JP4717967B2 - 遺伝子改変酵母株 - Google Patents
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Description
本発明はシトクロムＰ４５０活性を発現する新規酵母株とその使用に関する。本発明は特に、ヒトシトクロムＰ４５０酵素系を産生することが可能な酵母株及びその構築に使用するプラスミドに関する。
シトクロムＰ４５０は膜酵素スーパーファミリーを構成する。特に生体異物と医薬の代謝に関与するモノオキシゲナーゼである。
シトクロムＰ４５０は特に次の用途に使用される。
−天然又は人工（汚染物質、医薬又は添加物）生体異物分子のヒト肝代謝による毒性又は突然変異誘発代謝物の形成のｉｎｖｉｔｒｏ診断。この診断は新規医薬分子の開発に肝要である。
−環境毒性又は汚染分子の同定と破壊。
−代謝物の生成。
前記タンパク質はこれらの解毒プロセス及び毒性現象の両者に関与しているため、広く研究されている（Ｇｕｅｎｇｕｅｒｉｃｈ，１９８８）。
しかし、こうした研究はすぐにシトクロムＰ４５０の個々の形態の研究等の問題にぶつかった。これらの問題を解決するために、その後、異種発現系が開発された。
１９８６年以来、異種発現宿主としての哺乳動物細胞の使用が開発されている（Ｚｕｂｅｒら，１９８６）。これらの系は肝細胞（シトクロムＰ４５０の主要検出部位）に近似するという利点があるが、残念ながら発現レベルが低い。
細菌等の原核宿主については、実際に正確に複製されたシトクロムＰ４５０を大量に獲得できる（Barnesら，1991）が、この種の宿主ではＤＮＡの５’末端発現部分の改変が避けられない（ＤｏｅｈｍｅｒとＧｒｅｉｍ，１９９２）。
他方、酵母型の真核宿主を選択すると特に有利であり、この生物はヒト肝細胞に似た状態におくことができ、高いタンパク質発現レベルが得られる。更に、酵母はシトクロムＰ４５０型の膜タンパク質とその関連酵素の発現に必要な全酵素メカニズムを内在形態でもっており、即ち、シトクロムＰ４５０の機能に必要な２種の酵素であるシトクロムｂ５とＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをもつ。
従って、酵母を用いると、
−（細菌での発現の場合のように）発現されるタンパク質がそのＮ末端配列のレベルで改変されずに済み、
−種々の生化学及び構造研究に妥当な量の異種シトクロムＰ４５０が得られ、
−関連酵素系が既に存在している
ため、酵母は種々の問題に有利な解決手段を提供する（Ｏｅｄａ Ｋ．ら，１９８５；Ｐｏｍｐｏｎ，１９８８）。
異種タンパク質の発現に関して特に研究されている酵母のうちでは、特にＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Hansenula、Ｃａｎｄｉｄａ及びSaccharomyceｓを挙げることができ、そのゲノム構造は周知である。シトクロムＰ４５０の種々の酵母発現系が文献に記載されている。
所謂第１世代の株ではシトクロムＰ４５０はプラスミドから発現されており、酵母に内在するＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼとシトクロムｂ５を電子供与体として使用している（Ｐｏｍｐｏｎ，１９８８；ＣｕｌｌｉｎとＰｏｍｐｏｎ，１９８８）。
この系の最初の改良により得られた所謂第２世代の株では、（ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下に）酵母シトクロムＰ４５０レダクターゼを過剰発現させ、ヒトシトクロムｂ５を同時発現させている（国際公開ＷＯ９３／０２２００及びＴｒｕａｎら，１９９３）。従って、これらの株ではイソ形に応じて出発株の５〜６０倍の組換えシトクロムＰ４５０の酵素活性が得られるようになった。
しかし、既存の系は完全に満足とは言えず、タンパク質の満足な発現が得られなかったり、得られたタンパク質がヒト系に十分に近似しないという欠点がある。
本発明は詳細には、上記欠点のない第３世代の株を提案することを目的とする。予想外にも、本願出願人は酵母のＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼとシトクロムｂ５をそれらのヒト相同体で同時に置換えられることを発見した。これらの２種の遺伝子の同時分裂は酵母では致死性であることが知られており、２種の遺伝子を欠失する生存可能な株を得ることはまだできなかったので、この発見は一層意外である。
本発明の株では、酵母シトクロムＰ４５０レダクターゼ及び／又はシトクロムｂ５をそのヒト相同体に置換えた。その結果、多重酵素系が同一種であるため、非常に有利なことに肝細胞に非常によく似た系を作製することができた。
この新規系は、発現されるシトクロムＰ４５０の酸化還元パートナーの種類の効果と、肝臓に存在すると同等のシトクロムＰ４５０活性に必要な化学量論比を試験するためにも利用できる。
従って、本発明の第１の目的は、
１）内在シトクロムｂ５と内在NADPH−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子が不活化されており、
２）ヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸を含み、
３）ヒトシトクロムｂ５をコードする核酸を含むことを特徴とする遺伝子改変酵母株にある。
ヒトシトクロムｂ５及びヒトレダクターゼをコードする遺伝子を株に組み込むために使用する核酸は、ｃＤＮＡが好ましい。これらの２種のタンパク質をコードする完全配列を含むｃＤＮＡは単離及び配列決定されている（ヒトレダクターゼについてはＳ．Yamanoら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８９，ｖｏｌ．３６：８３−８、ヒトシトクロムｂ５についてはＭ．Ｍｉｙａｔａら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１９８９，ｖｏｌ．２１：５１３−２０参照）。
更に、選択する酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが好ましい。
本発明の意味では、不活化遺伝子とはその天然タンパク質をコードできなくした遺伝子を意味する。前記遺伝子がその天然タンパク質をコードできないことは、構造又はコンフォメーション変異による不活性タンパク質の産生や、天然タンパク質の産生の不在や産生レベルの低下により確認できる。
天然遺伝子の不活化は以下に挙げる種々の方法により得られる。
−遺伝子の完全又は部分的欠失。欠失とは該当遺伝子の任意抑圧を意味する。例えば、タンパク質をコードする領域の一部及び／又は転写プロモーター領域の全部又は一部の欠失が挙げられる。
−遺伝子における１以上の点突然変異。この突然変異は化学的突然変異誘発物質（例えばアルキル化剤、ビアルキル化剤又は挿入剤）又は物理的突然変異誘発物質（Ｘ線、紫外線）による処理や、指向的突然変異誘発により得られる。
−遺伝子の読取り枠を遮断し、これを不活化する制限酵素の作用による突然変異挿入、及び／又は
−例えばＲｏｔｈｓｔｅｉｎ［Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）２０２］により最初に記載されたプロトコルによる遺伝子破壊。この場合には、対応するヒトタンパク質をコードする配列で野生型配列を相同組換えにより置換できるように、コーディング配列の完全性を破壊する。
本発明によると、上記のような遺伝子破壊方法を使用するのが好ましい。
本発明によりヒト酵素を発現させるために本発明の株を形質転換する方法としては種々の方法が考えられ、まず、遺伝子の１個を不活化しておいた野生型株を、対応するヒトタンパク質をコードする核酸を含む複製型プラスミドで形質転換する方法がある。この場合、核酸は酵母のゲノムに組み込まれない。
また、該当ヒトタンパク質をコードする配列を含むｃＤＮＡ形態の核酸を酵母のゲノムに組み込んでもよい。この場合には、酵母の増殖性と生存性を変えないようにマーカー遺伝子に対応するこのゲノム上の既知遺伝子座に組み込んでもよいし、不活化した天然遺伝子に占有される場所に組み込んでもよい。
こうして、レダクターゼをコードする核酸とシトクロムｂ５をコードする核酸をこれらの方法のいずれか１種により株に導入することができる。
本発明によると、株の安定性を改善し、より有利な条件におくために、ヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸及び／又はヒトシトクロムｂ５をコードする核酸を酵母のゲノムに組み込む実施態様を選択するのが好ましく、本発明の好適実施態様では、これらの核酸を内在遺伝子の代わりに組み込む。
本発明の別の好適実施態様によると、ヒトシトクロムｂ５をコードする遺伝子をマーカー遺伝子の遺伝子間部位、特に遺伝子間部位ＳＰＬ１／ｌｅｕ２に組み込む。
本発明の別の特徴は、ヒトシトクロムｂ５をコードする核酸がゲノムに組み込まれていることを特徴とする株にある。
本発明の特定実施態様では、形質転換株にシトクロムｂ５の２コピーを存在させる。
本願出願人が遭遇した別の問題は、ヒト遺伝子を酵母で十分なレベルで発現させるという問題である。
このためには、これらの遺伝子の発現を可能にする酵母プロモーターの制御下にこれらの遺伝子をおくと有利である。これらの酵母プロモーターは誘導的プロモーターでも構成的プロモーターでもよい。本願において、構成的プロモーターとは標準培養条件で安定して発現されるプロモーターを意味する。本発明によると、ヒト遺伝子の少なくとも１個を構成的酵母プロモーターの制御下におく。
このプロモーターは公知プロモーターから選択される。例えば、イソシトクロムＣ１（ＣＹＣ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）、転写延長因子（ＴＥＦ）、酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＡＰＤＨと称する）及び酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ（以下、ＰＧＫと称する）の遺伝子のプロモーターを使用することができる。
プロモーターは、酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター、酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター及び酵母シトクロムｂ５の内在プロモーターから選択するのが好ましい。本発明の１特定実施態様では、ヒトシトクロムｂ５をコードする遺伝子が内在Ｙｂ５プロモーターの制御下にあることに留意すべきである。
誘導的プロモーターについては、ＧＡＬ１０及びＣＹＣ１−ＧＡＬ１０プロモーターから選択するのが好ましい。
本願出願人が着目した特徴である上記内在遺伝子の不活化と対応するヒト遺伝子をコードする核酸による置換という特徴を示す１倍体株はこれまで得ることができなかった。２倍体形態に止まっていた。本発明の利点の１つは１倍体酵母で操作することができ、従って、最良の安定性を得ると共に望ましくない組換えを避けることができる。
従って、本発明の好適実施態様によると、株は１倍体であることを特徴とする。
本発明による株は、ヒトシトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１種の核酸をもつ。該核酸はプラスミドに組み込むことが好ましい。本発明によるヒト化酵母株は、その選択マーカーのレベルで作製される酵母株と適合可能なものであれば任意のシトクロムＰ４５０発現プラスミドを用いて慣用技術により形質転換することができる。特に、このようなプラスミドはプラスミドｐＹｅＤＰ６０のクローニングポリリンカーに任意のヒトシトクロムＰ４５０をコードするｃＤＮＡのコーディングフレームを常法に従ってクローニングすることにより得られる（材料と方法の項参照）。
シトクロムＰ４５０は特にヒトシトクロムＰ４５０１Ａ１、１Ａ２、１Ｂ１、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８、２Ｃ１９、２Ｅ１、３Ａ４、３Ａ５から選択することができる。本発明によるヒト化株は野生型酵母及び従来作製されている組換え株に比較して明白な発現上の利点がある。
本発明の別の目的は、本発明による酵母株において、プラスミドに含まれるヒトシトクロムＰ４５０のモノオキシゲナーゼ活性をも発現させる酵母株にある。
本発明の別の実施態様は、プラスミド、特にシトクロムＰ４５０をコードする核酸の１コピーを既に含んでいるプラスミド上に上記シトクロムｂ５をコードする核酸の付加的コピーを存在させることにある。Ｐ４５０の最適活性を得るためには、実際にヒトシトクロムｂ５及びヒトＰ４５０の発現レベル間に少なくとも１／１の化学量論的相対モル比を実現できるようにすると特に有利である。シトクロムｂ５の遺伝子の単一コピーのゲノム組み込みでは、本発明による多重コピープラスミドからの発現のような高いＰ４５０発現レベルに達するには不十分な場合もあることが分かっている。そこで、本発明は該当シトクロムＰ４５０の発現カセットとシトクロムｂ５の発現カセットを併有するプラスミド系列の構築を説明することにより、系の効力を更に改善できるようにする。これらのプラスミドの特殊な構造により、２種のシトクロム間に十分な化学量論比を実現しながら高レベルで安定した発現が可能になる。これらのプラスミドは本願に記載する全株に適合可能である。これらのプラスミドは他の株にも当然利用できる。
本発明は特に、上記全特徴に対応する酵母株の開発を目的とする。このような酵母株に到達するための数種の中間体にも関する。
本発明では文献に記載されているような株から出発するのが好ましく、特に以下の株が挙げられる。
−酵母シトクロムｂ５をコードする遺伝子（以下、Ｙｂ５と称する）が破壊されているＷ（ΔＢ）株（Ｔｒｕａｎｔらにより記載）。これを作製するためには、シトクロムｂ５の遺伝子の制限部位のレベルに組み込まれたＨＩＳ３マーカー遺伝子をもつベクターを構築する。このベクターを使用して２倍体ＨＩＳ３−株を形質転換する。組換え細胞を選択する。
−酵母レダクターゼをコードする遺伝子が不活化されているＷ（Ｒ）株。
−ベクターｐＵＰ８１（図１）で形質転換することによりＷ（ＲΔ）株から得られるＷ（ｈＲ）株。この株では、誘導的プロモーターとヒトレダクターゼ（以下、ＨＲＥＤと称する）をコードする配列を含むカセットを挿入することにより、酵母レダクターゼ（以下、ＹＲＥＤと称する）をコードする不活化遺伝子を置換している。
これらの株を交配後、胞子形成させ、Ｙｂ５とＹＲＥＤを欠失し且つＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下でヒトレダクターゼを発現する１倍体Ｗ（ｈＲ，ΔＢ）株を選択する。
この点で、本発明の別の目的はＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸を含み、酵母シトクロムｂ５と酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子が不活化されている株（Ｗ（ｈＲ，ΔＢ）株）にある。
本発明による別の好適株は、誘導的ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターがＧＡＰＤＨプロモーターで置換された上記と同様の株である。
この置換は、ｐＵＰ８１（図９）から構築され、構成的ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下のＨＲＥＤをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＢ２（図４）で形質転換することにより実施できる。形質転換細胞は国際公開ＷＯ９４／０１５６４に記載の方法により選択する。得られた株をＷ（ＧｈＲ，ΔＢ）と呼ぶ。この株では、ヒトレダクターゼをコードする配列が酵母ＧＡＰＤＨの構成的プロモーターの制御下にあり、酵母のシトクロムｂ５とＹＲＥＤが不活化されている。
本発明の別の目的は、ヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸が酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下にあることを特徴とする株である。
本発明による別の好適株は、ヒトシトクロムｂ５をコードする配列を含むベクターｐＡＢ３（図６及び１２）で形質転換することによりＷ（ｈＲ，ΔＢ）株から得られる。
前記配列を組み込んだ酵母を選択する。こうして得られた株をＷ（ｈＲ，ｈｂ５）と呼ぶ。この株はヒトタンパク質をコードする２種の配列をもつ。
本発明による特に有利な株を構築するためには、上記と同様の方法でＷ（ＧｈＲ，ΔＢ）株をプラスミドｐＡＢ３で形質転換する。こうして上記２種の性質をもつＷ（ＧｈＲ，ｈｂ５）株が得られ、即ちこの株は酵母ＧＡＰＤＨのプロモーターの制御下にヒトレダクターゼをコードする遺伝子を発現すると共に、酵母ｐＹｂ５プロモーターの制御下にヒトシトクロムｂ５をコードする遺伝子をも発現することができる。
同様に好ましい態様として、本願出願人はＷ（ｈＲ，ΔＢ）株からも株を構築した。Ｗ（ｈＲ，ΔＢ）株を制限酵素の作用により予め線状化しておいたプラスミドベクターｐＡＰ１（図８及び１３）で形質転換する。酵母染色体の遺伝子間部位ｌｅｕ２／ＳＰＬ１のレベルでｐＡＰ１に含まれる酵母ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５をコードする配列を組み込んだ形質転換細胞を選択する（図１４）。
この株は本願出願人の命名法ではＷ（ｈＲ，Ｌｈｂ５）の名称をもつ。この株はｐＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のヒトレダクターゼをコードする配列と酵母ＰＧＫプロモーターの制御下のシトクロムｂ５をコードする配列を発現することができる。
本発明の別の目的は、酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５をコードする少なくとも１種の核酸を含むことを特徴とする酵母株にある。
以下の株が特に好ましい。即ち、Ｗ（ＧｈＲ，ΔＢ）株から出発し、線状化ベクターｐＡＰ１により形質転換する。酵母ＰＧＫプロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５をコードする配列を上記遺伝子間部位ｌｅｕ２／ＳＰＬ１に組み込んだクローンを選択する。
