DE102005029170A1

DE102005029170A1 - System zur Genexpression in Hefen der Gattung Sporidiobolus

Info

Publication number: DE102005029170A1
Application number: DE102005029170A
Authority: DE
Inventors: Rupert Dr. Dipl.-Chem. Pfaller
Original assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Current assignee: Wacker Chemie AG
Priority date: 2005-06-23
Filing date: 2005-06-23
Publication date: 2006-12-28
Also published as: WO2006136311A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung umfasst ein Expressionssystem, bestehend aus einem Wirtsorganismus der Gattung Sporidiobolus und einem DNS-Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Vektor ein Selektionsmarkergen enthält, welches für ein Protein kodiert, das nach Transformation des Wirtsorganismus eine Selektion positiver Transformanten erlaubt und ausgewählt ist aus der Gruppe der Antibiotikaresistenzgene, der Gene, die eine Auxotrophie des Wirtsorganismus komplementieren, und der Gene, die für ein Protein kodieren, die zu einer farbgebenden Reaktion befähigt sind, wobei die Expression des Selektionsmarkergens durch mindestens ein im Wirtsorganismus aktives genetisches Regulationselement kontrolliert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein System zur Genexpression in Hefen der Gattung Sporidiobolus, seine Herstellung und seine Verwendung.
Zur Genexpression sind verschiedene prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme bekannt. Diese Systeme zur Genexpression sind dadurch charakterisiert, dass sie zum einen dazu verwendet können, einzelne Proteine in wirtschaftlicher Weise zu produzieren. Weiterhin können solche Expressionssysteme auch dazu verwendet werden, Proteine eines Stoffwechselweges vermehrt zu produzieren und dadurch erhöhte Ausbeuten des Produktes aus dem Stoffwechselweg zu erzielen (bezeichnet als sog. „Metabolic Engineering"). Beim „Metabolic Engineering" wird häufig ein Mikroorganismus ausgewählt, der natürlicherweise bereits relativ hohe Mengen eines wirtschaftlich wertvollen Stoffwechselproduktes produziert und es wird ein genetisches Expressionssystem entwickelt, mit dem einzelne oder mehrere Proteine des gewünschten Stoffwechselweges überproduziert werden und auf diese Weise die Ausbeute des gewünschten Produktes gezielt verbessert wird.
Stämme der Art Sporidiobolus ruineniae sind bekannt dafür, dass sie in der Lage sind, natürlicherweise große Mengen des wirtschaftlich wertvollen Naturstoffs Coenzym Q10 (auch Ubichinon genannt, in der Folge als Q10 bezeichnet) zu produzieren (siehe z. B. US 4070244 , EP 1469078 A ). Jedoch sind die erzielten Q10 Ausbeuten für eine industrielle Nutzung noch zu niedrig.
Eine Möglichkeit, die Q10 Ausbeuten zu erhöhen, bietet ein „Metabolic Engineering" von Stämmen der Gattung Sporidiobolus. Voraussetzung dafür ist jedoch ein genetisches Expressionssystem, mit dem gezielt in den Q10 Biosyntheseweg von Sporidiobolus eingegriffen werden kann.
Hefen der Gattung Sporidiobolus gehören zu den höher entwickelten Pilzen aus der Klasse der Basidiomyceten. Das erfindungsgemäße Sporidiobolus Expressionssystem eignet sich daher neben dem „Metabolic Engineering" auch zur Produktion von Proteinen, die mit anderen Expressionssystemen nicht oder nur mit schlechten Ausbeuten produziert werden können.
Beispiele dafür sind bekannte prokaryontische Expressionssysteme, wie z. B. Escherichia coli und Bacillus subtilis. Die Methoden zur genetischen Manipulation dieser Organismen sind wohl etabliert. Spezifische Nachteile dieser Expressionssysteme sind jedoch die oft enttäuschend niedrigen Produktionsraten von vor allem eukaryontischen Proteinen, die Faltung der produzierten Proteine derart, dass sie nicht in aktiver Form vorliegen sowie vor allem auch das Fehlen der posttranslationalen Modifikation der exprimierten Proteine. Als fehlende posttranslationale Modifikation seien beispielsweise der fehlende Einbau prosthetischer Gruppen oder die fehlende Glykosilierung des zu exprimierenden Proteins genannt.
Diese Nachteile prokaryontischer Expressionssysteme können durch Verwendung eukaryontischer Expressionssysteme umgangen werden. Zu den eukaryontischen Expressionssystemen mit breiter Anwendung gehören Zellkultursysteme sowohl von Säugerzellen wie auch Insektenzellen sowie eukaryontische Mikroorganismen wie Hefen oder filamentöse Pilze. Während bei diesen Expressionssystemen das zu exprimierende Protein in der Regel in aktiver Form gebildet wird, ist die Produktionsrate vor allem bei der Expression heterologer Proteine in vielen Fällen zu niedrig. Als Beispiel hierfür kann die Expression in den Hefen Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris dienen, bzw. bei filamentösen Pilzen der Gattung Aspergillus. Filamentöse Pilze bereiten dazu oft Probleme bei der fermentativen Proteinproduktion.
Aus den genannten Gründen eignen sich die etablierten prokaryontischen und eukaryontischen Expressionssysteme oft nicht zur gentechnischen Optimierung eines Stoffwechselweges. Speziell, was die Produktion von Q10 betrifft, wird dieses Ubichinon z. B. in E. coli, Bäckerhefe, Pichia pastoris oder Bacillus nicht in der richtigen Form produziert, so dass eine gentechnische Optimierung mit großem Aufwand verbunden ist, da erst der Stoffwechselweg zum Q10 etabliert werden muss.
Basidiomycete Hefen der Gattung Sporidiobolus wurden schon früh als gute Produzenten von Q10 beschrieben ( US 4070244 ). Von einer technischen Nutzung wurde dagegen nicht berichtet. EP 1469078 (entspricht der US Anmeldung mit der Serial Number 10/803841) offenbart ein Verfahren zur Verbesserung der Q10-Produktion in Sporidiobolus durch klassische Stammoptimierung mittels Mutagenese und Selektion und anschließende Fermentation. Speziell die dort berichtet guten Fermentationseigenschaften machen S. ruineniae nicht nur zu einem interessanten Wirtsorganismus für die Q10-Produktion, sondern generell für das „Metabolic Engineering" und auch für die rekombinante Proteinexpression.
Über gentechnische Arbeiten mit Pilzen und Hefen aus der Klasse der Basidiomyceten ist nur wenig bekannt. Für ein Sporidiobolus Expressionssystem liefert der Stand der Technik keine Anleitung zum technischen Handeln. Wery et al. (Biotechnology Techniques (1998) 12, 399–405) z. B. berichten über ein Expressionssystem für die Hefe Phaffia rhodozyma (synonym auch als Xanthophyllomyces dendrorhous bezeichnet), die zur mikrobiellen Produktion von Astaxanthin (einem Carotin) diskutiert wird. Dort werden zur Selektion von Transformanten geeignete DNS-Vektoren beschrieben. Es werden vergleichsweise hohe Transformationsraten von > 1000 Transformanten/μg Vektor-DNS erzielt. Der Nutzen des Phaffia Expressionssystems zur Optimierung der Astaxanthinproduktion ist jedoch bisher gering. Nachteil des P. rhodozyma Expressionssystems ist auch, dass die Fermentation bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen von 20°C durchgeführt werden muss, was die technische Umsetzung erschwert.
Für verschiedene filamentöse Pilze aus der Klasse der Basidiomyceten wurden ebenfalls DNS-Vektoren beschrieben, die zur Transformation und Selektion von Transformanten geeignet sind. EP 1066393 z. B. beschreibt ein Verfahren zur Transformation von Trametes versicolor und die Verwendung dieses Expressionssystems für die Produktion des Enzyms Laccase für technische Anwendungen.
Für Phanerochaete chrysosporium wurde ebenfalls ein Verfahren zur genetischen Transformation beschrieben (M. Alic et al. (1991) Curr. Genet. 19, 491–494), ebenso für Pleurotus ostreatus (K. Yanai et al. (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60, 472–475). US 5362640 beschreibt DNS-Vektoren für die Transformation des Basidiomyceten Coriolus hirsutus.
Die auf filamentösen Pilzen basierenden Expressionssysteme sind üblicherweise durch eine nur geringe Transformationsrate charakterisiert. Außerdem ist das Transformationsverfahren sehr aufwändig. Diese Expressionssysteme haben außerdem den Nachteil, dass die Fermentation im technischen Maßstab oft schwierig ist wegen des filamentösen Zellwachstums und hoher Viskosität der fermentierten Biomasse.
Aus dem vorliegenden Stand der Technik konnte also eine Anleitung für ein Expressionssystem von Hefen der Gattung Sporidiobolus nicht abgeleitet werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Expressionssystem für Hefen der Gattung Sporidiobolus zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, das erfindungsgemäße Expressionssystem durch „Metabolic Engineering" gezielt für die Produktion des wirtschaftlich wertvollen Stoffwechselproduktes Coenzym Q10 zu verbessern.
Die erstgenannte Aufgabe wird gelöst durch ein Expressionssystem bestehend aus einem Wirtsorganismus der Gattung Sporidio bolus und einem DNS-Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Vektor ein Selektionsmarkergen enthält, welches für ein Protein kodiert das nach Transformation des Wirtsorganismus eine Selektion positiver Transformanten erlaubt und ausgewählt ist aus der Gruppe der Antibiotikaresistenzgene, der Gene, die eine Auxotrophie des Wirtsorganismus komplementieren und der Gene, die für ein Protein kodieren, die zu einer farbgebenden Reaktion befähigt sind, wobei die Expression des Selektionsmarkergens durch mindestens ein im Wirtsorganismus aktives genetisches Regulationselement kontrolliert wird.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung enthält der DNS-Vektor ein Selektionsmarkergen ausgewählt aus der Gruppe der Antibiotikaresistenzgene.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung enthält der DNS-Vektor neben dem Selektionsmarkergen auch mindestens ein Gen, welches für ein zu produzierendes Protein kodiert, wobei die Expression dieses Gens durch mindestens ein im Wirtsorganismus aktives genetisches Regulationselement kontrolliert wird.
