WO2001005976A1 - Mutiertes ribosomales protein l3 - Google Patents

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WO2001005976A1 PCT/AT2000/000194 AT0000194W WO0105976A1 WO 2001005976 A1 WO2001005976 A1 WO 2001005976A1 AT 0000194 W AT0000194 W AT 0000194W WO 0105976 A1 WO0105976 A1 WO 0105976A1
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Gerhard Adam
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Innovationsagentur Gesellschaft M.B.H.
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Definitions

  • the present invention relates to a ribosomal protein L3 (RPL3), a DNA molecule which codes for this protein, a biologically functional vector comprising the DNA molecule, a method for producing trichothecene-tolerant recombinant cells, in particular plant cells, and plants.
  • RPL3 ribosomal protein L3
  • the invention further relates to a method for producing a DNA molecule comprising a region coding for RPL3, which leads to increased trichothecene resistance in the organism in which it is expressed.
  • Trichothecenes are a group of toxic, sesguiterpenoid, secondary metabolites, which are mainly formed by phytopathogenic fungi such as Trichothecium, Fusarium, Myrothetium, Trichoderma, Stachybotrys. In total, more than 180 different naturally occurring compounds from different groups have been isolated. The following four toxin groups, which differ in their chemical structure, are mostly described: The groups A and B, which differ in the occurrence of a keto group on the C 8 , have the greatest importance. Group C toxins have another epoxy group in the same place (between C 8 and C 7 ). The macrocyclic trichothecenes are summarized in Group D.
  • Trichothecenes play an important role as a virulence factor in the plant pathogenesis of fungi.
  • the toxic effect of the trichothecenes which varies depending on the structure of the trichothecenes, is essentially due to the inhibition of translation caused by binding to ribosomal subunits (Cundliffe et al., Inhibition of initiation, elongation and termination of eukaryotic protein synthesis by trichothecene fungal toxins ; Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1977), Vol. 11, No. 3, pp. 491-499).
  • DON deoxynivalenol
  • TDI tolerable daily intake
  • Contamination of important agricultural products such as wheat, barley or maize with mycotoxins such as the trichothecenes is a worldwide problem. Their distribution in these agricultural products has negative effects on their health, not only when humans eat these foods directly, but also when they are fed to farm animals in agriculture.
  • Trichothecic intoxications are associated with nausea, diarrhea, anorexia, ataxia, leukocystosis and subsequent severe leukopenia, inflammation of the gastrointestinal tract, destruction of nerve cells of the central nervous system, hemorrhage of the heart muscle, lesions of lymph nodes, testes and thymus and tissue.
  • DON as a protein biosynthesis inhibitor suppresses the active defense of the plant and on the other hand in The more toxin-resistant plants the natural defense against the fungus is more efficient.
  • the Steel et al. ("Sequence and developmental regulation of the gene that encodes the Dictyostelium discoideum L3 ribosomal protein", Gene 162 (1995), (123-128)) relates to genomic and recombinant plasmids which are responsible for the RPL3 protein of Coding Dictyostelium discoideum (Dd).
  • the sequences of these plasmids have a high degree of homology to genes of RPL3 proteins from low and high eukaryotes.
  • the aim of the present invention is to determine the cause of the resistance on the basis of molecular-biological investigations and, on the basis of this determination, to provide further mutations of the ribosomal protein L3 which lead to resistance, so that trichothecene-resistant cells, in particular plant cells, and trichothecene cells resistant plants can be obtained. Furthermore, DNA molecules coding for the mutated protein are to be made available.
  • the inventive RPL3 of the type mentioned at the outset is characterized in that its amino acid sequence has a mutation at the serine 2 site, so that the organism in which the mutated RPL3 is expressed has an increased trichothecic resistance.
  • This mutation site in the amino acid sequence for the production of trichothecene-resistant organisms can be found, for example, by mutating a well-established laboratory organism, such as Saccharomyces cerevisiae, then selecting it in nutrient medium containing trichothecene and sequencing the resistant strains. Any mutation at the serine 2 site is conceivable as long as the RPL3 remains functional.
  • a mutation at the serine 2 site of the amino acid sequence can be performed on RPL3 proteins of any organism, e.g. in mammals, plants, fungi and microorganisms. These terms are to be understood in the broadest sense, so that all organisms or cells that have an RPL3 are affected.
  • Trichothecene resistance is understood to mean resistance to one, several or all trichothecene types, in particular to type B and DON, cells which contain the mutated RPL3 gene being able to grow at certain trichothecene concentrations which are inhibitory for wild types. These mutated cells preferably have a 50% higher resistance, particularly preferably a 200% higher resistance, to trichothecenes compared to the respective wild types.
  • An advantageous RPL3 has an amino acid with an aliphatic side chain at the serine 2 site.
  • the RPL3 preferably comprises an amino acid sequence which has a proline instead of the serine 2. If the serine was exchanged for a proline, the cells with this recombinant RPL3 are particularly resistant to trichothecene.
  • Another aspect of this invention relates to an RPL3 whose amino acid sequence has a mutation at the proline 9 site, so that the organism in which the mutated RPL3 is expressed has an increased resistance to trichothecene.
  • proline can be replaced by any amino acid as long as the protein remains active.
  • An RPL3 is particularly preferred, the amino acid sequence of which instead of the proline has another amino acid with an aliphatic side chain. It is particularly advantageous if the amino acid sequence has a leucine instead of the proline. This mutation results in a recombinant organism that is resistant to trichothecenes.
  • RPL3 is an RPL3, with the exception of RPL3 from Saccharomyces cerevisiae strain CLPl, whose amino acid sequence has a mutation at the tryptophan 255 site, so that the organism in which the mutated RPL3 is expressed has increased trichothecene resistance.
  • a mutation at this point, whereby the tryptophan can be replaced by any other amino acid provides organisms which are more resistant to trichothecenes by more than 50%, in particular more than 200%, compared to the wild type.
  • the amino acid sequence is numbered in accordance with the numbering of the amino acids of the Seq. ID No. 1 (from Saccharomyces cerevisiae). Some organisms have a sequence shifted by insertion or deletion of some amino acids. In these sequences, the respective amino acid exchanged relates to the speaking same amino acid, but one or more amino acids higher or lower in the sequence.
  • the corresponding tryptophan is located at position 252 (see Adams et al., "Sequence identification of 2, 375 human brain genes", Nature 355 (6361), 632-634 (1992)), or at position 257 (see the sequence of Drosophila melanogaster, accession number 016797, from Chan et al.), or also 258 (see Nishi et al., "The primary structure of two proteins ins form the large ribosomal subunit of rice "; Biochim. Biophys. Acta 1216 (1), 110-112 (1993)), to name just a few examples.
  • the tryptophan 255 of Seq. ID.Nr. 1 corresponding tryptophan replaced.
  • the amino acid sequence has a cysteine or methionine instead of the tryptophan.
  • the tryptophan By replacing the tryptophan with an amino acid with a sulfur-containing side chain, particularly resistant cells are obtained. It is particularly favorable if the amino acid sequence has a cysteine instead of the tryptophan. This represents a particularly optimal exchange for trichothecene-resistant cells.
  • Another aspect of the present invention relates to an RPL3, the amino acid sequence of which at the site of tryptophan 255 has an amino acid with a basic side chain, so that the organism in which the mutated RPL3 is expressed has increased trichothecene resistance. If the tryptophan 255 is replaced by an amino acid with a basic side chain, particularly resistant cells are also produced, which at the same time have sufficient viability. Again, if the amino acid sequence is shifted, the corresponding tryptophan is exchanged.
  • the amino acid sequence has an arginine instead of the tryptophan.
  • the arginine is particularly resistant.
  • Another aspect of the present invention relates to an RPL3 whose amino acid sequence has a mutation at the site of histidine 256, so that the particular organism in which the mutated RPL3 is expressed has increased trichothecene resistance.
  • the histidine 256 can be replaced by any possible amino acid as long as the function of the RPL3 is guaranteed. Again, if the sequence is shifted, the corresponding histidine is exchanged.
  • the amino acid sequence preferably has an amino acid with an aromatic side chain instead of the histidine.
  • An amino acid with an aromatic side chain has a particularly high resistance requirement at this point, it being particularly favorable if the amino acid sequence has a tyrosine instead of the histidine.
  • the amino acid sequence of the RPL3 has a mutation as described above at two sites. Any conceivable combination can be possible, e.g. a mutation at the serine 2 site and another mutation at the proline 9 site or additionally a mutation at the tryptophan 255 site and / or a mutation at the histidine site 256. Mutants with at least two of the mutations described above can be even better Have resistance properties than the individual mutants, since they can be more resistant by at least one concentration level.
  • Optimal resistance of an organism is obtained if the amino acid sequence of the RPL3 has a mutation in the C-terminal region and one in the N-terminal region.
  • different combinations are possible, for example a mutation at the serine 2 site in combination with a mutation at the tryptophan 255 site or a mutation at the proline 9 site in combination with a mutation at the histidine 256 site or vice versa.
  • the double mutant P9L / W255R shows increased trichothecene resistance
  • any further mutations can be provided within the scope of this invention as long as they do not significantly reduce the activity of the RPL3, that is to say the viability of the mutated organism is not endangered.
  • other substitution, deletion and / or insertion mutations can be provided which are readily available to the person skilled in the art in this area and can be checked for their viability and resistance properties, above all using the methods described here.
  • an additional sequence is appended to the C-terminus of the amino acid sequence.
  • This additional sequence can e.g. introduced by means of PCR, whereby the sequence can be used for various functions, e.g. as an epitope for antigen-antibody reactions or a sequence that serves to detect the protein.
  • Another aspect of the present invention relates to a DNA molecule which codes for one of the RPL3 proteins described above.
  • it can also contain any other mutations, as long as it codes for an active, functional RPL3 with trichothecene resistance.
  • DNA molecule that comprises a partial sequence of the above-described DNA molecule, including the mutated region in each case.
  • This can include, for example, a sequence in the C region as well as a sequence in the N region of the RPL3, it is only important that it comprises at least one of the mutations described above which lead to trichothecene resistance and at least a length of 15-25 bp, in particular of over 25 bp.
  • this also includes the respective complementary sequences.
  • two partial sequences can be made available which are used as primers for a PCR reaction. This enables the specific mutated sequences to be amplified and thus, for example, detected.
  • a DNA molecule which is covalently associated with a detectable labeling substance is particularly preferred. These molecular markers are particularly useful for the detection of naturally present in overall 'netic resources or induced by classical mutation process variants a RPL3- gene one (useful) plant corresponding to one of the identified in yeast resistance-mediating mutations and lead to increased trichothecene resistance.
  • the DNA molecule binds to the homologous sequence and the labeling substance is subsequently detected.
  • This labeling substance can be, for example, a fluorescent, luminescent, radioactive substance and a non-isotropic label. This provides reagents which are useful for the detection, selection and quantification of homologous sequences in liquid samples but also in solid tissue samples, for example from plants, by means of hybridization processes or PCR processes.
  • Another aspect of the present invention relates to a biologically functional vector which comprises a DNA molecule described above.