こうして、２種の構成的酵母プロモーターの制御下の２種のヒト遺伝子をコードする配列を含むＷ（ＧｈＲ，Ｌｈｂ５）株が得られる。
本発明の別の目的は、
−酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロキシゲナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下のヒト−ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸と、
−酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５をコードする核酸
を１つの株に併有することを特徴とする。
本発明の別の実施態様は、Ｗ（Ｒ）株から出発し、ベクターｐＡＰ１で形質転換し、選択後にＷ（Ｒ，Ｌｈｂ５，Ｙｂ５）株を得ることである。
Ｗ（ｈＲ）株から出発し、同様に形質転換し、選択後にＷ（ｈＲ，Ｌｈｂ５，Ｙｂ５）株を得るのが好ましい。
本発明により構築された株は、シトクロムＰ４５０酵素系による新規化学分子の分解により生成される代謝物の毒性の評価方法に利用することができる。
本発明の別の目的は化合物の毒性の評価方法に関し、該方法は、前記化合物を本発明による酵母又は該酵母から誘導される酵素調製物の存在下におき、生成される代謝物をその毒性について分析することを特徴とする。
本発明は更に、ヒト肝細胞に存在するものに非常によく似た酵素複合体の獲得を可能にする。その結果、良好なヒト酵素発現条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ操作することが可能になる。従って、シトクロムＰ４５０複合体による新規化合物の分解によりヒト体内でどのような代謝物が生成されるかを調べることができる。
本発明の別の目的は、化合物のヒト代謝物のｉｎ vitro測定方法であり、該方法は、前記化合物を本発明による酵母又は該酵母から誘導される酵素調製物の存在下におき、生成される代謝物を同定することを特徴とする。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は非限定的な例示とみなすべきである。
図面の説明
図１：プラスミドｐＵＰ８１。
図２：プラスミドｐＰＬｌ００。
図３：プラスミドｐＡＢ１。
図４：プラスミドｐＡＢ２。
図５：プラスミドｐＬＩＰ１。
図６：プラスミドｐＡＢ３。
図７：プラスミドｐＣＤ２６。
図８：プラスミドｐＡＰ１。
図９：ｐＵＰ８１からｐＡＢ２の構築。
図１０：ｐＡＢ２によるＷ（ＧｈＲ，ΔＢ）株の構築。
図１１：カセットｈｂ５の構築。
図１２：ｐＡＢ３の構築。
図１３：ｐＡＰ１の構築。
図１４：Ｗ（ＧｈＲ，Ｌｈｂ５）株の構築。
図１５：プラスミドｐＹｅＤＰ６０、ｐＹｅＤＰ１／１０／ｈｂ５及びｐＹｅＤＰ１１０の模式図。
図１６：プラスミドｐＡＰ２、ｐＡＰ３、ｐＶＤ１、ｐＶＤ２、ｐＶＤ３、ｐＶＤ４の模式図。
図１７：ｐＡＰ４の構築と構造。
図１８：ｐＶＤ１の構築。
図１９：ｐＶＤ２の構築。
図２０：ｐＶＤ３の構築。
材料と方法：
１−培地：
次頁表Ｉ参照。
胞子形成培地には株に応じて種々の栄養要求性を補うように成分を補充する。
（１）アミノ酸とアンモニウムを含まない窒素酵母基本培地（ＹＮＢ）はＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製品である。硫酸アンモニウムはＭＥＲＣＫ製品である。ドイツ産寒天はＲＯＨＳＴＯＦＦＧｍｂｈ製品である。アデニン、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−トリプトファンはＳＩＧＭＡ製品である。Ｌ−ロイシンとウラシルはＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製品である。Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、グリセロール及び無水酢酸カリウムはＰＲＯＬＡＢＯ製品である。バクトペプトン（Ｂ．ペプトン）と酵母エキス（ＹＥ）はＤＩＦＣＯ製品である。
Ｎ３は、Ｎａ2ＨＰＯ4 ８９ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２７２ｇ及びスペシリン１ｇを水５リットルに溶かすことにより得たリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２）で緩衝する。
液体培地は、寒天を含まない以外は固体培地と同一組成である。
リンゲル液：０．９％ＮａＣｌ水溶液。
２−株：
−酵母：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：
Ｗ（Ｎ）：ＭＡＴａ及びａ，ｌｅｕ２−３，１１２，ｈｉｓ３−１１，ａｄｅ２−１，ｔｒｐ１−１，ｕｒａ３−１。Ｗ（Ｎ）ａはＷ（Ｎ）Ｍａｔａを表し、Ｗ（Ｎ）ａはＷ（Ｎ）Ｍａｔａを表す。
Ｗ（ΔＢ）：ＭＡＴａ及びａ，ｌｅｕ２−３，１１２，ａｄｅ２−１，ｔｒｐ１−１，ｕｒａ３−１，Ｙｂ５：ＨＩＳ３。Ｗ（ΔＢ）ａはＷ（ΔＢ）Ｍａｔａを表し、Ｗ（ΔＢ）ａはＷ（ΔＢ）Ｍａｔａを表す。
Ｗ（ｈＲ）：ＭＡＴａ及びａ，ｌｅｕ２−３，１１２，ｈｉｓ３−１１，ａｄｅ２−１，ｔｒｐ１−１，ＹＲＥＤ：［ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１：：ＨＲＥＤ］。Ｗ（ｈＲ）ａはＷ（ｈＲ）Ｍａｔａを表し、Ｗ（ｈＲ）ａはＷ（ｈＲ）Ｍａｔａを表す。
−細菌：
大腸菌ＤＨ５−１：ｓｕｐＥ４４，ｈｄｄＲ１７，ｒｅｃＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡ１。
３−ベクター：
−プラスミドｐＵＰ８１：プライマーＮ１及びＮ２を用いてＰＣＲにより得られたヒトシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子のコーディングフレームをＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで切断した後、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの側のＡＴＧであるそのBamHI部位のレベルで組み込みベクターＤＰ１１０にクローニングする（Ｕｒｂａｎら，１９９３）。
プライマーＮ１：５’−ＧＣｇｇａｔｃｃＡＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＣＧＴＧＧ−３’（配列番号１）。塩基１〜２はＧＣクランプを形成し、塩基３〜８（小文字）は付加されたＢａｍＨＩ部位に対応し、塩基９〜１７及び２１〜２７はヒトレダクターゼ遺伝子のオープンリーディングフレームの配列のヌクレオチド１〜９及び１３〜１９に夫々相同であり、塩基１８〜２０（太字）はヒトレダクターゼのコーディング配列のＡＴＧから１０〜１２位のヌクレオチドＴＣＣを突然変異させることができる。この突然変異は酵母での翻訳の阻害に関与する最初から２０塩基対で転写されるＲＮＡのフォーク構造を破壊することができる（Ｂａｉｍら，１９８８）。
プライマーＮ２：５’−ＣＧｇａａｔｔｃＡＧＡＴＣＴＡＧＣＴＣＣＡＣＡＣＧＴＣＣＡＧＧ−３’（配列番号２）。塩基１〜２はＧＣクランプを形成し、塩基３〜８（小文字）はＥｃｏＲＩ部位に対応し、塩基９〜１４（下線）はＢｇｌＩＩ部位に対応し、塩基１４〜１６（太字）は停止コドン（相補鎖）に対応し、塩基１３〜３１はヒトレダクターゼ遺伝子のオープンリーディングフレームのヌクレオチド２０１８〜２０３４に相補的である。
−プラスミドｐＦＬ２６（Ｂｏｎｎｅａｕｄら，１９９１）。
−プラスミドｐＰＬ１００：ＡＤＥ２／ｐＦＬ（ＳｔｏｔｚとＬｉｎｄｅｒ）。酵母ＡＤＥ２遺伝子を改変してベクターｐＰＬ１００を構築した。ＡＴＧから５９３位のアデノシンをグアニンに突然変異させることにより、遺伝子の内部BglII部位を破壊する。この突然変異はアミノ酸配列もタンパク活性も変えない。開始コドンから−３７３位のＡＤＥ２遺伝子の５’領域にＢｇｌＩＩ部位を導入する。この遺伝子はＡＴＧから１８６２位にＢｇｌＩＩ部位をもつ。２２４１ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメントをＢｇｌＩＩ部位でベクターｐＦＬ３６にクローニングする（Ｂｏｎｎｅａｕｄら，１９９１）。
−「Ｂｌｕｅｓｒｉｐｔ」プラスミドはキット「ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫ（＋）クローニングキット」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に記載されている。
４−交配：
逆符号（ａ又はａ）の１倍体株をＹＰＧＡ完全培地で別々に培養する。次に、細胞をリンゲル液で約１０５個／ｍｌまで希釈する。２種の１倍体細胞懸濁液各５００ｍｌの混合物を調製する。混合物から懸濁液５０ｍｌを固体培地ＹＰＧＡにプレーティングする。８時間培養後、２種の親に同時に存在する栄養素のみを補充した選択培地で細胞をサブクローニングする。こうすると、交配により生じた２倍体は成長できるが、元の１倍体は成長できなくなる。２日間培養後、出現する２倍体クローンを同一選択培地で二次培養する。
５−胞子形成：
２倍体の栄養要求性マーカーを補充した固体胞子形成培地で２倍体細胞を二次培養する。３日間胞子形成後に胞子を解剖する。
６−胞子の解剖：
所謂バルク法：
１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブで１００ｍｇ／ｍｌのチモリアーゼ１０，０００（生化学工業社、日本、東京）を含む水で胞子を５×１０8細胞／ｍｌまで希釈した後、２８℃で３０分間インキュベートする。５００ｍｌアリコートを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。細胞沈渣を水１ｍｌにとり、遠心分離し、水１００ｍｌにとる。細胞を２分間ボルテックス撹拌する。チューブを２〜３回転倒させながら水で濯ぐ。５回濯いだ後、疎水性の胞子はチューブの壁に付着しているが、２倍体栄養細胞は懸濁したままなので、濯ぎ落とす。次に、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）溶液に胞子を再懸濁する。遠心分離後に希釈剤を捨てる。精製した胞子をリンゲル液にとり、固体選択培地にプレーティングする。
顕微鏡解剖：
胞子を０．５ｇ／ｌサイトヘリカーゼ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）溶液（５５％グリセロール）中で２２℃で１５分間インキュベートした後、予め切り取って載物ガラスに載せておいた寒天片にプレーティングする。次に載物ガラスを顕微鏡解剖チャンバーに逆さに置く。四分子に含まれる４個の胞子を顕微鏡下にマイクロマニピュレーターで分離する。こうして解剖した四分子を担持する寒天をＹＰＧａｌＡ完全培地容器に移す。
７−ＧＡＰＤＨプロモーターのクローニング：
ＰＣＲ増幅：
プライマーとしてプライマーＮ３（配列番号３）及びＮ４（配列番号４）５０ｎｇを使用することにより、従来記載されている方法（Ｂｅｌｌａｍｉｎｅら，１９９４）に従って調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ（Ｎ）のゲノムＤＮＡ １００ｎｇからＰＣＲ法により酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターのＤＮＡをクローニングした（図９）。増幅は天然Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）２．５Ｕを用いて実施する。重合反応は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍｇ／ｍｌ無ヌクレアーゼ「血清アルブミン」及び４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）各２００ｍＭからなる溶液５０ｍｌ中で実施する。ＰＣＲ条件は以下の通りである。
プライマーの配列は次の通りである。
−プライマーＮ３：５’−ＣＣａａｇｃｔｔＧＡＧＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＴＣＧ−３’（配列番号３）。最初から２つの塩基はＧＣクランプを形成し、小文字はＨｉｎｄＩＩＩ部位に対応し、塩基９〜３１はＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターの配列のヌクレオチド−６７３〜−６５０と相同である。
−プライマーＮ４：５’−ＣｇｇａｔｃｃＴＡＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＧＴＴＣＴＴＧＧ−３’（配列番号４）。小文字はＢａｍＨＩ部位に対応し、塩基８〜４２はヌクレオチド−６〜−４８に相補的である。
増幅後のＤＮＡの寸法は６９１ｂｐである。
７．５Ｍ酢酸アンモニウム２６ｍｌと水４ｍｌをＰＣＲ産物５０ｍｌに加える。混合物をエタノール８０ｍｌで２２℃で１０分間沈殿させる。沈殿したＤＮＡを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。沈渣を７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、乾燥し、水２０ｍｌにとる。
このＤＮＡの１０ｎｇアリコートを販売業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示に従ってキット「ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫ（＋）クローニングキット」のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＳｒｆＩ部位にクローニングする。クローンをＰｖｕＩＩ制限により選択する。クローニングしたＤＮＡとＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの接合レベルで、２５１３及び１１３９ｂｐのＰｖｕＩＩフラグメントを与えるクローンをキットＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ Ｕ．Ｓ．Ｂ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により１００ｂｐにわたって配列決定する。これらの構築物をｐＡＢ１と呼ぶ。
組み込みベクターｐＵＢ８１へのＧＡＰＤＨプロモーターのクローニング：
クローンｐＡＢ１をＨｉｎｄＩＩＩで切断する。この切断により生じた付着末端部位をＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）で充填する。こうして線状化したベクターｐＡＢ１（３６５２ｂｐフラグメント）を次にその５’末端をＢａｍＨＩで切断した後、ＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩ部位間でベクターｐＵＰ８１にクローニングする。連結時に、平滑末端化されたＨｉｎｄＩＩＩ部位は平滑末端であるＥｃｏＲＶ部位に適合し、フラグメントｐＧＡＰＤＨと組み込みベクターｐＵＰ８１の２つのＢａｍＨＩ半部位は相互に結合する。ＥｃｏＲＶ部位を選択し、同時にＵＲＡ３遺伝子を破壊した（図９）。クローンを酵素ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで酵素制限により選択する。６０、１０４、１９７、３８５、４４０及び２５６４ｂｐフラグメント（ベクターｐＵＢ８１に存在するフラグメント）以外に６００及び８００ｂｐのＤＮＡフラグメントを与えるクローンが、ＧＡＰＤＨプロモーターのＤＮＡを含むベクターｐＵＰ８１に相当する。この構築物をｐＡＢ２と呼ぶ。ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターのＤＮＡの５’末端からプライマーＮ３（配列番号３）により１００ｂｐにわたって配列決定することにより、プラスミドｐＡＢ２を含む３個のクローンが確認される。
８．ヒトシトクロムｂ５のＹＣＹＢ５遺伝子座組み込みカセットの構築：
この構築は３種の異なるＰＣＲで実施した。
第１のＰＣＲ（ＰＣＲ１）では、プライマーＮ５（配列番号５）及びＮ６（配列番号６）と酵母Ｗ（Ｎ）のゲノムＤＮＡを使用することにより、酵母シトクロムｂ５遺伝子（Ｙｂ５）のプロモーターの３’末端の３５３ｂｐを増幅した。
−プライマーＮ５：５’−ｇｇａｔｃｃＧＡＧＣＧＧＧＴＡＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号５）はその５末端からＢａｍＨＩ部位（小文字）を含む。このプライマーは、塩基７〜３１が酵母シトクロムｂ５遺伝子のプロモーターのオープンリーディングフレームのヌクレオチド−３３１〜−３０６と相同である。
−プライマーＮ６：５’−ｃｃｇａｃｔｇｃｔｃｔｇｃｃａｔＧＡＴＴＧＴＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧ−３’（配列番号６）はその５’末端からヒトシトクロムｂ５遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端の最初から１６個のヌクレオチドに相補的な配列である塩基１〜１６（小文字）と、酵母シトクロムｂ５遺伝子のプロモーターのヌクレオチド−１〜−３２に相補的な配列である塩基１７〜４９を含む。
増幅後のフラグメントは３７５ｂｐである。
第２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）では、酵母シトクロムｂｐ遺伝子のターミネーターの５’部分の最後の１４７ｂｐをプライマーＮ７（配列番号７）及びＮ８（配列番号８）により増幅した。
−プライマーＮ７：５’−ｃｃｔａｔａｃａｔｇｇｃａｇａｇｇａｃｔｇａＡＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号７）はその５’末端からヒトシトクロムｂ５遺伝子のオープンリーディングフレームのヌクレオチド３８３〜４０５に相同の配列である塩基１〜２２（小文字）と、ターミネーターの停止コドンから１〜２８位のヌクレオチドに相同の配列である塩基２３〜５０を含む。