Dabei kann der DNS-Vektor gleichzeitig ein Selektionsmarkergen und das Gen enthalten, welches für das zu produzierende Protein kodiert. Diese beiden Gene können auch auf verschiedenen DNS-Vektoren vorhanden sein. In diesem Fall werden beide Vektoren gleichzeitig transformiert (Co-Transformation).
Für das erfindungsgemäße Expressionssystem bevorzugte Wirtsorganismen sind Stämme der Gattung Sporidiobolus, besonders bevorzugt der Art Sporidiobolus ruineniae.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Expressionssystem dadurch gekennzeichnet, dass der Wirtsorganismus sensitiv gegen ein Antibiotikum ist und in dessen Gegenwart nicht mehr zum Wachstum befähigt ist und das Selektionsmarkergen derart ausgewählt ist, dass dessen Expression nach Transformation des Wirtsorganismus eine Resistenz gegen das Antibiotikum bewirkt und das Wachstum unter selektiven Bedingungen ermöglicht.
Bevorzugt geeignet sind Antibiotikaresistenzgene, die Resistenz verleihen gegen ein Antibiotikum ausgewählt aus der Gruppe Hygromycin, G418, Geneticin^®, Glyphosat, Cycloheximid, Bialaphos, Kanamycin, Bleomycin, Oligomycin, Zeocin^TM, Benomyl, Nystatin und Phleomycin.
Besonders bevorzugt geeignet sind Antibiotikarestistenzgene, die Resistenz gegen ein Antibiotikum ausgewählt aus der Gruppe Hygromycin, G418, Geneticin^®, Glyphosat, Bialaphos oder Cycloheximid verleihen.
Insbesonders bevorzugt sind Antibiotikaresistenzgene gegen Hygromycin, G418, Geneticin^®, Glyphosat und Bialaphos.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Expressionssystem dadurch gekennzeichnet, dass der Wirtsorganismus ausgewählt aus der Gattung Sporidiobolus, einen genetischen Defekt im Stoffwechselmetabolismus (Auxotrophie) besitzt, aufgrund dessen einer oder mehrere für das Wachstum essentielle Stoffwechselmetaboliten nicht mehr synthetisiert werden können und der Wirtsorganismus auf Minimalmedien ohne Zusatz dieses oder dieser Stoffwechselmetaboliten nicht mehr zum Wachstum befähigt ist und das Selektionsmarkergen derart ausgewählt ist, dass es den auxotrophen Gendefekt des Wirtsorganismus komplementiert.
Beispiele für Selektionsmarkergene, die einen auxotrophen Gendefekt im Wirtsorganismus komplementieren können, sind das pyrG-Gen (kodiert für das Enzym Orotidin-5'-Phosphat Decarboxylase, Goosen et al., Curr. Genet. (1987) 11: 499–503), das pyrF-Gen (kodiert für das Enzym Orotsäure-Phosphoribosyltransferase, DE 199 34 408 ), das OCT-Gen (kodiert für das Enzym Ornithin-Carbamoyltransferase, US 5362640 ) oder das trpC Gen (ein Gen, dessen trifunktionales Genprodukt Enzymaktivität für Phosphoribosyl-Anthranilsäureisomerase, Glutamin-Amidotransferase und Indol-Glycerinphosphatsynthase besitzt, Yelton et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 1470–1474).
Weiterhin sind auch Selektionsmarkergene geeignet, die für Proteine kodieren, die zu einer farbgebenden Reaktion befähigt sind, z. B. das Glucuronidasegen, das Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP) (einschließlich der davon abgeleiteten genetischen Varianten) oder das Gen einer Laccase.
Bevorzugt ist ein Expressionssystem, bei dem ein Selektionsmarkergen aus der Gruppe der Antibiotikaresistenzgene verwendet wird.
Die Erfindung betrifft auch DNS Vektoren, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen Expressionssystems geeignet sind. Ein solcher DNS-Vektor ist dadurch gekennzeichnet, dass er das Selektionsmarkergen, bevorzugt aus der Gruppe der Antibiotikaresistenzgene, enthält.
Insbesonders für das erfindungsgemäße Expressionssystem geeignete Selektionsmarkergene sind die Resistenzgene für folgende Antibiotika:

G418, bzw. Geneticin^®: Das Kanamycin (G418)-Resistenzgen aus dem E. coli Transposon Tn903 (Webster and Dickson, Gene (1983) 26: 243–252).
Hygromycin: Das Hygromycin B Phosphotransferasegen aus E. coli (Gritz and Davis, Gene (1983) 25: 179–188) oder aus Streptomyces hygroscopicus (Malpartida et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 117: 6–12).
Glyphosat: Das 5-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphatsynthasegen (EPSP) aus E. coli(Kunze et al., Curr. Genet. (1989) 15: 91–98). Es ist jedoch auch jedes andere EPSP-Gen geeignet, bzw. mutierte EPSP-Gene mit erhöhter Resistenz gegen Glyphosat.
Bialaphos: Das Bialaphos Resistenzgen (Bar-Gen) aus Streptomyces hygroscopicus (Avalos et al., Curr. Genet. (1989) 16: 369–372).

Der erfindungsgemäße DNS-Vektor zur Expression des Selektionsmarkergens, ausgewählt aus der Gruppe der Antibiotikaresistenzgene, enthält außerdem ein Promotor- und Terminatorelement, jeweils funktional verknüpft mit dem Selektionsmarkergen, um dessen Expression im Wirtsorganismus zu gewährleisten.
Für die Expression des Selektionsmarkergens geeignet sind die Promotor- und Terminatorelemente für das Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenasegen (GAPDH Gen) beispielsweise aus Hefen oder filamentösen Pilzen aus der Klasse der Basidiomyceten. Das GAPDH Gen kann dabei homolog aus einer Hefe der Gattung Sporidiobolus oder heterolog aus einer Hefe oder einem Pilz aus der Klasse der Basidiomyceten sein, z. B. aus Phaffia rhodozyma, Ustilago maydis, Schizophyllum commune, Trametes versicolor, Agaricus bisporus oder Phanerochaete chrysosporium. Es eignen sich jedoch auch alle anderen in Sporidiobolus aktiven Promotor- und Terminatorelemente zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNS-Vektoren.
Besonders geeignet sind Promotor- und Terminatorelemente des GAPDH Gens aus Sporidiobolus ruineniae, gekennzeichnet durch die Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, sowie des GAPDH Gens aus Phaffia rhodozyma. Die Promotorstrukturen für das Phaffia rhodozyma GAPDH Gen sind offenbart in Verdoes et al., Yeast (1997) 13: 1231–1242. Dabei zeigt ein Vergleich der Transformationsraten (in den Beispielen beschrieben), dass die homologen Expressionssignale des Sporidiobolus GAPDH-Gens den heterologen Expressionssignale des P. rhodozyma GAPDH-Gens deutlich überlegen sind.
Insbesondere geeignet sind Promotor- und Terminatorelemente des GAPDH Gens aus Sporidiobolus ruineniae, gekennzeichnet durch die Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2.
Die Erfindung betrifft somit auch die Promotor- und Terminatorelemente des Sporidiobolus GAPDH-Gens, offenbart für den GAPDH-Klon gap5 in SEQ ID NO: 1, bp 1–1050 (Promotor), bzw. bp 2997–3500 (Terminator) sowie für den GAPDH-Klon 18 in SEQ ID NO: 2, bp 1–790 (Promotor) und davon durch Verlängerung, Verkürzung oder Veränderung abgeleitete DNS-Sequenzen, die in Sporidiobolus als Promotor oder Terminator aktiv sein können.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Promotor- und Terminatorelemente des Sporidiobolus GAPDH-Gens, offenbart für den GAPDH-Klon gap5 in SEQ ID NO: 1, bp 1–1050 (Promotor), bzw. bp 2997–3500 (Terminator) sowie für den GAPDH-Klon 18 in SEQ ID NO: 2, bp 1–790 (Promotor).
Die Erfindung betrifft weiterhin einen DNS-Vektor, der mindestens ein Selektionsmarkergen enthält, welches für ein Protein kodiert, das nach Transformation einer Hefe der Gattung Sporidiobolus eine Selektion positiver Transformanten erlaubt, dadurch gekennzeichnet, dass das Selektionsmarkergen ausgewählt ist aus der Gruppe der Antibiotikaresistenzgene, die für Proteine kodieren, die die wachstumshemmende Wirkung von Antibiotika aufheben, gegen die der Wirtsorganismus nicht resistent ist, der Gene, die einen genetischen Defekt des Wirtsorganismus (Auxotrophie) komplementieren und der Gene, die für Proteine kodieren, die zu einer farbgebenden Reaktion befähigt sind, und dass das Selektionsmarkergen durch mindestens ein im Wirtsorganismus aktives genetisches Regulationselement kontrolliert wird.
In einer bevorzugten Ausführung erlauben die erfindungsgemäßen DNS-Vektoren die Selektion positiver Transformanten von Hefen der Gattung Sporidiobolus aufgrund der nach der Transformation erworbenen Antibiotikaresistenz im Wirtsorganismus.
Insbesondere bevorzugt wird die Selektion von Transformanten der Hefe Sporidiobolus ruineniae durch erfindungsgemäße DNS-Vektoren ermöglicht, welche die als bevorzugt geeignet genannten Antibiotikaresistenzgene enthalten.
