현을 측정하는 단계; 및
(c) 제 2 연골세포에서의 SIRT1의 발현이 제 1 연골세포에서의 SIRT1의 발현보다 높은 경우,
상기 후보물질은 연골 내 염증성 질환 치료와 함께 연골분화를 촉진하거나 연골손상을 방지하고,
상기 염증성 질환은 골관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 라임관절염, 석회화근염, 상완골외과염, 족저근막염, 박리성 골연골염, 반월상 연골판 손상 후 관절염 및 이단성 골연골염 중 하나인 물질로 판단하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법.
제 7항에 있어서,
상기 염증 반응 유도는 IL-1β에 의한 것인, 스크리닝 방법.
삭제
제 7항에 있어서,
상기 발현 정도는 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학분석법(immunohistochemical analysis), 실시간 PCR (Real-Time PCR), qRT-PCR, 웨스턴 블롯팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는, 방법.
제 7항에 있어서,
상기 SIRT1은 활성화 유전자 발현이 증가할 때 동화작용 유전자의 발현을 mRNA 또는 단백질 수준에서 증가시키는, 방법.
제 11항에 있어서,
상기 동화작용 유전자는 제 II형 콜라겐 또는 아그레칸인, 방법.
제 7항에 있어서,
상기 SIRT1은 유전자 발현이 증가할 때 이화작용 유전자의 발현을 mRNA 또는 단백질 수준에서 감소시키는, 방법.
제 13항에 있어서,
상기 이화작용 유전자는 매트릭스 메탈로프로티나제 (matrix metalloprotenase, MMP)-13 및 ADAMTS (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs) 중 하나인, 방법.