−プライマーＮ８：５’−ＧＧａｇａｔｃｔＧＴＧＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴＧＣＧＡＴＡＴＡＧ−３’（配列番号８）はＧＣクランプを形成する塩基１〜２と、ＢｇｌＩＩ部位に対応する塩基３〜８（小文字）を含む。このプライマーは塩基９〜３２が酵母ＹＣＹＢ５遺伝子のターミネーターのオープンリーディングフレームの停止コドンから１〜１４７位のヌクレオチドに相補的である。
増幅後のフラグメントは１８０ｂｐである。
ＰＣＲ１及び２では、酵母Ｗ（Ｎ）のゲノムＤＮＡを鋳型として用いる。
第３のＰＣＲ（ＰＣＲ３）では、４種のプライマーを使用する。
−最初の２種のＰＣＲ産物（３７５及び１８０ｂｐ）２００ｎｇをプライマーとして使用し、ヒトシトクロムｂ５のコーディングフレームのＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として用いる（図１１）。こうすると、少量ではあるが、ヒトｂ５の組み込みカセット（ＣＩＨ）が得られる。
−このＰＣＲ産物を次にプライマーＰ５（配列番号５）及びＮ８（配列番号８）で増幅すると、より多量の組み込みカセットが得られた。融合産物を増幅後に０．２ｍＭ ｄＮＴＰの存在下でＰｆｕポリメラーゼで７６℃で３０分間処理する。得られるフラグメントは９１７ｂｐである。増幅はＴａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ）を用いて実施する。
使用したＰＣＲプログラムは以下の通りである。
ＰＣＲ１及びＰＣＲ２：
ＰＣＲ３：
こうして構築した組み込みカセット（ＣＩＨ）をＳｆｒＩ部位のレベルでｐＣＲＳｃｒｉｐｔベクターにクローニングする。得られたクローンｐＬＩＰ１を、酵母ＹＣＹＢ５遺伝子のプロモーター及びターミネーターとヒトシトクロムｂ５遺伝子のコーディングフレーム間の２つの接合部のレベルの２００ｂｐにわたって配列決定することにより確認する。ヒトｂ５の組み込みカセットの組み込みが適正に行われるように組換えアームを延長するために、ベクターｐＬＩＰ１の９１７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントからヒトシトクロムｂ５遺伝子のコーディングフレームと酵母ＹＣＹＢ５遺伝子のプロモーター及びターミネーター全体を含む新規組み込みカセットを構築した。酵母ＹＣＹＢ５遺伝子全体を含むベクターＹＣＹＢ５／ＹＥＰ３５２（Ｔｒｕａｎら，１９９４）を固有ＣｌａＩ部位で切断する。この線状化フラグメントとベクターｐＬＩＰ１の９１７ｂｐのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントでＷ（Ｎ）ａ株を同時形質転換する。ベクターＹＣＹＢ５／ＹＥＰ３５２の線状化はＹＣＹＢ５遺伝子のコーディングフレームのレベルで行われるので、酵母シトクロムｂ５は酵母で相同組換え後にヒトシトクロムｂ５により置換される（図１２）。発現ベクターの再環状化により組換え体を選択する（Ｂｅｌｌａｍｉｎｅら，１９９４）。新規ベクターｐＡＢ３を酵母から回収後、従来記載されている方法（Ｂｅｌｌａｍｉｎｅら，１９９４）に従って大腸菌で増幅する。
９．ヒトシトクロムｂ５の遺伝子間部位ｌｅｕ２Ｄ／ＳＰＬ１組み込みカセットの構築：
ＳＰＬ１遺伝子の５００ｂｐとの遺伝子間領域でＬＥＵ２遺伝子の直ぐ近傍にヒトシトクロムｂ５遺伝子を組み込むことが可能なカセットを２段階で構築した。
−ベクターｐＣＤ２６の構築：ＬＥＵ２遺伝子とＳＰＬ１遺伝子の５００ｂｐを併有するベクターｐＦＬ２６（Ｂｏｎｎｅａｕｄら，１９９１）から３回のＰＣＲでＮｏｔＩ部位を導入した（図１３）。
第１のＰＣＲでは、プライマーＰ９（配列番号９）及びＮ１０（配列番号１０）を使用することによりＬＥＵ２遺伝子の３’部分の７０４ｂｐを増幅する。
−プライマーＮ９：５’−ＴＴＧＡＡＧＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＧ−３’（配列番号９）はＬＥＵ２遺伝子のオープンリーディングフレームの終点に対応するベクターｐＦＬ２６のヌクレオチド２１９０〜２２１４に相同である（ベクターｐＦＬ２６のナンバリングはＢａｍＨＩ部位の上流４１７ｂｐに配置されたヌクレオチド１から始まる）。
−プライマーＮ１０：５’−ＧＴＧＴＧｇｃｇｇｃｃｇｃＣＴＣＣＴＴＧＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧ−３’（配列番号１０）はベクターｐＦＬ２６のヌクレオチド２８９０〜２９８４に相補的な５個の塩基をその５’末端に含み、更に塩基６〜１３のＮｏｔＩ部位と、塩基１４〜３８のヌクレオチド２８５７〜２８８１の相補的配列を含む。
第２のＰＣＲでは、プライマーＮ１１（配列番号１１）及びＮ１２（配列番号１２）を使用することにより、ＳＰＬ１遺伝子の３’部分の最後の３４７ｂｐを増幅する。
−プライマーＮ１１：５’−ＣＡＡＧＧＡＧｇｃｇｇｃｃｇｃＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＴＴＡＧＧＴＧＴ−３’（配列番号１１）はベクターｐＦＬ２６の配列のヌクレオチド２８７５〜２８８１に相補的な７個の塩基をその５’末端に含み、更に塩基８〜１５のＮｏｔＩ部位と、塩基１６〜３４のｐＦＬ２６のヌクレオチド２８８９〜２９０８に相同な配列を含む。
−プライマーＮ１２：５’−ＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＴＡＧＡＡＣＣＴＴＣＴＴＡＴＧ−３’（配列番号１２）はベクターｐＦＬ２６のＳＰＬ１遺伝子のオープンリーディングフレームをコードする鎖の３’末端のヌクレオチド３１９８〜３２２２に相補的である。
第３のＰＣＲでは、最初の２回のＰＣＲから得られた２つのフラグメント（ＮｏｔＩ部位を含む２０ｂｐのオーバーラップをもつ）１００ｎｇを鋳型として使用し、プライマーＮ９及びＮ１２をプライマーとして使用する。増幅後の１０３１ｂｐをＮｓｉＩ及びＢｓｔＸＩ部位でベクターｐＦＬ２６にクローニングし、ベクターｐＣＤ２６を得る。
増幅はＴａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ）を用いて実施する。最初の２回のＰＣＲは上記第８節のＰＣＲ１及び２と同一プログラムを使用し、ＰＣＲ３は下記プログラムを使用する。
−組み込みベクターｐＡＰ１の構築：予め構築しておいたベクターｐＵＰ１２（Ｕｒｂａｎら，１９９０）から、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断により酵母ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）遺伝子のプロモーター及びターミネーターの制御下のヒトシトクロムｂ５の発現カセットを回収する。この２４００ｂｐフラグメントをＭｕｎｇ Ｂｅａｎヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｐｓ）で平滑末端化した後、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端化したＮｏｔＩ部位で切断したベクターｐＣＤ２６にクローニングする（図１３）。５１５４及び２９０４ｂｐのＰｓｔＩ制限フラグメントを与えるクローン（ｐＡＰ１と呼ぶ）を組み込みに使用する。
１０−シトクロムＰ４５０による形質転換用ベクター
プラスミドｐＹｅＤＰ６０は大腸菌ｏｒｉと２μ ｏｒｉの複製起点、アンピシリン耐性をコードするｂｌａ遺伝子、栄養素補充マーカーであるＵＲＡ３及びＡＤＥ２遺伝子、ガラクトースの存在下で誘導的なGAL 10−CYC 1ハイブリッドプロモーター及びＰＧＫ遺伝子の転写ターミネーターをもつ9265ｂｐのシャトルベクター（細菌、酵母）である。発現させようとするｃＤＮＡのクローニング後に、特にＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ制限部位を含むポリリンカーをプロモーターと転写ターミネーターの間に挿入する。
プラスミド１Ａ１／Ｖ６０及び３Ａ４／Ｖ６０は、ヒトシトクロムＰ４５０１Ａ１及び３Ａ４を夫々コードするｃＤＮＡのコーディングフレームがＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターとＰＧＫ転写ターミネーターの制御下に挿入されたベクターＶ６０に対応する。
１１−酵母株の形質転換用培地
ＹＰＧＥ培地
−酵母エキス １０ｇ／ｌ
−バクトペプトン １０ｇ／ｌ
−グルコース ５ｇ／ｌ
−エタノール ３０ｍｌ／Ｌ
ＳＷ６培地
−酵母窒素基本培地（Ｄｉｆｃｏ） ７ｇ／ｌ
−グルコース ２０ｇ／ｌ
−カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ） １ｇ／ｌ
−トリプトファン ２０ｍｇ／ｌ
−寒天 １５ｇ／ｌ（固体培地のみ）
対応するガラクトース培地（ＳＷ５）は、グルコースを同一濃度のガラクトースで置換える。
１２−ミクロソームフラクションの調製
１２．１ 形質転換
「塩化リチウム」法と呼ばれる標準方法により酵母をプラスミド１Ａ１／Ｖ６０又は３Ａ４／Ｖ６０で形質転換する。アデニンとウラシルを含まない合成グルコース酵母培地（ＳＷ６）に、使用する株（更には株の遺伝子型）に応じて残留栄養要求性を補うように必要な栄養素を加え、この培地で形質転換細胞を選択する。グルコース培地で選択された一次形質転換細胞のかなりの割合は最少ガラクトース培地では成長しない。ガラクトース培地で適正に成長するクローニングのみを保存する。
１２．２ 予備培養
選択されたクローンをプラスミドに選択的な非誘導性最少グルコース培地（一般にＳＷ６培地）で二次培養した後、同一液体培地２０ｍｌ中で２８℃で一晩インキュベートする。
１２．３ 培養
ＹＰＧＥ培地２５０ｍｌに予備培養物を接種し、８〜９．６×１０7細胞／ｍｌの細胞密度が得られるまで２８℃で撹拌下にインキュベートする。次にガラクトースを２０ｇ／ｌの濃度まで加え、２×１０8細胞／ｍｌの細胞密度が得られるまで培養物を２８℃で一晩インキュベートする。ガラクトースの存在はＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターに依存してシトクロムＰ４５０及び他の遺伝子の誘導を可能にする。
１２．４ 細胞の分画
細胞を遠心分離し、ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．４（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；０．１Ｍ ＫＣｌ）で洗浄し、ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．４、０．６Ｍソルビトールに再懸濁する。細胞を破壊するために、ガラスビーズを加え、試験管を４℃で５分間激しく転倒撹拌する。４℃で下記段階を実施する。破壊した細胞の懸濁液を回収し、ビーズを同一緩衝液で数回洗浄する。細胞破片、核及びミトコンドリアフラクションを除去するために、夫々３５００ｒｐｍで３分間と15000ｒｐｍで１０分間の２回の遠心分離を行う。ミクロソームを沈殿させるために、上清をＮａＣｌ（最終濃度０．１５Ｍ）及びＰＥＧ ４０００（最終濃度１０％）の存在下で氷冷下に１５分間インキュベートする。１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離後に、ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．４、２０％グリセロール中でミクロソーム沈渣を回収する。ミクロソーム調製物を分取し、−８０℃で保存する。
１３−シトクロムＰ４５０の定量
ミクロソームフラクション中のシトクロムＰ４５０の濃度をスペクトルにより測定する。定量しようとするシトクロムＰ４５０をＴＥ緩衝液、ｐＨ７．４で希釈（ミクロソームタンパク質約１ｍｇ／ｍｌ）し、数個の亜ジチオン酸ナトリウム粒子で還元する。基線（還元シトクロムＰ４５０対還元シトクロムＰ４５０）の記録後、数個のＣＯ気泡を測定槽に加え、４００〜５００ｎｍで示差スペクトルを測定する。ＣＯはシトクロムＰ４５０の還元鉄と安定な錯体を形成し、この錯体は４５０ｎｍに特徴的吸収最大値をもつ。吸収係数εＭ（４５０〜４９０ｎｍ）は９１ｍＭ-1．ｃｍ-1である。
１４−ミクロソームタンパク質の定量
全タンパク質の定量はＰＩＥＲＣＥ−ＢＣＡ定量キットを製造業者の指定条件で使用することにより実施する。ウシ血清アルブミンを標準として使用する。
１５−シトクロムＰ４５０の触媒活性
１５．１ ミクロソームでのＥＲＯＤ活性試験
シトクロムＰ４５０１Ａ１は７−エトキシレゾルフィンのＯ−脱エチル化を触媒する。５３０ｎｍで励起後の反応産物レゾルフィン（７−ヒドロキシフェノキサジン）は５８６ｎｍで蛍光発光する。単位時間当たりに形成されるレゾルフィンの量はレゾルフィンの蓄積速度に対応する。
インキュベーション混合物は、５０μＭ ＮＡＤＰＨ及び２．５μＭ ７−エトキシレゾルフィンを含むＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌ中のミクロソーム（ミクロソームタンパク質２０〜５０μｇ）懸濁液２μｌからなる。触媒効力に及ぼすウサギシトクロムｂ５の効果を測定するために、過剰の精製シトクロムの存在下でミクロソームフラクションを予め冷温でインキュベートする。
１５．２ ミクロソームでのＴＨＬ活性試験：テストステロンの６β−ヒドロキシル化
テストステロンはシトクロム３Ａ４により６β位をヒドロキシル化されたステロイドホルモンである。インキュベーション培地は、過剰のシトクロムｂ５の不在下又は存在下に５０μＭ ＮＡＤＰＨ、８０μＭテストステロン（エタノール中５ｍＭ母液から）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４又は５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４の緩衝液０．２５ｍｌ中にミクロソームタンパク質１００μｇを含む。
インキュベーションは２８℃又は３７℃で１０分間行う。水中５０％ＴＦＡ１０μｌを加えて反応を停止する。抽出手順は以下の通りである。
−ジクロロメタン５００μｌ添加、
−１分間最大速度でボルテックス撹拌、
−１００００ｒｐｍで５分間遠心分離、
−上部水相の除去、
−窒素流下に有機相の蒸発。
乾燥残渣をメタノール２０μｌにとった後、水２０μｌを加える。半量を逆相HPLCカラムＳＰＨＥＲＩ−５ＲＰ−18.5μｍ（100×2.1ｍｍ）に注入し、アセトニトリルを１ｍｌ／ｍｉｎで溶離剤として使用する。溶離勾配のアセトニトリル組成は０分で１０％（ｖ／ｖ）→８分で６０％とする。検出は２５４ｎｍで行う。溶離時間はβ−ヒドロキシテストステロンで６分２０秒間、テストステロンで８分間とする。
実施例
実施例１：Ｗ（ｈＲ，ΔＢ）株の構築
Ｗ（ΔＢ）ａ株（Ｗ０ＡＢＩＦ培地で成長）とＷ（ｈＲ）ａ株（Ｗ０ＡＤＩＦ培地で成長）を交配し、Ｗ０ＡＩＦグルコース培地で２倍体を選択する。この培地は１倍体の各々に致死性であるが、２倍体Ｗ（ｈＲ／ＹＲ，Ｙｂ５／ΔＹｂ５）には非致死性である。２倍体クローンを同一選択培地でサブクローニングする。胞子形成後、四分子を顕微鏡解剖又はバルク解剖により解剖する。ＹＰＧａｌＡ培地で培養した胞子を次に炭素源としてガラクトースを含む種々の選択培地で二次培養し、各種胞子の栄養要求性を試験する。ガラクトース培地で成長し、ウラシルとヒスチジンに関して原栄養性の酵母クローンがＷ（ｈＲ，ΔＢ）株に対応する。同一培地でガラクトースをグルコースに置換えると、これらの条件下ではヒトレダクターゼが発現しないので、これらの酵母は成長しなくなる。二重欠失は致死性であるため、レダクターゼと酵母ｂ５（その遺伝子は破壊されている）を同時に欠失しているこれらの株は成長しない（Ｔｒｕａｎら，１９９４）。顕微鏡解剖により得たＳｐ１及びＳｐ２とバルク解剖により得たＣ１及びＣ２の４個のクローンを後期試験に備えて保存する。
実施例２：Ｗ（ＧｈＲ，ΔＢ）株の構築
ＮｏｔＩで切断したＧＡＰＤＨプロモーターの組み込みベクターｐＡＢ２を使用してＷ（ｈＲ，ΔＢ）ａ株を形質転換する。ベクターｐＰＬ１００（ベクターｐＡＢ２のＤＮＡ２ｍｇに対してベクターｐＰＬ１００のＤＮＡ１０〜１５ｎｇ）を同時形質転換マーカーとして使用する。形質転換細胞をＷ０ＢＤＩＦ培地で選択する。クローンを次の３種のスクリーニングにかける。
−ウラシル要求性の選択：形質転換細胞をＷ０ＡＢＤＩＦ培地、次いでＷ０ＡＤＩＦ培地で二次培養し、ウラシルの不在下では成長しないクローンを検出する。ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの代わりにＧＡＰＤＨプロモーターを組み込むとプロモーターの上流のＵＲＡ３遺伝子も同時に不活化されるので、ＵＲＡ３遺伝子の喪失はＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターがＧＡＰＤＨプロモーターで置換されたことを示唆する。形質転換細胞の２５％はウラシルの不在下では成長しない（図１０）。
−第２の選択：ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で発現されるヒトレダクターゼの活性を確認するために、Ｗ（ＧｈＲ，ΔＢ）クローンのケトコナゾール耐性を評価した（国際公開ＷＯ９４／０１５６４）。３個の異なるクローンは２０ｍｇ／ｍｌのケトコナゾールに耐性であるが、ヒトレダクターゼがＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下で発現されるＷ（ｈＲ）株は同一条件下で１〜５ｍｇ／ｍｌの耐性である。
−第３の選択：Ｗ（ＧｈＲ，ΔＢ）株におけるヒトレダクターゼの発現レベルを推定するために、３個の被験クローンのミクロソームフラクションに含まれるレダクターゼによるシトクロムｃの還元を測定する（Ｔｒｕａｎら，１９９３）。培養条件に応じてシトクロムｃの還元はＷ（ｈＲ）株の１．５〜３倍である。