Ein erfindungsgemäßer DNS-Vektor eignet sich insbesondere zur Expression von Genen, die für Proteine kodieren, in einem Wirtsorganismus der Gattung Sporidiobolus. Unter Genen, die für Proteine kodieren, sind im Sinne der Erfindung auch die von den Strukturgenen abgeleiteten cDNS-Gene der Proteine, sowie mutierte Gene zu verstehen. Bei den Proteinen kann es sich um für den Wirtsorganismus heterologe Proteine oder um für den Wirtsorganismus homologe Proteine handeln, die darüberhinaus entweder intrazellulär oder extrazellulär (sekretierte Proteine) vorliegen können.
Der erfindungsgemäße DNS-Vektor enthält somit vorzugsweise auch mindestens ein zu exprimierendes Gen, das für ein Protein kodiert.
Das zu exprimierende Gen kann jedes für eine technische oder pharmazeutische Anwendung zu verwendende Protein sein oder aber auch ein Enzym aus einem biosynthetischen Stoffwechselweg. Dabei kann der biosynthetische Stoffwechselweg bereits im Wirtsorganismus angelegt sein und das zu exprimierende Gen verändert die Produktionsleistung (Ausbeute) für das gewünschte Stoffwechselprodukt, oder aber durch das zu exprimierende Gen wird ein neuer Stoffwechselweg angelegt, wodurch der rekombinante Wirtsorganismus ein neues Stoffwechselprodukt herstellt.
In einer bevorzugten Ausführung handelt es sich bei dem zu exprimierenden Gen um ein Gen aus dem Q10-Biosyntheseweg. Einen Überblick über die bekannten Q10-Biosynthesegene gibt Meganathan, FEMS Microbiol Lett. (2001) 203: 131–139. Die Q10-Biosynthesegene können dabei homolog aus Sporidiobolus stammen oder heterolog aus einem anderen Organismus. Beispiele für Gene aus dem Q10-Biosyntheseweg sind die Gene für die Hydroxymethyl-Glutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA Reduktase), Farnesylpyrophosphatsynthase, Dekaprenylpyrophosphatsynthase oder p-Hydroxybenzoesäure-Dekaprenylpyrophosphattransferase. Die erfindungsgemäßen Gene des Q10-Biosyntheseweges sind jedoch nicht nur auf diese Beispiele beschränkt.
Insbesondere bevorzugt handelt es sich bei diesen Genen um homologe Gene aus dem Q10-Biosyntheseweg von Sporidiobolus ruineniae.
Für die Expression im Wirtsorganismus wird das proteinkodierende Gen funktional mit genetischen Regulationselementen wie einem Promotor oder einem Terminator verknüpft.
Der Promotor kann von dem zu exprimierenden Gen stammen oder es kann auch der Promotor eines fremden Gens, mit dem kodierenden Bereich des zu exprimierenden Gens funktionell verknüpft, verwendet werden.
Der erfindungsgemäße DNS-Vektor enthält somit vorzugsweise auch einen Promotor für die Expression des proteinkodierenden Gens.
Bevorzugt enthält der erfindungsgemäße DNS-Vektor als Promotor für die Expression des proteinkodierenden Gens einen Promotor, der eine hohe Expressionsleistung gewährleistet.
Ein zu diesem Zweck besonders bevorzugt verwendeter Promotor ist der Promotor des Gens für das GAPDH-Gen, und hier insbesondere bevorzugt der GAPDH-Promotor aus Sporidiobolus ruineniae (SEQ ID NO: 1, bp 1–1050 und SEQ ID NO: 2, bp 1–790).
Der erfindungsgemäße DNS-Vektor enthält vorzugsweise auch einen Transkriptionsterminator für das proteinkodierende Gen.
Als Transkriptionsterminator kann der Terminator des zu exprimierenden proteinkodierenden Gens verwendet werden oder aber der Terminator eines fremden Gens. Bevorzugt wird der Transkriptionsterminator aus einem GAPDH-Gen, insbesondere des GAPDH-Gens aus Sporidiobolus ruineniae (SEQ ID NO: 1, bp 2997–3500).
In einer besonders bevorzugten Ausführung verwendet man den Promotor des GAPDH-Gens, speziell des GAPDH-Gens aus Sporidio bolus ruineniae (SEQ ID NO: 1, bp 1–1050 oder SEQ ID NO: 2, bp 1–790) und davon durch Verlängerung, Verkürzung oder Veränderung abgeleitete DNS-Sequenzen, die in Sporidiobolus als Promotor aktiv sein können. Die Isolierung des Sporidiobolus GAPDH-Gens wird im 4. Beispiel beschrieben.
Die Erfindung betrifft somit auch ein in Sporidiobolus aktives Regulationselement, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es den in SEQ ID NO: 1 enthaltenen Sequenzabschnitt von Base 1–1050, bzw. den in SEQ ID NO: 2 enthaltenen Sequenzabschnitt von Base 1–790 und davon durch Verlängerung, Verkürzung oder Veränderung abgeleitete DNS-Sequenzen enthält, die in Sporidiobolus als Promotor aktiv sein können.
Ein Beispiel dafür ist der im 5. Beispiel verwendete GAPDH-Promotor aus Phaffia rhodozyma (Gendatenbank Zugangsnummer „PRGPDGENE.gb_pl, bp 1–717), der zum in SEQ ID NO: 1 enthaltenen Sequenzabschnitt von Base 1–1050 zu 37 % identisch ist, bzw. zu dem in SEQ ID NO: 2 enthaltenen Sequenzabschnitt von Base 1–790 zu 35 % identisch ist und als heterologer Promotor zur Regulierung der Genexpression in S. ruineniae geeignet ist.
Zur Analyse von DNS-Sequenzen wurde dabei das Computerprogramm "Wisconsin Package Version 10.3, Accelrys Inc." verwendet. Die Homologiebestimmung erfolgte durch Vergleich der DNS-Sequenzen mit dem Unterprogramm "Gap". Hierbei werden die voreingestellten Parameter "gap creation penalty 50" und "gap extension penalty 3" verwendet.
Ein DNS-Vektor zur Transformation von Sporidiobolus enthält kein genetisches Element, das dessen autonome Replikation im Wirtsorganismus gewährleistet. Daher muss der DNS-Vektor nach Transformation in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Die Integration in das Wirtsgenom kann ungerichtet durch zufällige Rekombination oder aber gerichtet durch homologe Rekombination erfolgen.
Als Integrationsort für die homologe Rekombination eignet sich der Genbereich der sog. rDNS, der für ribosomale RNS kodiert und von dem im Genom des Wirtsorganismus ca. 100 Kopien enthalten sind. Aus kurzen, publizierten Sequenzen für Abschnitte der rDNS von S. ruineniae wurde ein rDNS-Fragment für die homologe Rekombination isoliert (SEQ ID NO: 3). Die Isolierung eines Sporidiobolus rDNS-Fragments wird im 2. Beispiel beschrieben.
Ein erfindungsgemäßer DNS-Vektor enthält somit vorzugsweise auch ein rDNS Fragment aus S. ruineniae (SEQ ID NO: 3).
Die Herstellung der erfindungsgemäßen DNS-Vektoren erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren. Verschiedene Möglichkeiten sind in den Beispielen dargelegt. Die dort beschriebenen Verfahren lassen sich vom Fachmann auf beliebige andere Vektoren, Resistenzgene, Regulationselemente und Strukturgene anwenden.
Die erfindungsgemäßen DNS-Vektoren eignen sich zur Herstellung von Sporidiobolus Stämmen, die zur effizienten Genexpression befähigt sind.
Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung von Sporidiobolus Stämmen, die zur effizienten Genexpression befähigt sind.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass als Wirtsorganismus eine Hefe der Gattung Sporidiobolus verwendet wird, welche mit einem DNS-Vektor, der ein zu exprimierendes Gen und ein Antibiotika Resistenzgen besitzt, transformiert wird und aus dem Transformationsansatz die mit dem DNS-Vektor transformierten Klone durch Selektion Antibiotika resistenter Transformanten ausgewählt werden, wobei die Expression des zu exprimierenden Gens und des Antibiotika Resistenzgens im Wirtsstamm jeweils durch ein genetisches Regulationselement kontrolliert wird, das im Wirtsstamm aktiv ist.
Das zu transformierende Gen kann aber auch in einen Expressionsvektor ohne Selektionsmarkergen kloniert werden und zusammen mit einem das Selektionsmarkergen exprimierenden Vektor zur Erzeugung von Transformanten verwendet werden (Co-Transformation).
Das zu transformierende Gen wird in bekannter Art und Weise in einen erfindungsgemäßen DNS-Vektor kloniert und mittels der genannten Methoden in eine Hefe der Gattung Sporidiobolus eingebracht.
Bei dem betreffenden Hefestamm aus der Gattung Sporidiobolus kann es sich dabei um einen monokaryontischen oder aber auch um einen dikaryontischen Stamm handeln.
Insbesondere bevorzugt als Wirt für die Genexpression ist eine Hefe der Art Sporidiobolus ruineniae.
Die Transformation des Wirtsstammes erfolgt nach Methoden, die dem Stand der Technik entsprechen. Zu diesen Methoden gehören die Transformation mit der Lithiumacetatmethode, die Transformation durch Elektroporation oder die biolistische Transformation durch Beschuss mit DNS-haltigen Mikroprojektilen, bzw. eine Kombination der genannten Methoden. Diese Verfahren sind in Standardlehrbüchern beschrieben.
Die Selektion positiver Transformanten erfolgt beispielsweise, indem Sporidiobolus Zellen nach der Transformation mit Vektor DNS auf einem Medium ausgebracht werden, welchem Antibiotikum in Mengen zugefügt wurde, welche das Wachstum des Wildtypstammes unterdrückt und welches die Selektion von Antibiotika resistenten Transformanten erlaubt. Ein Verfahren zur erfindungsgemäßen Transformation von Sporidiobolus wird im 8. Beispiel beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die Hefe Sporidiobolus ruineniae in der oben genannten Weise mit dem Gen eines oder mehrerer Q10-Biosyntheseenzyme transformiert.