  • An independent, reproducible vector is required for transformation in host cells, a suitable vector being able to be used depending on the host cell, transformation mechanism, task and size of the DNA molecule.
  • These vectors are well known to any person skilled in the art, so that all possible types of vectors are not listed in this application.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for producing trichothecene-tolerant recombinant cells, at least one DNA molecule according to the invention or a vector as described above being introduced into the cell and the mutated RPL3 being expressed.
  • the cell expresses recombinant RPL3 and thus has an increased resistance to trichothecene.
  • the DNA molecule or the vector can be introduced into the cell in various ways, for example by Agrobacterium-mediated transformation, by means of the biolistic method (particle gun), by electronics. troporation, or different methods of direct DNA transfer in protoplasts. These methods are also well known to any person skilled in the art, so that a detailed explanation of these methods can be dispensed with here.
  • the selection of a successful introduction of the DNA molecule into a cell can be carried out directly with a nutrient medium containing trichothecene (selection marker). Media can be used that contain a wide variety of compounds of the trichothecene class in the appropriate concentration range.
  • Another selection can e.g. by selection for a conventional transformation marker (e.g. antibiotic or herbicide resistance and subsequent screening for trichothecene resistance) or by coding the DNA molecule integrated in the cell for another protein that is visible or can be made. A successful transformed cell is thus visible (screening marker).
  • a conventional transformation marker e.g. antibiotic or herbicide resistance and subsequent screening for trichothecene resistance
  • Another protein e.g. the ß-glucuronidase, luciferase or green fluorescent protein from jellyfish.
  • a method for producing trichothecene-tolerant recombinant plants or plant cells is made available, at least one DNA molecule according to the invention or a vector described above being introduced into the plant or plant cells and the mutated RPL3 being expressed.
  • Any plant transformation technology a number of which have already been described and successfully used, is possible.
  • One possibility is direct DNA transfers, for example by means of chemical treatment, electroporation and in particular particle bombardment (method in which heavy metal particles carrying DNA material are shot directly at plant tissue with high acceleration). It is also possible to introduce the DNA into seeds under vacuum or to facilitate the penetration of DNA into specific plant tissue, possibly partially digested plant tissue, using microscopic needles or fibers.
  • Viral vectors can also be used to introduce the mutated RPL3 according to the invention into plants or cells.
  • the Ti plasmid with the Agrobacterium system can be used to transform the plant. Agrobacteria cause root neck galls in plants.
  • T-DNA recombinant DNA section
  • the T-DNA and thus also the inserted DNA molecule is stably incorporated into the chromosomal DNA of the cell, so that the genes of the T-DNA are expressed in the plant.
  • Plants have a special property; namely, they are able to develop from a (transformed) cell or from a protoblast into a complete plant that can be grown.
  • Different plant tissues can be transformed, e.g. an immature embryo, a callus from seeds, a meristem, etc.
  • plant is understood to mean any type of plant, in particular those which play a role in agriculture, e.g. Corn, wheat, barley, rice, soybeans, beans, cotton, tomatoes, tobacco.
  • a vector comprising a DNA encoding a mutated, recombinant RPL3 described above is transformed into a plant or plant cell, a plant with increased trichothecene resistance is thereby produced.
  • Another aspect of the present invention relates to cells which comprise a DNA molecule or a mutation described above in the genome, so that they express an RPL3 mutated according to the invention and thereby have a trichot-hecene tolerance.
  • the extent of the trichothecene tolerance depends on the respective mutation in the DNA molecule.
  • Certain mutations in the RPL3 gene can also make cells available that have trichothecene hypersensitivity. By providing different cell cultures with different hypersensitivity or tolerance properties, the type and amount of trichothecene contamination in substances can be detected, for example.
  • the cells preferably have a type B trichothecene tolerance and particularly preferably a deoxynivalenol (DON) tolerance. These cells can be used in particular in agriculture or for quality control in the manufacture of agricultural products.
  • DON deoxynivalenol
  • the cells have an increased trichothecene resistance of over 50%, preferably over 200%, compared to the respective wild type. This ensures toxin control even at higher toxin concentrations.
  • Another aspect of the present invention relates to a plant or plant cells which comprises or comprise in the genome a DNA molecule or mutation of the type described above, so that they express or express an RPL3 mutated according to the invention and thereby have a trichothecene tolerance or have.
  • These toxin-resistant plants are efficient in the natural defense against the fungus. In this way, plants are grown which are less susceptible to fungal contamination, so that the yield losses, e.g. for cereals, and the impairment of the crop can be greatly reduced.
  • the plant or plant cells preferably have a type B trichothecene tolerance, particularly preferably a DON tolerance.
  • the type B trichothecenes are particularly responsible for the contamination of agricultural products, DON being a representative of the type B trichothecenes of particular importance.
  • the plant or plant cells has or have an increased trichothecene resistance of more than 50%, preferably more than 200%, compared to the respective wild type.
  • the tolerance property of the plant or plant cells depends on the species the mutation, with some mutations causing a lower tolerance and others a higher tolerance.
  • the type of tolerance also depends on the mutation. Depending on the use of the plant or plant cells, a particular mutation may be particularly preferred.
  • the method for producing a DNA molecule of the type mentioned at the outset is characterized in that a wild-type RPL3 gene is point-mutated, after which the mutated gene is introduced into a test organism which then expresses mutated RPL3, the test organism subsequently comprising on a nutrient medium Trichothecen is cultivated and selected, after which mutated DNA molecules are isolated from the selected clones and purified and, if necessary, sequenced.
  • the wild-type RPL3 gene is mutated, either by random mutation methods or by targeted mutation, with individual bases being exchanged.
  • a single base can be exchanged, but two to three or more bases are also possible. It is only important that at least one amino acid, which is different from the wild-type gene, is formed by the base exchange.
  • the gene is introduced into a test organism using the methods already described above, which are known to the person skilled in the art, it being possible for the test organism to be, for example, yeast or bacteria.
  • the test organism which expresses the mutated RPL3 is cultivated on a nutrient medium comprising trichothecene of any type and in various concentrations.
  • test organisms that successfully take up the mutated RPL3 gene and express a functional RPL3 can comprehensively grow trichothecene on the nutrient medium if the mutation inserted into the RPL3 gene leads to trichothecene tolerance.
  • test organisms are obtained that can grow more or less well in this nutrient medium, including trichothecene.
  • Individual clones of the trichothecene-tolerant test organisms are selected and, if necessary, can be multiplied individually so that a sufficient amount of DNA can be isolated and purified. The respective DNA molecule can then be sequenced to check the mutation, using any known sequencing method.
  • the test organism into which the mutated DNA molecule is introduced has a hypersensitivity to trichothecenes.
  • the hypersensitivity of the test organism can be ensured, for example, by impairing detoxification enzymes, for example by deleting the corresponding gene. This enables the selection of the test organism to be carried out on a nutrient medium with a lower concentration of trichothecene. This reduces the consumption of trichotheces, which is cheaper, and also ensures better working conditions in the laboratory.
  • the test organism into which the mutated DNA molecule is introduced preferably has a disruption in the genomic RPL3. This is a simple and efficient method of obtaining a test organism that is hypersensitive to trichothecene without influencing any other properties of the test organism.
  • the mutated DNA molecule has at least one selection marker.
  • This can e.g. introduce antibiotic resistance in the test organism so that in addition to trichothecene, the nutrient medium contains the specific antibiotic.
  • Another possibility is e.g. represents a DNA molecule which codes for a protein which leads to the coloration or decolorization of the clone in a particular nutrient medium, see. e.g. the ADE2 marker. This additional selection of successfully introduced DNA ensures that these clones are clearly identified.
  • a particularly advantageous method is characterized in that the mutation is carried out using hydroxylamine (see L. Fishbein, WG Flamm and HL Falk (1970): Chemical Mutagens, Academic Press, NY; RS Sikorski and JD Boeke (1991): In vitro mutagenesis and plasmid shuffling: from cloned gene to mutant yeast, Methods in Enzymology 194, 302-318).
  • the hydroxylamine is added in a certain concentration, which leads to random mutations in DNA molecules.
  • DNA molecules are obtained which have mutations in a wide variety of locations. The more DNA molecules with different Mutations are obtained, the higher the probability that mutations that lead to trichothecene tolerance are obtained when the mutated RPL3 gene is expressed in the organism.
  • E. coli mutation strain e.g. XLI-Red
  • A. Greener, M. Callahan and B. Jerpseth An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain.
  • This E. coli strain has an extremely high spontaneous mutation rate for DNA molecules that are introduced into this strain.
  • These mutations are also based on the random principle, so that a number of DNA molecules with various mutations are obtained.
  • the nutrient medium for selecting the transformed host organisms particularly preferably comprises at least 100 ppm DON, preferably at least 200 ppm DON.
  • the nutrient medium for selecting the transformed host organisms particularly preferably comprises at least 100 ppm DON, preferably at least 200 ppm DON.
  • concentrations of 200 ppm DON successfully transformed test organisms can be selected, since the concentration is sufficient to prevent non-transformed test organisms from growing in this nutrient medium and, on the other hand, is not too high, so that successfully transformed test organisms with the desired mutations can grow in the DNA molecule.
  • these are preferably introduced into host cells, which are cultivated and selected on nutrient medium comprising trichothecene, after which mutated DNA molecules are in turn isolated and purified if necessary.
  • host cells can be other than the test organisms mentioned above, with the aim of producing certain trichothecene-tolerant cells, which can then be used for further purposes.
  • DNA molecules can in turn be isolated and purified from these host cells and subsequently sequenced.
  • these host cells can again be the same Cells like the test organisms mentioned above, for example to carry out further experiments.
  • the wild-type RPL3 gene is point mutated at the serine 2 and / or proline 9 and / or histidine 256 site. In this way, DNA molecules are obtained which lead to a particularly high resistance to trichothecene in the organism in which it is expressed.
  • the mutated DNA molecules are particularly preferably transformed in plants or plant cells.
  • This can e.g. the DNA molecules isolated from the above-mentioned test organism, but preferably the DNA molecules isolated from the above-mentioned host cells, since the resistance to trichothecene was confirmed by the repeated transformation into the host cells.
  • the transformation in plants or plant cells has already been described above, and in turn a wide variety of plants or plant cells can be transformed. This should make it possible to produce plants with improved properties for agriculture (increased resistance to trichothecenes, thereby increased resistance to trichothecene-producing fungi, and thus lower trichothecene residues in the crop).
  • a further aspect of the present invention relates to cells, with the exception of a Saccharomyces cerevisiae strain CLPL comprising a W255C mutation, which have been transformed with a mutated DNA molecule as described above, express mutant RPL3 and have a trichothecene tolerance.
  • the invention also relates to plants or plant cells which have been transformed with a mutated DNA molecule as described above, express mutated RPL3 and have a trichothecene tolerance.
  • the trichothecene tolerance of these transformed cells, plants or plant cells can relate to any possible trichothecene type, but preferably type A and type B. Also that The extent of trichothecene tolerance varies depending on the mutation in the DNA molecule.