−呼吸試験：得られたクローンをＮ３固体培地で二次培養し、呼吸表現型を試験する。３個のクローンはＮ３上で成長しない。従って負の呼吸表現型である。「呼吸を正に」するためには、これらのクローンを正の呼吸表現型株Ｗ（ｈＲ）ａと交配する。得られた２倍体Ｗ（ＧｈＲ／ｈＲ，ΔＢ／Ｙｂ５）をＷ０ＡＩＦ培地で選択する。胞子形成及びバルク解剖後、１倍体のゲノムＤＮＡを調製した後、このＤＮＡでプライマーＮ１３（配列番号１３）及びＮ１４（配列番号１４）を用いてＰＣＲを実施する。
−プライマーＮ１３：５’−ＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＴＴＡＣＡＧＴＴＡＣＣ−３’（配列番号１３）。塩基１〜３０は酵母ＹＣＹＢ５遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端の３０ヌクレオチドに相同である。
−プライマーＮ１４：５’−ＣＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＧＴＴＣＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１４）。塩基１〜４２は酵母ｂ５をコードする鎖のヌクレオチド３２１〜３６３に相補的である。
分析した６個のクローンのうち、３個のクローンは３６３ｂｐに増幅されたバンド（酵母シトクロムｂ５遺伝子のコーディングフレーム）をもち、他の３個のクローンはＨＩＳ３遺伝子の寸法（１７００ｂｐ）と酵母ｂ５のオープンリーディングフレームの寸法（３６３ｂｐ）の和に対応する２０６３ｂｐのバンドをもつ。これらのクローンをＷ０ＡＢＩＦ固体培地でサブクローニングし、ヒスチジンに対する栄養要求性を試験する。全クローンはヒスチジンの不在下で成長するが、そのうちの５０％（３６３ｂｐに増幅されたＰＣＲバンドをもつクローン）はヒスチジン要求性であるとみなされる。元のＷ（Ｎ）株のｈｉｓ３−１１遺伝子は突然変異している。Ｗ（ΔＢ）株（Ｔｒｕａｎら，１９９３）の構築時にＹＣＹＢ５のコーディングフレームにＨＩＳ３遺伝子を組み込んで酵母ＹＣＹＢ５遺伝子を破壊した際に、別の遺伝子座へのＨＩＳ３遺伝子の第２の組み込みが随伴したと予想される。このため、ＨＩＳ３遺伝子の２個の機能的コピーを含む株（Ｗ（ΔＢ））が構築されると考えられる。ＨＩＳ３遺伝子を分離すると２／２型ではなくなる。得られる結果はこのように説明できる。これらのクローンの２個を後期試験に備えて保存する（Ｂ１及びＢ２）。
実施例３：Ｗ（ｈＲ，ｈｂ５）株の構築
ＳＰ１、ＳＰ２、Ｃ１及びＣ２の４個のクローンをＹＰＧａｌＡ液体完全培地で培養し、ベクターｐＡＢ３の２０２２ｂｐのＰｖｕＩＩフラグメントにより形質転換する（図１２）。形質転換細胞をＹＰＧＡ培地にプレーティングする。ヒトシトクロムｂ５がグルコース培地上でＷ（ｈＲ，ΔＢ）株を致死性から救済する能力について組み込み細胞を選択する。成長したクローンをロット毎にまとめる。各ロットのゲノムＤＮＡを調製する。プライマーＮ５（配列番号５）及びＮ１５（配列番号１５）を用いてＰＣＲを実施する（上記第８節のＰＣＲ１及び２と同一条件）。７５８ｂｐに増幅されたバンドを与えるロットをＰＣＲにより個々に分析する。ヒトシトクロムｂ５の発現カセットをＹＣＹＢ５遺伝子座に組み込んだクローンＷ（ｈＲ，ｈｂ５）が初期クローンＷ（ｈＲ，ΔＢ）Ｓｐ１から得られる。
−プライマーＮ１５：５’−ＣＣｇａａｔｔｃＴＧＡＴＣＡＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号１５）。塩基１〜２はＧＣクランプであり、塩基３〜８（小文字）はＥｃｏＲＩ部位に対応し、塩基９〜１４はＢｃｌＩ部位に対応し、塩基１２〜１４は停止コドンに対応し、塩基１５〜３３はヒトシトクロムｂ５遺伝子のオープンリーディングフレームのヌクレオチド３８６〜４０５に相補的である。
実施例４：Ｗ（ＧｈＲ，ｈｂ５）の構築
クローンＢ１及びＢ２をＹＰＧＡ液体完全培地で培養し、ベクターｐＡＢ３の２０２２ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメントと同時形質転換マーカーとしてのベクターｐＰＬ１００により形質転換する。形質転換細胞をＷ０ＢＤＩＦ固体培地で選択する。成長するクローンを次にロット毎にまとめ、プライマーＮ３（配列番号３）及びＮ１３（配列番号１３）を使用することによりＰＣＲ分析する。前節と同様に個々のクローンをＰＣＲにより確認する。
実施例５：Ｗ（ｈＲ，Ｌｈｂ５）株の構築
組み込みベクターｐＡＰ１をＸｂａＩにより切断する。ＳＰ１、ＳＰ２、Ｃ１及びＣ２の４個のクローンをこの線状化フラグメントで形質転換する。形質転換細胞をＹＰＧＡ培地にプレーティングする。酵母で相同組換えにより、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター及びターミネーターの依存下のヒトシトクロムｂ５発現カセットは遺伝子間部位ｌｅｕ２／ＳＰＬ１に組み込まれる（図１４）。この組換えは同時に、ゲノム内の不活性ｌｅｕ２−３遺伝子をベクターｐＡＰ１に含まれる野生型ＬＥＵ２で置換することができる。形質転換細胞の第１の選択はＬＥＵ２遺伝子の復元、即ち形質転換細胞のロイシン要求性について行われる（選択培地Ｗ０ＡＩ）。第２の選択は上記第９節に記載したＰＣＲ条件でプライマーＮ９（配列番号９）及びＮ１６（配列番号１６）を用いることにより形質転換細胞のゲノムＤＮＡでＰＣＲにより実施される。１４９５ｂｐのＰＣＲバンドを示すクローンはｈｂ５の発現カセットを組み込んでいる。
−プライマーＮ１６：５’−ＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＴＣＧＧＡＣＧ−３（配列番号１６）は塩基１〜４のＧＣクランプ配列と、塩基５〜１０のＢｇｌＩＩ部位と、ヒトシトクロムｂ５遺伝子のオープンリーディングフレームのヌクレオチド１〜１９（ＡＴＧから）に相同の配列である塩基１１〜２９を含む。
実施例６：Ｗ（ＧｈＲ，Ｌｈｂ５）株の構築
この株の構築はＷ（ＧｈＲ，ΔＢ）から出発する以外はＷ（ｈＲ，Ｌｈｂ５）株と同様に行う。Ｗ０ＡＢＩ培地で形質転換細胞を直接選択した後、ゲノムＤＮＡでＰＣＲ分析する。
実施例７：Ｗ（Ｒ，Ｌｈｂ５，Ｙｂ５）株の構築
Ｗ（Ｒ）株をＹＧＰＡ液体完全培地で培養し、ＸｂａＩにより線状化したベクターｐＡＰ１により形質転換する。形質転換細胞の第１の選択はＬＥＵ遺伝子の復元、即ち形質転換細胞のロイシン要求性について行う（選択培地Ｗ０ＡＩ）。第２の選択は上記第９節（材料と方法の項）に記載したＰＣＲ条件でプライマーＮ９（配列番号９）及びＮ１６（配列番号１６）を使用することにより形質転換細胞のゲノムＤＮＡでＰＣＲにより行う。１４９５ｂｐのＰＣＲバンドを示すクローンはｈｂ５の発現カセットを組み込んでいる。この株はガラクトースの存在下で酵母レダクターゼを過剰発現し、ＰＧＫプロモーターの制御下でヒトシトクロムｂ５を発現する。内在ｂ５の発現は正常株と変わらない。
実施例８：Ｗ（ｈＲ，Ｌｈｂ５，Ｙｂ５）株の構築
Ｗ（Ｒ）株をＷ（ｈＲ）株に置換える以外はＷ（Ｒ，Ｌｈｂ５，Ｙｂ５）株と同様に構築する。
実施例９：本発明による酵母株におけるシトクロムＰ４５０の発現レベル
種々の株における２種のシトクロムＰ４５０の発現レベルを表II及びIIIに示す。驚くべきことに、シトクロムＰ450の発現レベルは同等の培養条件でヒト化株で有意に増加している。タンパク質１ｍｇ当たりの活性は発現レベルとターンオーバー値に同時に比例して増加することが認められる。
実施例１０：酵母で産生されるシトクロムＰ４５０１Ａ１及び３Ａ４の酵素特性に及ぼすレダクターゼとシトクロムｂ５の効果
得られた結果によると、シトクロムＰ４５０１Ａ１の触媒効力は、酵母レダクターゼを過剰生産し且つヒトシトクロムｂ５を産生する１倍体株Ｗ（Ｒ，ＬＨｂ５）で最適である。他方、ウサギシトクロムｂ５を加えると活性は僅かに増加し、代謝物２７ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌシトクロムＰ４５０／分のターンオーバーに達する。
シトクロムＰ４５０１Ａ１で得られる結果とは逆に、シトクロムＰ４５０３Ａ４の触媒効力はヒトレダクターゼを発現する酵母株で優先的に増加する。Ｗ（ＧｈＲ，ｈｂ５）株は最適触媒効力を示す。レダクターゼの種類とレベルに関係なく、シトクロムｂ５をコードするｃＤＮＡが株のゲノムに存在すると触媒効力は増加する（２〜２０倍）。シトクロムｂ５の内在遺伝子の欠失は、特に発現されるヒトｂ５の存在下で非常に有利な要因であると思われる。ヒトレダクターゼの発現、内在シトクロムｂ５の破壊及び同一１倍体酵母株におけるヒトｂ５の発現は、所定のヒトシトクロムＰ450、特にシトクロムＰ4503Ａ４の発現に特に有利な要因である。
実施例１１：シトクロムＰ４５０とヒトミクロソームシトクロムｂ５の同時発現を可能にするプラスミドの構築
本実施例は本発明による酵母株のＰ４５０活性を最適化するために使用可能なプラスミドの構築に関する。これらのプラスミドはシトクロムＰ４５０とヒトミクロソームシトクロムｂ５の同時発現を可能にする。この系列の全プラスミドは以下の共通特徴の兼備という独自の特徴をもつ。
（ｉ）Ｐ４５０の発現カセットは誘導的ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの転写制御下にあることが好ましい。
（ｉｉ）シトクロムｂ５の発現カセットはＧＡＬ１０−ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ又はＰＧＫの３種のプロモーターのうちの１種の転写制御下にあることが好ましい。
（ｉｉｉ）２個の選択マーカーが存在し、そのうちの一方は酵母ＡＤＥ２遺伝子であることが好ましい。
（ｉｖ）２個の発現カセットがプラスミド上で酵母複製起点とＡＤＥ２マーカーにより分離されている。ｂ５とＰ４５０の発現にＧＡＬ１０−ＣＹＣ１型の２個の同一プロモーターを使用する場合には、これらのプロモーターはプラスミド上で（プラスミドの回転に関して）逆向きである。２種の異なる転写ターミネーター、好ましくは酵母ＰＧＫ及びＰ４５０レダクターゼ遺伝子の転写ターミネーターを使用する。
これらの性質の兼備は、特に相同組換え現象に対して安定なプラスミドを獲得することを目的とする。
この系列のプラスミドはシトクロムｂ５の発現に使用するプロモーターと別種である。この性質により、相対発現レベルを調節し、種々の培養条件又は用途に合わせて最適化することができる。
実施例１１．１ ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のＰ４５０の発現とＰＧＫプロモーターの制御下のヒトｂ５の発現を可能にするプラスミドｐＡＰ４の構築
図１５に示すベクターｐＹｅＤＰ１／１０／Ｈｂ５は、開始コドンのすぐ上流のＢｇｌＩＩ部位と停止コドンのすぐ下流のＥｃｏＲＩ部位に挟まれたヒトシトクロムｂ５のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を含む。カセットＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩは発現ベクターｐＹｅＤＰ１／１０（ＣｕｌｌｉｎとＰｏｍｐｏｎ，Ｇｅｎｅ．６５（１９８８）２０３−２１７）に含まれる。このベクターをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＰＧＫ遺伝子のプロモーター及びターミネーターの配列とヒトシトクロムｂ５をコードする配列を含む２３１０ｂｐのフラグメントを回収後、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端化する。ベクターｐＹｅＤＰ６０を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、５８１９ｂｐフラグメントを回収する。このフラグメントは酵母と大腸菌の複製起点を含む。このフラグメントを再環状化し、ベクターｐＡＰ２を得る。このベクターをＰｖｕＩＩで消化し、図１７に示す発現カセットを含むベクターｐＡＰ３が得られるような向きでベクターｐＹｅＤＰ１／１０／Ｈｂ５に由来する２３１０ｂｐフラグメントを挿入する。このベクターをＢｇｌＩで消化する。７０１２ｂｐフラグメントを回収する。ベクターｐＹｅＤＰ６０をＰｖｕＩＩにより線状化し、線状化プラスミドに対応するバンドを精製する。Ｗ（Ｎ）株のクローンに由来する酵母培養物を線状化プラスミドと７０１２ｂｐフラグメントで同時形質転換し、ウラシルとアデニルに関する原栄養株クローンを選択する。酵母で相同組換えにより、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター及びターミネーターの制御下のシトクロムｂ５の発現カセットはベクターｐＹｅＤＰ６０のＰｖｕＩＩ部位に置換し、最終ベクターｐＡＰ４を与える（図１６及び１７）。ベクターｐＡＰ４に対応するプラスミドＤＮＡを酵母から回収し、これを使用して大腸菌を形質転換する（Ａｍｐｒ）。選択、増幅及び制限によるプラスミド構造の確認後、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターとＰＧＫ遺伝子のターミネーターの間に配置された多重クローニングゾーンでベクターｐＡＰ４に該当シトクロムＰ４５０のＯＲＦを挿入する。得られたプラスミドを使用し、本願に記載する酵母株のうちで優先的に選択される受容酵母株をアデニルとウラシルに関する原栄養株クローンの選択により形質転換する。
実施例１１．２ ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のＰ４５０の発現とＧＡＰＤＨプロモーターの制御下のヒトｂ５の発現を可能にするプラスミドｐＶＤ２の構築
ベクターｐＹｅＤＰ１／１０／Ｈｂ５をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ヒトシトクロムｂ５をコードするバンドを除去する。ｂ５のＯＲＦに対応する４１７ｂｐのバンドを精製した後、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＡＢ２にクローニングする。得られたベクターで次にＥｃｏＲＩ消化によりＥｃｏＲＩ部位を破壊後、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントによりこの部位を充填した後、リガーゼにより再環状化する。４９９３ｂｐのこのプラスミドをｐＶＤ１と呼ぶ（図１６及び１８）。
次に、プライマーＮ１７（配列番号１７）及びＮ１８（配列番号１８）をプライマーとして使用することにより、ｐＶＤ１の発現カセットをＰＣＲ増幅する。増幅後のバンドは１７５３ｂｐである。プライマーはｐＹｅＤＰ６０のＰｖｕＩＩ固有部位の周囲に配置された領域で発現カセットの両端に相同組換えアームを付加するように設計する。ＰｖｕＩＩ部位で線状化してアルカリホスファターゼにより脱リン酸化したｐＹｅＤＰ６０と、ＰＣＲ増幅した発現カセットの相同組換え（実施例１１．１及び図１７参照）により、図１６及び１９に示すベクターｐＶＤ２が得られる。酵母（同時形質転換）、次いで大腸菌（選択及び増幅）にシャトル後にこのベクターの構造をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化により確認する。１０９９４ｂｐの消化バンドを示す所望のプラスミドをｐＶＤ２（図１９）と呼ぶ。プライマーＮ１９（配列番号１９）及びＮ２０（配列番号２０）で配列決定することにより発現カセットの種々の接合部を確認する。
実施例１１．３ ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のＰ４５０の発現とＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のヒトｂ５の発現を可能にするプラスミドｐＶＤ３の構築
前記構築と同様に、ｐＹｅＤＰ１／１０／Ｈｂ５からＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてヒトシトクロムｂ５のＯＲＦを得る。（ｉ）酵母Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子のプロモーター領域のすぐ上流に配置された配列と、（ｉｉ）ＵＲＡ３遺伝子と、（ｉｉｉ）ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターと、（ｉｖ）酵母Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子の転写ターミネーターから構成される配列ブロックを含む図１５に示すプラスミドｐＹｅＤＰ１１０のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位間にこのＯＲＦを連結により導入する。上述のように、連結産物であるプラスミドのＥｃｏＲＩ部位を切断により破壊−充填−連結し、ｐＶＤ３と呼ぶ５５５１ｂｐのプロモーターを得る（図２０）。次に、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５の発現カセットを実施例１２と同様にプライマーＮ１７及びＮ１８によりＰＣＲ増幅する。増幅後の２３６５ｂｐのバンドを精製後、上述のようにｐＹｅＤＰ６０のＰｖｕＩＩ部位に相同組換えにより導入する（ＧＡＰＤＨプロモーターをＧＡＬ１０−ＣＹＣ１に置き換える以外は図１９に同じ）。本発明のプラスミドの一般構造の説明で示したように、ＰＣＲにより導入した組換えアームの配列の性質により、組換えプラスミド上に存在する２個のＧＡＬ１０−ＣＹＣ１カセットは逆向きになる。次に、酵母−大腸菌シャトル後にｐＶＤ４と呼ぶ１１５９５ｂｐのプラスミド（図１６）を選択する。ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターとシトクロムｂ５遺伝子の接合部をプライマーＮ２１（配列番号２１）による配列決定により確認する。
得られた株の命名法：
W(GhR,ΔB):MATa,leu2-3,112,ade2-1,trp1-1,ura3-1.
W(hR,ΔB):MATa,leu2-3,112,ade2-1,trp1-1.
W(hR,hb5):MATa,leu2-3,112,ade2-1,trp1-1.
W(GhR,hb5):MATa,leu2-3,112,ade2-1,trp1-1,ura3-1.
W(hR,Lhb5):MATa,ade2-1,trp1-1.
W(GhR,Lhb5):MATa,ade2-1,trp1-1,ura3-1.