Dadurch wird eine Steigerung der Expressionsrate für das besagte Gen erzielt und die Q10-Produktionsrate signifikant verbessert. Dabei können die Q10-Biosynthesegene aus Hefen der Gattung Sporidiobolus stammen oder es können auch andere Q10-Biosynthesegene verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Sporidiobolus Expressionssystem eignet sich insbesondere zur Expression eines oder mehrerer Gene aus dem Q10-Biosyntheseweg, z. B. einer Hydroxymethyl-Glutaryl-CoA-Reduktase, einer Farnesylpyrophosphatsynthase, einer Dekaprenylpyrophosphatsynthase oder einer p-Hydroxbenzoesäure-Dekaprenylpyrophosphattransferase.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das erfindungsgemäße Expressionssystem in an sich bekannter Weise zur Proteinproduktion eingesetzt wird oder dass ein Stamm der Hefe Sporidiobolus, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, in an sich bekannter Art und Weise kultiviert wird.
Solche Herstellungsverfahren sind beispielsweise bekannt aus EP 1469078 A oder aus US 4070244 .
Die Erfindung umfasst jedoch nicht nur die Verwendung des Expressionssystems zur gentechnischen Optimierung der Q10-Produktion. Das Expressionssystem kann auch dazu verwendet werden, jeden anderen Stoffwechselweg in Stämmen der Gattung Sporidiobolus gentechnisch zu verändern oder zu optimieren. Beispiele dafür sind die Produktion von Steroiden oder Carotinoiden. Darüber hinaus eignet sich das erfindungsgemäße Expressionssystem auch zur heterologen, bzw. homologen Produktion von Proteinen in rekombinanter Form. Diese rekombinant produzierten Proteine finden Verwendung, z. B. als therapeutische Proteine in der Medizin, bei Biotransformationen in der enzymkatalyisierten organisch-chemischen Synthese oder als technische Enzyme in verschiedenen industriellen Anwendungen. Als Beispiele seien genannt die Waschmittel-, Papier-, Nahrungsmittel- oder Futtermittelindustrie.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Die in den Beispielen verwendeten Standardmethoden zur Behandlung von DNS oder RNS, wie die Behandlung mit Restriktionsendonukleasen, DNS Polymerasen, Reverser Transkriptase etc. sowie die Standardverfahren wie Transformation von Bakterien, Southern und Northern Analyse, DNS Sequenzierung, Markierung von DNS-Sonden, Screening und PCR-Technologie wurden, wenn nicht anders angegeben, durchgeführt wie vom Hersteller empfohlen oder wenn keine Herstelleranleitung vorhanden war entsprechend dem aus den Standardlehrbüchern bekannten Stand der Technik.
1. Beispiel:
Anzucht von Sporidiobolus ruineniae auf Minimalmedium in Gegenwart von Antibiotika
Verwendet wurde der Stamm Sporidiobolus ruineniae Sr-1 (hinterlegt bei der DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 15553).
Anzucht von Sporidiobolus ruineniae Sr-1: Als Kulturmedien verwendet wurden YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Glucose), YPG-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 5 % Glycerin) oder YNB-Minimalmedium (1,34 % „Yeast Nitrogen Base", 2 % Glucose). Die Anzucht erfolgte in Flüssigmedien oder auf Agarplatten (YPD-, YPG- bzw. YNB-Medium mit jeweils 2 % Agar), jeweils für 2 bis 5 Tage bei 28°C. Flüssigkulturen wurden unter diesen Bedingungen bei 140 rpm auf einem Orbitalschüttler (Infors) geschüttelt.
Antibiotika-Sensitivitätstests wurden mit den Antibiotika G418 (auch bekannt unter dem Markennamen Geneticin^®; Invitrogen), Hygromycin B (Calbiochem) und Glyphosat (N-(Phosphonomethyl)- Glycin, Sigma, bekannt als Herbizid unter dem Markennamen RoundUp^®) durchgeführt.
Selektionsbedingungen für G418: Es wurden YNB-Platten mit einer G418 Konzentration von 50 µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml und 200 µg/ml hergestellt, Sr-1 darauf ausplattiert und bei 28°C inkubiert. Gegenüber Kontrollplatten ohne G418 wurde ab einer G418-Konzentration von 100 µg/ml ein deutlich reduziertes Wachstum und bei 200 µg/ml kein Wachstum des Stammes Sr-1 mehr beobachtet. Für Transformationsexperimente wurden YNB-Platten mit einer G418-Konzentration von 100 µg/ml und 150 µg/ml als Selektivmedium verwendet.
Selektionsbedingungen für Hygromycin B: Es wurden YNB-Platten mit einer Hygromycin B Konzentration von 40 µg/ml, 60 µg/ml, 80 µg/ml und 100 µg/ml hergestellt, Sr-1 darauf ausplattiert und bei 28°C inkubiert. Gegenüber Kontrollplatten ohne Hygromycin B wurde ab einer Hygromycin B-Konzentration von 60 µg/ml ein deutlich reduziertes Wachstum und bei 100 µg/ml kein Wachstum des Stammes Sr-1 mehr beobachtet. Für Transformationsexperimente wurden YNB-Platten mit einer Hygromycin B-Konzentration von 80 µg/ml und 100 µg/ml als Selektivmedium verwendet.
Selektionsbedingungen für Glyphosat: Es wurden YNB-Platten mit einer Glyphosat-Konzentration von 1 mg/ml, 1,25 mg/ml, 1,5 mg/ml 1,75 mg/ml und 2 mg/ml hergestellt, Sr-1 darauf ausplattiert und bei 28°C inkubiert. Gegenüber Kontrollplatten ohne Glyphosat wurde ab einer Glyphosat-Konzentration von 1,25 mg/ml ein deutlich reduziertes Wachstum und bei 1,75 mg/ml kein Wachstum des Stammes Sr-1 mehr beobachtet.
2. Beispiel
Isolierung eines Genfragments der ribosomalen DNS (rDNS) aus Sporidiobolus ruineniae
Isolierung von genomischer DNS aus S. ruineniae Sr-1:
Sr-1 wurde für 2 Tage in YPD-Flüssigmedium kultiviert, wie im 1. Beispiel beschrieben. Die Sr-1 Zellen wurden danach durch Zentrifugation isoliert (10 min 3000 rpm, Heraeus Megafuge 1.0R). DNS wurde aus den Sr-1 Zellen mit dem Qiagen „Genomic Tip" Kit zur Extraktion genomischer DNS isoliert.
Isolierung eines DNS-Fragments der ribosomalen DNS (rDNS) aus S. ruineniae:
DNS-Sequenzen kurzer Fragmente der S. ruineniae rDNS sind in Gendatenbanken hinterlegt unter den Zugangsnummern ab021696.gb_pl und af070438.gb_pl. Diese DNS-Sequenzen wurden dazu verwendet, Sequenzvergleiche mit dem bekannten rDNS-Bereich der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae (Gendatenbank Zugangsnummer scylr154c.gb_pl1) zu machen. Zur Suche und Analyse von DNS-Sequenzen wurde dabei das Computerprogramm "Wisconsin Package Version 10.3, Accelrys Inc." verwendet. Anhand dieses Vergleiches wurden die PCR-Primer SrRD1f (SEQ ID NO: 4) und SrRD2r (SEQ ID NO: 5) ausgewählt, deren DNS-Sequenzen in S. cerevisiae und S. ruineniae identisch sind.
Die Primer hatten folgende Sequenzen:
Primer SrRD1f: 5'-GCTTGTCTCAAAGATTAAGC-3' (SEQ ID NO: 4)
Primer SrRD2r: 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3' (SEQ ID NO: 5)
PCR-Reaktionen mit den Primern SrRD1f und SrRD2r mit genomischer DNS aus S. ruineniae Sr-1 wurden nach dem Stand der Technik mit einem GenAmp PCR System 2400 der Fa. Applied Biosystems durchgeführt. Verwendet wurde der Taq Core PCR-Kit (Qiagen) mit dem folgenden PCR-Programm: Nach Inkubation des PCR-Ansatzes für 1' bei 94°C wurden 30 Reaktionszyklen von 1' 94°C, 30'' 50°C und 2,5' 72°C durchgeführt und die Reaktion mit einer Inkubation für 5' bei 72°C beendet. Das gebildete PCR-Produkt wurde durch präparative Agarose Gelelektrophorese gereinigt. Die Grösse des gebildeten DNS-Fragments war 3 kb.
Vektor pSrrDNA:
Das 3 kb grosse DNS-Fragment wurde in den Vektor PCR-Script SK(+) (Stratagene) kloniert. Dabei entstand der Vektor pSrrDNA (1). Die Sequenzanalyse des klonierten DNS-Fragments von Vektor pSrrDNA (SEQ ID NO: 3) bestätigte, dass es sich um das erwartete Fragment der ribosomalen DNS von S. ruineniae handelte.
3. Beispiel
Herstellung einer chromosomalen Genbank aus Sporidiobolus ruineniae.
Genomische DNS von S. ruineniae wurde aus den Zellen von drei Schüttelkolbenkulturen (je 50 ml YPD-Medium, 24 h, 140 rpm, 28°C) isoliert. Dazu wurden die Zellen aus der Anzucht zuerst gefriergetrocknet (Gefriertrockner Christ alpha 2–4) und daraus mit dem Qiagen „Genomic-tip" DNS-Isolierungskit die genomische DNS isoliert. Dabei wurde nach den Angaben des Herstellers verfahren. Die Ausbeute betrug 100 µg genomische DNS.