  • FIG. 6 shows a list of partial sequences of RPL3 genes from different organisms, the site comprising the W255 and H256 being shown,
  • the plasmid pZGA121 (see FIG. 5), which is used as the E. coli yeast shuttle vector and which can complement an RPL3 mutation, comprises an EcoRI site into which the wild-type yeast (Saccharomyces cerevisiae) RPL3 gene was cloned. 6 shows partial sequences of RPL3 proteins from different organisms, it being clear that the sequence is conserved. The gene in the plasmid acts under its own promoter and can complement the function of an RPL3-disrupted yeast.
  • the plasmid pZGA121 additionally contains a yeast gene (ADE2), which serves as an indicator of the efficiency of the mutagenesis: If an intact ADE2 gene is introduced into an ade2 yeast strain, the resulting colony is white, is the mutant ADE2 * - However, the gene is defective, and the colony, like the ade2 mutant, turns red due to the accumulation of a pigmented precursor from adenine biosynthesis. Furthermore, the plasmid pZGA121 is conditionally unstable in yeast (on galactose medium), since a GAL1 promoter is placed next to the centromere and interferes with its function. The TRPl gene serves as a selection marker for the yeast transformation. In addition, as an antibiotic resistance, the plasmid contains the gene for the ⁇ -lactamase to be used in E. coli transformants can be cultivated on nutrient baths containing antibiotics.
  • ADE2 yeast gene
  • the plasmid was transformed into the E. coli strain XLI-Red.
  • This E. coli strain has a spontaneous mutation frequency that is approximately 5000 times higher than that of the wild-type strain.
  • the DNA that is transformed and amplified into this strain is continuously reproduced incorrectly and thus receives mutations in their sequence, with a mutation probability that is approximately the same for all bases.
  • 400 ⁇ l XLI-Red are mixed with 2 ⁇ g DNA and placed on ice for 30 minutes.
  • the plasmids are obtained from each pool (3.1.1.) And transformed into competent (CaCl 2 ) bacteria (E. coli) in order to obtain all clones in mutation-stable bacteria: The transformation was carried out as in 1).
  • solution I 50 mM glucose; 2 mM Tris-HCl (pH 8.0); 10 mM EDTA (pH 8.0) (shake for 10 min).
  • solution II 0.2 N NaOH; Mix 1% SDS
  • the mutagenized plasmid DNA molecules described above were used for the retransformation into the yeast stand YZGA315.
  • This yeast strain is derived from YPH252 and has the following properties:
  • YZGA315 MAT ⁇ ; ura3 leu2 his3 trpl ade2 lys2 rpl3:: LYS2; pdr5:: hisG; pZGA196 [URA3 -GAL1 -RPL3J
  • the transformed yeast strain YZGA315 has the following essential properties: the chromosomal wild-type RPL3 gene is disrupted (rpl3:: LYS2). Since RPL3 is an essential gene, the strain contains another modified RPL3 copy on plasmid pZGA196. The RPL3 gene on this plasmid is under the control of a GAL1 promoter. This promoter is inactive on glucose medium and consequently the strain YZGA315 cannot grow on media with glucose as the C source, but only on galactose media.
  • the strain also contains an inactivated PDR5 gene (pdr5:: hisG), which makes it hypersensitive to trichothecenes (PDR5 codes for an ABC transporter protein that is localized in the plasma membrane and toxin that has penetrated into the cell with ATP expenditure away) .
  • PDR5 codes for an ABC transporter protein that is localized in the plasma membrane and toxin that has penetrated into the cell with ATP expenditure away
  • yeasts are washed with a lithium-containing solution and mixed with polyethylene, they are able to take up foreign DNA.
  • DNA transformation is promoted by the presence of single-stranded carrier DNA (herring sperm DNA).
  • the yeast strain to be transformed is grown in a suitable medium (50 ml) at 30 ° C overnight. Depending on the growth of the yeast, the incubation period may need to be extended to 48 hours or more.
  • yeast suspension is centrifuged for 5 s and resuspended in 200 ⁇ l 1 x TE buffer (pH 7.5).
  • SC-Trp / ⁇ Ade plates (simplified): 1.43 g / 1 YNB (Yeast Nitrogen Base, Cat.No. 25685-033, GIBCO) 5.00 g / 1 NH 4 S0 4 , 10 ml / 1 stock solution (100 ⁇ concentrated) of the components (amino acids): Thr, Leu, His, Ile, Arg, Lys, adenine, uracil, no Trp; with a final concentration of 20 mg / 1, except Leu (60 mg / 1). Autoclave 2% agar and 2% glucose separately from the other ingredients and mix thoroughly before pouring.
  • YNB Yeast Nitrogen Base, Cat.No. 25685-033, GIBCO
  • Transformants which can grow on SC-TRP medium (with glucose as the C source) and which consequently have taken up a plasmid with a functional RPL3 gene are selected.
  • the trans Formants are then transferred to medium containing trichothecene and toxin-resistant mutants are selected.
  • yeast transformants were washed off the plates with liquid YPD (4 ml) and the pools were mixed thoroughly. Approx. 50 ⁇ l of this mixture were applied to YPD plates with 200 ppm DON (deoxynivalenol) and incubated at 30 ° C.
  • the plasmid can either be lost again (unstable on galactose medium), or first transferred from the yeast to E. coli and the test by transforming the Yeast strain YZGA315.
  • the mutation responsible for resistance can be identified by subcloning and DNA sequencing.
  • the resistance behavior of the yeast was confirmed by isolation of the plasmids from the selected yeast transformants, renewed transformation into fresh yeast cells and selection on YPD (+ DON200ppm) plates.
  • YPD 1% yeast extract (Cat.No. 70161, FLUKA) 2% peptone (from meat; 1.07224 MERCK) 2% dextrose (glucose; Cat.No. 49159, FLUKA)
  • the plasmids were obtained from the resistant yeast colonies with the nucleospin purification kit and purified. Sequencing was carried out according to the principle of the chain termination method using the ABI310 system from Perkin Elmer. In this system, the dideoxy NTPs responsible for chain termination are fluorescence-labeled and can therefore be distinguished from one another.
  • the reaction is carried out in one batch.
  • the samples are separated on a separation column in the device and each fragment is registered individually.
  • the batch is precipitated in a 1.5 ml Eppendorf with 50 ⁇ l 95% ethanol and 2 ⁇ l 3 M sodium acetate (pH 4.6) and placed on ice (-20 ° C.) for at least 10 minutes.
  • the batch can also be precipitated at -20 ° C. overnight or longer in order to obtain any higher yields of DNA.
  • DNA sequencing kit no. 403044 (contains TRR mix); PERKIN ELMER
  • the plasmids were obtained and purified using the nucleospin purification kit.
  • the primers already listed in Table 2 were available for sequencing the RPL3 gene of the plasmids.
  • the plasmids with double mutation were transformed into the yeast strain YZGA315 and separated.
  • TTC trichothecin
  • the yeasts were applied to a YPD plate with 200 ppm DON.
  • a YPD plate (0.4% acetone, 0.4% ethanol) was used as a zero control. This amount of ethanol and acetone corresponded to the amount of the two components which was contained in the highest concentration level (10 ppm) as a solvent for the toxin.
  • the double mutants generally seemed to grow worse than the single mutants.
  • the double mutants pARM8A49B, pARM34A49B and pARM34A14B were all more resistant than the single mutants by one concentration level (growth up to 0.9 ppm to 1 ppm).

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Abstract

Beschrieben wird ein ribosomales Protein L3 (RPL3), wobei dessen Aminosäuresequenz an der Stelle Serin 2 und/oder Prolin 9 und/oder Tryptophan 255 und/oder Histidin 256 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines mutierten DNA-Moleküls umfassend eine für RPL3 codierende Region, das in dem Organismus, in dem es exprimiert wird, zu einer erhöhten Trichothecen-Resistenz führt.

Description

Mutiertes ribosomales Protein L3
Die vorliegende Erfindung betrifft ein ribosomales Protein L3 (RPL3) , ein DNA-Molekül, das für dieses Protein codiert, einen biologisch funktionellen Vektor, umfassend das DNA-Molekül, ein Verfahren zur Herstellung von Trichothecen-toleranten rekombi- nanten Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, und Pflanzen.
Weiters betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls umfassend eine für RPL3 codierende Region, das in dem Organismus, in dem es exprimiert wird, zu einer erhöhten Trichothecen-Resistenz führt.
Trichothecene sind eine Gruppe von toxischen, sesguiterpenoiden, sekundären Metaboliten, welche hauptsächlich von pflanzenpatho- genen Pilzen, wie Trichothecium, Fusarium, Myrothetium, Tricho- derma, Stachybotrys gebildet werden. Insgesamt sind mehr als 180 verschiedene natürlich vorkommende Verbindungen verschiedener Gruppen isoliert worden. Meistens werden folgende vier Toxin- Gruppen beschrieben, die sich in ihrem chemischen Aufbau unterscheiden: Die größte Bedeutung haben die Gruppe A und B, die sich durch das Vorkommen einer Ketogruppe am C8 unterscheiden. Toxine der Gruppe C besitzen an der gleichen Stelle (zwischen C8 und C7) eine weitere Epoxygruppe. Die makrozyklischen Trichothecene werden in Gruppe D zusammengefasst .
Trichothecene spielen als Virulenzfaktor bei der Pflanzenpatho- genese von Pilzen eine große Rolle. Die toxische Wirkung der Trichothecene, die je nach Struktur der Trichothecene unterschiedlich hoch ist, beruht im Wesentlichen auf durch Bindung an ribosomale Untereinheiten verursachte Inhibierung der Translation (Cundliffe et al . , Inhibition of initiation, elongation and termination of eukaryotic protein synthesis by trichothecene fungal toxins; Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1977) , Vol. 11, Nr. 3, S. 491-499).
Das in Getreide wichtigste Mykotoxin ist Deoxynivalenol (DON) , ein Vertreter der Typ B-Trichothecene, wobei der TDI-Wert (tolerable daily intake) für Erwachsene und Kinder auf 3 μg DON/kg Körpergewicht bzw. 1,5 μg/kg geschätzt wird.
Die Kontamination wichtiger landwirtschaftlicher Produkte, wie Weizen, Gerste oder Mais mit Mykotoxinen, wie den Trichothece- nen, ist ein weltweites Problem. Ihre Verbreitung in diesen landwirtschaftlichen Produkten hat nicht nur beim unmittelbaren Verzehr dieser Lebensmittel durch den Menschen, sondern auch bei der Verfütterung an Nutztiere in der Landwirtschaft, negative Auswirkungen auf deren Gesundheit.
Trichothecen-Intoxikationen sind mit Brechreiz, Diarrhöe, Anore- xie, Ataxie, Leukocystose und nachfolgend schwerer Leukopenie, Entzündungen des Magen-Darm-Traktes, Zerstörung von Nervenzellen des Zentralnervensystems, Hämorrhagie des Herzmuskels, Läsionen von Lymphknoten, Testes und Thymus und Gewebsnekrosen verbunden.
