DK175898B1

DK175898B1 - Fremgangsmåde til at udtrykke ikke-gærprotein i en gærvært og transformeret gærvært samt anvendelsen af en transformeret gær til fremstilling af gærværten

Info

Publication number: DK175898B1
Application number: DK198902215A
Authority: DK
Inventors: Jeffrey R Shuster
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1988-05-06
Filing date: 1989-05-05
Publication date: 2005-05-30
Also published as: EP0340986B1; JP3484386B2; JP3561513B2; JPH02104291A; DE68922932T2; ES2072900T3; DK221589D0; CA1324969C; DK221589A; JP2000300277A; JP2003116525A; EP0340986A3; US6183985B1; JP2004081222A; ATE123521T1; JP3074174B2; DE68922932D1; EP0340986A2

Description

DK 175898 B1

Fremgangsmåde til at udtrykke ikke-gærprotein i en gærvært og transformeret gærvært samt anvendelsen af en transformeret gær til fremstilling af gærværten 5 Den foreliggende opfindelse angår fremgangsmåder og materialer, der er egnet til produktion af heterologe proteiner i gær ved rekombinant-DNA-metoder. Den foreliggende opfindelse angår navnlig fremgangsmåder og materialer, som forbedrer udbyttet af heterologe proteiner, der frembringes i gær, når gæren udtrykkes under kontrol af et gæralkoholdehydrogenasei-10 soenzym-ll-genpromotoren (ADH-ll-genpromotor) eller dens opstrøms aktiveringssekvens (UAS).

Ekspressionen af fremmede gener i gær, som styres af det system, der forårsager ekspression af ADH II, har vist sig at være ganske værdifuld. Denne 15 ekspression indbefatter sædvanligvis anbringelse af den sekvens, der koder for det heterologe protein, under styring af promotoren fra ADH2-genet eller hybridpromotorer, der gør brug af ADH2-promotorens opstrøms regulerende område i kombination med en stærk gærpromotor, såsom gIyceraldehyd-3-phosphatpromotoren (GAP-promotoren). Se f.eks. EPO publikationsnr.

20 164.556; EPO publikationsnr. 196.056; beskrivelsen til US patentansøgning nr. 868.639, indleveret 29. maj 1986. Ekspressionskassetter for det heterologe protein, der gør brug af de regulerende ADH2-områder, forekommer sædvanligvis i gærekspressionsværten i højt kopital. Selv om der opnås gode resultater med sådanne ekspressionssystemer, eksisterer der et fortsat be- f i 25 hov for at forøge udbyttet af heterologt protein.

Der er blevet publiceret et antal undersøgelser af reguleringen af ADH2-genet med gær ADR1-genet, se f.eks. S'huster et al. (1986) Mol. Cell. Biol.

6:1894-1902; Denis et al. (1983) Mol. Cell. biol. 3:360-370. Der er blevet pub- 30 liceret adskillige undersøgelser over forholdet mellem ADR1 -ekspressions-niveauet og native ADH2-geners ekspressionsniveau, se Irani et al. (1987) I DK 175898 B1

Mol. Cell. Biol. 7:1233-1241; Denis (1987) Mol. Gen. Genet 208:101-106.

Men disse undersøgelser har ikke vist, om forøget ADR1-ekspression ultimativt ville forbedre udbyttet af et heterologt protein, der udtrykkes under styring af ADH2-reguleringssekvenseme. Det blev f.eks. observeret af Irani et al.

* 5 (1987), at mere end 100 kopier af ADR1 ikke kunne overvinde en 3- til il ganges inhiberingen i ADH2-transkription den af multiple ADH2-promotorer forårsagede. Det blev foreslået, at dette resultat underbygger en model for ADH-ll-regulering, ved hvilken der forekommer andre positive begrænsende faktorer på ADH2-ekspression end ADR1. Denis (1987) har også rapporteret, 10 at stigende ADR1 -gen-dosering tilsyneladende var toxisk for gæn/ærten, hvilket førte til en signifikant forøgelse af cellefordoblingstid.

Det er overraskende blevet opdaget, at udbyttet af heterologt protein fra en gærvært, der er transformeret med en ekspressionskassette for det hetero-15 loge protein, som gør brug af ADH2-reguleringssystemet, kan forøges væsentligt ved at øge ekspressionen i gærværten af det protein, som indkodes med ADR 1-genet. Dette resultat er overraskende i betragtning af den rapporterede toxisitet af forøget ADR 1-gen-dosering og den minimale effekt af 100 +kopier af ADR1-genet på ADH Il-aktivitet i en gærvært, der er transformeret 20 med multiple ADH2-promotorer.

I en udførelsesform angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til ekspression af et heterologt protein i gær, hvilken fremgangsmåde omfatter tilvejebringelse af en gærvært, der er transformeret med: (i) en ekspressions-25 kassette for ikke-gærproteinet, som omfatter en kodende DNA-sekvens for ikke-gærproteinet under styring af gær-genkendte transkriptionsinitierings- og -termineringssekvenser, der er funktionelle i gærværten, hvilken transkrip-tionsinitieringssekvens yderligere omfatter et opstrøms gær-ADH2-akti-veringssted og en gærpromotor som er heterolog med opstrøms gær-ADH2-30 aktiveringsstedet; og (ii) en ekspressionskassette, som er heterolog med gærværten for gær-ADR-l, der omfatter en kodende DNA-sekvens for ADR-I

[ - DK 175898 B1 3 under styring af gær-genkendte transkriptionsinitierings- og -terminerings-sekvenser, som er funktionelle i gærværten; (b) dyrkning af en klonpopulation af den transformere gærvært under betingelser, ved hvilke ikke-gærproteinet og ADR-I udtrykkes; og (c) indvinding af ikke-gærproteinet fra klonpopula-5 tionen.