Zur Herstellung der chromosomalen Genbank wurden 100 µg chromosomale DNS von Sporidiobolus ruineniae Sr-1 in einem Partialverdau mit Sau 3A geschnitten und durch Agarose Gelelektrophorese aufgetrennt. Die chromosomalen DNS-Fragmente wurden im Größenbereich von 1–20 kb isoliert und, entsprechend den Angaben des Herstellers, jeweils in mit Bam HI vorgeschnittene Lambda-Phagen kloniert (Stratagene Klonierungssystem „Lambda ZAP Express"). Von der 1–20 kb DNS-Fraktion wurden 2,5 × 106 Phagen/µg Vektor-DNS erhalten. Die Phagen wurden durch Infektion des E. coli Stammes XL-1 Blue MRF' amplifiziert.
4. Beispiel
Klonierung des S. ruineniae GAPDH-Gens
A. Isolierung einer GAPDH DNS-Sonde aus Sporidiobolus ruineniae:
Es wurde der Stamm Sporidiobolus ruineniae Sr-1 (siehe 1. Beispiel) verwendet. Genomische DNS wurde isoliert wie im 2. Beispiel beschrieben.
Anhand der publizierten DNS-Sequenzen des GAPDH-Gens aus Phanerochaete chrysosporium (M. C. Harmsen et al. (1992), Curr. Genet. 22, 447–454) und des GAPDH-Gens aus Coriolus hirsutus (JP 9-47289) und Phaffia rhodozyma (J. C. Verdoes et al. (1997), Yeast 13, 1231–1242) wurden Primer zur PCR-Amplifikation eines GAPDH-spezifischen Genfragments konstruiert. Die Primer hatten die folgenden DNS-Sequenzen:
Primer srgap1:
5'-CTTGAGTACATGGTCTACATGTTC-3' (SEQ ID NO: 6).
Primer srgap2r:
5'-TTARCACCGCAGACGAACATGG-3' (SEQ ID NO: 7).
PCR-Amplifikationen wurden entsprechend dem Stand der Technik durchgeführt: In einer PCR Reaktion wurden 200 ng chromosomaler Sporidiobolus ruineniae DNS in einer 50 µl PCR Reaktion eingesetzt, die den vom Hersteller bereitgestellten Puffer enthielt und darüberhinaus 1,25 U Taq Polymerase, 1,25 mM MgCl₂, je 0,2 mM der vier dNTPs (dATP, dCTP, cGTP, dTTP) und jeweils 100 pmol der Primer srgap1 und srgap2r. Die weiteren Bedingungen zur spezifischen Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts waren: 5 Min. bei 94°C, gefolgt von 30 Zyklen von 0,5 Min. bei 94°C, 1 Min. bei 50°C und 1 Min. bei 72°C. Es wurde ein PCR-Produkt von ca. 0,3 kb erhalten.
Das PCR-Produkt wurde durch Agarose Gelelektrophorese gereinigt, in den Vektor PCR-Script SK(+) (Stratagene) kloniert und E. coli Top 10F' transformiert. Aus der Anzucht transformierter E. coli wurde das Plasmid isoliert. DNS-Sequenzanalyse bestätigte, dass es sich bei dem klonierten DNS-Fragment um das Fragment des GAPDH-Gens aus S. ruineniae handelte.
Zur Vorbereitung der DNS-Sonde für das Screening des GAPDH-Gens wurde das GAPDH-spezifische PCR-Fragment durch Behandlung mit Not I und Eco RI ausgeschnitten, über Agarose Elektrophorese isoliert und mit dem „AlkPhos Direct" DNS-Markierungs-Kit (Amersham Biosciences) markiert, wie vom Hersteller empfohlen.
B: Isolierung eines chromosomalen GAPDH-Gens aus S. ruineniae:
Es wurde die im 3. Beispiel beschriebene chromosomale Genbank von Sporidiobolus ruineniae Sr-1 verwendet. Das Screening nach dem chromosomalen GAPDH-Gen wurde nach dem Stand der Technik durchgeführt. In einer ersten Screeningrunde wurden Zellen von E. coli XL-1 Blue MRF' auf 6 Petrieschalen zuerst kultiviert und dann mit 50.000 Phagen der Genbank pro Petrieschale infiziert. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die neu gebildeten Phagen auf Nylonfilter (Hybond-N⁺, Amersham Biosciences) transferiert. Die Filter wurden dann entsprechend den Empfehlungen des Herstellers mit der markierten GAPDH-spezifischen Sonde (siehe Abschnitt A) hybridisiert. Die Hybridisierungstemperatur betrug 60°C. Die Waschtemperatur betrug 60°C. Die Detektion positiver Klone erfolgte durch Chemiluminiszenz (CDP-Star Detektions-Kit der Fa. Amersham Biosciences) und Autoradiographie. 18 positive Klone wurden gepickt. Diese wurden durch Wiederholung des Screeningverfahrens gereinigt. Nach drei Runden der Vereinzelung wurden bei dem Screening fünf stark hybridisierende Phagenklone isoliert, die nach einer Vorschrift des Herstellers (Stratagene) durch "in vivo excision" in den pBK CMV Vektor (Stratagene) umkloniert wurden. Analyse der Klone durch Verdau mit Restriktionsendonucleasen und DNS-Sequenzierung ergab, dass es sich bei vier der fünf Klone um GAPDH-Klone handelte. Zwei allelische Klone, bezeichnet als gap5 (SEQ ID NO: 1), und gap18 (SEQ ID NO: 2) wurden sequenziert.
Das Start ATG-Codon des GAPDH-Gens wurde durch die dem Fachmann geläufige 5'-RACE Analyse (Generacer Kit von Invitrogen) bestimmt. Es wurde der vom Hersteller bereitgestellten Versuchsanleitung gefolgt. Die dabei zur Herstellung der cDNS be nötigte RNS wurde mit dem „pegGOLD TriFast" Reagens (PegLab) isoliert. Der weiterhin für die PCR-Reaktion benötigte genspezifische Primer srgap10r hatte folgende Sequenz:
Primer srgap10r:
5'-TTGAACATGTAGACCATGTACTCGAG-3' (SEQ ID NO: 8).
Ein Vergleich der DNS-Sequenz des 5'-RACE cDNS Fragments mit den Sequenzen der gap5 und gap18 Klone ergab, dass das Start ATG-Codon durch ein Intron unterbrochen wird. Die entsprechenden Promotorregionen sind somit bp 1–1050 im Klon gap5 (SEQ ID NO: 1), bzw. bp 1–790 im Klon gap18 (SEQ ID NO: 2). Als Terminatorregion wurde die DNS-Sequenz bp 2997–3500 im Klon gap5 (SEQ ID NO: 1) bestimmt.
Ein Sequenzvergleich der DNS der verfügbaren kodierenden Bereiche (einschließlich Intronsequenzen) des gap5 Klons (SEQ ID NO: 1, bp 1051–2996) und des gap18 Klons (SEQ ID NO: 2, bp 791–2126) ergab eine 97,8 % Identität. Dagegen waren die oben genannten Promotorbereiche nur zu 41,8 % identisch. In der vorliegenden Erfindung beziehen sich alle erwähnten Homologiewerte auf Ergebnisse, die mit dem Computerprogramm "Wisconsin Package Version 10.3, Accelrys Inc." erhalten wurden. Die Homologiebestimmung erfolgte durch Vergleich der DNS-Sequenzen mit dem Unterprogramm "gap". Hierbei werden die voreingestellten Parameter "gap creation penalty 50" und "gap extension penalty 3" verwendet.
5. Beispiel
Expressionsvektor pprG418Sr für die Transformation von S. ruineniae
Das GAPDH-Gen aus Phaffia rhodozyma ist bekannt (Genbezeichnung in der GCG-Gendatenbank: PRGPDGENE.gb_pl) und seine Verwendung zur Transfromation von Phaffia rhodozyma ist beschrieben (Wery et al., Biotechnology Techniques (1998) 12: 399–405). Das G418 Resistenzgen aus dem E. coli Transposon Tn903 ist enthalten in dem Saccharomyces cerevisiae Expressionsvek tor pUG6 (beschrieben in Gueldener et al., Nucleic Acids Res. (1996) 24: 2519–2524; die DNS-Sequenz ist in der GCG-Gendatenbank abgelegt unter der Zugangsnummer AF298793).
Promoter und Terminator des GAPDH-Gens wurden durch PCR-Reaktionen aus genomischer DNS des Stammes Phaffia rhodozyma CBS 6938 (erhältlich von der Stammsammlung Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Niederlande) isoliert. Genomische DNS von P. rhodozyma wurde isoliert, wie im 2. Beispiel für S. ruineniae beschrieben.
Zur Isolierung des Promotor DNS-Fragments wurden die Primer prgap1 und prgap2r verwendet. Zur Isolierung des Terminators wurden die Primer prgap3 und prgap4r verwendet. Die Primer hatten folgende DNS-Sequenzen:
Primer prgap1:
5'-CCGAAGCTTAAGTCGAGGGAACCCGAG-3' (SEQ ID NO: 9).
Primer prgap2r:
5'-TTCGGATCCCCGCGGCCATGGTGGTAAGAGTGTTAG-3' (SEQ ID NO: 10).
Primer prgap3:
5'-ACGGTTCTCTCCAAACCCTC-3' (SEQ ID NO: 11).
Primer prgap4r:
5'-GGATCCCGGAGATGATGGTGATG-3' (SEQ ID NO: 12).