Auch die chronische Aufnahme von geringen Mengen von Trichothe- cenen ist problematisch, da Effekte wie Beeinträchtigung des Immunsystems und Störungen des Neurotransmitterhaushaltes auftreten können (B. Rotter, D. Prelusky und J. Pestka, Toxicology of deoxynivalenol (vomitoxin) , J. Toxicol . Environ. Health 48 (1996) , 1-34) .
Die aussichtsreichste und einzige nachhaltige Lösung des Problems der Trichothecen-Kontamination von Lebensmitteln ist die Züchtung von Pflanzen, die erhöhte Resistenz gegen Fusarium-Ar- ten aufweisen und auch nach Befall nur niedrige Mykotoxin-Konzentrationen aufweisen. Es sind im verfügbaren Zuchtmaterial von Weizen, Gerste, etc. jedoch keine vollständigen Resistenzen bekannt, sondern nur polygen vererbte, quantitative Unterschiede. Dabei ist eine Erfahrung der Pflanzenzüchter, dass eine hohe Resistenz gegen DON in vitro stark mit hoher Feldresistenz gegen Fusarium (geringe visuell bonitierte Symptome) und niedrigem DON-Gehalt im Erntegut nach artifizieller Inokulation korreliert ist .
Es ist anzunehmen, dass DON als Protein Biosynthese- Inhibitor die aktive Abwehr der Pflanze unterdrückt und andererseits in Toxin-resistenteren Pflanzen die natürliche Abwehr gegen den Pilz effizienter ist.
Mit Hilfe einer semidominanten Mutante der Bäckerhefe Saccha- romyces cerevisiae Stamm CLP1, die resistent gegen Trichodermin, einem Vertreter der Trichothecene war, konnten Fried und Warner (Cloning of yeast gene for trichodermin resistance and ribosomal protein L3 , Proc. Natl . Acad. Sei., USA; Vol. 78, Nr. 1, S. 238- 242, Jänner 1981) zeigen, dass das ribosomale Protein L3 (RPL3) der Wirkungsort dieses Toxins ist, siehe auch L.D. Schultz und J.D. Friesen (1983) : Nucleotide sequence of the tcml gene (ribosomal protein L3) of Saccharomyces cerevisiae, J. Bacteriol 155, 8-14.
In der Schrift von Ohtake et al . ("Yeast Virus Propagation depends eritieally on free 60S ribosomal subunit concentration" ; Molecular and Cellular Biology, May 1995, (2772-2781)) wird beschrieben, dass Mutationen in verschiedenen MAK-Genen (z.B. im RPL3-Gen) zu einer Verringerung der freien 6OS Ribosomen-Unter- einheiten führen und sich auf die Bildung des Toxin-codierenden Satelliten x des L-A doppelsträngigen RNA-Virus auswirken.
Gemäß der Veröffentlichung von Peltz et al . ("Ribosomal Protein L3 mutants alter translational fidelity and promote rapid loss of the yeast killer virus", Molecular and Cellular Biology, Jan. 1999 (384-391)) führen Mutationen im RPL3-Gen zu einer Verringerung der Translation des Mx Killer-Virus.
In der Schrift von Liebich et al . ("Two genes encoding ribosomal protein L3 of Schizosaccharomyces pombe and their proximal Promoter regions" , Gene 142 (1994), (119-122)) wird die geklonte Sequenz von zwei Genen (RPL3-1 und RPL3-2) beschrieben. Diese Sequenzen weisen ein Sequenzfragment auf, das 75% Identität zu einem Sequenzfragment des Saccharomyces cerevisae RPL3-Gens zeigt .
Die Schrift von Steel et al . ("Sequence and developmental regulation of the gene that encodes the Dictyostelium discoideum L3 ribosomal protein", Gene 162 (1995), (123-128)) betrifft genomische und rekombinante Plasmide, die für das RPL3-Protein von Dictyostelium discoideum (Dd) codieren. Die Sequenzen dieser Plasmide weisen einen hohen Grad an Homologie zu Genen von RPL3- Proteinen von niederen und hohen Eukaryoten auf .
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, aufgrund von molekular-biologischen Untersuchungen die Ursache der Resistenz festzustellen und aufgrund dieser Feststellung weitere zur Resistenz führende Mutationen des ribosomalen Proteins L3 zur Verfügung zu stellen, so dass Trichothecen-resistente Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, sowie Trichothecen-resistente Pflanzen erhalten werden können. Es sollen weiters DNA-Moleküle, codierend für das mutierte Protein, zur Verfügung gestellt werden.
Das erfindungsgemäße RPL3 der eingangs angeführten Art ist dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an der Stelle Serin 2 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in welchem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Tricho- thecen-Resistenz aufweist.
Diese Mutationsstelle in der Aminosäuresequenz zur Herstellung von Trichothecen-resistenten Organismen kann beispielsweise durch Mutation eines gut etablierten Labororganismus, wie von Saccharomyces cerevisiae, anschließender Selektion in Trichothe- cen-hältigem Nährboden und Sequenzieren der resistenten Stämme gefunden. Dabei ist jede Mutation an der Serin 2-Stelle denkbar, solange das RPL3 weiterhin funktionsfähig bleibt. Eine Mutation an der Serin 2-Stelle der Aminosäuresequenz kann bei RPL3-Proteinen eines jeden Organismus durchgeführt werden, z.B. bei Säugern, Pflanzen, Pilzen sowie Mikroorganismen. Dabei sind diese Begriffe im weitesten Sinn zu verstehen, so dass alle Organismen bzw. Zellen davon betroffen sind, die ein RPL3 aufweisen.
Unter Trichothecen-Resistenz wird eine Resistenz gegen einen, mehrere oder alle Trichothecen-Typen verstanden, insbesondere gegen Typ B und DON, wobei Zellen, die das mutierte RPL3-Gen enthalten, bei bestimmten für Wildtypen inhibitorischen Trichothecen-Konzentrationen noch wachsen können. Diese mutierten Zellen weisen vorzugsweise eine 50 % höhere Resistenz, besonders bevorzugt eine 200 % höhere Resistenz, gegen Trichothecene, verglichen mit den jeweiligen Wildtypen, auf. Ein vorteilhaftes RPL3 weist an der Stelle Serin 2 eine Aminosäure mit einer aliphatischen Seitenkette auf.
Vorzugsweise umfasst das RPL3 eine Aminosäuresequenz, die an Stelle des Serins 2 ein Prolin aufweist. Wurde das Serin gegen ein Prolin ausgetauscht, weisen die Zellen mit diesem rekombi- nanten RPL3 eine besonders hohe Resistenz gegenüber Trichothecen auf .
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft ein RPL3 , dessen Aminosäuresequenz an der Stelle Prolin 9 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist. Auch hier kann Prolin durch jegliche Aminosäure ausgetauscht werden, solange das Protein aktiv bleibt. Besonders bevorzugt ist ein RPL3, dessen Aminosäuresequenz an Stelle des Prolins eine andere Aminosäure mit aliphatischer Seitenkette aufweist. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Aminosäuresequenz an Stelle des Prolins ein Leucin aufweist. Durch diese Mutation wird ein re- kombinanter Organismus erhalten, der resistent gegenüber Tricho- thecenen ist .
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein RPL3 , ausgenommen RPL3 aus Saccharomyces cerevisiae Stamm CLPl, dessen Aminosäuresequenz an der Stelle des Tryptophans 255 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist. Durch eine Mutation an dieser Stelle, wobei das Tryptophan durch jegliche andere Aminosäure ausgetauscht werden kann, werden Organismen zur Verfügung gestellt, die eine gegenüber Trichothece- nen höhere Resistenz um über 50 %, insbesondere über 200 %, verglichen mit dem Wildtyp aufweisen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Nummerierung der Aminosäuresequenz entsprechend der Nummerierung der Aminosäuren der Seq. ID.Nr.1 (aus Saccharomyces cerevisiae). Manche Organismen weisen eine durch Insertion bzw. Deletion einiger Aminosäuren verschobene Sequenz auf. Bei diesen Sequenzen bezieht sich die jeweilige ausgetauschte Aminosäure auf die ent- sprechende gleiche Aminosäure, die sich jedoch um eine oder mehrere Aminosäuren weiter oben oder unten in der Sequenz befindet.
Bei manchen Organismen befindet sich das entsprechende Tryptophan an der Stelle 252 (s. Adams et al . , "Sequence identifica- tion of 2, 375 human brain genes", Nature 355 (6361), 632-634 (1992)), bzw. an der Stelle 257 (s. die Sequenz von Drosophila melanogaster, Hinterlegungsnummer 016797, von Chan et al . ) , oder auch 258 (s. Nishi et al . , "The primary structure of two prote- ins form the large ribosomal subunit of rice"; Biochim. Biophys . Acta 1216 (1), 110-112 (1993)), um nur einige Beispiele zu nennen. Selbstverständlich wird gemäß der vorliegenden Erfindung jeweils das dem Tryptophan 255 der Seq. ID.Nr. 1 entsprechende Tryptophan ersetzt.
Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Aminosäuresequenz an Stelle des Tryptophans ein Cystein oder Methionin aufweist . Durch den Ersatz des Tryptophans mit einer Aminosäure mit schwefelhaltiger Seitenkette werden besonders resistente Zellen erhalten. Besonders günstig ist es, wenn die Aminosäuresequenz anstelle des Tryptophans ein Cystein aufweist. Dies stellt einen für Trichothecen-resistente Zellen besonders optimalen Austausch dar.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein RPL3 , dessen Aminosäuresequenz an der Stelle des Tryptophans 255 eine Aminosäure mit basischer Seitenkette aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist. Wird das Tryptophan 255 durch eine Aminosäure mit basischer Seitenkette ersetzt, werden ebenfalls besonders resistente Zellen erzeugt, die gleichzeitig eine ausreichende Lebensfähigkeit aufweisen. Auch hier gilt wiederum, dass bei verschobener Aminosäuresequenz das jeweilige entsprechende Tryptophan ausgetauscht wird.
Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Aminosäuresequenz an Stelle des Tryptophans ein Arginin aufweist. Das Arginin wirkt an dieser Stelle besonders resistenzfordernd. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein RPL3, dessen Aminosäuresequenz an der Stelle des Histidins 256 eine Mutation aufweist, so dass der jeweilige Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist. Dabei kann das Histidin 256 durch jede mögliche Aminosäure ersetzt werden, solange die Funktion des RPL3 gewährleistet ist. Auch hier gilt wiederum, dass bei verschobener Sequenz das jeweils entsprechende Histidin ausgetauscht wird.
Vorzugsweise weist die Aminosäuresequenz an Stelle des Histidins eine Aminosäure mit einer aromatischen Seitenkette auf. Eine Aminosäure mit aromatischer Seitenkette wirkt an dieser Stelle besonders resistenzfordernd, wobei es besonders günstig ist, wenn die Aminosäuresequenz an Stelle des Histidins ein Tyrosin aufweist. Durch den Ersatz von Histidin durch Tyrosin bleibt die Aktivität des RPL3 erhalten, wobei eine hohe Trichothecen-Resistenz erhalten wird.