I en anden udførelsesform angår den foreliggende opfindelse en gærcelle, der er transformeret med: (a) en ekspressionskassette med en kodende DNA-sekvens for et ikke-gærprotein under styring af gær-genkendte 10 transkriptionsinitierings- og -termineringssekvenser, som er funktionelle i gærværten, hvilken transkriptionsinitieringssekvens omfatter et opstrøms gær-ADH2-aktiveringssted og en gærpromotor som er heterolog med opstrøms gær-ADH2-aktiveringsstedet; og (b) en ekspressionskassette som er heterolog med gærværten for ADR-I med en kodende DNA-sekvens for 15 ADR-I under styring af gær-genkendte transkriptionsinitierings- og -termineringssekvenser, som er funktionelle i gærværten.

I endnu en anden udførelsesform angår den foreliggende opfindelse en transformeret gær med en ekspressionskassette, der er integreret i genomet, 20 hvilken ekspressionskassette indeholder en kodende sekvens for ADR I under styring af gær-genkendte transkriptionsinitierings- og -termineringssekvenser, hvilken transkriptionsinitieringssekvens er forskellig fra ADR1-; promotoren.

25 Disse og andre udførelsesformer for den foreliggende opfindelse vil ud fra følgende beskrivelse være umiddelbart forståelige for fagfolk med sædvanligt kendskab til fagområdet.

I DK 175898 B1

Kort beskrivelse af figurerne

Figur 1 viser et flow-diagram, der viser konstruktionen af plasmider pJS119 og pDM15.

Figur 2 viser et restriktionskort over plasmid pJS119. Ikke alle restrik-tionsstedeme er vist. Følgende forkortelser anvendes i figuren: URA3, gær URA3-gen; LEU2-d, gær LEU2-d-gen; GAP-t, glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase mRNA-termineringssekvens; ADR1, gær ADRI-gen; p-GAP, 10 glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase mRNA-promotor startsekvenser; pBR322, E. coli plasmidsekvenser; 2 pm, gær 2 mm plasmidsekvenser.

Figur 3 viser et restriktionskort over plasmid pDM15. Ikke alle restriktionssteder er vist. Forkortelserne er de samme som for figur 2 med følgende 15 tilføjelser. G418, gen, der overfører resistens mod G418 (Geneticin); (Sma/Pst), fusionssted mellem Smal- og Pstl-restriktionssteder.

Ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse vil der, med mindre andet er angivet, blive anvendt sædvanlig molekylærbiologi, mikrobiologi og rekombi-20 nant DNA-teknikker, der ligger inden for en fagmands kunnen. Sådanne teknikker er fuldt ud forklaret i litteraturen. Se f.eks. Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning. bind I og II (D.N. Glover, ed. 1985): Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed.

1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & SJ. Higgins, eds. 1984); 25 Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

I beskrivelsen af den foreliggende opfindelse vil følgende terminologi blive anvendt ifølge de nedenfor fremsatte definitioner.

30 DK 175898 B1 5 "ADH II” henviser til alkoholdehydrogenase II, der kan undertrykkes af glucose, fra gær, navnlig Saccharomyces og specielt S. cerevisiae. "ADH2" henviser til det gærgen, der koder for ADH II såvel som dets associerede regulerende sekvenser. Se f.eks. Russell et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:2674-5 2682.

MUAS" er en anerkendt betegnelse inden for fagområdet for ovenstrøms aktiveringssekvenser eller forstærkerområder, der sædvanligvis er korte, repetitive DNA-sekvenser, der er lokaliseret ovenstrøms for en promotors TATA-10 box. Af speciel interesse i den foreliggende opfindelse er ADH2 UAS, der er en 22-bp perfekt inverteret gentagelse, lokaliseret ovenstrøms for ADH2 TA-TA-boxen. Se Shuster et al. (1986) Mol. Cell. biol. 6:1894-1902.

"ADR1" henviser til et positivt regulerende gen fra gær, der kræves til eks-15 pressionen af ADH II. Se f.eks. Denis et al. (1983) Mol. cell. Biol. 3:360-370.

Det i ADR1 -genet indkodede protein henvises til heri som "ADR I".

Et "replicon" er et hvilket som helst genetisk element (f.eks. plasmid, cosmid, chromosom, virus), der fungerer som en autonom enhed for DNA-replikation 20 in vivo, dvs. er i stand til replikation under sin egen styring.

En "vektor" er et replicon såsom et plasmid, en phag eller et cosmid, hvortil et andet DNA-segment kan forbindes, for at frembringe replikationen af det forbundne segment.

25

Et "dobbelt-strenget DNA-molekyle" henviser til den polymere form af deoxy-ribonucleotider (adenin, guanin, thymidin eller cytosin) i dets normale dobbeltstrengede helix. Denne betegnelse henviser kun til molekylets primære og sekundære struktur og begrænser det ikke til nogle bestemte tertiære 30 former. Denne betegnelse omfatter dermed dobbeltstrenget DNA, der blandt andet findes i lineære DNA-molekyler (f.eks. restriktionsfragmenter), viruser,

I DK 175898 B1 I

I 6 I

plasmider og kromosomer. Ved omtalen af et specielt dobbeltstrenget DNA- I

I molekyles struktur, vil sekvenserne blive beskrevet heri ifølge den normale I

I konvention ved kun at give sekvensen i 5'- til 3-retningen langs den ikke- I

transkriberede DNA-streng, dvs. den streng, der har en sekvens, der er ho- I

I 5 molog med det fra en bestemt kodende sekvens producerede mRNA. · I

I En DNA "kodende sekvens” er en DNA-sekvens, der kan transkriberes og I

I translateres til et polypeptid in vivo, når den anbringes under styring af pas- I