PCR-Reaktionen mit genomischer P. rhodozyma DNS und den Primern prgap1 und prgap2r, bzw. prgap3 und prgap4r wurden durchgeführt wie im 2. Beispiel beschrieben. Verwendet wurde folgendes PCR-Programm: Nach Inkubation des PCR-Ansatzes für 1' bei 94°C wurden 30 Reaktionszyklen von 1' 94°C, 30'' 50°C und 30'' 72°C durchgeführt und die Reaktion mit einer Inkubation für 5' bei 72°C beendet. Die gebildeten PCR-Produkte wurden durch Agarose Gelelektrophorese analysiert. Die Grösse des Promotor DNS-Fragments (Primer prgap1 und prgap2r) war 0,7 kb. Die Grösse des Terminator DNS-Fragments (Primer prgap3 und prgap4r) war 0,4 kb. Die beiden DNS-Fragmente wurden durch präparative Agarose Gelelektrophorese gereinigt.
Das isolierte Promotor DNS-Fragment wurde mit Hind III (Schnittstelle war in Primer prgap1 enthalten) und Bam HI (Schnittstelle war in Primer prgap2r enthalten) geschnitten und in den mit Hind III und Bam HI geschnittenen und dephosphorylierten pUC18 Vektor (Amersham Biosciences) kloniert. Dabei entstand der 3,9 kb grosse Vektor pPRgap-pro.
Das isolierte Terminator DNS-Fragment wurde in den PCR-Script Vektor (Stratagene) kloniert. Dabei entstand der 3,4 kb große Vektor pPRgap-term. Für die nachfolgenden Arbeiten wurde ein Klon ausgewählt, bei dem die Bam HI Schnittstelle aus dem Primer prgap4r neben der Bam HI Schnittstelle des PCR-Script Vektors lag.
Vektor pPRgap:
Vektor pPRgap-pro wurde mit Sac II und Bam HI geschnitten und der linerisierte Vektor dephosphoryliert.
Vektor pPRgap-term wurde mit Sac II und Bam HI geschnitten und das entstehende 0,4 kb Terminatorfragment durch präparative Agarose Gelelelektrophorese isoliert.
Das pPRgap-pro Vektorfragment und das Terminatorfragment wurden ligiert und E.coli Top10F' (Invitrogen) transformiert. Es entstand der 3,8 kb große Vektor pPRgap.
Herstellung des Vektors pprG418:
Vektor pPRgap wurde zuerst mit Sac II geschnitten und das überhängende Ende durch Reaktion mit der Pfu DNS-Polymerase (Stratagene) aufgefüllt. Dann wurde der Vektor mit Nco I geschnitten. Das so linearisierte 3,8 kb große Vektorfragment wurde anschließend dephosphoryliert.
Das G418-Resistenzgen wurde aus dem Vektor pUG6 durch Verdau mit Nco I und Sca I als 0,8 kb großes Fragment herausgeschnitten und durch präparative Agarose Gelelektrophorese isoliert.
Das linearisierte 3,8 kb pPRgap Vektorfragment wurde mit dem 0,8 kb G418-Resistenz Genfragment ligiert und E.coli Top 10F' transformiert. Dabei entstand der 4,6 kb große Vektor pprG418, in dem das G418-Resistenzgen funktionell mit dem GapDH-Promotor und -Terminator aus Phaffia rhodozyma verknüpft ist (2).
Herstellung des Expressionsvektors pG418Sr:
Vektor pprG418 mit dem G418 Selektionsmarkergen wurde mit Afl II und Bam HI geschnitten. Das dadurch erzeugte 1,9 kb DNS-Fragment, das die Expressionskassette bestehend aus P. rhodozyma GapDH-Promotor, G418 Resistenzgen und P. rhodozyma GapDH-Terminator enthielt, wurde durch Agarose Gelelektrophorese isoliert.
Vektor pSrrDNA wurde mit Afl II und Bgl II geschnitten, das dadurch linearisierte 5,9 kb Vektorfragment durch Agarose Gelelektrophorese isoliert und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Das 1,9 kb DNS-Fragment aus dem Vektor pprG418 wurde mit dem 5,9 kb pSrrDNA Vektorfragment ligiert und E. coli Top10 F' transformiert. Dabei entstand der 7,8 kb große Expressionsvektor pG418Sr (3). pG418Sr ist ein neuer Expressionsvektor, der sich zur Transformation von Sporidiobolus ruineniae und zur Selektion von G418-resistenten Transformanten eignet.
6. Beispiel
Expressionsvektor pprHPHsr für die Transformation von S. ruineniae
Vektor pPRgap:
Verwendet wurde das im 3. Beispiel beschriebene 3,8 kb Vektorfragment, das durch Verdau mit Sac II, Auffüllreaktion mit der Pfu DNS-Polymerase, Verdau mit Nco I und Dephosphorylierung hergestellt worden war.
Hygromycin Resistenzgen (HPH):
Die Sequenz des Hygromycin Resistenzgens aus E. coli ist in der GCG-Datenbank unter der Datei „ECAPH4" abgelegt (Kaster et al., Nucleic Acids Res. (1983) 11, 6895–6911. Das Hygromycin Resistenzgen wurde aus E. coli DNS durch PCR mit der Pfu DNS-Polymerase (Stratagene) und den Primern hph1f und hph2r hergestellt. Primer hph1f und hph2r hatten folgende DNS-Sequenz:
Primer hph1f:
5'-GAGTCATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3' (SEQ ID NO: 13).
Primer hph2r:
5'-TACTCTATTCCTTTGCCCTCGG-3' (SEQ ID NO: 14).
Bei der PCR-Reaktion entstand ein 1 kb großes DNS-Fragment, das mit Bsp HI (im Primer hph1f enthalten) geschnitten wurde.
Herstellung des Vektors pprHPH:
Das 3,8 kb große pPRgap Vektorfragment wurde mit dem 1 kb großen DNS-Fragment des Hygromycin Resistenzgens ligiert und E. coli Top 10F' transformiert. Dadurch entstand der 4,8 kb große Vektor pprHPH (4).
Herstellung des Expressionsvektor pHPHsr:
Vektor pprHPH mit dem Hygromycin B-Selektionsmarkergen wurde mit Afl II und Bam HI geschnitten. Das dabei entstandene 2,1 kb DNS-Fragment, das die Expressionskassette bestehend aus P. rhodozyma GapDH-Promotor, Hygromycin B-Resistenzgen und P. rhodozyma GapDH-Terminator enthielt, wurde durch Agarose Gelelektrophorese isoliert.
Vektor pSrrDNA wurde mit Afl II und Bgl II geschnitten, das dadurch linearisierte 5,9 kb Vektorfragment durch Agarose Gelelektrophorese isoliert und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Das 2,1 kb DNS-Fragment aus dem Vektor pprG418 (enthält die Expressionskassette mit dem Hygromycin B-Resistenzgen) wurde mit dem 5,9 kb pSrrDNA Vektorfragment ligiert und E. coli Top10 F' (Invitrogen) transformiert. Dabei entstand der 8 kb große Expressionsvektor pHPHsr (5). pHPHsr ist ein neuer Expressionsvektor, der sich zur Transformation von Sporidiobolus ruineniae und zur Selektion von Hygromycin B-resistenten Transformanten eignet.
7. Beispiel
Expressionsvektor G418G5R für die Transformation von S. ruineniae
Herstellung des Vektors pG418G5:
Vektor pprG418 (siehe 5. Beispiel) wurde mit Afl II und Nco I geschnitten, um den P. rhodozyma GAPDH-Promotor zu entfernen. Dabei entstand ein 3,9 kb Vektorfragment, das durch Agarosegelelektrophorese isoliert und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert wurde.
Genomische DNS des S. ruineniae GAPDH-Klons gap5 (siehe 4. Beispiel) wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS-Polymerase, Qiagen Taq Core Kit) zusammen mit den Primern srgap5 und srgap6 eingesetzt. srgap5 (forward) bindet an den Beginn des Promotor Sequenzabschnitts, srgap6 (reverse), an dessen Ende. Die beiden Primer hatten folgende Sequenzen:
Primer srgap5:
5'-GATCTTAAGGAAGAGTCGCTCACTC-3' SEQ ID NO: 15
Primer srgap6:
5'-CTTCCATGGTGAGGTTGATCCGCTG-3' SEQ ID NO: 16
Die Bedingungen für die PCR-Reaktion waren: 1' 94°C, gefolgt von 30 Zyklen zu je 30'' 94°C, 30'' 52°C, 60' 72°C und schließlich 5' 72°C. Das bei der PCR-Reaktion gebildete 1 kb DNS-Fragment des GAPDH-Promotors wurde isoliert und mit Afl II und Nco I geschnitten.
Das 3,9 kb Afl II/Nco I geschnittene pprG418 Vektorfragment und das 1 kb Afl II/Nco I-geschnittene GAPDH-Promotorfragment wurden ligiert und in E.coli Top 10F' transformiert. Es entstand der 4,9 kb große Vektor pGapPromG418, in dem der gap5-Promotor mit dem G418-Resistenzgen verknüpft war.
Vektor pGapPromG418 wurde mit Not I und Bam HI geschnitten, wobei das 0,4 kb P. rhodozyma GAPDH-Terminatorfragment entfernt wurde. Das 4,5 kb Vektorfragment wurde durch Agarose Gelelektrophorese isoliert und durch Phosphatasebehandlung dephosphoryliert.
Genomische DNS des S. ruineniae GAPDH-Klons gap5 (siehe 4. Beispiel) wurde in einer PCR-Reaktion (Taq DNS-Polymerase, Qiagen Taq Core Kit) zusammen mit den Primern srgap11f und srgap12r eingesetzt. srgap11f enthält eine Not I Schnittstelle zur Verknüpfung mit dem 3'-Ende des G418 Resistenzgens und enthält die Sequenz nach dem ersten möglichen Stop-Codon des GAPDH-Gens (siehe 4. Beispiel). srgap12r enthält eine Bam HI Schnittstelle und stammt vom sequenzierten 3'-Ende des gap5 Klons. Die beiden Primer hatten folgende Sequenz:
Primer srgap11f:
5'-TATGCGGCCGCTATGCGCCGTGTAAAGCGTG-3' SEQ ID NO: 17
Primer srgap12r:
5'-TATGGRTCCCAGGGCTGATCGCTCGTTGC-3' SEQ ID NO: 18
Die Bedingungen für die PCR-Reaktion waren: 1' 94°C, gefolgt von 30 Zyklen zu je 30'' 94°C, 30'' 52°C, 30'' 72°C und schliesslich 5' 72°C. Das bei der PCR-Reaktion gebildete 0,42 kb DNS-Fragment des GAPDH-Promotors wurde isoliert und mit Not I und Bam HI geschnitten.