Für eine hohe Resistenz ist es weiters günstig, wenn die Aminosäuresequenz des RPL3 an zwei Stellen eine Mutation wie oben beschrieben aufweist. Dabei kann jede erdenkliche Kombination möglich sein, z.B. eine Mutation an der Stelle Serin 2 und eine weitere Mutation an der Stelle Prolin 9 bzw. zusätzlich eine Mutation an der Stelle des Tryptophans 255 und/oder eine Mutation an der Stelle des Histidins 256. Mutanten mit zumindest zwei der oben beschriebenen Mutationen können noch bessere Resistenzeigenschaften aufweisen als die Einzelmutanten, da sie um zumindest eine Konzentrationsstufe resistenter sein können.
Eine optimale Resistenz eines Organismus wird dadurch erhalten, dass die Aminosäuresequenz des RPL3 eine Mutation im C-termina- len Bereich und eine im N-terminalen Bereich aufweist. Auch hier sind wieder verschiedene Kombinationen möglich, so z.B. eine Mutation an der Stelle Serin 2 in Kombination mit einer Mutation an der Stelle Tryptophan 255 bzw. eine Mutation an der Stelle Prolin 9 in Kombination mit einer Mutation an der Stelle Histidin 256 oder umgekehrt. Die Doppelmutante P9L/W255R zeigt eine erhöhte Trichothecen-Resistenz, die Doppelmutante mit dem Allel S2P/W255R weist besonders hohe Resistenzeigenschaften auf. Bei all diesen oben beschriebenen Mutationen handelt es sich dabei um für die Trichothecen-Resistenz entscheidende Mutationen. Es ist selbstverständlich, dass jegliche weitere Mutationen im Rahmen dieser Erfindung vorgesehen sein können, solange sie die Aktivität des RPL3 nicht wesentlich vermindern, d.h. die Lebensfähigkeit des mutierten Organismus nicht gefährdet wird. Es können dabei z.B. andere Substitutions- , Deletions- und/oder Inser- tionsmutationen vorgesehen sein, die für den Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres erhältlich sind und auf ihre Lebensfähigkeit und Resistenzeigenschaften vor allem mit den hierin dargestellten Methoden überprüft werden können.
Weiters kann es besonders günstig sein, wenn am C-Terminus der Aminosäuresequenz eine zusätzliche Sequenz angehängt ist. Diese zusätzliche Sequenz kann z.B. mittels PCR eingeführt werden, wobei die Sequenz für verschiedene Funktionen eingesetzt werden kann, z.B. als Epitop für Antigen-Antikδrperreaktionen bzw. eine Sequenz, die zum Nachweis des Proteins dient.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein DNA- Molekül, das für eines der oben beschriebenen RPL3-Proteine codiert. Neben den Mutationen, die zum Austausch der oben genannten Aminosäuren führen, kann es auch jegliche andere Mutationen beinhalten, solange es für ein aktives, funktionsfähiges RPL3 mit Trichothecen-Resistenz codiert.
Von Vorteil ist weiters ein DNA-Molekül, das eine Teilsequenz des oben beschriebenen DNA-Moleküls, inklusive des jeweils mutierten Bereiches, umfasst. Dieses kann z.B. eine Sequenz im C- Bereich als auch eine Sequenz im N-Bereich des RPL3 umfassen, wichtig ist lediglich, dass es zumindest eine der oben beschriebenen Mutationen, die zur Trichothecen-Resistenz führen, umfasst und zumindest eine Länge von 15-25 bp, insbesondere von über 25 bp, aufweist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind hierunter auch die jeweiligen Komplementärsequenzen zu verstehen. Es können z.B. zwei Teilsequenzen zur Verfügung gestellt werden, die als Primer für eine PCR-Reaktion verwendet werden. Dadurch können die spezifischen mutierten Sequenzen amplifiziert und so z.B. nachgewiesen werden. Besonders bevorzugt ist ein DNA-Molekül, das kovalent mit einer nachweisbaren Markierungssubstanz assoziiert ist. Diese molekularen Marker sind insbesondere nützlich zum Auffinden von in ge- ' netischen Resourcen natürlicherweise vorhandenen oder durch klassische Mutationsverfahren induzierte Varianten eines RPL3- Gens einer (Nutz) pflanze, die einer der in Hefe identifizierten resistenzvermittelnden Mutationen entsprechen und zu erhöhter Trichothecen-Resistenz führen. Das DNA-Molekül bindet an die homologe Sequenz und die Markierungssubstanz wird in der Folge nachgewiesen. Diese Markierungssubstanz kann beispielsweise eine fluoreszierende, lumineszierende, radioaktive Substanz sowie eine nichtisotrope Markierung sein. Dadurch werden Reagentien bereitgestellt, die für den Nachweis, die Selektion und Quantifizierung von homologen Sequenzen in Flüssigkeitsproben aber auch in festen Gewebeproben, z.B. von Pflanzen, durch Hybridi- sierungsverfahren oder PCR-Verfahren nützlich sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen biologisch funktioneilen Vektor, der ein oben beschriebenes DNA- Molekül umfasst. Zur Transformation in Wirtsszellen ist ein eigenständiger vermehrungsfähiger Vektor notwendig, wobei je nach Wirtszelle, Transformationsmechanismus, Aufgabe und Größe des DNA-Moleküls ein passender Vektor verwendet werden kann. Diese Vektoren sind jedem Fachmann bestens bekannt, so dass auf eine Aufzählung aller möglichen Vektorenarten in dieser Anmeldung verzichtet wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Trichothecen-toleranten rekombinanten Zellen, wobei zumindest ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül oder ein Vektor wie oben beschrieben in die Zelle eingeschleust und das mutierte RPL3 exprimiert wird.
Wird das erfindungsgemäße DNA-Molekül oder der Vektor in eine Zelle effizient eingeschleust, exprimiert die Zelle rekombinan- tes RPL3 und weist somit eine erhöhte Trichothecen-Resistenz auf. Das Einschleusen des DNA-Moleküls oder des Vektors in die Zelle kann auf unterschiedliche Arten bewerkstelligt werden, beispielsweise durch Agrobacterium-vermittelte Transformation, mittels des biolistischen Verfahrens (particle gun) , durch Elek- troporation, oder verschiedene Methoden des direkten DNA-Transfers in Protoplasten. Auch diese Methoden sind jedem Fachmann bestens bekannt, so dass auf eine detaillierte Erläuterung dieser Methoden hier verzichtet werden kann. Die Selektion einer erfolgreichen Einschleusung des DNA-Moleküls in eine Zelle kann direkt mit Trichothecen-hältigem Nährboden durchgeführt werden (Selektions-Marker) . Dabei können Medien verwendet werden, die unterschiedlichste Verbindungen der Trichothecen-Klasse im jeweiligen sinnvollen Konzentrationsbereich enthalten.
Eine weitere Selektion kann z.B. durch Selektion auf einen konventionellen Transformationsmarker (z.B. Antibiotika- oder Herbizidresistenz und anschließendes Screening auf Trichothecen-Resistenz) erfolgen oder auch dadurch, dass das in die Zelle integrierte DNA-Molekül für ein weiteres Protein codiert, das sichtbar ist oder gemacht werden kann. Somit ist eine erfolgreiche transformierte Zelle sichtbar (Screening-Marker) . Solche Proteine sind z.B. die ß-Glucuronidase, Luciferase oder Grünfluoreszenz-Protein aus Quallen.
Weiters wird ein Verfahren zur Herstellung von Trichothecen-to- leranten rekombinanten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen zur Verfügung gestellt, wobei zumindest ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül oder ein oben beschriebener Vektor in die Pflanze bzw. Pflanzenzellen eingeschleust und das mutierte RPL3 exprimiert wird.
Es ist jede Pflanzen-Transformations-Technologie, von der bereits eine Reihe beschrieben und erfolgreich eingesetzt wurden, möglich. Eine Möglichkeit sind direkte DNA-Transfers, so z.B. mittels chemischer Behandlung, Elektroporation und insbesondere Partikel-Bombardement (Methode, bei der schwere Metallpartikel, die DNA-Material tragen, mit hoher Beschleunigung direkt auf Pflanzengewebe geschossen werden) . Weiters ist es möglich, die DNA in Samen unter Vakuum einzuschleusen oder mittels mikroskopischer Nadeln oder Fasern die Penetration von DNA in spezifische Pflanzengewebe, möglicherweise zum Teil verdautes Pflanzengewebe, zu erleichtern. Auch virale Vektoren können zum Einschleusen des erfindungsgemäßen mutierten RPL3 in Pflanzen bzw. -zellen eingesetzt werden. Zur Transformation der Pflanze kommt z.B. das Ti-Plasmid mit dem Agrobacteriumsystem in Frage . Agrobakterien verursachen bei Pflanzen Wurzelhals-Gallen. Wenn Agrobakterien eine verletzte Pflanze infizieren, gelangen die Bakterien selbst nicht in die Pflanze sondern sie schleusen den rekombinanten DNA-Abschnitt, die sogenannte T-DNA aus dem ringförmigen extrachromosomalen Tumor-induzierenden Ti-Plasmid in die Pflanzenzellen ein. Die T- DNA und damit auch das darin eingefügte DNA-Molekül wird stabil in die chromosomale DNA der Zelle eingebaut, so dass die Gene der T-DNA in der Pflanze exprimiert werden. Pflanzen weisen eine besondere Eigenschaft auf; sie sind nämlich in der Lage, sich aus einer (transformierten) Zelle bzw. aus einem Protoblasten zu einer vollständigen Pflanze wieder zu entwickeln, die gezüchtet werden kann.
Verschiedene Pflanzengewebe können transformiert werden, so z.B. ein ungereiftes Embryo, ein Kallus aus Samen, ein Meristem, etc.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "Pflanze" jede Pflanzenart verstanden, insbesondere solche, die in der Landwirtschaft eine Rolle spielen, z.B. Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sojabohnen, Bohnen, Baumwolle, Tomaten, Tabak.
Wird ein Vektor umfassend eine DNA, die ein oben beschriebenes mutiertes, rekombinantes RPL3 codiert, in eine Pflanze bzw. Pflanzenzelle transformiert, so wird dadurch eine Pflanze mit erhöhter Trichothecen-Resistenz hergestellt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Zellen, die im Genom ein oben beschriebenes DNA-Molekül bzw. eine oben beschriebene Mutation umfassen, so dass sie ein erfindungsgemäß mutiertes RPL3 exprimieren und dadurch eine Trichot-hecen-Tole- ranz aufweisen. Das Ausmaß der Trichothecen-Toleranz hängt dabei von der jeweiligen Mutation im DNA-Molekül ab. Durch bestimmte Mutationen im RPL3-Gen können weiters Zellen zur Verfügung gestellt werden, die eine Trichothecen-Hypersensitivität aufweisen. Durch das Vorsehen verschiedener Zellkulturen mit unterschiedlichen Hypersensitivitäts- bzw. Toleranzeigenschaften können z.B. die Art und Menge der Trichothecen-Kontamination in Stoffen nachgewiesen werden. Vorzugsweise weisen die Zellen eine Typ B-Trichothecen-Toleranz und besonders bevorzugt eine Deoxynivalenol (DON) -Toleranz auf. Diese Zellen können insbesondere in der Landwirtschaft bzw. bei der Qualitätskontrolle bei der Herstellung von Landwirtschafts- produkten eingesetzt werden.