W(R,Lhb5,Yb5)
W(hR,Lhb5,Yb5)
使用したプライマーの配列：
最初から４２個の塩基はｐＹｅＤＰ６０の塩基４０６９〜４１１３の領域に相同である。大文字で示した塩基４３〜６９に相当するプライマーのヌクレオチドはＵＲＡ３遺伝子の１領域に対応するｐＵＢ８１の塩基５７７２〜５７９９の領域に相同である。
最初から４３個の塩基はｐＹｅＤＰ６０の塩基４１１４〜４１５７の領域の相補鎖に相同である。塩基４４〜７１はｐＵＢ８１の塩基２５０７〜２５３８の領域に相同である。
このプライマーはＧＡＰＤＨプロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５の組み込みカセットに隣接するＵＲＡ３遺伝子のオープンリーディングフレームの終点に対応するｐＶＤ２の４１０２〜４１２５の領域に相同である。
この配列決定用プライマーはＧＡＰＤＨプロモーターの終点に対応するｐＶＤ２の塩基４８３５〜４８６０の部分に相同である。
この配列決定用プライマーはＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターとヒトシトクロムｂ５のＯＲＦの接合部の−１２０ｂｐに配置されたＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの領域に相同である。
参考文献：
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２７
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：２
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：３
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：４
配列の長さ：４２
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：５
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：６
配列の長さ：４８
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：７
配列の長さ：５０
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：８
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：９
配列の長さ：２５
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：１０
配列の長さ：３８
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：１１
配列の長さ：３４
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：１２
配列の長さ：２５
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：１３
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：１４
配列の長さ：４２
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：１５
配列の長さ：３３
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：１６
配列の長さ：２９
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：１７
配列の長さ：６９
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：１８
配列の長さ：７０
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：１９
配列の長さ：２４
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：２０
配列の長さ：２４
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列番号：２１
配列の長さ：２１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
シトクロムＰ４５０は膜酵素スーパーファミリーを構成する。特に生体異物と医薬の代謝に関与するモノオキシゲナーゼである。
シトクロムＰ４５０は特に次の用途に使用される。
−天然又は人工（汚染物質、医薬又は添加物）生体異物分子のヒト肝代謝による毒性又は突然変異誘発代謝物の形成のｉｎｖｉｔｒｏ診断。この診断は新規医薬分子の開発に肝要である。
−環境毒性又は汚染分子の同定と破壊。
−代謝物の生成。
前記タンパク質はこれらの解毒プロセス及び毒性現象の両者に関与しているため、広く研究されている（Ｇｕｅｎｇｕｅｒｉｃｈ，１９８８）。
しかし、こうした研究はすぐにシトクロムＰ４５０の個々の形態の研究等の問題にぶつかった。これらの問題を解決するために、その後、異種発現系が開発された。
１９８６年以来、異種発現宿主としての哺乳動物細胞の使用が開発されている（Ｚｕｂｅｒら，１９８６）。これらの系は肝細胞（シトクロムＰ４５０の主要検出部位）に近似するという利点があるが、残念ながら発現レベルが低い。
細菌等の原核宿主については、実際に正確に複製されたシトクロムＰ４５０を大量に獲得できる（Barnesら，1991）が、この種の宿主ではＤＮＡの５’末端発現部分の改変が避けられない（ＤｏｅｈｍｅｒとＧｒｅｉｍ，１９９２）。
他方、酵母型の真核宿主を選択すると特に有利であり、この生物はヒト肝細胞に似た状態におくことができ、高いタンパク質発現レベルが得られる。更に、酵母はシトクロムＰ４５０型の膜タンパク質とその関連酵素の発現に必要な全酵素メカニズムを内在形態でもっており、即ち、シトクロムＰ４５０の機能に必要な２種の酵素であるシトクロムｂ５とＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをもつ。
従って、酵母を用いると、
−（細菌での発現の場合のように）発現されるタンパク質がそのＮ末端配列のレベルで改変されずに済み、
−種々の生化学及び構造研究に妥当な量の異種シトクロムＰ４５０が得られ、
−関連酵素系が既に存在している
ため、酵母は種々の問題に有利な解決手段を提供する（Ｏｅｄａ Ｋ．ら，１９８５；Ｐｏｍｐｏｎ，１９８８）。
異種タンパク質の発現に関して特に研究されている酵母のうちでは、特にＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Hansenula、Ｃａｎｄｉｄａ及びSaccharomyceｓを挙げることができ、そのゲノム構造は周知である。シトクロムＰ４５０の種々の酵母発現系が文献に記載されている。
所謂第１世代の株ではシトクロムＰ４５０はプラスミドから発現されており、酵母に内在するＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼとシトクロムｂ５を電子供与体として使用している（Ｐｏｍｐｏｎ，１９８８；ＣｕｌｌｉｎとＰｏｍｐｏｎ，１９８８）。
この系の最初の改良により得られた所謂第２世代の株では、（ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下に）酵母シトクロムＰ４５０レダクターゼを過剰発現させ、ヒトシトクロムｂ５を同時発現させている（国際公開ＷＯ９３／０２２００及びＴｒｕａｎら，１９９３）。従って、これらの株ではイソ形に応じて出発株の５〜６０倍の組換えシトクロムＰ４５０の酵素活性が得られるようになった。
しかし、既存の系は完全に満足とは言えず、タンパク質の満足な発現が得られなかったり、得られたタンパク質がヒト系に十分に近似しないという欠点がある。
本発明は詳細には、上記欠点のない第３世代の株を提案することを目的とする。予想外にも、本願出願人は酵母のＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼとシトクロムｂ５をそれらのヒト相同体で同時に置換えられることを発見した。これらの２種の遺伝子の同時分裂は酵母では致死性であることが知られており、２種の遺伝子を欠失する生存可能な株を得ることはまだできなかったので、この発見は一層意外である。
本発明の株では、酵母シトクロムＰ４５０レダクターゼ及び／又はシトクロムｂ５をそのヒト相同体に置換えた。その結果、多重酵素系が同一種であるため、非常に有利なことに肝細胞に非常によく似た系を作製することができた。
この新規系は、発現されるシトクロムＰ４５０の酸化還元パートナーの種類の効果と、肝臓に存在すると同等のシトクロムＰ４５０活性に必要な化学量論比を試験するためにも利用できる。
従って、本発明の第１の目的は、
１）内在シトクロムｂ５と内在NADPH−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子が不活化されており、
２）ヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸を含み、
３）ヒトシトクロムｂ５をコードする核酸を含むことを特徴とする遺伝子改変酵母株にある。
ヒトシトクロムｂ５及びヒトレダクターゼをコードする遺伝子を株に組み込むために使用する核酸は、ｃＤＮＡが好ましい。これらの２種のタンパク質をコードする完全配列を含むｃＤＮＡは単離及び配列決定されている（ヒトレダクターゼについてはＳ．Yamanoら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９８９，ｖｏｌ．３６：８３−８、ヒトシトクロムｂ５についてはＭ．Ｍｉｙａｔａら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１９８９，ｖｏｌ．２１：５１３−２０参照）。
更に、選択する酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが好ましい。
本発明の意味では、不活化遺伝子とはその天然タンパク質をコードできなくした遺伝子を意味する。前記遺伝子がその天然タンパク質をコードできないことは、構造又はコンフォメーション変異による不活性タンパク質の産生や、天然タンパク質の産生の不在や産生レベルの低下により確認できる。
天然遺伝子の不活化は以下に挙げる種々の方法により得られる。
−遺伝子の完全又は部分的欠失。欠失とは該当遺伝子の任意抑圧を意味する。例えば、タンパク質をコードする領域の一部及び／又は転写プロモーター領域の全部又は一部の欠失が挙げられる。
−遺伝子における１以上の点突然変異。この突然変異は化学的突然変異誘発物質（例えばアルキル化剤、ビアルキル化剤又は挿入剤）又は物理的突然変異誘発物質（Ｘ線、紫外線）による処理や、指向的突然変異誘発により得られる。
−遺伝子の読取り枠を遮断し、これを不活化する制限酵素の作用による突然変異挿入、及び／又は
−例えばＲｏｔｈｓｔｅｉｎ［Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）２０２］により最初に記載されたプロトコルによる遺伝子破壊。この場合には、対応するヒトタンパク質をコードする配列で野生型配列を相同組換えにより置換できるように、コーディング配列の完全性を破壊する。
本発明によると、上記のような遺伝子破壊方法を使用するのが好ましい。
本発明によりヒト酵素を発現させるために本発明の株を形質転換する方法としては種々の方法が考えられ、まず、遺伝子の１個を不活化しておいた野生型株を、対応するヒトタンパク質をコードする核酸を含む複製型プラスミドで形質転換する方法がある。この場合、核酸は酵母のゲノムに組み込まれない。
また、該当ヒトタンパク質をコードする配列を含むｃＤＮＡ形態の核酸を酵母のゲノムに組み込んでもよい。この場合には、酵母の増殖性と生存性を変えないようにマーカー遺伝子に対応するこのゲノム上の既知遺伝子座に組み込んでもよいし、不活化した天然遺伝子に占有される場所に組み込んでもよい。
こうして、レダクターゼをコードする核酸とシトクロムｂ５をコードする核酸をこれらの方法のいずれか１種により株に導入することができる。
本発明によると、株の安定性を改善し、より有利な条件におくために、ヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸及び／又はヒトシトクロムｂ５をコードする核酸を酵母のゲノムに組み込む実施態様を選択するのが好ましく、本発明の好適実施態様では、これらの核酸を内在遺伝子の代わりに組み込む。
本発明の別の好適実施態様によると、ヒトシトクロムｂ５をコードする遺伝子をマーカー遺伝子の遺伝子間部位、特に遺伝子間部位ＳＰＬ１／ｌｅｕ２に組み込む。
本発明の別の特徴は、ヒトシトクロムｂ５をコードする核酸がゲノムに組み込まれていることを特徴とする株にある。
本発明の特定実施態様では、形質転換株にシトクロムｂ５の２コピーを存在させる。
本願出願人が遭遇した別の問題は、ヒト遺伝子を酵母で十分なレベルで発現させるという問題である。
このためには、これらの遺伝子の発現を可能にする酵母プロモーターの制御下にこれらの遺伝子をおくと有利である。これらの酵母プロモーターは誘導的プロモーターでも構成的プロモーターでもよい。本願において、構成的プロモーターとは標準培養条件で安定して発現されるプロモーターを意味する。本発明によると、ヒト遺伝子の少なくとも１個を構成的酵母プロモーターの制御下におく。
このプロモーターは公知プロモーターから選択される。例えば、イソシトクロムＣ１（ＣＹＣ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）、転写延長因子（ＴＥＦ）、酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＡＰＤＨと称する）及び酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ（以下、ＰＧＫと称する）の遺伝子のプロモーターを使用することができる。
プロモーターは、酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター、酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター及び酵母シトクロムｂ５の内在プロモーターから選択するのが好ましい。本発明の１特定実施態様では、ヒトシトクロムｂ５をコードする遺伝子が内在Ｙｂ５プロモーターの制御下にあることに留意すべきである。
誘導的プロモーターについては、ＧＡＬ１０及びＣＹＣ１−ＧＡＬ１０プロモーターから選択するのが好ましい。
本願出願人が着目した特徴である上記内在遺伝子の不活化と対応するヒト遺伝子をコードする核酸による置換という特徴を示す１倍体株はこれまで得ることができなかった。２倍体形態に止まっていた。本発明の利点の１つは１倍体酵母で操作することができ、従って、最良の安定性を得ると共に望ましくない組換えを避けることができる。
従って、本発明の好適実施態様によると、株は１倍体であることを特徴とする。
本発明による株は、ヒトシトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１種の核酸をもつ。該核酸はプラスミドに組み込むことが好ましい。本発明によるヒト化酵母株は、その選択マーカーのレベルで作製される酵母株と適合可能なものであれば任意のシトクロムＰ４５０発現プラスミドを用いて慣用技術により形質転換することができる。特に、このようなプラスミドはプラスミドｐＹｅＤＰ６０のクローニングポリリンカーに任意のヒトシトクロムＰ４５０をコードするｃＤＮＡのコーディングフレームを常法に従ってクローニングすることにより得られる（材料と方法の項参照）。
シトクロムＰ４５０は特にヒトシトクロムＰ４５０１Ａ１、１Ａ２、１Ｂ１、２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８、２Ｃ１９、２Ｅ１、３Ａ４、３Ａ５から選択することができる。本発明によるヒト化株は野生型酵母及び従来作製されている組換え株に比較して明白な発現上の利点がある。
本発明の別の目的は、本発明による酵母株において、プラスミドに含まれるヒトシトクロムＰ４５０のモノオキシゲナーゼ活性をも発現させる酵母株にある。
本発明の別の実施態様は、プラスミド、特にシトクロムＰ４５０をコードする核酸の１コピーを既に含んでいるプラスミド上に上記シトクロムｂ５をコードする核酸の付加的コピーを存在させることにある。Ｐ４５０の最適活性を得るためには、実際にヒトシトクロムｂ５及びヒトＰ４５０の発現レベル間に少なくとも１／１の化学量論的相対モル比を実現できるようにすると特に有利である。シトクロムｂ５の遺伝子の単一コピーのゲノム組み込みでは、本発明による多重コピープラスミドからの発現のような高いＰ４５０発現レベルに達するには不十分な場合もあることが分かっている。そこで、本発明は該当シトクロムＰ４５０の発現カセットとシトクロムｂ５の発現カセットを併有するプラスミド系列の構築を説明することにより、系の効力を更に改善できるようにする。これらのプラスミドの特殊な構造により、２種のシトクロム間に十分な化学量論比を実現しながら高レベルで安定した発現が可能になる。これらのプラスミドは本願に記載する全株に適合可能である。これらのプラスミドは他の株にも当然利用できる。
本発明は特に、上記全特徴に対応する酵母株の開発を目的とする。このような酵母株に到達するための数種の中間体にも関する。
本発明では文献に記載されているような株から出発するのが好ましく、特に以下の株が挙げられる。
−酵母シトクロムｂ５をコードする遺伝子（以下、Ｙｂ５と称する）が破壊されているＷ（ΔＢ）株（Ｔｒｕａｎｔらにより記載）。これを作製するためには、シトクロムｂ５の遺伝子の制限部位のレベルに組み込まれたＨＩＳ３マーカー遺伝子をもつベクターを構築する。このベクターを使用して２倍体ＨＩＳ３−株を形質転換する。組換え細胞を選択する。
−酵母レダクターゼをコードする遺伝子が不活化されているＷ（Ｒ）株。
−ベクターｐＵＰ８１（図１）で形質転換することによりＷ（ＲΔ）株から得られるＷ（ｈＲ）株。この株では、誘導的プロモーターとヒトレダクターゼ（以下、ＨＲＥＤと称する）をコードする配列を含むカセットを挿入することにより、酵母レダクターゼ（以下、ＹＲＥＤと称する）をコードする不活化遺伝子を置換している。
これらの株を交配後、胞子形成させ、Ｙｂ５とＹＲＥＤを欠失し且つＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下でヒトレダクターゼを発現する１倍体Ｗ（ｈＲ，ΔＢ）株を選択する。
この点で、本発明の別の目的はＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸を含み、酵母シトクロムｂ５と酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子が不活化されている株（Ｗ（ｈＲ，ΔＢ）株）にある。
本発明による別の好適株は、誘導的ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターがＧＡＰＤＨプロモーターで置換された上記と同様の株である。
この置換は、ｐＵＰ８１（図９）から構築され、構成的ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下のＨＲＥＤをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＢ２（図４）で形質転換することにより実施できる。形質転換細胞は国際公開ＷＯ９４／０１５６４に記載の方法により選択する。得られた株をＷ（ＧｈＲ，ΔＢ）と呼ぶ。この株では、ヒトレダクターゼをコードする配列が酵母ＧＡＰＤＨの構成的プロモーターの制御下にあり、酵母のシトクロムｂ５とＹＲＥＤが不活化されている。
本発明の別の目的は、ヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸が酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下にあることを特徴とする株である。
本発明による別の好適株は、ヒトシトクロムｂ５をコードする配列を含むベクターｐＡＢ３（図６及び１２）で形質転換することによりＷ（ｈＲ，ΔＢ）株から得られる。