I sende regulerende sekvenser. Grænserne for den kodende sekvens be- I

I 10 stemmes ved og omfatter translationsstart codonet ved 5' (amino) terminalen I

I og et translationsstopcodon ved 3' (carboxy) terminalen. En kodende se- I

kvens kan omfatte, men er ikke begrænset til, prokaryotiske DNA-sekvenser, I

I virale DNA-sekvenser, cDNA eller genomiske DNA-sekvenser fra eukaryo- I

I tiske kilder (f.eks. pattedyr) og endda syntetiske DNA-sekvenser. I

I I

I "Gær-genkendte transkriptionsinitierings- og -termineringssekvenser'' henvi- I

I ser til regulerende DNA-regioner, der flankerer en kodende sekvens og er I

I ansvariige for transkriptionen i gær af et mRNA, der er homologt med den I

I kodende sekvens, der herefter kan translateres til polypeptidet, der er indko- I

I 20 det i den kodende sekvens. Transkriptionsinitieringssekvenser omfatter I

I gærpromotorsekvenser, der er regulerende DNA-sekvenser, der er i stand til I

I at binde gær RNA-polymerase i en celle og initiere transkription af en I

I nedenstrøms (3'-retning) kodende sekvens. For definitionsformål for den fo- I

I religgende opfindelse er promotorsekvensen afgrænset ved dens 3'-terminal I

I 25 ved (og udelukker) translationsstart-codonet for en kodende sekvens og I

I strækker sig ovenstrøms (5'-retning) til at omfatte det mindste antal nukleoti- I

I der eller elementer, der er nødvendige for at initiere transkription i niveauer, I

I der kan påvises over baggrund. Der vil inden for promotorsekvensen findes I

I et transkriptionsinitieringssted (hensigtsmæssigt defineret ved at kortlægge I

I 30 med nuklease S1) såvel som protein-bindende domæner (konsensus- I

I sekvenser), der er ansvarlige for bindingen af gær RNA-polymerasen (f.eks. I

DK 175898 B1 7 TATA-boxen). Transkriptionsinitieringssekvenser kan også omfatte andre regulatoriske områder, der er ansvarlige for promotorregulering eller forstærkning, såsom UAS.

5 Promotorer der er egnede i den foreliggende opfindelse omfatter vildtype ADR1-promotoren såvel som andre gærpromotorer. Navnlig foretrukket er promotorer, der er forbundet med enzymerne i glycolysen, f.eks. phospho- I

glucoisomerase, phopshofructokinase, phosphotrioseisomerase, phospho-glucomutase, enolase, pyrudruesyrekinase, glyceraldehyd-3-phosphat-10 dehydrogenase (GAPD), ADH I, ADH II, såvel som hybrider af disse promotorer. En navnlig foretrukket hybrid promotor er hybriden fra dannet 5’reguleringssekvens (herunder UAS) og GAPD-promotortranskriptions-initieringsstedet og konsensussekvenser, der henvises til som en "ADH2/GAPD-hybridpromotoru. Se f.eks. EPO publikation nr. 120.551 og 15 164.556 og nr. 196.056. På samme måde kan en transkriptionsterminerings- sekvens, der er lokaliseret 3' for translationsstop-codonet, enten være vildtype ADR1. ADH2 eller GAPD-transkriptionstermineringssekvenser eller en anden gær-genkendt termineringssekvens såsom de, der stammer fra generne for andre glycolytiske enzymer.

20

En kodende sekvens er "under styring" af transkriptionsinitierings- og -termi-neringssekvenser, når RNA-polymerase binder transkriptionsinitierings-sekvensen og transkriberer den kodende sekvens til mRNA, stopper ved transkriptionstermineringssekvensen og mRNA’et translateres herefter til det 25 af den kodende sekvens indkodede polypeptid (dvs. "ekspression").

En "ekspressionskassette" er en DNA-konstruktion med den kodende sekvens under styring af transkriptionsinitierings- og -termineringssekvenser. I udførelsen af den foreliggende opfindelse vil sådanne konstruktioner omfatte 30 gær-genkendte transkriptionsinitierings- og -termineringssekvenser og eks-pressionskassetteme vil f.eks. omfatte en kodende sekvens for ADR1- L 1 1 — — ...... '

I DK 175898 B1 I

Η I

I I

I proteinet eller ikke-gærprotein eller begge. Det er navnlig foretrukket at flan- I

kere ekspressionskassetterne med restriktionssteder, der vil sørge for hen- I

I sigtmæssig kloning af kassetterne i en passende vektor. I

I 5 En celle er "transformeret" med exogent DNA, når sådant exogent DNA er I

I blevet introduceret i cellen. Afkommet fra sådanne celler, der beholder det I

exogene DNA, henvises også til heri som "transformerede" celler. Exogent I

I DNA kan eventuelt være integreret (covalent bundet) med kromosomalt I

I DNA, der udgør cellens genom. Det exogene DNA kan vedligeholdes ekstra- I

I 10 kromosomalt i den transformerede celle i et replicon såsom et plasmid. Når I

I det exogene DNA er blevet integreret i kromosomet nedarves det af datter- I

I celler gennem kromosomreplikation. En celle, der er blevet transformeret I

I med exogent DNA, der er integreret i kromosomet, henvises til som en "sta- I

I bilt" transformeret celle. I

I 15 I

I En "klon" eller "klonpopulation" er en cellepopulation, der er afledt fra en en- I

I kelt celle eller fælles stamcelle ved mitose. I

I To DNA-sekvenser er "i det væsentlige homologe", når mindst ca. 60% (for- I

I 20 trinsvis mindst ca. 75% og mest fortrinsvis mindst ca. 90%) af nukleotideme I