Dabei ist es besonders günstig, wenn die Zellen eine erhöhte Trichothecen-Resistenz von über 50 %, vorzugsweise über 200 %, verglichen mit dem jeweiligen Wildtyp aufweisen. Dies gewährleistet eine Toxin-Kontrolle auch bei höheren Toxin-Konzentratio- nen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Pflanze bzw. Pflanzenzellen, die im Genom ein oben beschriebenes DNA-Molekül bzw. eine derartige Mutation umfasst bzw. umfassen, so dass sie ein erfindungsgemäß mutiertes RPL3 exprimiert bzw. exprimieren und dadurch eine Trichothecen-Toleranz aufweist bzw. aufweisen. Diese Toxin-resistenten Pflanzen sind in der natürlichen Abwehr gegen den Pilz effizient. Auf diese Weise werden Pflanzen gezüchtet, die weniger anfällig auf Pilzkontaminationen sind, so dass dadurch die Ertragseinbußen, z.B. bei Getreide, und die Wertminderung des Erntegutes stark verringert werden.
Vorzugsweise weist bzw. weisen die Pflanze bzw. die Pflanzenzellen eine Typ B-Trichothecen-Toleranz, besonders bevorzugt eine DON-Toleranz auf. Die Typ B-Trichothecene sind wie oben bereits beschrieben, besonders für die Kontamination landwirtschaftlicher Produkte verantwortlich, wobei DON ein Vertreter der Typ B- Trichothecene von besonderer Wichtigkeit ist. Durch das Zurver- fügungstellen von Trichothecen-toleranten Pflanzenzellen können Trichothecen-tolerante Pflanzen herangezüchtet werden, wobei die Typ B-Trichothecen-toleranten Pflanzen und insbesondere die DON- toleranten Pflanzen für die Landwirtschaft von Bedeutung sind.
Dabei ist es von besonderem Vorteil, wenn die Pflanze bzw. die Pflanzenzellen eine erhöhte Trichothecen-Resistenz von über 50 %, vorzugsweise über 200 %, verglichen mit dem jeweiligen Wildtyp aufweist bzw. aufweisen. Hierbei hängt wiederum die Toleranzeigenschaft der Pflanze bzw. der Pflanzenzellen von der Art der Mutation ab, wobei manche Mutationen eine geringere Toleranz herbeiführen und andere wiederum eine höhere Toleranz . Auch ist der Toleranztyp von der Mutation abhängig. Dabei kann je nach Einsatz der Pflanze bzw. Pflanzenzellen jeweils eine bestimmte Mutation besonders bevorzugt sein.
Das Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls der eingangs angeführten Art ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Wildtyp- RPL3-Gen punktmutiert wird, wonach das mutierte Gen in einen Testorganismus eingeschleust wird, das daraufhin mutiertes RPL3 exprimiert, wobei der Testorganismus anschließend auf einem Nährmedium umfassend Trichothecen kultiviert und selektiert wird, wonach mutierte DNA-Moleküle aus den selektierten Klonen isoliert und gereinigt und gegebenenfalls sequenziert werden.
Das Wildtyp-RPL3-Gen wird mutiert, entweder durch Zufallsmutationsmethoden oder auch zielgerichtete Mutation, wobei einzelne Basen ausgetauscht werden. Es kann dabei eine einzige Base ausgetauscht werden, möglich sind aber auch zwei bis drei oder mehr Basen. Wichtig ist dabei lediglich, dass zumindest eine, verglichen zum Wildtyp-Gen andere Aminosäure durch den Basenaustausch entsteht. Das Gen wird mit Hilfe von den oben bereits beschriebenen Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, in einen Testorganismus eingeschleust, wobei der Testorganismus z.B. Hefe oder Bakterien sein kann. Der Testorganismus, der das mutierte RPL3 exprimiert, wird auf einem Nährmedium umfassend Trichothecen irgendeines Typs und in verschiedenen Konzentrationen kultiviert. Lediglich die Testorganismen, die das mutierte RPL3-Gen erfolgreich aufgenommen und ein funktionelles RPL3 exprimieren, können auf dem Nährmedium umfassend Trichothecen wachsen, wenn die in das RPL3-Gen eingefügte Mutation zu einer Trichothecen-Toleranz führt. Je nach Mutation werden Testorganismen erhalten, die mehr oder weniger gut in diesem Nährmedium umfassend Trichothecen wachsen können. Einzelne Klone der Trichothecen-toleranten Test- organismen werden ausgewählt, können gegebenenfalls einzeln vermehrt werden, so dass eine ausreichende Menge an DNA isoliert und gereinigt werden kann. Anschließend kann zur Überprüfung der Mutation das jeweilige DNA-Molekül sequenziert werden, wobei jede bekannte Sequenziermethode angewandt werden kann. Dabei ist es besonders von Vorteil, wenn der Testorganismus, in den das mutierte DNA-Molekül eingeschleust ist, eine Hypersensi- tivität gegenüber Trichothecene aufweist. Die Hypersensitivität des Testorganismus kann z.B. durch Beeinträchtigung von Detoxi- fikationsenzymen, etwa durch Deletion des entsprechenden Gens, gewährleistet werden. Dadurch wird ermöglicht, dass die Selektion des Testorganismus auf einem Nährmedium mit einer geringeren Konzentration an Trichothecen durchgeführt werden kann. Dies verringert den Verbrauch an Trichothecen, was kostengünstiger ist, und auch bessere Arbeitsbedingungen im Labor sind dadurch gewährleistet .
Vorzugsweise weist der TestOrganismus, in den das mutierte DNA- Molekül eingeschleust ist, eine Disruption im genomischen RPL3 auf. Dies ist eine einfache und effiziente Methode, einen gegenüber Trichothecen hypersensitiven Testorganismus zu erhalten, ohne jegliche andere Eigenschaften des Testorganismus zu beeinflussen.
Dabei ist es weiters günstig, wenn das mutierte DNA-Molekül zumindest einen Selektions-Marker aufweist. Dies kann z.B. eine Antibiotika-Resistenz im Testorganismus einführen, so dass zusätzlich zum Trichothecen das Nährmedium das bestimmte Antibiotika umfasst. Eine andere Möglichkeit stellt z.B. ein DNA-Molekül dar, das für ein Protein codiert, das in einem bestimmten Nährmedium zur Färbung bzw. Entfärbung des Klons führt, s. z.B. den ADE2-Marker. Durch diese zusätzliche Selektion von erfolgreich eingeschleuster DNA wird eine eindeutige Erkennung dieser Klone sichergestellt.
Ein besonders vorteilhaftes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation mittels Hydroxylamin durchgeführt wird (s. L. Fishbein, W.G. Flamm und H.L. Falk (1970): Chemical Mutagens, Academic Press, NY; R.S. Sikorski und J.D. Boeke (1991) : In vitro mutagenesis and plasmid shuffling: from cloned gene to mutant yeast, Methods in Enzymology 194, 302-318) . Das Hydroxylamin wird in einer bestimmten Konzentration zugesetzt, was zu Zufallsmutationen in DNA-Molekülen führt. Dadurch werden DNA-Moleküle erhalten, die Mutationen an den verschiedensten Stellen aufweisen. Je mehr DNA-Moleküle mit unterschiedlichen Mutationen erhalten werden, umso höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass Mutationen, die zur Trichothecen-Toleranz führen, wenn das mutierte RPL3-Gen im Organismus exprimiert wird, erhalten werden.
Eine weitere günstige Möglichkeit besteht darin, dass die Mutation in einem E. coli-Mutationsstamm, z.B. XLI-Red, durchgeführt wird (s. A. Greener, M. Callahan und B. Jerpseth: An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. In: Methods in Molecular Biology, Bd. 57 (In vitro Mutagenesis Protocols, Hrsg. M.K. Trower) , S. 375-385, Humana Press, Totowa, NJ) . Dieser E. coli-Stamm weist eine ausgesprochen hohe Spontan- Mutationsrate für DNA-Moleküle, die in diesen Stamm eingeschleust werden auf . Auch diese Mutationen beruhen auf dem Zufallsprinzip, so dass eine Reihe von DNA-Molekülen mit verschiedensten Mutationen gewonnen werden.
Besonders bevorzugt umfasst das Nährmedium zur Selektion der transformierten Wirtsorganismen zumindest 100 ppm DON, vorzugsweise zumindest 200 ppm DON. Insbesondere bei Konzentrationen von 200 ppm DON können erfolgreich transformierte Testorganismen selektiert werden, da die Konzentration ausreichend ist, um nicht-transformierte Testorganismen an einem Wachstum in diesem Nährmedium zu hindern, und andererseits nicht zu hoch ist, so dass erfolgreich transformierte Testorganismen mit den gewünschten Mutationen im DNA-Molekül wachsen können.
Vorzugsweise werden nach Isolierung und Reinigung der mutierten DNA-Moleküle diese in Wirtszellen eingeschleust, die auf Nährmedium umfassend Trichothecen kultiviert und selektiert werden, wonach mutierte DNA-Moleküle gegebenenfalls wiederum isoliert und gereinigt werden. Diese Wirtszellen können andere sein als die oben genannten Testorganismen, mit dem Ziel, bestimmte Trichothecen-tolerante Zellen herzustellen, die dann zu weiteren Zwecken dienen können. Zur Sicherstellung, dass diese eingeschleusten DNA-Moleküle dieselbe Trichothecen-Toleranz-Mutation aufweisen, können aus diesen Wirtszellen DNA-Moleküle wiederum isoliert und gereinigt und in der Folge sequenziert werden. Selbstverständlich können diese Wirtszellen wiederum dieselben Zellen wie die obengenannten Testorganismen sein, etwa um weitere Versuche durchzuführen.
Gemäß einem besonders vorteilhaften Verfahren wird das Wildtyp- RPL3-Gen an der Stelle Serin 2 und/oder Prolin 9 und/oder Histidin 256 punktmutiert. Auf diese Weise werden DNA-Moleküle erhalten, die in dem Organismus, in dem es exprimiert wird, zu einer besonders hohen Trichothecen-Resistenz führen.
Besonders bevorzugt werden nach Isolierung und Reinigung der mutierten DNA-Moleküle diese in Pflanzen bzw. Pflanzenzellen transformiert. Dies können z.B. die aus dem oben genannten Testorganismus isolierten DNA-Moleküle sein, vorzugsweise sind es jedoch die aus den oben genannten Wirtszellen isolierten DNA-Moleküle, da durch die nochmalige Transformation in die Wirtszellen die Resistenz gegenüber Trichothecen bestätigt wurde. Die Transformation in Pflanzen bzw. Pflanzenzellen wurde bereits oben beschrieben, wobei wiederum die unterschiedlichsten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen transformiert werden können. Dadurch sollte es möglich sein, Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften für die Landwirtschaft herzustellen (erhöhte Resistenz gegen Trichothecene, dadurch erhöhte Resistenz gegen Trichothecen-pro- duzierende Pilze, und somit geringere Trichothecen-Ruckstände im Erntegut) .