前記配列を組み込んだ酵母を選択する。こうして得られた株をＷ（ｈＲ，ｈｂ５）と呼ぶ。この株はヒトタンパク質をコードする２種の配列をもつ。
本発明による特に有利な株を構築するためには、上記と同様の方法でＷ（ＧｈＲ，ΔＢ）株をプラスミドｐＡＢ３で形質転換する。こうして上記２種の性質をもつＷ（ＧｈＲ，ｈｂ５）株が得られ、即ちこの株は酵母ＧＡＰＤＨのプロモーターの制御下にヒトレダクターゼをコードする遺伝子を発現すると共に、酵母ｐＹｂ５プロモーターの制御下にヒトシトクロムｂ５をコードする遺伝子をも発現することができる。
同様に好ましい態様として、本願出願人はＷ（ｈＲ，ΔＢ）株からも株を構築した。Ｗ（ｈＲ，ΔＢ）株を制限酵素の作用により予め線状化しておいたプラスミドベクターｐＡＰ１（図８及び１３）で形質転換する。酵母染色体の遺伝子間部位ｌｅｕ２／ＳＰＬ１のレベルでｐＡＰ１に含まれる酵母ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５をコードする配列を組み込んだ形質転換細胞を選択する（図１４）。
この株は本願出願人の命名法ではＷ（ｈＲ，Ｌｈｂ５）の名称をもつ。この株はｐＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のヒトレダクターゼをコードする配列と酵母ＰＧＫプロモーターの制御下のシトクロムｂ５をコードする配列を発現することができる。
本発明の別の目的は、酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５をコードする少なくとも１種の核酸を含むことを特徴とする酵母株にある。
以下の株が特に好ましい。即ち、Ｗ（ＧｈＲ，ΔＢ）株から出発し、線状化ベクターｐＡＰ１により形質転換する。酵母ＰＧＫプロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５をコードする配列を上記遺伝子間部位ｌｅｕ２／ＳＰＬ１に組み込んだクローンを選択する。
こうして、２種の構成的酵母プロモーターの制御下の２種のヒト遺伝子をコードする配列を含むＷ（ＧｈＲ，Ｌｈｂ５）株が得られる。
本発明の別の目的は、
−酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロキシゲナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下のヒト−ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸と、
−酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５をコードする核酸
を１つの株に併有することを特徴とする。
本発明の別の実施態様は、Ｗ（Ｒ）株から出発し、ベクターｐＡＰ１で形質転換し、選択後にＷ（Ｒ，Ｌｈｂ５，Ｙｂ５）株を得ることである。
Ｗ（ｈＲ）株から出発し、同様に形質転換し、選択後にＷ（ｈＲ，Ｌｈｂ５，Ｙｂ５）株を得るのが好ましい。
本発明により構築された株は、シトクロムＰ４５０酵素系による新規化学分子の分解により生成される代謝物の毒性の評価方法に利用することができる。
本発明の別の目的は化合物の毒性の評価方法に関し、該方法は、前記化合物を本発明による酵母又は該酵母から誘導される酵素調製物の存在下におき、生成される代謝物をその毒性について分析することを特徴とする。
本発明は更に、ヒト肝細胞に存在するものに非常によく似た酵素複合体の獲得を可能にする。その結果、良好なヒト酵素発現条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏ操作することが可能になる。従って、シトクロムＰ４５０複合体による新規化合物の分解によりヒト体内でどのような代謝物が生成されるかを調べることができる。
本発明の別の目的は、化合物のヒト代謝物のｉｎ vitro測定方法であり、該方法は、前記化合物を本発明による酵母又は該酵母から誘導される酵素調製物の存在下におき、生成される代謝物を同定することを特徴とする。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は非限定的な例示とみなすべきである。
図面の説明
図１：プラスミドｐＵＰ８１。
図２：プラスミドｐＰＬｌ００。
図３：プラスミドｐＡＢ１。
図４：プラスミドｐＡＢ２。
図５：プラスミドｐＬＩＰ１。
図６：プラスミドｐＡＢ３。
図７：プラスミドｐＣＤ２６。
図８：プラスミドｐＡＰ１。
図９：ｐＵＰ８１からｐＡＢ２の構築。
図１０：ｐＡＢ２によるＷ（ＧｈＲ，ΔＢ）株の構築。
図１１：カセットｈｂ５の構築。
図１２：ｐＡＢ３の構築。
図１３：ｐＡＰ１の構築。
図１４：Ｗ（ＧｈＲ，Ｌｈｂ５）株の構築。
図１５：プラスミドｐＹｅＤＰ６０、ｐＹｅＤＰ１／１０／ｈｂ５及びｐＹｅＤＰ１１０の模式図。
図１６：プラスミドｐＡＰ２、ｐＡＰ３、ｐＶＤ１、ｐＶＤ２、ｐＶＤ３、ｐＶＤ４の模式図。
図１７：ｐＡＰ４の構築と構造。
図１８：ｐＶＤ１の構築。
図１９：ｐＶＤ２の構築。
図２０：ｐＶＤ３の構築。
材料と方法：
１−培地：
次頁表Ｉ参照。
（１）アミノ酸とアンモニウムを含まない窒素酵母基本培地（ＹＮＢ）はＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製品である。硫酸アンモニウムはＭＥＲＣＫ製品である。ドイツ産寒天はＲＯＨＳＴＯＦＦＧｍｂｈ製品である。アデニン、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−トリプトファンはＳＩＧＭＡ製品である。Ｌ−ロイシンとウラシルはＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ製品である。Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、グリセロール及び無水酢酸カリウムはＰＲＯＬＡＢＯ製品である。バクトペプトン（Ｂ．ペプトン）と酵母エキス（ＹＥ）はＤＩＦＣＯ製品である。
Ｎ３は、Ｎａ2ＨＰＯ4 ８９ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ２７２ｇ及びスペシリン１ｇを水５リットルに溶かすことにより得たリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．２）で緩衝する。
液体培地は、寒天を含まない以外は固体培地と同一組成である。
リンゲル液：０．９％ＮａＣｌ水溶液。
２−株：
−酵母：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：
Ｗ（Ｎ）：ＭＡＴａ及びａ，ｌｅｕ２−３，１１２，ｈｉｓ３−１１，ａｄｅ２−１，ｔｒｐ１−１，ｕｒａ３−１。Ｗ（Ｎ）ａはＷ（Ｎ）Ｍａｔａを表し、Ｗ（Ｎ）ａはＷ（Ｎ）Ｍａｔａを表す。
Ｗ（ΔＢ）：ＭＡＴａ及びａ，ｌｅｕ２−３，１１２，ａｄｅ２−１，ｔｒｐ１−１，ｕｒａ３−１，Ｙｂ５：ＨＩＳ３。Ｗ（ΔＢ）ａはＷ（ΔＢ）Ｍａｔａを表し、Ｗ（ΔＢ）ａはＷ（ΔＢ）Ｍａｔａを表す。
Ｗ（ｈＲ）：ＭＡＴａ及びａ，ｌｅｕ２−３，１１２，ｈｉｓ３−１１，ａｄｅ２−１，ｔｒｐ１−１，ＹＲＥＤ：［ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１：：ＨＲＥＤ］。Ｗ（ｈＲ）ａはＷ（ｈＲ）Ｍａｔａを表し、Ｗ（ｈＲ）ａはＷ（ｈＲ）Ｍａｔａを表す。
−細菌：
大腸菌ＤＨ５−１：ｓｕｐＥ４４，ｈｄｄＲ１７，ｒｅｃＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡ１。
３−ベクター：
−プラスミドｐＵＰ８１：プライマーＮ１及びＮ２を用いてＰＣＲにより得られたヒトシトクロムＰ４５０レダクターゼ遺伝子のコーディングフレームをＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩで切断した後、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの側のＡＴＧであるそのBamHI部位のレベルで組み込みベクターＤＰ１１０にクローニングする（Ｕｒｂａｎら，１９９３）。
プライマーＮ１：５’−ＧＣｇｇａｔｃｃＡＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＡＣＧＴＧＧ−３’（配列番号１）。塩基１〜２はＧＣクランプを形成し、塩基３〜８（小文字）は付加されたＢａｍＨＩ部位に対応し、塩基９〜１７及び２１〜２７はヒトレダクターゼ遺伝子のオープンリーディングフレームの配列のヌクレオチド１〜９及び１３〜１９に夫々相同であり、塩基１８〜２０（太字）はヒトレダクターゼのコーディング配列のＡＴＧから１０〜１２位のヌクレオチドＴＣＣを突然変異させることができる。この突然変異は酵母での翻訳の阻害に関与する最初から２０塩基対で転写されるＲＮＡのフォーク構造を破壊することができる（Ｂａｉｍら，１９８８）。
プライマーＮ２：５’−ＣＧｇａａｔｔｃＡＧＡＴＣＴＡＧＣＴＣＣＡＣＡＣＧＴＣＣＡＧＧ−３’（配列番号２）。塩基１〜２はＧＣクランプを形成し、塩基３〜８（小文字）はＥｃｏＲＩ部位に対応し、塩基９〜１４（下線）はＢｇｌＩＩ部位に対応し、塩基１４〜１６（太字）は停止コドン（相補鎖）に対応し、塩基１３〜３１はヒトレダクターゼ遺伝子のオープンリーディングフレームのヌクレオチド２０１８〜２０３４に相補的である。
−プラスミドｐＦＬ２６（Ｂｏｎｎｅａｕｄら，１９９１）。
−プラスミドｐＰＬ１００：ＡＤＥ２／ｐＦＬ（ＳｔｏｔｚとＬｉｎｄｅｒ）。酵母ＡＤＥ２遺伝子を改変してベクターｐＰＬ１００を構築した。ＡＴＧから５９３位のアデノシンをグアニンに突然変異させることにより、遺伝子の内部BglII部位を破壊する。この突然変異はアミノ酸配列もタンパク活性も変えない。開始コドンから−３７３位のＡＤＥ２遺伝子の５’領域にＢｇｌＩＩ部位を導入する。この遺伝子はＡＴＧから１８６２位にＢｇｌＩＩ部位をもつ。２２４１ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメントをＢｇｌＩＩ部位でベクターｐＦＬ３６にクローニングする（Ｂｏｎｎｅａｕｄら，１９９１）。
−「Ｂｌｕｅｓｒｉｐｔ」プラスミドはキット「ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫ（＋）クローニングキット」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に記載されている。
４−交配：
逆符号（ａ又はａ）の１倍体株をＹＰＧＡ完全培地で別々に培養する。次に、細胞をリンゲル液で約１０５個／ｍｌまで希釈する。２種の１倍体細胞懸濁液各５００ｍｌの混合物を調製する。混合物から懸濁液５０ｍｌを固体培地ＹＰＧＡにプレーティングする。８時間培養後、２種の親に同時に存在する栄養素のみを補充した選択培地で細胞をサブクローニングする。こうすると、交配により生じた２倍体は成長できるが、元の１倍体は成長できなくなる。２日間培養後、出現する２倍体クローンを同一選択培地で二次培養する。
５−胞子形成：
２倍体の栄養要求性マーカーを補充した固体胞子形成培地で２倍体細胞を二次培養する。３日間胞子形成後に胞子を解剖する。
６−胞子の解剖：
所謂バルク法：
１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブで１００ｍｇ／ｍｌのチモリアーゼ１０，０００（生化学工業社、日本、東京）を含む水で胞子を５×１０8細胞／ｍｌまで希釈した後、２８℃で３０分間インキュベートする。５００ｍｌアリコートを１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。細胞沈渣を水１ｍｌにとり、遠心分離し、水１００ｍｌにとる。細胞を２分間ボルテックス撹拌する。チューブを２〜３回転倒させながら水で濯ぐ。５回濯いだ後、疎水性の胞子はチューブの壁に付着しているが、２倍体栄養細胞は懸濁したままなので、濯ぎ落とす。次に、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）溶液に胞子を再懸濁する。遠心分離後に希釈剤を捨てる。精製した胞子をリンゲル液にとり、固体選択培地にプレーティングする。
顕微鏡解剖：
胞子を０．５ｇ／ｌサイトヘリカーゼ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）溶液（５５％グリセロール）中で２２℃で１５分間インキュベートした後、予め切り取って載物ガラスに載せておいた寒天片にプレーティングする。次に載物ガラスを顕微鏡解剖チャンバーに逆さに置く。四分子に含まれる４個の胞子を顕微鏡下にマイクロマニピュレーターで分離する。こうして解剖した四分子を担持する寒天をＹＰＧａｌＡ完全培地容器に移す。
７−ＧＡＰＤＨプロモーターのクローニング：
ＰＣＲ増幅：
プライマーとしてプライマーＮ３（配列番号３）及びＮ４（配列番号４）５０ｎｇを使用することにより、従来記載されている方法（Ｂｅｌｌａｍｉｎｅら，１９９４）に従って調製したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｗ（Ｎ）のゲノムＤＮＡ １００ｎｇからＰＣＲ法により酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターのＤＮＡをクローニングした（図９）。増幅は天然Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）２．５Ｕを用いて実施する。重合反応は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、６ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍｇ／ｍｌ無ヌクレアーゼ「血清アルブミン」及び４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）各２００ｍＭからなる溶液５０ｍｌ中で実施する。ＰＣＲ条件は以下の通りである。
−プライマーＮ３：５’−ＣＣａａｇｃｔｔＧＡＧＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＴＣＧ−３’（配列番号３）。最初から２つの塩基はＧＣクランプを形成し、小文字はＨｉｎｄＩＩＩ部位に対応し、塩基９〜３１はＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターの配列のヌクレオチド−６７３〜−６５０と相同である。
−プライマーＮ４：５’−ＣｇｇａｔｃｃＴＡＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＧＴＴＣＴＴＧＧ−３’（配列番号４）。小文字はＢａｍＨＩ部位に対応し、塩基８〜４２はヌクレオチド−６〜−４８に相補的である。
増幅後のＤＮＡの寸法は６９１ｂｐである。
７．５Ｍ酢酸アンモニウム２６ｍｌと水４ｍｌをＰＣＲ産物５０ｍｌに加える。混合物をエタノール８０ｍｌで２２℃で１０分間沈殿させる。沈殿したＤＮＡを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。沈渣を７０％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、乾燥し、水２０ｍｌにとる。
このＤＮＡの１０ｎｇアリコートを販売業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示に従ってキット「ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＳＫ（＋）クローニングキット」のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＳｒｆＩ部位にクローニングする。クローンをＰｖｕＩＩ制限により選択する。クローニングしたＤＮＡとＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの接合レベルで、２５１３及び１１３９ｂｐのＰｖｕＩＩフラグメントを与えるクローンをキットＳｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ Ｕ．Ｓ．Ｂ．（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により１００ｂｐにわたって配列決定する。これらの構築物をｐＡＢ１と呼ぶ。
組み込みベクターｐＵＢ８１へのＧＡＰＤＨプロモーターのクローニング：
クローンｐＡＢ１をＨｉｎｄＩＩＩで切断する。この切断により生じた付着末端部位をＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）で充填する。こうして線状化したベクターｐＡＢ１（３６５２ｂｐフラグメント）を次にその５’末端をＢａｍＨＩで切断した後、ＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩ部位間でベクターｐＵＰ８１にクローニングする。連結時に、平滑末端化されたＨｉｎｄＩＩＩ部位は平滑末端であるＥｃｏＲＶ部位に適合し、フラグメントｐＧＡＰＤＨと組み込みベクターｐＵＰ８１の２つのＢａｍＨＩ半部位は相互に結合する。ＥｃｏＲＶ部位を選択し、同時にＵＲＡ３遺伝子を破壊した（図９）。クローンを酵素ＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで酵素制限により選択する。６０、１０４、１９７、３８５、４４０及び２５６４ｂｐフラグメント（ベクターｐＵＢ８１に存在するフラグメント）以外に６００及び８００ｂｐのＤＮＡフラグメントを与えるクローンが、ＧＡＰＤＨプロモーターのＤＮＡを含むベクターｐＵＰ８１に相当する。この構築物をｐＡＢ２と呼ぶ。ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーターのＤＮＡの５’末端からプライマーＮ３（配列番号３）により１００ｂｐにわたって配列決定することにより、プラスミドｐＡＢ２を含む３個のクローンが確認される。
８．ヒトシトクロムｂ５のＹＣＹＢ５遺伝子座組み込みカセットの構築：
この構築は３種の異なるＰＣＲで実施した。
第１のＰＣＲ（ＰＣＲ１）では、プライマーＮ５（配列番号５）及びＮ６（配列番号６）と酵母Ｗ（Ｎ）のゲノムＤＮＡを使用することにより、酵母シトクロムｂ５遺伝子（Ｙｂ５）のプロモーターの３’末端の３５３ｂｐを増幅した。
−プライマーＮ５：５’−ｇｇａｔｃｃＧＡＧＣＧＧＧＴＡＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号５）はその５末端からＢａｍＨＩ部位（小文字）を含む。このプライマーは、塩基７〜３１が酵母シトクロムｂ５遺伝子のプロモーターのオープンリーディングフレームのヌクレオチド−３３１〜−３０６と相同である。
−プライマーＮ６：５’−ｃｃｇａｃｔｇｃｔｃｔｇｃｃａｔＧＡＴＴＧＴＴＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧ−３’（配列番号６）はその５’末端からヒトシトクロムｂ５遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端の最初から１６個のヌクレオチドに相補的な配列である塩基１〜１６（小文字）と、酵母シトクロムｂ５遺伝子のプロモーターのヌクレオチド−１〜−３２に相補的な配列である塩基１７〜４９を含む。
増幅後のフラグメントは３７５ｂｐである。
第２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）では、酵母シトクロムｂｐ遺伝子のターミネーターの５’部分の最後の１４７ｂｐをプライマーＮ７（配列番号７）及びＮ８（配列番号８）により増幅した。
−プライマーＮ７：５’−ｃｃｔａｔａｃａｔｇｇｃａｇａｇｇａｃｔｇａＡＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＡＧＣＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号７）はその５’末端からヒトシトクロムｂ５遺伝子のオープンリーディングフレームのヌクレオチド３８３〜４０５に相同の配列である塩基１〜２２（小文字）と、ターミネーターの停止コドンから１〜２８位のヌクレオチドに相同の配列である塩基２３〜５０を含む。