I passer sammen over en defineret længde (f.eks. 100 bp, 200 bp, 500 bp, 1 I

I kb, 2 kb eller mere) af molekylerne. Sekvenser, der i det væsentlige er homo- I

I loge, kan identificeres i et Southem-hybridiseringseksperiment under betin- I

I gelser med udvalgt stringens som er angivet for det pågældende system. I

I 25 Angivelse af passende hybridiseringsbetingelser ligger inden for en fag- I

I mands kunne. Se f.eks. Maniatis et al., ovenfor; DNA-Cloninq. ovenfor; I

I Nucleic Acid Hybridization, ovenfor. I

I Et "heterologt" område i et DNA-molekyle er et identificerbart DNA-segment I

I 30 inden for et større DNA-molekyle, der ikke naturligt findes forbundet med det I

I større molekyle. Et identificerbart segment er en sekvens af tilstrækkelig I

DK 175898 B1 9 længde til at identificere sekvensen som havende en kilde, der er exogen for det større molekyle eller dets oprindelsesorganisme. Når det heterologe område koder for et pattedyrsprotein, vil det heterologe område således sædvanligvis flankeres af DNA, der ikke flankerer pattedyrs DNA-sekvensen i 5 oprindelsesorganismens genom. Et andet eksempel på en heterolog kodende sekvens er en konstruktion, hvori selve den kodende sekvens ikke naturligt findes (f.eks. et cDNA, hvor den genomiske kodende sekvens indeholder intrans eller syntetiske sekvenser med codons, der er forskellige fra organist mer, der koder for samme eller lignende protein). Allelvariationer, punktmuta-10 tioner eller naturligt forekommende mutationsbegivenheder fører ikke til et "heterologt" DNA-område som anvendt heri. Et protein, der er "heterologt" for en organisme, er et protein, der ikke er indkodet i organismens naturlige ge nom. Et "ikke-gær" protein er heterologt til den pågældende gær.

15 Som anvendt heri omfatter "gær" ascosporogene gær (Endomycetales), ba- i sidiosporogene gær og gær, der hører til Fungi imperfect! (Blastomycetes).

De ascosporogene gær deles i to familier, Spermophthoraceae og Saccha-romycetaceae. Sidstnævnte består af fire underfamilier, Schizosaccharomy-coideae (f.eks. slægten Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoi-20 deae og Saccharomycoideae (f.eks. slægterne Pichia, Kluyveromyces og Saccharomyces). De basidiosporogene gær omfatter slægterne Leucosporo-dium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium og Filobasidiella. Gær der hører til Fungi imperfecti deles i to familier, Sporobolomycetaceae (f.eks. slægterne Sporobolomyces, Bullera); og Cryptococcaceae (f.eks. slægten 25 Candida). Af specielle interesse for den foreliggende opfindelse er arter inden for slægterne Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces og Candida. Af navnlig interesse er Saccharomyces-arteme S. cere-visiae. S. carlsberqensis. S. diastaticus. S. douqlasii, S. kluweri. S. norbensis og S, oviformis. Arter af speciel interesse i slægten Kluyveromyces omfat-30 ter K. lactis. Da klassifikationen af gær kan ændres i fremtiden, skal gær, for formålene med opfindelsen, defineres som beskrevet i Biology and Activities

I DK 175898 B1 I

I 10 I

I of Yeast (F.A. Skinner, S.M. Passmore og R.R. Davenport eds. 1980) (Soc. I

App. Bacteriol. Symp. Serie nr. 3). Foruden det foregående er fagfolk formo- I

I dentlig kendt med gærs biologi og den genetiske manipulation af gær. Se I

f.eks. Biochemistry and Gentics of Yeast (M. Bacila, B.L. Horecker og A.O.M. I

I 5 Stoppani eds. (1978); The Yeasts (A.H. Rose og J.S. Harrison eds., 2. udgå- I

I ve, 1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomvces (Strathem et I

I al. eds. 1981). I

I Til eksempelformål vil den foreliggende opfindelse blive beskrevet i forhold til I

10. gær af slægten Saccharomyces, navnlig S. cerevisiae. Men opfindelsen er I

I ikke begrænset til disse gær. I

Den foreliggende opfindelse, forøget ekspression af heterologe proteiner i I

I gær, opnås ved at anbringe den kodende sekvens for det heterologe protein I

I 15 under styring af ADH2 reguleringssekvenserne inden for gærværten og også I

I forsyne gærværten med forstærket ekspression af ADR I. Konstruktionen af I

I ekspressionskassetter for ikke-gærproteiner under anvendelse af ADH2- I

promotorer, herunder hybrid ADH2-promotorer, såsom ADH2/GAPD-hybrid- I

I promotoren, er fuldstændigt beskrevet i EPO publikations nummer 120.551 I

I 20 og nr. 164.556. I

I

Den foreliggende opfindelse anvender gærværter med forstærket ADR I- I

I ekspression i forhold til vildtypegærstammer. Når sådanne gærværter an- I

I vendes sammen med ovennævnte ADH2-baserede ekspressionskassetter, I

I 25 er der en væsentlig forøgelse i produktionen af heterologt protein, produceret I

I fra ADH2-kassetteme. Gærværter, der tilvejebringer den forstærkede ADR I- I

I ekspression, kan tilvejebringes på et antal måder. I

I I en foretrukken udførelsesform tilvejebringes forstærket ADR l-ekspression I

I 30 ved at transformere gærværten med en ekspressionskassette, der indeholder I

I en kodende sekvens for ADR I (sædvanligvis fra ADR l-qenet), hvori kasset- I

DK 175898 B1 11 ten tilvejebringer højere ekspressionsniveauer af ADR I i værten. Ekspressionskassetten kan bestå af den kodende sekvens under styring af ADR I-transkriptionsinitierings- og -termineringssekvenser eller der kan anvendes heterologe transkriptionsinitierings- og -termineringssekvenser. I en foretruk-5 ket udførelsesform konstrueres ADR l-kassetten under anvendelse af en stærk gærpromotor i stedet for ADR l-promotoren; dvs. en promotor, der tilvejebringer mindst en 5-gange forøgelse af transkription af en kodende sekvens i forhold til ADR l-promotoren. Et eksempel på en sådan promotor er GAPD-promotoren.