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Zellen, ausgenommen eine W255C-Mutation umfassende Saccharomyces cerevisiae-Zellen Stamm CLPl, die mit einem mutierten DNA-Molekül wie oben beschrieben, transformiert wurden, mutiertes RPL3 exprimie- ren und eine Trichothecen-Toleranz aufweisen.
Ebenfalls betrifft die Erfindung Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die mit einem mutierten DNA-Molekül wie oben beschrieben transformiert wurden, mutiertes RPL3 exprimieren und eine Trichothecen-Toleranz aufweisen.
Die Trichothecen-Toleranz dieser transformierten Zellen, Pflanzen bzw. -Pflanzenzellen kann dabei jeden möglichen Trichothe- cen-Typ betreffen, vorzugsweise jedoch Typ A und Typ B. Auch das Ausmaß der Trichothecen-Toleranz ist unterschiedlich, je nach Mutation im DNA-Molekül.
Die vorliegende Erfindung wird nun an Hand von den Beispielen sowie den in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispielen, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, näher erläutert, wobei die
Fig. 1 die allgemeine Formel der Gruppe A-Trichothecene,
Fig. 2 die allgemeine Formel der Gruppe B-Trichothecene,
Fig. 3 die allgemeine Formel der Gruppe C-Trichothecene,
Fig. 4 die allgemeine Gruppe der Typ D-Trichothecene,
Fig. 5 das Plasmid pZGA121, und
Fig. 6 eine Liste von Teilsequenzen von RPL3-Genen verschiedener Organismen, wobei die Stelle umfassend das W255 und H256 gezeigt ist,
darstellen. Dabei sind in Tabelle 1 die Seitengruppen der Trichothecene gezeigt.
T a b e l l e
Seitengruppen der Trichothecene in Fig. 1-4
Figure imgf000019_0001
B e i s p i e l 1 : Mutation von PL3 -Genen mittels E. coli- Stamm XLI-Red
Das Plasmid pZGA121 (siehe Fig. 5), dass als E. coli-Hefe-Shutt- levektor verwendet wird und eine RPL3-Mutation komplementieren kann, umfasst eine EcoRI-Schnittstelle, in die das Wildtyp-Hefe (Saccharomyces cerevisiae) RPL3-Gen cloniert wurde. In Fig. 6 sind Teilsequenzen von RPL3-Proteinen aus verschiedenen Organismen gezeigt, wobei deutlich ist, dass die Sequenz konserviert ist. Das Gen steht im Plasmid unter Wirkung des eigenen Promotors und kann die Funktion einer RPL3-disruptierten Hefe komplementieren. Das Plasmid pZGA121 enthält zusätzlich ein Hefegen (ADE2) , das als Indikator der Effizienz der Mutagenese dient: wird ein intaktes ADE2-Gen in einen ade2-Hefestamm eingebracht, ist die resultierende Kolonie weiß, ist das mitmutierte ADE2*- Gen jedoch defekt, zeigt die Kolonie so wie die ade2-Mutante Rotfärbung aufgrund der Akkumulation einer pigmentierten Vorstufe aus der Adeninbiosynthese . Weiters ist das Plasmid pZGA121 in Hefe konditional instabil (auf Galaktosemedium) , da ein GAL1- Promotor neben dem Centromer plaziert ist und dessen Funktion stört. Als Selektionsmarker für die Hefetransformation dient das TRPl-Gen. Zusätzlich enthält das Plasmid als Antibiotika-Resistenz das Gen für die ß-Lactamase, um in E . coli-Transformanten auf Antibiotika-versetzten Nährbäden kultiviert werden zu können.
Das Plasmid wurde in den E. coli-Stamm XLI-Red transformiert. Dieser E. coli-Stamm besitzt eine Spontan-Mutationsfrequenz, die um ca. das 5000fache erhöht ist als beim Wildtyp-Stamm. Die DNA, die in diesen Stamm transformiert und amplifiziert wird, wird fortlaufend fehlerhaft reproduziert und erhält dadurch Mutationen in ihrer Sequenz, mit einer Mutationswahrscheinlichkeit, die für alle Basen etwa gleich ist.
Transformation des E. coli-Mutationsstammes :
1) Transformation des E. coli-Mutationsstammes XLI-Red (siehe 3.13) mit dem Plasmid pZGA121 wie in 3.2.2. beschrieben (CaCl2 -kompetent) .
400 μl XLI-Red werden mit 2 μg DNA gemischt und 30 Minuten auf Eis gesetzt.
90 Sekunden bei 42 °C im Wasserbad inkubieren. 900 μl SOC (LB) -Medium zufügen und 30 Minuten bei 37°C inkubieren.
Jeweils 200 μl der Transformationslösung auf eine LB- AmplOO-Platte ausplattieren und über Nacht bei 37°C inkubieren.
2) Platten mit LB-AmplOO waschen (ca. 3 ml) und in einen Er- lenmeyerkolben mit LB-AmplOO überführen. Über Nacht bei
37°C am Schüttler bebrüten.
3) Am nächsten Tag 50 μl der Bakteriensuspension in frisches LB-AmplOO (50 ml) überführen und wieder über Nacht bei 37°C am Schüttler inkubieren. Gleichzeitig werden von der Suspension Aliquots (2 x 2 ml) entnommen und zum Miniprepen eingefroren (-20°C) . 4) Punkt 3) wird 7 mal wiederholt und man erhält 8 Plasmid- pools.
5) Von jedem Pool werden die Plasmide gewonnen (3.1.1.) und in kompetente (CaCl2) Bakterien (E. coli) transformiert, um alle Klone in mutationsstabilen Bakterien zu erhalten: Die Durchführung der Transformation erfolgte wie in 1) .
6) Die Platten der Retransformation werden mit 4 ml LB-AmplOO abgewaschen und in 50 ml LB-AmplOO über Nacht bei 37°C inkubiert .
7) Von der Suspension jeweils 1 ml bei -70°C und -20°C einfrieren und von der restlichen Suspension eine DNA-Präparation machen:
Suspension in einem 50 ml-Flacon abzentrifugieren (5 min; 5000 rpm) .
In 4 ml Lösung I (50 mM Glucose; 2 mM Tris-HCl (pH 8,0); 10 mM EDTA (pH 8,0) resuspendieren (10 min schütteln). Mit 8 ml Lösung II (0,2 N NaOH; 1 % SDS) durch Invertieren mischen (nicht vortexen) und bei Raumtemperatur nicht länger als 5 min inkubieren.
6 ml eisgekühlte Lösung III (60 ml 5 M Kaliumacetat+11, 5 ml Eisessig+28, 5 ml H20; die resultierende Lösung ist 3 M an K+-Ionen und 5 M an Acetat-Ionen) zusetzen, mischen und mindestens 20 Minuten auf -20°C setzen.
15 Minuten 10000 rpm abzentrifugieren und den Überstand über Glaswolle abfiltrieren.
Mit 0,7fachem Volumen an Isopropanol fällen und 20 min abzentrifugieren (10000 rpm) .
Pellet in 70 % Ethanol waschen und abzentrifugieren. Pellet in 0,5 ml Wasser oder TE lösen.
8) Zum Quantifizieren der Ausbeute wird ein Aliquot mit RNAse verdaut und auf ein Agarosegel aufgetragen (nicht gezeigt) .
B e i s p i e l 2 : Mutation des RPL3-Gens mittels Hydroxylamin
1) 10 μg DNA (pZGA121) werden mit 500 μl Hydroxylamin-Reaktionslösung gemischt und bei 75°C inkubiert.
2) Von der Inkubationsmischung werden alle 20 Minuten jeweils 100 μl-Aliquots entnommen (5 DNA-Pools) . 3) Die 100 μl-Aliquots werden mit 70 μl Isopropanol (oder 200 μl Ethanol 98 %) gefällt, abzentrifugiert und in 50 μl Wasser gelöst.
4) Von den Proben werden jeweils 3 μl entnommen und für die Elektroporation eingesetzt.
5) Die gesamten Ansätze auf LBAmpl00-Platten ausplattieren und über Nacht bei 37°C inkubieren.
6) Von jedem DNA-Pool des Hydroxylamin-Ansatzes die Platten mit LBAmplOO abwaschen, vereinigen und in einem Erlenmeyer- kolben 2 Stunden bei 37°C inkubieren.
7) Bei 5000 g 7 min abzentrifugieren.
8) Midiprep der Proben;
9) Nach dem Abfiltrieren über Glaswolle, Fällen mit Isopropanol und Waschen mit 70 % Ethanol sind die Proben für die Hefetransformation bereit.
Herstellung der Hydroxylamin-Reaktionslösung:
0,5 M Pyrophosphatpuffer (pH 7,99):
13,295 g Na4P207 einwiegen und auf 100 ml mit H20 auffüllen. 11,095 g Na2H2P207 einwiegen und auf 100 ml mit H20 auffüllen.
Beide Lösungen mit solchen Verhältnissen vereinigen, dass der resultierende pH-Wert = 7,00 ist. 5 M Hydroxylaminiösung:
3,5 g Hydroxylamin mit 7 ml H20 mischen (pH ca. 2,1) und auf einen pH von 7,00 mit 10 N NaOH bringen. Mit H20 auf 10 ml auffüllen. Mischen der Reaktionslösung:
Figure imgf000022_0001
Mit H20 auf 10 ml auffüllen und das Gemisch zu 1 ml in Eppis abfüllen und bei -20°C einfrieren. B e i s p i e l 3 : Transformation von Hefe mit mutagenisierter Plasmid-DNA.
Die oben beschriebenen mutagenisierten Plasmid-DNA-Moleküle wurden für die Retransformation in den Hefestand YZGA315 verwendet. Dieser Hefestamm ist abgeleitet von YPH252 und hat folgende Eigenschaften:
YZGA315: MATα; ura3 leu2 his3 trpl ade2 lys2 rpl3 : :LYS2; pdr5: :hisG; pZGA196 [URA3 -GAL1 -RPL3J
Der transformierte Hefestamm YZGA315 weist neben einem trpl - und ade2-Marker folgende wesentliche Eigenschaften auf: das chromo- somale Wildtyp-RPL3-Gen ist disruptiert ( rpl3 : :LYS2) . Da RPL3 ein essentielles Gen ist, enthält der Stamm eine weitere, modifizierte RPL3-Kopie auf dem Plasmid pZGA196. Das RPL3-Gen auf diesem Plasmid ist unter Kontrolle eines GAL1-Promotors . Auf Glucosemedium ist dieser Promotor inaktiv und folglich kann der Stamm YZGA315 nicht auf Medien mit Glucose als C-Quelle wachsen, sondern nur auf Galaktosemedien. Weiters enthält der Stamm ein inaktiviertes PDR5-Gen (pdr5 : : hisG) , wodurch dieser hypersensitiv auf Trichothecene ist (PDR5 codiert für ein ABC-Transporter- Protein, das in der Plasmamembran lokalisiert ist und unter ATP- Aufwand in die Zelle eingedrungenes Toxin wieder entfernt) .