Das 4,5 kb Not I/Bam HI geschnittene pGapPromG418 Vektorfragment und das 0,42 kb Not I/Bam HI geschnittene GAPDH-Terminatorfragment wurden ligiert und in E.coli Top 10F' transformiert. Es entstand der 4,9 kb große Vektor pG418G5 (6), in dem der Promotor und Terminator des Gap5 GAPDH-Klons funktionell mit dem G418-Resistenzgen verknüpft sind.
Herstellung des Vektors pG418G5R:
Aus dem Vektor pG418G5 wurde die G418-Expressionskassette durch Verdau mit Afl II und Bam HI als 2,3 kb großes DNS-Fragment herausgeschnitten und durch Agarose Gelelektrophorese isoliert.
Vektor pSrrDNA wurde mit Afl II und Bgl II geschnitten, das _ 5,8 kb Vektorfragment durch Agarose Gelelektrophorese isoliert und dephosphoryliert.
Die beiden DNS-Fragmente wurden ligiert und in E.coli Top 10F' transformiert. Es entstand der 8,1 kb große Vektor pG418G5R (7). pG418G5R ist ein neuartiger Expressionsvektor, der sich zur Transformation von Hefen der Gattung Sporidiobolus eignet.
8. Beispiel
Transformation von Sporidiobolus ruineniae
Zellen von dem S. ruineniae Stamm Sr-1 wurden in einer Vorkultur in YPD-Medium (28°C, 140 rpm, 2 d Anzuchtsdauer) hergestellt, wie im 1. Beispiel beschrieben. Die Vorkultur wurde verwendet, um eine Tageskultur von 200 ml YPD-Medium auf eine Zelldichte OD_600nm von 0,2 zu beimpfen. Die Tageskultur wurde dann bei 28°C und 140 rpm inkubiert, bis eine Zelldichte OD_600nm von 1,0–1,5 erreicht wurde.
Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation geerntet (10 min 3000 rpm, Heraeus Megafuge 1.0R). Das Zellpellet wurde in 40 ml DTT-Puffer (100 mM Lithiumacetat; 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM Dithiotreitol, 0,6 M Mannitol) suspendiert und 15 Min. bei 28°C und 140 rpm inkubiert. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugation isoliert und das Zellpellet zweimal mit 200 ml eiskaltem 0,9 M Mannitol gewaschen und das Zellpellet schließlich in 1 ml 0,9 M Mannitol aufgenommen. Die so vorbereiteten Zellen wurden für die Transformation durch Elektroporation verwendet.
Für einen Elektroporationsansatz wurden 100 µl Zellen mit 1–10 µg DNS (maximal 10 µl Volumen) in einer Elektroporationsküvette gemischt und auf Eis gekühlt. Die DNS wurde vorher durch Verdau mit Nhe I linearisiert. Bei der zu transformierenden DNS handelte es sich um die Vektoren pG418Sr (5. Beispiel, G418 Selektion), pHPHsr (6. Beispiel, Hygromycin B Selektion) und pG418G5R (7. Beispiel, G418 Selektion). In einem Kontrollansatz wurden Zellen ohne zugesetzte DNS verwendet.
Zur Elektroporation wurde ein Gene Pulser der Firma BioRad verwendet. Die Bedingungen der Elektroporation waren: Spannung 7,5 kV/cm; Kapazität 25 µF und ein Widerstand von 200 Ohm. Die Entladungszeit betrug ca. 4 mSek.
Nach der Elektroporation wurde der Transformationsansatz mit 1 ml YNB-Medium versetzt und unter leichtem Schütteln bei 28°C über Nacht inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation (2 min 13.000 rpm, Eppendorf Mikrozentrifuge) isoliert, in 1 ml YNB-Medium aufgenommen und in Aliquots zu je 0,25 ml auf 4 selektiven Agarplatten ausplattiert. Selektive Agarplatten enthielten jeweils YNB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum. Bei der G418 Selektion enthielten die Agarplatten G418 in einer Konzentration von 100–150 µg/ml (abhängig von der jeweiligen Antibiotikumscharge). Bei der Hygromycin Selektion enthielten die Agarplatten Hygromycin B in einer Konzentration von 60–100 µg/ml (abhängig von der jeweiligen Antibiotikumscharge).
Die auf selektiven Platten ausplattierten Transformationsansätze wurden bei 28°C inkubiert. Kolonien von Antibiotika-resistenten Transformanten wurden nach einer Inkubationsdauer von 5 bis 10 Tagen beobachtet.
Erhaltene Transformanten wurden zuerst auf selektive Platten überimpft und bei 28°C bebrütet, um die Ausprägung des Antibiotika-resistenten Phänotyps zu bestätigen. Von den am besten wachsenden Transfomanten wurden dann auf selektiven Platten Reinigungsausstriche gemacht.
Typische Transformationsraten aus Transformationsexperimenten mit den Expressionskonstrukten pG418Sr, pHPHsr und pG418G5R sind in Tab. 1 angegeben. Wie in Tab. 1 dargestellt, wurden mit dem homologen Sporidiobolus GAPDH-Promotor (Konstrukt pG418G5R) deutlich höhere Transformationsraten erzielt als mit dem heterologen P. rhodozyma Promotor (Konstrukte pG418Sr, pHPHsr). Zur Kontrolle des Hintergrunds wurden in equivalenter Weise Transformationsansätze ohne DNS durchgeführt. Dabei wurden nur im Falle der G418-Selektion Hintergrundklone beobachtet.
Tab. 1
Durch die spezielle Kombination der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren, bestehend aus Promotor, Terminator, Antibiotikumsresistenzgen und rDNS, gelang es in unerwarteter Weise, einen Hefestamm aus der Gattung Sporidiobolus zu transformieren. Dieses Transformationssystem bildet die Grundlage zur er findungsgemässen gentechnischen Optimierung der Q10-Produktion in Sporidiobolus. pG418sr, PG418G5R und pHPHsr sind also neuartige Expressionsvektoren, die sich zur Transformation von S. ruineniae eignen und in Kombination mit einem Q10-Biosynthesegen zur Verbesserung der Q10-Produktion eingesetzt werden können.
9. Beispiel
Genetische Analyse der Transformanten
Transformanten von Sporidiobolus ruineniae, wie im 8. Beispiel erhalten, wurden mittels PCR und Southernblot Analyse auf die Integration der Plasmide pG418Sr, pHPHsr, bzw. pG418G5R untersucht. Von verschiedenen Transformanten mit den Plasmiden pG418Sr, pG418G5R, pHPHsr und als Kontrolle vom Stamm Sr-1 wurde nach Anzucht in YPD-Medium (siehe 1. Beispiel) genomische DNS isoliert, wie im 2. Beispiel beschrieben.
Plasmide pG418Sr und pG418G5R: Von den G418-resistenten Stämmen wurden je 1 µg der genomischen DNS und 50 ng des Plasmids pG418Sr mit Nco I und Not I geschnitten, anschließend durch Agarose Gelelektrophorese getrennt, auf Nylonfilter (Hybond+, Amersham Biosciences) geblottet und mit einer DNS-Sonde hybridisiert, die spezifisch für das G418 Resistenzgen war.
Die DNS-Sonde wurde vorbereitet, indem das Plasmid pG418Sr mit Nco I und Not I geschnitten und das dabei entstandene 0,8 kb lange DNS-Fragment (enthält das G418 Resistenzgen) durch präparative Gelelektrophorese isoliert wurde. Das 0,8 kb lange G418-spezifische DNS-Fragment wurde entsprechend den Angaben des Herstellers mit dem AlkPhos DNS-Markierungskit der Firma Amersham Biosciences markiert. Die Hybridisierungstemperatur für die auf Nylonfilter (Hybond+, Amersham Biosciences) geblottete DNS mit der markierten DNS-Sonde betrug 60°C. Zur Detektion von hybridisierter DNS-Sonde wurde der „CDP Star Detection-Kit" der Firma Amersham Biosciences verwendet. Es wurden die in der Fachliteratur und vom Hersteller beschriebenen Bedingungen für Southernblots eingehalten. Southernblots wurden durch Autoradiographie ausgewertet. Dabei konnte das 0,8 kb lange G418-spezifische DNS-Fragment nur in den Transformanten, nicht jedoch in dem Sr-1 Wildtypstamm nachgewiesen werden.
Plasmid pHPHsr: Genomische DNS von Hygromycin-resistenten Transformanten (jeweils 200 ng) und von S. ruineniae Sr-1 (200 ng, Negativ-Kontrolle) sowie pHPHsr Plasmid DNS (50 ng, Positiv-Kontrolle) wurden in PCR-Reaktionen (Taq Core Kit, Qiagen) mit den Primern hph1f (SEQ ID NO: 13) und hph2r (SEQ ID NO: 14) eingesetzt. Die Bedingungen der PCR-Reaktion waren: 1' 94°C gefolgt von 30 Zyklen mit je 30'' 94°C, 30'' 55°C, 1' 72°C sowie schließlich 5' 72°C. Aliquots der PCR-Reaktionen wurden durch Agarose Gelelektrophorese analysiert. Das Hygromycin Resistenzgen wurde als 1 kb PCR-Fragment (siehe 6. Beispiel) nur in Transformanten und in der pHPHsr Positivkontrolle beobachtet, nicht dagegen in der nicht-transformierten S. ruineniae Sr-1 Negativkontrolle.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass bei der Transformation des Stammes Sporidiobolus ruineniae Sr-1 das G418-, bzw. das Hygromycin Resistenzgen aus den Expressionsvektoren pG418Sr und pG418G5R, bzw. pHPHsr, in das Genom integriert worden war und zur produktiven Expression des G418-, bzw. Hygromycin Resistenzgens führte, wodurch Transformanten auf G418-, bzw. Hygromycin B Antibiotikum enthaltenden Medien wachsen konnten. Überraschenderweise wurde dabei auch erstmals festgestellt, dass die Expressionssignale des GAPDH-Gens aus der Basidiomyceten-Hefe Phaffia rhodozyma auch in Sporidiobolus ruineniae funktionsfähig sind, wenngleich die Transformationseffizienz mit dem heterologen Expressionssignalen deutlich niedriger war (siehe 8. Beispiel).