10 ADR l-Kassetteme kan anvendes til transformering af gærværter ved enten at vedligeholde kassetten som en ekstrakromosomal vektor, såsom en høj-kopitalsvektor eller ved en integration i gærværtsgenomet via en integrationsvektor. ADR l-Kassetten og ikke-gærproteinkassetten kan vedligeholdes i 15 gærværten på enten samme eller forskellige vektorer eller kan inkorporeres i værtsgenomet ved den samme eller en anden integrationsvektor.

J

I en navnlig foretrukken udførelsesform transformeres gærværten med en iritegrationsvektor, der bærer ADR l-kassetten under anvendelse af en stærk 20 gærpromotor og den heterologe proteinkassette vedligeholdes på en ekstrakromosomal højkopivektor. F.eks. kan den integrerede ADR l-kassette anvende GAPD-promotoren og den ekstrakromosomale ikke-gærproteinkas-sette kan anvende ADH2-promotoren eller ADH2/GAPD-hybridpromotoren.

25 De i den foreliggende opfindelse anvendte replikons, sædvanligvis plasmider, vil omfatte ét eller flere replikationssystemer, helst to replikationssystemer, der tillader vedligeholdelse af replikonet i både en gærvært til ekspression og i en bakterievært (f.eks. E. colil til kloning. Eksempler på sådanne gær-bakteriefærgevektorer omfatter YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17-24], 30 pCl/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-46461 og YRp17 [Stinchomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:1571. En ekstrakromosomal

I DK 175898 B1 I

I I

I vektor kan yderligere være en højkopitals- eller lavkopitalsvektor, hvor kopi- I

I tallet generelt ligger på fra ca. 1 til ca. 500. Med højkopitalsgærvektorer vil I

I der generelt være mindst 10, fortrinsvis mindst 20 og sædvanligvis ikke mere I

I end ca. 150-500 kopier i en enkelt vært. Afhængig af det udvalgte ikke-

I 5 gærprotein kan enten en højkopitals- eller lavkopitalsvektor være ønsket, af- I

I hængig af vektorens effekt og effekten af det fremmede protein på værten. I

I Se f.eks. Brake et al., ovenfor. DNA-Konstruktioner ifølge foreliggende opfin- I

I delse kan også integreres i gærgenomet ved en integrationsvektor. Eksem-

I pier på sådanne vektorer kendes inden for fagområdet. Se f.eks. Botstein et I

I 10 al., ovenfor. Der integreres fortrinsvis mindre end 50 kopier af kassetten i I

I genomet, mere fortrinsvis mindre end ca. 10 og sædvanligvis mindre end ca.

I 5 (foruden et hvilket som helst vildtypegen). Der integreres typisk kun én eller I

I to kopier. I

I 15 Udvælgelsen af passende gær- og andre mikroorganismeværter (f.eks. I

I diploide, haploide, auxotrofe osv.) til udførelsen af den foreliggende opfmdel- I

I se ligger inden for en fagmands kunnen. Ved udvalg af gærværter til eks- I

I 1 I

I pression kan passende værter omfatte de, der er vist bl.a. at have god se- I

I cemeringskapacitet, lav proteolytisk aktivitet og generel robusthed. Gær og I

I 20 andre mikroorganismer er almindeligvis tilgængelige fra et udvalg af kilder, I

herunder "Yeast Genetic Stock Center", Department of Biophysics and Medi- I

I cal Physics, University of California, Berkeley, Californien og ’The American

I Type Culture Collection", Rockville, Maryland. I

I 25 Metoder til introduktion af exogent DNA i gærværter er velkendte inden for I

I fagområdet. Der er et bredt udvalg af måder, hvorpå gær kan transformeres. I

F.eks. beskrives sphæroplasttransformation af Hinnen et al. (1978) Proct. I

I Natl. Acad. Sci. USA 75:1919-1933 og Stinchcomb et al., EPO publikation nr. I

I 45.573. Transformanter dyrkes i et passende næringsmedium og vedligehol- I

I 30 des, hvor det er passende, under selektivt tryk for at sikre bibeholdelse af I

I exogent DNA. Hvor ekspression er inducerbar, kan der tillades vækst af I

DK 175898 B1 13 gærværten til at give en høj densitet af celler og herefter induceres ekspression. Ikke-gærproteinet kan høstes ved en hvilken som helst sædvanlig metode og oprenses ved kromatografi, elektroforese, dialyse, opløsningsmiddel-opløsningsmiddelekstraktion og lignende.

5

Eksempler Følgende eksempler gives kun for illustrative formål og er ikke tænkt at begrænse rammerne for den foreliggende opfindelse. Det formodes, at depone-10 ring af det biologiske udgangsmateriale ikke er nødvendigt for udførelsen af den foreliggende opfindelse, idet enten samme eller tilsvarende materialer er offentligt tilgængelige. Den kendte teknik fra alle de i beskrivelsen citerede j ; referencer formodes at være kendt af fagfolk og medtages udtrykkeligt heri ved henvisning.