−プライマーＮ８：５’−ＧＧａｇａｔｃｔＧＴＧＡＣＡＴＡＣＴＴＣＴＡＴＧＣＧＡＴＡＴＡＧ−３’（配列番号８）はＧＣクランプを形成する塩基１〜２と、ＢｇｌＩＩ部位に対応する塩基３〜８（小文字）を含む。このプライマーは塩基９〜３２が酵母ＹＣＹＢ５遺伝子のターミネーターのオープンリーディングフレームの停止コドンから１〜１４７位のヌクレオチドに相補的である。
増幅後のフラグメントは１８０ｂｐである。
ＰＣＲ１及び２では、酵母Ｗ（Ｎ）のゲノムＤＮＡを鋳型として用いる。
第３のＰＣＲ（ＰＣＲ３）では、４種のプライマーを使用する。
−最初の２種のＰＣＲ産物（３７５及び１８０ｂｐ）２００ｎｇをプライマーとして使用し、ヒトシトクロムｂ５のコーディングフレームのＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として用いる（図１１）。こうすると、少量ではあるが、ヒトｂ５の組み込みカセット（ＣＩＨ）が得られる。
−このＰＣＲ産物を次にプライマーＰ５（配列番号５）及びＮ８（配列番号８）で増幅すると、より多量の組み込みカセットが得られた。融合産物を増幅後に０．２ｍＭ ｄＮＴＰの存在下でＰｆｕポリメラーゼで７６℃で３０分間処理する。得られるフラグメントは９１７ｂｐである。増幅はＴａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ）を用いて実施する。
使用したＰＣＲプログラムは以下の通りである。
ＰＣＲ１及びＰＣＲ２：
９．ヒトシトクロムｂ５の遺伝子間部位ｌｅｕ２Ｄ／ＳＰＬ１組み込みカセットの構築：
ＳＰＬ１遺伝子の５００ｂｐとの遺伝子間領域でＬＥＵ２遺伝子の直ぐ近傍にヒトシトクロムｂ５遺伝子を組み込むことが可能なカセットを２段階で構築した。
−ベクターｐＣＤ２６の構築：ＬＥＵ２遺伝子とＳＰＬ１遺伝子の５００ｂｐを併有するベクターｐＦＬ２６（Ｂｏｎｎｅａｕｄら，１９９１）から３回のＰＣＲでＮｏｔＩ部位を導入した（図１３）。
第１のＰＣＲでは、プライマーＰ９（配列番号９）及びＮ１０（配列番号１０）を使用することによりＬＥＵ２遺伝子の３’部分の７０４ｂｐを増幅する。
−プライマーＮ９：５’−ＴＴＧＡＡＧＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＧ−３’（配列番号９）はＬＥＵ２遺伝子のオープンリーディングフレームの終点に対応するベクターｐＦＬ２６のヌクレオチド２１９０〜２２１４に相同である（ベクターｐＦＬ２６のナンバリングはＢａｍＨＩ部位の上流４１７ｂｐに配置されたヌクレオチド１から始まる）。
−プライマーＮ１０：５’−ＧＴＧＴＧｇｃｇｇｃｃｇｃＣＴＣＣＴＴＧＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧ−３’（配列番号１０）はベクターｐＦＬ２６のヌクレオチド２８９０〜２９８４に相補的な５個の塩基をその５’末端に含み、更に塩基６〜１３のＮｏｔＩ部位と、塩基１４〜３８のヌクレオチド２８５７〜２８８１の相補的配列を含む。
第２のＰＣＲでは、プライマーＮ１１（配列番号１１）及びＮ１２（配列番号１２）を使用することにより、ＳＰＬ１遺伝子の３’部分の最後の３４７ｂｐを増幅する。
−プライマーＮ１１：５’−ＣＡＡＧＧＡＧｇｃｇｇｃｃｇｃＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＧＴＴＡＧＧＴＧＴ−３’（配列番号１１）はベクターｐＦＬ２６の配列のヌクレオチド２８７５〜２８８１に相補的な７個の塩基をその５’末端に含み、更に塩基８〜１５のＮｏｔＩ部位と、塩基１６〜３４のｐＦＬ２６のヌクレオチド２８８９〜２９０８に相同な配列を含む。
−プライマーＮ１２：５’−ＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＴＡＧＡＡＣＣＴＴＣＴＴＡＴＧ−３’（配列番号１２）はベクターｐＦＬ２６のＳＰＬ１遺伝子のオープンリーディングフレームをコードする鎖の３’末端のヌクレオチド３１９８〜３２２２に相補的である。
第３のＰＣＲでは、最初の２回のＰＣＲから得られた２つのフラグメント（ＮｏｔＩ部位を含む２０ｂｐのオーバーラップをもつ）１００ｎｇを鋳型として使用し、プライマーＮ９及びＮ１２をプライマーとして使用する。増幅後の１０３１ｂｐをＮｓｉＩ及びＢｓｔＸＩ部位でベクターｐＦＬ２６にクローニングし、ベクターｐＣＤ２６を得る。
増幅はＴａｑポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ）を用いて実施する。最初の２回のＰＣＲは上記第８節のＰＣＲ１及び２と同一プログラムを使用し、ＰＣＲ３は下記プログラムを使用する。
１０−シトクロムＰ４５０による形質転換用ベクター
プラスミドｐＹｅＤＰ６０は大腸菌ｏｒｉと２μ ｏｒｉの複製起点、アンピシリン耐性をコードするｂｌａ遺伝子、栄養素補充マーカーであるＵＲＡ３及びＡＤＥ２遺伝子、ガラクトースの存在下で誘導的なGAL 10−CYC 1ハイブリッドプロモーター及びＰＧＫ遺伝子の転写ターミネーターをもつ9265ｂｐのシャトルベクター（細菌、酵母）である。発現させようとするｃＤＮＡのクローニング後に、特にＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＩ制限部位を含むポリリンカーをプロモーターと転写ターミネーターの間に挿入する。
プラスミド１Ａ１／Ｖ６０及び３Ａ４／Ｖ６０は、ヒトシトクロムＰ４５０１Ａ１及び３Ａ４を夫々コードするｃＤＮＡのコーディングフレームがＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターとＰＧＫ転写ターミネーターの制御下に挿入されたベクターＶ６０に対応する。
１１−酵母株の形質転換用培地
ＹＰＧＥ培地
−酵母エキス １０ｇ／ｌ
−バクトペプトン １０ｇ／ｌ
−グルコース ５ｇ／ｌ
−エタノール ３０ｍｌ／Ｌ
ＳＷ６培地
−酵母窒素基本培地（Ｄｉｆｃｏ） ７ｇ／ｌ
−グルコース ２０ｇ／ｌ
−カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ） １ｇ／ｌ
−トリプトファン ２０ｍｇ／ｌ
−寒天 １５ｇ／ｌ（固体培地のみ）
対応するガラクトース培地（ＳＷ５）は、グルコースを同一濃度のガラクトースで置換える。
１２−ミクロソームフラクションの調製
１２．１ 形質転換
「塩化リチウム」法と呼ばれる標準方法により酵母をプラスミド１Ａ１／Ｖ６０又は３Ａ４／Ｖ６０で形質転換する。アデニンとウラシルを含まない合成グルコース酵母培地（ＳＷ６）に、使用する株（更には株の遺伝子型）に応じて残留栄養要求性を補うように必要な栄養素を加え、この培地で形質転換細胞を選択する。グルコース培地で選択された一次形質転換細胞のかなりの割合は最少ガラクトース培地では成長しない。ガラクトース培地で適正に成長するクローニングのみを保存する。
１２．２ 予備培養
選択されたクローンをプラスミドに選択的な非誘導性最少グルコース培地（一般にＳＷ６培地）で二次培養した後、同一液体培地２０ｍｌ中で２８℃で一晩インキュベートする。
１２．３ 培養
ＹＰＧＥ培地２５０ｍｌに予備培養物を接種し、８〜９．６×１０7細胞／ｍｌの細胞密度が得られるまで２８℃で撹拌下にインキュベートする。次にガラクトースを２０ｇ／ｌの濃度まで加え、２×１０8細胞／ｍｌの細胞密度が得られるまで培養物を２８℃で一晩インキュベートする。ガラクトースの存在はＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターに依存してシトクロムＰ４５０及び他の遺伝子の誘導を可能にする。
１２．４ 細胞の分画
細胞を遠心分離し、ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．４（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；０．１Ｍ ＫＣｌ）で洗浄し、ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．４、０．６Ｍソルビトールに再懸濁する。細胞を破壊するために、ガラスビーズを加え、試験管を４℃で５分間激しく転倒撹拌する。４℃で下記段階を実施する。破壊した細胞の懸濁液を回収し、ビーズを同一緩衝液で数回洗浄する。細胞破片、核及びミトコンドリアフラクションを除去するために、夫々３５００ｒｐｍで３分間と15000ｒｐｍで１０分間の２回の遠心分離を行う。ミクロソームを沈殿させるために、上清をＮａＣｌ（最終濃度０．１５Ｍ）及びＰＥＧ ４０００（最終濃度１０％）の存在下で氷冷下に１５分間インキュベートする。１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離後に、ＴＥ緩衝液、ｐＨ７．４、２０％グリセロール中でミクロソーム沈渣を回収する。ミクロソーム調製物を分取し、−８０℃で保存する。
１３−シトクロムＰ４５０の定量
ミクロソームフラクション中のシトクロムＰ４５０の濃度をスペクトルにより測定する。定量しようとするシトクロムＰ４５０をＴＥ緩衝液、ｐＨ７．４で希釈（ミクロソームタンパク質約１ｍｇ／ｍｌ）し、数個の亜ジチオン酸ナトリウム粒子で還元する。基線（還元シトクロムＰ４５０対還元シトクロムＰ４５０）の記録後、数個のＣＯ気泡を測定槽に加え、４００〜５００ｎｍで示差スペクトルを測定する。ＣＯはシトクロムＰ４５０の還元鉄と安定な錯体を形成し、この錯体は４５０ｎｍに特徴的吸収最大値をもつ。吸収係数εＭ（４５０〜４９０ｎｍ）は９１ｍＭ-1．ｃｍ-1である。
１４−ミクロソームタンパク質の定量
全タンパク質の定量はＰＩＥＲＣＥ−ＢＣＡ定量キットを製造業者の指定条件で使用することにより実施する。ウシ血清アルブミンを標準として使用する。
１５−シトクロムＰ４５０の触媒活性
１５．１ ミクロソームでのＥＲＯＤ活性試験
シトクロムＰ４５０１Ａ１は７−エトキシレゾルフィンのＯ−脱エチル化を触媒する。５３０ｎｍで励起後の反応産物レゾルフィン（７−ヒドロキシフェノキサジン）は５８６ｎｍで蛍光発光する。単位時間当たりに形成されるレゾルフィンの量はレゾルフィンの蓄積速度に対応する。
インキュベーション混合物は、５０μＭ ＮＡＤＰＨ及び２．５μＭ ７−エトキシレゾルフィンを含むＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌ中のミクロソーム（ミクロソームタンパク質２０〜５０μｇ）懸濁液２μｌからなる。触媒効力に及ぼすウサギシトクロムｂ５の効果を測定するために、過剰の精製シトクロムの存在下でミクロソームフラクションを予め冷温でインキュベートする。
１５．２ ミクロソームでのＴＨＬ活性試験：テストステロンの６β−ヒドロキシル化
テストステロンはシトクロム３Ａ４により６β位をヒドロキシル化されたステロイドホルモンである。インキュベーション培地は、過剰のシトクロムｂ５の不在下又は存在下に５０μＭ ＮＡＤＰＨ、８０μＭテストステロン（エタノール中５ｍＭ母液から）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４又は５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４の緩衝液０．２５ｍｌ中にミクロソームタンパク質１００μｇを含む。
インキュベーションは２８℃又は３７℃で１０分間行う。水中５０％ＴＦＡ１０μｌを加えて反応を停止する。抽出手順は以下の通りである。
−ジクロロメタン５００μｌ添加、
−１分間最大速度でボルテックス撹拌、
−１００００ｒｐｍで５分間遠心分離、
−上部水相の除去、
−窒素流下に有機相の蒸発。
乾燥残渣をメタノール２０μｌにとった後、水２０μｌを加える。半量を逆相HPLCカラムＳＰＨＥＲＩ−５ＲＰ−18.5μｍ（100×2.1ｍｍ）に注入し、アセトニトリルを１ｍｌ／ｍｉｎで溶離剤として使用する。溶離勾配のアセトニトリル組成は０分で１０％（ｖ／ｖ）→８分で６０％とする。検出は２５４ｎｍで行う。溶離時間はβ−ヒドロキシテストステロンで６分２０秒間、テストステロンで８分間とする。
実施例
実施例１：Ｗ（ｈＲ，ΔＢ）株の構築
Ｗ（ΔＢ）ａ株（Ｗ０ＡＢＩＦ培地で成長）とＷ（ｈＲ）ａ株（Ｗ０ＡＤＩＦ培地で成長）を交配し、Ｗ０ＡＩＦグルコース培地で２倍体を選択する。この培地は１倍体の各々に致死性であるが、２倍体Ｗ（ｈＲ／ＹＲ，Ｙｂ５／ΔＹｂ５）には非致死性である。２倍体クローンを同一選択培地でサブクローニングする。胞子形成後、四分子を顕微鏡解剖又はバルク解剖により解剖する。ＹＰＧａｌＡ培地で培養した胞子を次に炭素源としてガラクトースを含む種々の選択培地で二次培養し、各種胞子の栄養要求性を試験する。ガラクトース培地で成長し、ウラシルとヒスチジンに関して原栄養性の酵母クローンがＷ（ｈＲ，ΔＢ）株に対応する。同一培地でガラクトースをグルコースに置換えると、これらの条件下ではヒトレダクターゼが発現しないので、これらの酵母は成長しなくなる。二重欠失は致死性であるため、レダクターゼと酵母ｂ５（その遺伝子は破壊されている）を同時に欠失しているこれらの株は成長しない（Ｔｒｕａｎら，１９９４）。顕微鏡解剖により得たＳｐ１及びＳｐ２とバルク解剖により得たＣ１及びＣ２の４個のクローンを後期試験に備えて保存する。
実施例２：Ｗ（ＧｈＲ，ΔＢ）株の構築
ＮｏｔＩで切断したＧＡＰＤＨプロモーターの組み込みベクターｐＡＢ２を使用してＷ（ｈＲ，ΔＢ）ａ株を形質転換する。ベクターｐＰＬ１００（ベクターｐＡＢ２のＤＮＡ２ｍｇに対してベクターｐＰＬ１００のＤＮＡ１０〜１５ｎｇ）を同時形質転換マーカーとして使用する。形質転換細胞をＷ０ＢＤＩＦ培地で選択する。クローンを次の３種のスクリーニングにかける。
−ウラシル要求性の選択：形質転換細胞をＷ０ＡＢＤＩＦ培地、次いでＷ０ＡＤＩＦ培地で二次培養し、ウラシルの不在下では成長しないクローンを検出する。ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの代わりにＧＡＰＤＨプロモーターを組み込むとプロモーターの上流のＵＲＡ３遺伝子も同時に不活化されるので、ＵＲＡ３遺伝子の喪失はＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターがＧＡＰＤＨプロモーターで置換されたことを示唆する。形質転換細胞の２５％はウラシルの不在下では成長しない（図１０）。
−第２の選択：ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下で発現されるヒトレダクターゼの活性を確認するために、Ｗ（ＧｈＲ，ΔＢ）クローンのケトコナゾール耐性を評価した（国際公開ＷＯ９４／０１５６４）。３個の異なるクローンは２０ｍｇ／ｍｌのケトコナゾールに耐性であるが、ヒトレダクターゼがＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下で発現されるＷ（ｈＲ）株は同一条件下で１〜５ｍｇ／ｍｌの耐性である。
−第３の選択：Ｗ（ＧｈＲ，ΔＢ）株におけるヒトレダクターゼの発現レベルを推定するために、３個の被験クローンのミクロソームフラクションに含まれるレダクターゼによるシトクロムｃの還元を測定する（Ｔｒｕａｎら，１９９３）。培養条件に応じてシトクロムｃの還元はＷ（ｈＲ）株の１．５〜３倍である。
−呼吸試験：得られたクローンをＮ３固体培地で二次培養し、呼吸表現型を試験する。３個のクローンはＮ３上で成長しない。従って負の呼吸表現型である。「呼吸を正に」するためには、これらのクローンを正の呼吸表現型株Ｗ（ｈＲ）ａと交配する。得られた２倍体Ｗ（ＧｈＲ／ｈＲ，ΔＢ／Ｙｂ５）をＷ０ＡＩＦ培地で選択する。胞子形成及びバルク解剖後、１倍体のゲノムＤＮＡを調製した後、このＤＮＡでプライマーＮ１３（配列番号１３）及びＮ１４（配列番号１４）を用いてＰＣＲを実施する。
−プライマーＮ１３：５’−ＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＡＡＧＴＴＴＡＣＡＧＴＴＡＣＣ−３’（配列番号１３）。塩基１〜３０は酵母ＹＣＹＢ５遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端の３０ヌクレオチドに相同である。
−プライマーＮ１４：５’−ＣＧＧＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＴＣＧＴＴＣＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１４）。塩基１〜４２は酵母ｂ５をコードする鎖のヌクレオチド３２１〜３６３に相補的である。
分析した６個のクローンのうち、３個のクローンは３６３ｂｐに増幅されたバンド（酵母シトクロムｂ５遺伝子のコーディングフレーム）をもち、他の３個のクローンはＨＩＳ３遺伝子の寸法（１７００ｂｐ）と酵母ｂ５のオープンリーディングフレームの寸法（３６３ｂｐ）の和に対応する２０６３ｂｐのバンドをもつ。これらのクローンをＷ０ＡＢＩＦ固体培地でサブクローニングし、ヒスチジンに対する栄養要求性を試験する。全クローンはヒスチジンの不在下で成長するが、そのうちの５０％（３６３ｂｐに増幅されたＰＣＲバンドをもつクローン）はヒスチジン要求性であるとみなされる。元のＷ（Ｎ）株のｈｉｓ３−１１遺伝子は突然変異している。Ｗ（ΔＢ）株（Ｔｒｕａｎら，１９９３）の構築時にＹＣＹＢ５のコーディングフレームにＨＩＳ３遺伝子を組み込んで酵母ＹＣＹＢ５遺伝子を破壊した際に、別の遺伝子座へのＨＩＳ３遺伝子の第２の組み込みが随伴したと予想される。このため、ＨＩＳ３遺伝子の２個の機能的コピーを含む株（Ｗ（ΔＢ））が構築されると考えられる。ＨＩＳ３遺伝子を分離すると２／２型ではなくなる。得られる結果はこのように説明できる。これらのクローンの２個を後期試験に備えて保存する（Ｂ１及びＢ２）。
実施例３：Ｗ（ｈＲ，ｈｂ５）株の構築
ＳＰ１、ＳＰ２、Ｃ１及びＣ２の４個のクローンをＹＰＧａｌＡ液体完全培地で培養し、ベクターｐＡＢ３の２０２２ｂｐのＰｖｕＩＩフラグメントにより形質転換する（図１２）。形質転換細胞をＹＰＧＡ培地にプレーティングする。ヒトシトクロムｂ５がグルコース培地上でＷ（ｈＲ，ΔＢ）株を致死性から救済する能力について組み込み細胞を選択する。成長したクローンをロット毎にまとめる。各ロットのゲノムＤＮＡを調製する。プライマーＮ５（配列番号５）及びＮ１５（配列番号１５）を用いてＰＣＲを実施する（上記第８節のＰＣＲ１及び２と同一条件）。７５８ｂｐに増幅されたバンドを与えるロットをＰＣＲにより個々に分析する。ヒトシトクロムｂ５の発現カセットをＹＣＹＢ５遺伝子座に組み込んだクローンＷ（ｈＲ，ｈｂ５）が初期クローンＷ（ｈＲ，ΔＢ）Ｓｐ１から得られる。
−プライマーＮ１５：５’−ＣＣｇａａｔｔｃＴＧＡＴＣＡＧＴＣＣＴＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＴＡＧＧ−３’（配列番号１５）。塩基１〜２はＧＣクランプであり、塩基３〜８（小文字）はＥｃｏＲＩ部位に対応し、塩基９〜１４はＢｃｌＩ部位に対応し、塩基１２〜１４は停止コドンに対応し、塩基１５〜３３はヒトシトクロムｂ５遺伝子のオープンリーディングフレームのヌクレオチド３８６〜４０５に相補的である。
実施例４：Ｗ（ＧｈＲ，ｈｂ５）の構築
クローンＢ１及びＢ２をＹＰＧＡ液体完全培地で培養し、ベクターｐＡＢ３の２０２２ｂｐ ＰｖｕＩＩフラグメントと同時形質転換マーカーとしてのベクターｐＰＬ１００により形質転換する。形質転換細胞をＷ０ＢＤＩＦ固体培地で選択する。成長するクローンを次にロット毎にまとめ、プライマーＮ３（配列番号３）及びＮ１３（配列番号１３）を使用することによりＰＣＲ分析する。前節と同様に個々のクローンをＰＣＲにより確認する。
実施例５：Ｗ（ｈＲ，Ｌｈｂ５）株の構築
組み込みベクターｐＡＰ１をＸｂａＩにより切断する。ＳＰ１、ＳＰ２、Ｃ１及びＣ２の４個のクローンをこの線状化フラグメントで形質転換する。形質転換細胞をＹＰＧＡ培地にプレーティングする。酵母で相同組換えにより、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター及びターミネーターの依存下のヒトシトクロムｂ５発現カセットは遺伝子間部位ｌｅｕ２／ＳＰＬ１に組み込まれる（図１４）。この組換えは同時に、ゲノム内の不活性ｌｅｕ２−３遺伝子をベクターｐＡＰ１に含まれる野生型ＬＥＵ２で置換することができる。形質転換細胞の第１の選択はＬＥＵ２遺伝子の復元、即ち形質転換細胞のロイシン要求性について行われる（選択培地Ｗ０ＡＩ）。第２の選択は上記第９節に記載したＰＣＲ条件でプライマーＮ９（配列番号９）及びＮ１６（配列番号１６）を用いることにより形質転換細胞のゲノムＤＮＡでＰＣＲにより実施される。１４９５ｂｐのＰＣＲバンドを示すクローンはｈｂ５の発現カセットを組み込んでいる。