10. Beispiel
RNS-Analyse von Sporidiobolus Transformanten
Sporidiobolus ruineniae Sr-1 wurde mit den Expressionsvektoren pG418Sr und pG418G5R transformiert, wie im 8. Beispiel be schrieben. Ausgewählte Klone der Transformation wurden in YPG-Medium kultiviert wie im 1. Beispiel beschrieben. Aus den Zellen der Anzucht wurde RNS mit dem „pegGOLD TriFast" Reagens (PegLab) entsprechend den Angaben des Herstellers isoliert. RNS des heterolog exprimierten G418 Resistenzgens wurde durch reverse Transkription, kombiniert mit einer PCR-Reaktion (sog. RT-PCR), als cDNS nachgewiesen. Es wurde der „SuperScript^TM II Reverse Transcriptase" RT-PCR Klonierungskit der Fa. Invitrogen verwendet.
RNS wurde zuerst mit DNase I behandelt, um möglicherweise noch vorhandene Reste von DNS zu entfernen. 500 ng der so gewonnenen RNS wurden dann für die RT-PCR eingesetzt und dem Protokoll des Herstellers für den RT-PCR Klonierungskit gefolgt. Die auf diese Weise gewonnene cDNS wurde in PCR-Reaktionen (Taq Core Kit, Qiagen) mit den Primern Gres1f und Gres2r eingesetzt, um das G418-Resistenzgen nachzuweisen. Die Primer Gres1f und Gres2r stammten vom 5'-, bzw. 3'-Ende des 0,8 kb G418-Resistenzgens (siehe 5. Beispiel) und hatten folgende Sequenzen:
Primer Gres1f:
Gres1f: 5'-GGTAAGGAAAAGACTCACGT-3' (SEQ ID NO: 19).
Primer Gres2r:
Gres2r: 5'-TTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3' (SEQ ID NO: 20).
RT-PCR Reaktionen wurden mit RNS-Proben, die aus dem Wildtypstamm S. ruineniae Sr-1 sowie aus G418-resistenten Klonen der Transformation von S. ruineniae mit den Expressionsvektoren pG418Sr, bzw. pG418G5R isoliert worden waren, durchgeführt. Die cDNS-Produkte aus der RT-PCR wurden durch Agarose Gelelektrophorese analysiert. In RNS der G418-resistenten Transformanten konnte das erwartete 0,8 kb cDNS-Fragment nachgewiesen werden, dagegen nicht in RNS aus nicht-transformierten S. ruineniae Sr-1 Zellen.
Dieses Ergebnis zeigt, dass S. ruineniae mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren pG418Sr, pG418G5R und pHPHsr trans formiert werden kann, was in der funktionellen Expression eines heterologen Gens resultiert.
11. Beispiel
Phänotypische Analyse von Sporidiobolus Transformanten
G418-resistente Transformanten von S. ruineniae Stamm Sr-1 wurden auf G418-selektiven YNB-Platten gereinigt. Gereinigte Stämme wurden zur Anzucht in Schüttelkolben verwendet. Anzuchtsmedien waren YNB-Medium (nicht selektiv) und YNB-Medium mit G418 (selektiv). Anzuchtsbedingungen waren 28°C auf einem Orbitalschüttler (Infors, 140 rpm). Das Zellwachstum wurde durch photometrische Bestimmung der Zelldichte OD bei 600 nm gemessen. Als Kontrollstamm wurde nicht transformierter S. ruineniae Sr-1 verwendet. Das Ergebnis ist in Tab. 2 (Zellwachstum nach sechs Tagen Anzucht) aufgeführt. Während alle Stämme in nichtselektivem Medium gutes Zellwachstum aufwiesen (Spalte YNB ohne G418 in Tab. 2), konnte beim Wildtypstamm in selektivem Medium, wie erwartet, kein Wachstum beobachtet werden. Transformanten hingegen konnten nach einer anfänglichen Lag-Phase von ca. zwei Tagen auch auf selektivem Medium wachsen. Dies zeigt, dass das G418-Resistenzgen in transformierten S. ruineniae Stämmen funktionsfähig exprimiert wird, was zur Inaktivierung des G418-Antibiotikums und zum Wachstum der Transformanten führt.
Tab. 2
Dieser Versuch zeigt, dass S. ruineniae transformiert werden kann und unter Kontrolle des homologen S. ruineniae GAPDH-Promotors, bzw. des heterologen P. rhodozyma GAPDH-Promotors ein heterologes Gen in aktiver Form exprimiert wird, was den Transformanten einen Antibiotika-resistenten Phänotyp verleiht. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Expressionssystem bestehend aus einem Wirtsorganismus der Gattung Sporidiobolus und einem DNS-Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Vektor ein Selektionsmarkergen enthält, welches für ein Protein kodiert, das nach Transformation des Wirtsorganismus eine Selektion positiver Transformanten erlaubt und ausgewählt ist aus der Gruppe der Antibiotikaresistenzgene, der Gene, die eine Auxotrophie des Wirtsorganismus komplementieren und der Gene, die für ein Protein kodieren, die zu einer farbgebenden Reaktion befähigt sind, wobei die Expression des Selektionsmarkergens durch mindestens ein im Wirtsorganismus aktives genetisches Regulationselement kontrolliert wird.
Expressionssystem gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Vektor ein Selektionsmarkergen ausgewählt aus der Gruppe der Antibiotikaresistenzgene enthält.
Expressionssystem gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Vektor ein Gen enthält, welches für ein zu produzierendes Protein kodiert, wobei die Expression dieses Gens durch ein im Wirtsorganismus aktives genetisches Regulationselement kontrolliert wird.
Expressionssystem gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirtsorganismus ein Stamm der Gattung Sporidiobolus ist.
Expressionssystem gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Antibiotikaresistenzgene Resistenz verleihen gegen ein Antibiotikum ausgewählt aus der Gruppe Hygromycin, G418, Geneticin^®, Glyphosat, Cycloheximid, Bialaphos, Kanamycin, Bleomycin, Oligomycin, Zeocin^TM, Benomyl, Nystatin und Phleomycin.
Expressionssystem gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Antibiotikaresistenzgene Resistenz verleihen gegen ein Antibiotikum ausgewählt aus der Gruppe Hygromycin, G418, Geneticin^® und Glyphosat.
Expressionssystem gemäß Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor als Promotor- oder Terminatorelemente die Promotor- oder Terminatorelemente des GAPDH Gens aus Sporidiobolus ruineniae, oder des GAPDH Gens aus Phaffia rhodozyma umfasst.
Expressionssystem gemäß Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, dass die in Sporidiobolus aktiven Promotorelemente ausgewählt sind aus den DNS Sequenzen SEQ ID NO: 1, bp 1 bis bp 1050 oder SEQ ID NO: 2, bp 1 bis bp 790.
Expressionssystem gemäß Anspruch 7 oder 8 dadurch gekennzeichnet, dass das in Sporidiobolus aktive Terminatorelement der DNS Sequenzen SEQ ID NO: 1, bp 2997 bis bp 3500 entspricht.
Expressionssystem gemäß Anspruch 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Vektor eine DNS gemäß SEQ ID NO: 3 enthält.
Expressionssystem gemäß Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der DNS-Vektor ein zu exprimierendes Gen enthält, das für ein Protein kodiert.
Expressionssystem gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das zu exprimierende Gen ein Gen aus dem Q10-Biosyntheseweg ist.
Expressionssystem gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das zu exprimierende Gen aus dem Q10-Biosyntheseweg ausgewählt ist aus der Gruppe Hydroxymethyl-Glutaryl-CoA-Reduktase, Farnesylpyrophosphat synthase, Dekaprenylpyrophosphatsynthase und p-Hydroxbenzoesäure-Dekaprenylpyrophosphattransferase.
Verfahren zur Herstellung von Sporidiobolus Stämmen, die zur effizienten Genexpression und Produktion von Proteinen befähigt sind, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirtsorganismus eine Hefe der Gattung Sporidiobolus verwendet wird, welche mit einem DNS-Vektor, der ein zu exprimierendes Gen und ein Antibiotika Resistenzgen besitzt, transformiert wird und aus dem Transformationsansatz die mit dem DNS-Vektor transformierten Klone durch Selektion Antibiotika resistenter Transformanten ausgewählt werden, wobei die Expression des zu exprimierenden Gens und des Antibiotikaresistenzgens im Wirtsstamm jeweils durch ein genetisches Regulationselement kontrolliert wird, das im Wirtsstamm aktiv ist.
Verfahren zur Herstellung von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Expressionssystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Proteinproduktion eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 15 dadurch gekennzeichnet, dass eines oder mehrere Gene ausgewählt aus der Gruppe Hydroxymethyl-Glutaryl-CoA-Reduktase, Farnesylpyrophosphatsynthase, Dekaprenylpyrophosphatsynthase und p-Hydroxbenzoesäure-Dekaprenylpyrophosphattransferase exprimiert werden.