15 I.

I dette eksempel beskrives konstruktionen af en ekspressionskassette til forstærket ekspression af ADR I, insertionen af den i en autonomt replicerende 20 gærvektor og transformationen af gærstammer dermed. Figur 1 viser et flow-diagram af vektorens konstruktion og figur 2 viser et delvist restriktionskort for den resulterende vektor.

Plasmid YPp7-ADR1-411 [Denis et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:360-370] in-25 deholder gærgenet ADR1. Dette plasmid blev skåret med restriktionsenzym Hindi og et fragment, der indeholder ADR1 -genet, hvor codoneme for de første 16 aminosyrer ved 5'-enden mangler, blev isoleret. Et oligonukleotid blev syntetiseret ved standardmetoder til erstatning af de N-terminale codoner og til tilvejebringelse af en 5’-forlængelse, der indeholder et Bglll-restriktions-30 sted. Sekvensen af oligonukleotidadaptoren, der blev fremstillet under an-

DK 175898 B1 I

vendelse af gær foretrukne codoner i stedet for de i ADR 1-genet normalt fo- I

rekommende codoner, er som vist nedenfor. H

MetAlaAsnValGluLysProAsnAspCysSerGlyPheProValVal H

5 GATCTATTACCATGGCTAACGTTGAAAAGCCAAACGATTGTTCTGGTTTTCCAGTTGTT I

ATAATGGTACCGATTGCAACTTTTCGGTTTGCTAACAAGACCAAAAGGTCAACAA I

Adaptoren blev ligeret til Hincll-fragmentet fra YPp7-ADR1-411 under Stan-

dardbetingelser. Efter inaktivering af ligasen blev blandingen skåret med Bglll I

10 til frembringelse af et 1,9 kb Bglll-fragment, der indeholder kodende sekven- I

ser for de første 641 aminosyrer af ADR I. Dette Bglll-fragment blev herefter H

oprenset, reklonet og ligeret til et BglIl-sted mellem en GAPD-promotor og en H

GAPD-terminator i plasmid pAB27, såleded at promotoren direkte kunne kor- H

rigere transkription af den kodende sekvens for ADR I. Det resulterende H

15 plasmid blev kaldt pJS118. I

Plasmid pAB27 er en gærfærgeekspressionsvektor bestående af sekvenser I

fra gær 2 μηη plasmidet, E. coli pBR322 plasmidet, gærmarkørgeneme URA3 I

og LEU-2d, samt en "tom" GAPD-ekspressionskassette med et Bglll-inser- I

20 tionssted disponeret mellem GAPD-promotor- og GAPD-terminatorsekven- I

seme. I

Plasmid pJS118 er et mellemprodukt, da det kun koder for de første 641 I

aminosyrer i ADR I. Resten af den kodende sekvens fra ADR1-genet blev I

25 herefter sat til denne vektor til opnåelse af pJS119. Først blev YRp7-ADR1- I

411 skåret med Sacl og der blev isoleret et 4 kb-fragment, der indeholdt re- I

sten af den kodende sekvens fra ADR1 og dets 3-flankerende sekvenser. H

Dette 4 kb-fragment blev herefter ligeret ind i Sacl-skæring og alkalisk I

phosphatasebehandlet pJS118 til frembringelse af plasmid pJS119. Integrite- I

30 ten af ADR1 -kodningssekvensen blev undersøgt ved restriktionsenzymana- I

lyse for at sikre, at fragmentet var blevet indsat i den korrekte orientering. I

DK 175898 Bl 15

Plasmid pJS119 blev transformeret ind i to forskellige gærværtsstammer, AB110 og JC482 under anvendelse af standardprocedurer. Se f.eks. Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929.

5 Gærstamme AB110 blev opnået ved at krydse S. cerevisiae 2150*2-3 (tilgængelig fra Lee Hartwell, University of Washington) med S. cerevisiae AB103.1 transformant, der indeholder pC1/1 -derivat. Diploideme blev sporu-leret og tetraderne blev dissekeret. Stammer blev vedligeholdt på leucinse-lektive plader for at sikre vedligeholdelse af plasmidet, idet forældrene er au-10 xotrofe. En serie af kolonier blev screenet for genotype med hensyn til et antal af markører (Mat a, ura3, Ieu2, pep4-3). Stamme AB 110 blev opnået ved at befri den resulterende hybridstamme for sit residerende plasmid ved dyrkning i nænrær af leucin (dvs. fravær af selektivt tryk) og herefter selektion for leu' kolonier ved replikaudpladning. AB110 har følgende genotype: Mat a, 15 ura3-52, leu2-04 eller både leu2-3 og Ieu2-112, pep4-3, his4-580, cir°. En prøve af denne stamme, der indeholder et andet heterologt plasmid blev deponeret hos ATCC den 9. maj 1984 under deponeringsnr. 20709. Se EPO publikationsnr. 164.556.

20 Stamme JC482 blev opnået fra Dr. John Cannon ved University of Pennsylvania, Philadelphia, Pennsylvania. Stammen blev befriet for residerende 2 pm plasmid.

Ovennævnte stammer udviser forstærket ADH Il-aktivitet og er egnede til 25 transformation med en ekspressionskassette for heterologt protein under styring af en ADH2-reguleringssekvens, navnlig ekspressionskassetter på en integrationsvektor. Alternativt kan sådanne ekspressionskassetter indsættes i et hvilket som helst passende resktriktionssted i pJS119, og den resulterende vektor kan anvendes til at transformere en passende gærstamme.