−プライマーＮ１６：５’−ＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＴＣＧＧＡＣＧ−３（配列番号１６）は塩基１〜４のＧＣクランプ配列と、塩基５〜１０のＢｇｌＩＩ部位と、ヒトシトクロムｂ５遺伝子のオープンリーディングフレームのヌクレオチド１〜１９（ＡＴＧから）に相同の配列である塩基１１〜２９を含む。
実施例６：Ｗ（ＧｈＲ，Ｌｈｂ５）株の構築
この株の構築はＷ（ＧｈＲ，ΔＢ）から出発する以外はＷ（ｈＲ，Ｌｈｂ５）株と同様に行う。Ｗ０ＡＢＩ培地で形質転換細胞を直接選択した後、ゲノムＤＮＡでＰＣＲ分析する。
実施例７：Ｗ（Ｒ，Ｌｈｂ５，Ｙｂ５）株の構築
Ｗ（Ｒ）株をＹＧＰＡ液体完全培地で培養し、ＸｂａＩにより線状化したベクターｐＡＰ１により形質転換する。形質転換細胞の第１の選択はＬＥＵ遺伝子の復元、即ち形質転換細胞のロイシン要求性について行う（選択培地Ｗ０ＡＩ）。第２の選択は上記第９節（材料と方法の項）に記載したＰＣＲ条件でプライマーＮ９（配列番号９）及びＮ１６（配列番号１６）を使用することにより形質転換細胞のゲノムＤＮＡでＰＣＲにより行う。１４９５ｂｐのＰＣＲバンドを示すクローンはｈｂ５の発現カセットを組み込んでいる。この株はガラクトースの存在下で酵母レダクターゼを過剰発現し、ＰＧＫプロモーターの制御下でヒトシトクロムｂ５を発現する。内在ｂ５の発現は正常株と変わらない。
実施例８：Ｗ（ｈＲ，Ｌｈｂ５，Ｙｂ５）株の構築
Ｗ（Ｒ）株をＷ（ｈＲ）株に置換える以外はＷ（Ｒ，Ｌｈｂ５，Ｙｂ５）株と同様に構築する。
実施例９：本発明による酵母株におけるシトクロムＰ４５０の発現レベル
種々の株における２種のシトクロムＰ４５０の発現レベルを表II及びIIIに示す。驚くべきことに、シトクロムＰ450の発現レベルは同等の培養条件でヒト化株で有意に増加している。タンパク質１ｍｇ当たりの活性は発現レベルとターンオーバー値に同時に比例して増加することが認められる。
得られた結果によると、シトクロムＰ４５０１Ａ１の触媒効力は、酵母レダクターゼを過剰生産し且つヒトシトクロムｂ５を産生する１倍体株Ｗ（Ｒ，ＬＨｂ５）で最適である。他方、ウサギシトクロムｂ５を加えると活性は僅かに増加し、代謝物２７ｐｍｏｌ／ｐｍｏｌシトクロムＰ４５０／分のターンオーバーに達する。
シトクロムＰ４５０１Ａ１で得られる結果とは逆に、シトクロムＰ４５０３Ａ４の触媒効力はヒトレダクターゼを発現する酵母株で優先的に増加する。Ｗ（ＧｈＲ，ｈｂ５）株は最適触媒効力を示す。レダクターゼの種類とレベルに関係なく、シトクロムｂ５をコードするｃＤＮＡが株のゲノムに存在すると触媒効力は増加する（２〜２０倍）。シトクロムｂ５の内在遺伝子の欠失は、特に発現されるヒトｂ５の存在下で非常に有利な要因であると思われる。ヒトレダクターゼの発現、内在シトクロムｂ５の破壊及び同一１倍体酵母株におけるヒトｂ５の発現は、所定のヒトシトクロムＰ450、特にシトクロムＰ4503Ａ４の発現に特に有利な要因である。
実施例１１：シトクロムＰ４５０とヒトミクロソームシトクロムｂ５の同時発現を可能にするプラスミドの構築
本実施例は本発明による酵母株のＰ４５０活性を最適化するために使用可能なプラスミドの構築に関する。これらのプラスミドはシトクロムＰ４５０とヒトミクロソームシトクロムｂ５の同時発現を可能にする。この系列の全プラスミドは以下の共通特徴の兼備という独自の特徴をもつ。
（ｉ）Ｐ４５０の発現カセットは誘導的ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの転写制御下にあることが好ましい。
（ｉｉ）シトクロムｂ５の発現カセットはＧＡＬ１０−ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ又はＰＧＫの３種のプロモーターのうちの１種の転写制御下にあることが好ましい。
（ｉｉｉ）２個の選択マーカーが存在し、そのうちの一方は酵母ＡＤＥ２遺伝子であることが好ましい。
（ｉｖ）２個の発現カセットがプラスミド上で酵母複製起点とＡＤＥ２マーカーにより分離されている。ｂ５とＰ４５０の発現にＧＡＬ１０−ＣＹＣ１型の２個の同一プロモーターを使用する場合には、これらのプロモーターはプラスミド上で（プラスミドの回転に関して）逆向きである。２種の異なる転写ターミネーター、好ましくは酵母ＰＧＫ及びＰ４５０レダクターゼ遺伝子の転写ターミネーターを使用する。
これらの性質の兼備は、特に相同組換え現象に対して安定なプラスミドを獲得することを目的とする。
この系列のプラスミドはシトクロムｂ５の発現に使用するプロモーターと別種である。この性質により、相対発現レベルを調節し、種々の培養条件又は用途に合わせて最適化することができる。
実施例１１．１ ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のＰ４５０の発現とＰＧＫプロモーターの制御下のヒトｂ５の発現を可能にするプラスミドｐＡＰ４の構築
図１５に示すベクターｐＹｅＤＰ１／１０／Ｈｂ５は、開始コドンのすぐ上流のＢｇｌＩＩ部位と停止コドンのすぐ下流のＥｃｏＲＩ部位に挟まれたヒトシトクロムｂ５のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を含む。カセットＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩは発現ベクターｐＹｅＤＰ１／１０（ＣｕｌｌｉｎとＰｏｍｐｏｎ，Ｇｅｎｅ．６５（１９８８）２０３−２１７）に含まれる。このベクターをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＰＧＫ遺伝子のプロモーター及びターミネーターの配列とヒトシトクロムｂ５をコードする配列を含む２３１０ｂｐのフラグメントを回収後、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端化する。ベクターｐＹｅＤＰ６０を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化し、５８１９ｂｐフラグメントを回収する。このフラグメントは酵母と大腸菌の複製起点を含む。このフラグメントを再環状化し、ベクターｐＡＰ２を得る。このベクターをＰｖｕＩＩで消化し、図１７に示す発現カセットを含むベクターｐＡＰ３が得られるような向きでベクターｐＹｅＤＰ１／１０／Ｈｂ５に由来する２３１０ｂｐフラグメントを挿入する。このベクターをＢｇｌＩで消化する。７０１２ｂｐフラグメントを回収する。ベクターｐＹｅＤＰ６０をＰｖｕＩＩにより線状化し、線状化プラスミドに対応するバンドを精製する。Ｗ（Ｎ）株のクローンに由来する酵母培養物を線状化プラスミドと７０１２ｂｐフラグメントで同時形質転換し、ウラシルとアデニルに関する原栄養株クローンを選択する。酵母で相同組換えにより、ＰＧＫ遺伝子のプロモーター及びターミネーターの制御下のシトクロムｂ５の発現カセットはベクターｐＹｅＤＰ６０のＰｖｕＩＩ部位に置換し、最終ベクターｐＡＰ４を与える（図１６及び１７）。ベクターｐＡＰ４に対応するプラスミドＤＮＡを酵母から回収し、これを使用して大腸菌を形質転換する（Ａｍｐｒ）。選択、増幅及び制限によるプラスミド構造の確認後、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターとＰＧＫ遺伝子のターミネーターの間に配置された多重クローニングゾーンでベクターｐＡＰ４に該当シトクロムＰ４５０のＯＲＦを挿入する。得られたプラスミドを使用し、本願に記載する酵母株のうちで優先的に選択される受容酵母株をアデニルとウラシルに関する原栄養株クローンの選択により形質転換する。
実施例１１．２ ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のＰ４５０の発現とＧＡＰＤＨプロモーターの制御下のヒトｂ５の発現を可能にするプラスミドｐＶＤ２の構築
ベクターｐＹｅＤＰ１／１０／Ｈｂ５をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ヒトシトクロムｂ５をコードするバンドを除去する。ｂ５のＯＲＦに対応する４１７ｂｐのバンドを精製した後、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＡＢ２にクローニングする。得られたベクターで次にＥｃｏＲＩ消化によりＥｃｏＲＩ部位を破壊後、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントによりこの部位を充填した後、リガーゼにより再環状化する。４９９３ｂｐのこのプラスミドをｐＶＤ１と呼ぶ（図１６及び１８）。
次に、プライマーＮ１７（配列番号１７）及びＮ１８（配列番号１８）をプライマーとして使用することにより、ｐＶＤ１の発現カセットをＰＣＲ増幅する。増幅後のバンドは１７５３ｂｐである。プライマーはｐＹｅＤＰ６０のＰｖｕＩＩ固有部位の周囲に配置された領域で発現カセットの両端に相同組換えアームを付加するように設計する。ＰｖｕＩＩ部位で線状化してアルカリホスファターゼにより脱リン酸化したｐＹｅＤＰ６０と、ＰＣＲ増幅した発現カセットの相同組換え（実施例１１．１及び図１７参照）により、図１６及び１９に示すベクターｐＶＤ２が得られる。酵母（同時形質転換）、次いで大腸菌（選択及び増幅）にシャトル後にこのベクターの構造をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化により確認する。１０９９４ｂｐの消化バンドを示す所望のプラスミドをｐＶＤ２（図１９）と呼ぶ。プライマーＮ１９（配列番号１９）及びＮ２０（配列番号２０）で配列決定することにより発現カセットの種々の接合部を確認する。
実施例１１．３ ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のＰ４５０の発現とＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のヒトｂ５の発現を可能にするプラスミドｐＶＤ３の構築
前記構築と同様に、ｐＹｅＤＰ１／１０／Ｈｂ５からＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてヒトシトクロムｂ５のＯＲＦを得る。（ｉ）酵母Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子のプロモーター領域のすぐ上流に配置された配列と、（ｉｉ）ＵＲＡ３遺伝子と、（ｉｉｉ）ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターと、（ｉｖ）酵母Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子の転写ターミネーターから構成される配列ブロックを含む図１５に示すプラスミドｐＹｅＤＰ１１０のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位間にこのＯＲＦを連結により導入する。上述のように、連結産物であるプラスミドのＥｃｏＲＩ部位を切断により破壊−充填−連結し、ｐＶＤ３と呼ぶ５５５１ｂｐのプロモーターを得る（図２０）。次に、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下のヒトシトクロムｂ５の発現カセットを実施例１２と同様にプライマーＮ１７及びＮ１８によりＰＣＲ増幅する。増幅後の２３６５ｂｐのバンドを精製後、上述のようにｐＹｅＤＰ６０のＰｖｕＩＩ部位に相同組換えにより導入する（ＧＡＰＤＨプロモーターをＧＡＬ１０−ＣＹＣ１に置き換える以外は図１９に同じ）。本発明のプラスミドの一般構造の説明で示したように、ＰＣＲにより導入した組換えアームの配列の性質により、組換えプラスミド上に存在する２個のＧＡＬ１０−ＣＹＣ１カセットは逆向きになる。次に、酵母−大腸菌シャトル後にｐＶＤ４と呼ぶ１１５９５ｂｐのプラスミド（図１６）を選択する。ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターとシトクロムｂ５遺伝子の接合部をプライマーＮ２１（配列番号２１）による配列決定により確認する。
得られた株の命名法：
W(GhR,ΔB):MATa,leu2-3,112,ade2-1,trp1-1,ura3-1.
W(hR,ΔB):MATa,leu2-3,112,ade2-1,trp1-1.
W(hR,hb5):MATa,leu2-3,112,ade2-1,trp1-1.
W(GhR,hb5):MATa,leu2-3,112,ade2-1,trp1-1,ura3-1.
W(hR,Lhb5):MATa,ade2-1,trp1-1.
W(GhR,Lhb5):MATa,ade2-1,trp1-1,ura3-1.
W(R,Lhb5,Yb5)
W(hR,Lhb5,Yb5)
使用したプライマーの配列：
参考文献：
配列番号：１
配列の長さ：２７
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：４２
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：４８
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：５０
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：２５
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：３８
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：３４
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：２５
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：３１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：４２
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：３３
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：２９
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：６９
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：７０
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：２４
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：２４
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
配列の長さ：２１
配列の型：ヌクレオチド
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル配列：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
Claims (19)
- １）酵母シトクロムｂ５をコードする遺伝子と酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子が不活化されており、２）ヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸を含み、３）ヒトシトクロムｂ５をコードする核酸を含むことを特徴とし、前記核酸がｃＤＮＡであることを特徴とする遺伝子改変酵母株。
- ヒトｃＤＮＡの少なくとも１個が構成的又は誘導的酵母プロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項１に記載の株。
- 構成的プロモーターがグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーター及びシトクロムｂ５の内在プロモーターから選択されることを特徴とする請求項２に記載の株。
- 誘導的プロモーターがＧＡＬ１０及びＣＹＣ１−ＧＡＬ１０プロモーターから選択されることを特徴とする請求項２に記載の株。
- ヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸が酵母のゲノムに組み込まれていることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の株。
- ヒトシトクロムｂ５をコードする核酸が酵母のゲノムに組み込まれていることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の株。
- ヒトシトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１種の核酸を更に含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の株。
- ヒトシトクロムＰ４５０をコードする核酸がプラスミド上に組み込まれていることを特徴とする請求項７に記載の株。
- ヒトシトクロムｂ５をコードする核酸を前記プラスミド上又はゲノムに更に組み込んでいることを特徴とする請求項８に記載の株。
- １倍体であることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の株。
- 酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の株。
- ヒトシトクロムｂ５をコードする核酸とヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸を含むことを特徴とする請求項１から６、１０及び１１のいずれか一項に記載の株。
- ヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸が酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項１２に記載の株。
- ヒトシトクロムｂ５をコードする核酸が酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項１２に記載の株。
- ヒトシトクロムｂ５をコードする核酸が酵母ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下にあり、ヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸が酵母グリセルアルデヒドリン酸デヒドロケナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一項に記載の株。
- ヒトシトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１種の核酸を更に含むことを特徴とする請求項１２から１５のいずれか一項に記載の株。
- ヒトシトクロムＰ４５０をコードする核酸がプラスミド上に組み込まれていることを特徴とする請求項１６に記載の株。
- ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーターの制御下にあるヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０リダクターゼをコードする核酸を含み、酵母シトクロムｂ５および酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子が不活化されている酵母株を利用することを特徴とする、請求項１２または１４に記載の株の獲得方法。
- グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの制御下にあるヒトＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０リダクターゼをコードする核酸を含み、酵母シトクロムｂ５および酵母ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０リダクターゼが不活化されている酵母株を利用することを特徴とする、請求項１３または１５に記載の株の獲得方法。
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