30 II.

I DK 175898 B1 I

I 16 I

I I dette eksempel beskrives konstruktionen af en integrationsvektor, der inde- I

I holder en ekspressionskassette for ADR I og transformationen af gærstam- I

I mer dermed. Integrationsplasmidet, pDM15, er vist i figur 3 og konstruktionen I

I 5 er vist i flowdiagrammet i figur 1. I

I Plasmid pJS132 er et plasmid, der indeholder pBR322-sekvenser, og et gen, I

der koder for G418 resistens i gær under kontrol af Kluyveromvces lactis I

I ADH1 -promotor- og termineringssekvenser. Dette plasmid skæres med Smal I

I 10 og Sall, og det store lineære fragment oprenses. I

Plasmid pJS119 blev skåret med Pstl, der skærer ved et sted nedenstrøms I

fra 3-enden af den kodende sekvens for ADR I. det skårede plasmid blev I

I herefter behandlet med enkeltstrenget-specifik S1-nuklease til frembringelse I

I 15 af stumpe ender og herefter skåret med Sall til tilvejebringelse af et 6,2 kb I

I fragment, der indeholder ADR I ekspressionskassetten. Der blev udført phe- I

I nolekstraktion og ethanolpræcipitation mellem hvert successivt trin. Frag- I

I mentet med Sall-stumpe ender blev herefter ligeret til dét større pJS132- I

I fragment til frembringelse af plasmid pDM15. I

I 20 I

I Plasmid pDM15 blev herefter anvendt til frembringelse af saccaromyces- I

I stammer, der overproducerer ADR I, ved at transformere gær under anven- I

I delse af standardprocedurer. F.eks. blev stamme AB110 transformeret til I

I G418 resistens og en stamme, der udviser ADR I overproduktion, blev isole- I

25 ret. Denne stamme fik betegnelsen JSC300. En anden ADR I overproduce- I

rende stamme, JSC302, blev fremstillet på lignende måde fra stamme I

I BJ2168 (Yeast Genetic Center, ovenfor), der var befriet for det residerende I

plasmid. Endnu en anden ADR I overproducerende stamme er JSC308. I

III.

DK 175898 B1 17 I følgende eksempel demonstreres anvendeligheden af gærstammer med forstærket produktion af ADR I som ekspressionsværter for heterologe prote-5 iner.

Gærstamme JC300 blev transformeret med ekspressionsvektorer for et su-peroxiddismutase (SOD)/insulinlignende vækstfaktor II- (IGF II) -fusionsprotein og for basisk humanfibroblastvækstfaktor (engelsk: basic human fi-10 broblast growth factor) (hFGF).

SOD/IGF Il-ekspressionsvektoren, pYLUIGF2-14, er beskrevet i EPO publikation nr. 196.056. Den er også deponeret under ATCC dep. nr. 20745 (27. februar 1985).

15

Ekspressionsvektoren for basisk hFGF, pA/G-hFGF, blev fremstillet som følger. Først blev et syntetisk hFGF-gen fremstillet ved standardmetoder og det havde følgende sekvens:

20 CATGGCCGCCGGGAGCATCACCACGCTGCCAGCCCTGCCGGAGGACGGGGGCAGCGGCGC CTTCCCCCCAGGCCATTTCAAGGACCCAAAGAGACTGTACTGTAAGAACGGCGGGTTCTT CCTGAGAATCCATCCCGACGGCAGGGTCGATGGCGTGAGAGAGAAGAGCGACCCTCATAT CAAGCTTCAGCTGCAGGCCGAGGAGAGGGGCGTGGTCTCCATCAAGGGCGTCTGTGCCAA CAGGTACCTGGCCATGAAGGAGGACGGCAGGCTGCTGGCCTCCAAGTGTGTCACCGACGA 25 GTGTTTCTTCTTCGAGAGGCTGGAGTCCAACAACTACAACACCTACCGGTCAAGGAAATA CACCAGCTGGTACGTCGCCCTGAAGAGGACCGGCCAGTACAAGCTGGGATCCAAAACAGG ACCTGGGCAGAAGGCCATCCTGTTCCTGCCCATGTCCGCCAAGTCCTAATAGTCGAC

Plasmid pBS100 (EPO publikationsnr. 181.150] indeholder ADH2/GAPD-30 hybridpromotorkassette. Den syntetiske hFGF-sekvens blev geloprenset og klonet ind i Ncol/Sall-fordøjet pBS100 for at placere hFGF-sekvensen i kassetten. Kassetten blev skåret fra pBS100/FGF-plasmidet med BamHI og her- I DK 175898 B1 I 18

I efter klonet til BamHI-stedet i gasrfærgevektor pAB24. Se EPO ansøgning nr. I

I 88312306.9 og japansk ansøgning nr. 63-335685. Den resulterende vektor I

I blev kaldt pA/G-hFGF.

I 5 Ekspressionskassetteme ovenfor indeholdt et UAS fra ADH2-genet. Stam- I

I meme blev dyrket efter transformation og det heterologe protein genvandtes I

I ved standardprocedurer. Isoleret protein analyseredes ved SDS-polyacryl- I

I amidgelelektroforese. Ekspressionen af SOD/IGF Il-fusionen og hFGF i I stammerne AB110 (kontrol) og JCS300 viste, at der var en forøgelse af ud- I 10 byttet af ikke-gærprotein, når JCS300 blev anvendt som værten.

I Yderligere eksempler på højudbytteekspression omfatter polypeptider fra det I humane immundefektvirus (HIV) type 1. F.eks. kan et polypeptid, der svarer I til carboxyterminalhalvdelen af HIV gp120env udtrykkes i høje niveauer. Ek- I 15 sempler på egnede ekspressionsvektorer kan findes i EPO publikation nr.

H 181.150 og japansk patent ansøgning nr. 60-246102. En deri beskrevet spe- I cielt foretrukket vektor er pBS24/SOD-SF2env4.

Deponering af biologisk materiale I 20 H Prøver af følgende stammer og plasmider blev deponeret i "The American I Type Culture Collection" (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Mary- land, USA og vil blive vedligeholdt under bestemmelserne i Budapest Trakta- H ten. Deponeringsnumrene og datoerne for disse deponeringer er opført ne- 25 denfor.

Deponeret materiale ATCC dep. nr. Pep, dato S. cerevisiae JSC300 20878 5. maj 1988 S. cerevisiae JSC308 20879 5. maj 1988 30 pDM15 DNA 40453 5. maj 1988 pJS119 DNA 40454 5. maj 1988 ' DK 175898 B1 19

Disse deponeringer er tilvejebragt til udnyttelse af fagfolk. Disse deponeringer er hverken en indrømmelse af, at sådanne deponeringer er nødvendige til udførelse af den foreliggende opfindelse eller af, at tilsvarende udførelses-former ikke ligger inden for fagfolks kunnen med henblik på den foreliggende 5 beskrivelse. Disse deponeringers offentlige tilgængelighed er ikke en licensbevilling til at fremstille, anvende eller sælge de deponerede materialer under dette eller et hvilket som helst andet patent. De deponerede materialers nu-kleinsyresekvenser medtages i foreliggende beskrivelse ved henvisning og kontrollerer, hvis der er konflikt med en hvilken som helst af de heri beskrev-10 ne sekvenser.

Selv om den foregående opfindelse er blevet detaljeret beskrevet ved hjælp af illustration og eksempler til klarheds- og forståelsesformål, er det åbenbart, at ændringer og modifikationer kan udføres inden for de vedhæftede kravs 15 rammer.

Claims

20 I DK 175898 B1 I Patentkrav I
1. Fremgangsmåde til ekspression af ikke-gærprotein i en gærvært, k e η - I de tegnet ved, at fremgangsmåden omfatter: I (a) tilvejebringelse af en gærvært transformeret med: (i) en ekspressionskassette for ikke-gærproteinet, hvilken eks- I pressionskassette omfatter en kodende DNA-sekvens for ikke- I gærproteinet under styring af gær-genkendte transskriptionsini- I 10 tierings- og -termineringssekvenser, som er funktionelle i gær- I værten, hvilken transskriptionsinitieringssekvens yderligere om- I fatter et opstrøms gær ADH2 aktiveringssted og en gærpromo- I tor som er heterolog med opstrøms ADH2 aktiveringsstedet; og I (ii) en ekspressionskassette som er heterolog med gærværten for I
15 ADR-I, hvilken ekspressionskassette omfatter en kodende I DNA-sekvens for ADR-I under styringen af gær-genkendte I transskriptionsinitierings- og -termineringssekvenser, der er I funktionelle i gærværten; I 20 (b) dyrkning af en klonpopulation af den transformerede gærvært under I betingelser, ved hvilken ikke-gærproteinet og ADR-I udtrykkes; og I (c) indvinding af ikke-gærproteinet fra klonpopulationen. I
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at gærpromotoren I er en GAPD-promotor. I
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at ADR-I- I ekspressionskassetten omfatter en ikke-ADR1-promotor. I
30 I DK 175898 B1 j
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, k e n d e t e g n e t ved, at ikke-ADR1-promotoren er GAPD-promotoren.
5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 4, kendetegnet ved, 5 at ADR-I ekspressionskassetten opretholdes på en ekstrakromosomal vektor.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den ekstrakro-mosomale vektor er et højkopitals-plasmid.
7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 4, k e n d e t e g n e t ved, at ADR-l-ekspressionskassetten er integreret i gærværtens genom.
8. Transformeret gærvært, kendetegnet ved, at den omfatter: 15 (a)en ekspressionskassette, der omfatter en kodende DNA-sekvens for et ikke-gærprotein under styringen af gær-genkendte transskriptionsinitierings- og -termineringssekvenser, som er funktionelle i gærværten, hvilken transskriptionsinitieringssekvens omfatter et opstrøms gær-ADH2 aktiveringssted og en gærpromotor som er heterolog med 20 opstrøms ADH2 aktiveringsstedet; og (b) en ekspressionskassette som er heterolog med gærværten for ADR I, der omfatter en kodende DNA-sekvens for ADR I under styring af gærgenkendte transskriptionsinitierings- og -termineringssekvenser, som 25 er funktionelle i gærværten.
9. Gær ifølge krav 8, kendetegnet ved, at gær-promotoren som er heterolog med opstrøms gær-ADH2 aktiveringsstedet omfatter en gær-GAPD-promotor. 30 I DK 175898 B1 I I 22 I
10. Gær ifølge krav 12 eller 13, kendetegnet ved, at ikke- I I gærproteinekspressionskassetten opretholdes i gæret på en ekstrakromo- I somal vektor. I I 5 11. Gær ifølge ethvert af kravene 8 til 10, kendetegnet ved, at ADR-I- I I ekspressionskassetten er integreret i gærens genom. I I 12. Gær ifølge krav 11, kendetegnet ved, at ADR-I- I ekspressionskassetten omfatter en GAPD-promotor. I I 10 I I 13. Gær ifølge krav 8, kendetegnet ved, at ADR-I- I I ekspressionskassetten er integreret i gærens genom, at transskriptionsinitie- I ringssekvensen deri er en ikke-ADR1, stærk gærpromotor, og at ikke- I I gærproteinekspressionskassetten opretholdes på en ekstrakromosomal vek- I I 15 tor. I
14. Anvendelsen af en transformeret gær omfattende en ekspressionskas- I I sette integreret i genomet som indeholder en kodende sekvens for ADR-I I I under styringen af gær-genkendte transskriptionsinitierings- og - I I 20 termineringssekvenser, hvilken transskriptionsinitieringssekvens ikke er en I I ADR1-promotor, til fremstillingen af en transformeret gærvært som defineret i I I ethvert af kravene 8 til 13. I