Werden Hefen mit Lithium-haltiger Lösung gewaschen und mit Po- lyethylen gemischt, sind diese in der Lage, Fremd-DNA aufzunehmen.
Die DNA-Transformation wird durch Anwesenheit von einzelsträngi- ger Carrier-DNA (Heringsperma-DNA) begünstigt .
1) Der zu transformierende Hefestamm wird, ausgehend von einer Einzelkolonie, in einem geeigneten Medium (50 ml) bei 30°C über Nacht herangezogen. Abhängig vom Wachstum der Hefen muss die Bebrütungsdauer auf 48 Stunden oder mehr ausgedehnt werden .
2) Die Ernte erfolgt bei einer OD600=1. Dann wird die Suspension 5 min, 4000 g (Sorvall GSA: 5000 rpm) abzentrifugiert (50 ml Falcon) und der Überstand verworfen. 3) Die Zellen werden in 1-2 ml Lösung A resuspendiert und 30 min am Schüttler inkubiert .
4) Die Suspension in ein 2,2 ml Eppendorf überführen, abzentrifugieren und Überstand verwerfen. Das Pellet in geeigneter Menge Lösung A resuspendieren.
5) Für jede Transformation werden < 5 μg zu transformierende DNA, 50 μg Carrier-DNA, 100 μl Hefesuspension, sowie 700 μl Lösung B gemischt und 30 min bei 30°C inkubiert.
6) Hitzeschock: 15 min bei 42°C.
7) Die Hefesuspension wird 5 s zentrifugiert und in 200 μl 1 x TE-Puffer (pH 7,5) resuspendiert.
8) Die Suspension auf geeignetem Selektionsmedium (z.B. SC- Trp-Platten) ausplattieren und bei 30°C bebrüten.
9) Hefekolonien auf demselben Nährmedium auf Einzelkolonien ausstreichen und bei 30°C bebrüten.
Material und Geräte:
Lösung A: 100 mM Li-Acetat
10 mM TricCl (pH 7,5) 1 mM EDTA Lösung B: 40 % PEG (Polyethylenglykol) 4000 (Cat.No. 81240,
Fluka) 100 mM Li-Acetat 10 mM TrisCl (pH 7,5) 1 mM EDTA Carrier-DNA: Heringsperma-DNA 10 mg/ml (Cat.No. 31162, FLUKA) (denaturiert durch Hitzebehandlung)
SC-Trp/^Ade-Platten (vereinfacht): 1,43 g/1 YNB (Yeast Nitrogen Base, Cat.No. 25685-033, GIBCO) 5,00 g/1 NH4S04, 10 ml/1 Stammlösung (100 x konzentriert) der Komponenten (Aminosäuren) : Thr, Leu, His, Ile, Arg, Lys, Adenin, Uracil, kein Trp; mit einer Endkonzentration von 20 mg/1, außer Leu (60 mg/1) . 2 % Agar und 2 % Glucose getrennt von den anderen Bestandteilen autoklavieren und vor dem Ausgießen gründlich mischen.
Transformanten, die auf SC-TRP-Medium (mit Glucose als C-Quelle) wachsen können und die folglich ein Plasmid mit einem funktioneilen RPL3-Gen aufgneommen haben, werden selektiert. Die Trans- formanten werden anschließend auf Trichothecen-hältiges Medium übergeführt und toxinresistende Mutanten selektiert.
Von den Platten wurden mit flüssigem YPD (4 ml) die Hefetrans- formanten abgewaschen und sorgfältig die Pools gemischt. Von dieser Mischung wurden jeweils ca. 50 μl auf YPD-Platten mit 200 ppm DON(Deoxynivalenol) aufgetragen und bei 30°C bebrütet.
Die hochkommenden Kolonien wurden wiederum auf YPD (+DON200ppm) - Platten auf Einzelkolonien ausgestrichen.
Insgesamt konnten auf diese Weise aus insgesamt ca. 280 000 ge- screenten Hefetransformanten 50 neue DON-resistente Hefestämme gewonnen werden (YARM1 bis YARM50) .
Zum Beweis, dass die für die Resistenz erantwortliche Mutation auf dem Plasmid lokalisiert ist, kann das Plasmid entweder wieder verloren werden (instabil auf Galaktose-Medium) , oder zuerst aus der Hefe in E.coli übergeführt werden und der Test durch Re- transformation des Hefestammes YZGA315 geführt werden. Durch Subklonierung und DNA-Sequenzierung kann die für die Resistenz verantwortliche Mutation identifiziert werden.
Das Resistenzverhalten der Hefe wurde durch Isolierung der Plasmide aus den selektierten Hefetransformanten, neuerliche Transformation in frische Hefezellen und Selektion auf YPD(+DON200ppm) -Platten bestätigt.
YPD: 1 % Yeast-Extrakt (Cat.No. 70161, FLUKA) 2 % Pepton (aus Fleisch; 1.07224 MERCK) 2 % Dextrose (Glucose; Cat.No. 49159, FLUKA)
B e i s p i e l 4 : Sequenzieren der Toxin-resistenten Klone
Prinzip :
Die Plasmide wurden mit dem Nukleospin-Reinigungskit aus den re- sistenten Hefekolonien gewonnen und gereinigt. Sequenziert wurde nach dem Prinzip der Kettenabbruch-Methode mit dem System ABI310 von Perkin Eimer . Bei diesem System sind die für den Kettenabbruch verantwortlichen Dideoxy-NTP ' s fluoreszenzmarkiert und können dadurch voneinander unterschieden werden.
Die Reaktion wird in einem Ansatz durchgeführt.
Die Proben werden im Gerät auf einer Trennsäule getrennt und jedes Fragment einzeln registriert.
Der Vorteil dieses Systems ist es, daß nur ein Ansatz pro Sequenzierung notwendig ist.
Durchführung :
1) PCR-Programm: [ (96°C/30sec-50°C/15sec-60°C/4min) x25] hotlid on/kein Öl
2) Ansatz (20 μl) : 4,0 μl TRR-Mix
2,0 μl DNA (30-500 ng je nach Herkunft: PCR, Plasmid) 3,2 μl Primer (1 pmol/μl) 10,8 μl H20
3) Der Ansatz wird mit 50 μl 95 % Ethanol und 2 μl 3 M Natrium- acetat (pH 4,6) in einem 1,5 ml Eppendorf gefällt und für mindestens 10 Minuten auf Eis (-20°C) gestellt. Der Ansatz kann auch über Nacht oder länger auf -20°C gefällt werden, um eventuelle höhere Ausbeuten an DNA zu erhalten.
4) Die Fällung 20-30 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit
(14000 Umdrehungen/Minute) abzentrifugieren und Überstand vorsichtig verwerfen.
5) Das Pellet in ca. 100-200 μl 70 % Ethanol waschen und 15 Minuten abzentrifugieren (14 000 U/min) .
6) Überstand vollständig abheben, 3-5 Minuten gut trocknen lassen und in 20 μl Template Supression Reagent (TSR) oder Formamid lösen.
7) 5 Minuten bei 96°C am Heizblock denaturieren und sofort auf Eis stellen (DNA quenchen) .
8) Die Proben wurden am ABI310-SEQUENCE ANALYSER sequenziert.
9) Auswertung der Sequenzen mit den Programmen EDITSEQ und SEQMAN von DNASTAR (DNASTAR Inc.) und SEQUENCE ANALYSIS. Material und Geräte:
DNA Sequenzing Kit No . 403044 (enthält TRR-Mix) ; PERKIN ELMER
3 M Natriumacetat (pH 4,6)
95 % oder 98 % Ethanol
70 % Ethanol
Template Supression Reagent (TSR) No. 402844 (POP 6) PERKIN
ELMER
Formamid
SEQUENCE ANALYSER ABI310; PERKIN ELMER
Thermocycler OMN-E (HYBAID)
Die Plasmide wurden mit dem Nukleospin-Reinigungskit gewonnen und gereinigt. Zum Sequenzieren des RPL3-Gens der Plasmide standen die in Tabelle 2 angeführten, schon vorhandenen Primer zur Verfügung .
T a b e l l e 2
Figure imgf000027_0001
Die fünf Plasmide wurden vollständig sequenziert, dabei wurden folgende Mutationen gefunden (Tabelle 3) : T a b e l l e 3 Mutationen der Plasmide
Figure imgf000028_0001
B e i s p i e l Herstellung von Doppelmutanten
Um zu untersuchen, ob eine Resistenzsteigerung mit zwei Mutationen im RPL3-Gen möglich ist, wurden Doppelmutanten kloniert, die jeweils eine N-Mutation und eine C-Mutation enthielten (Tabelle 4) .
T a b e l l e 4
Figure imgf000028_0002
Die Plasmide mit Doppel-Mutation wurden in den Hefestamm YZGA315 transformiert und vereinzelt. Die isolierten Hefemutanten (jeweils 3 μl einer Hefesuspension (OD600=0, 01) ) wurden nun auf YPD- Platten verschiedener TTC (Trichothecin) -Konzentrationsstufen ausplattiert und deren Resistenzverhalten nach fünf Tagen beobachtet . Als Vergleichskontrolle wurden die Hefen auf eine YPD- Platte mit 200 ppm DON aufgetragen. Als Nullkontrolle wurde eine YPD-Platte (0,4 % Aceton, 0,4 % Ethanol) verwendet. Diese Menge an Ethanol und Aceton entsprach jener Menge der beiden Komponenten, die in der höchsten Konzentrationsstufe (10 ppm) als Lösungsmittel für das Toxin enthalten war. Die Doppelmutanten schienen generell schlechter zu wachsen als die Einfachmutanten. Jedoch waren die Doppelmutanten pARM8A49B, pARM34A49B und pARM34A14B alle um eine Konzentrationsstufe (Wachstum bis 0,9 ppm bis 1 ppm) resistenter als die Einzelmutanten. Die Resistenz der Doppelmutante pARM8A49B reichte bis in den 2 ppm-Bereich im Gegensatz zur Einfachmutante pARM49, die bei 2 ppm TTC nicht mehr wachsen kann.
Damit konnte gezeigt werden, dass, obwohl die Doppelmutante scheinbar ein schlechteres Wachstum besitzt, diese resistenter gegenüber Trichothecen sind, als die Einzelmutanten.
SEQUENZPROTOKOLL
<110> Adam Dr, Gerhard
Innovationsagentur
<120> RPL3
<130> R35564
<140> <141>
<160> 10
<170> Patentin Ver . 2.1
<210> 1
<211> 387
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
Met Ser His Arg Lys Tyr Glu Ala Pro Arg His Gly His Leu Gly Phe 1 5 10 15
Leu Pro Arg Lys Arg Ala Ala Ser Ile Arg Ala Arg Val Lys Ala Phe 20 25 30
Pro Lys Asp Asp Arg Ser Lys Pro Val Ala Leu Thr Ser Phe Leu Gly 35 40 45
Tyr Lys Ala Gly Met Thr Thr Ile Val Arg Asp Leu Asp Arg Pro Gly 50 55 60
Ser Lys Phe His Lys Arg Glu Val Val Glu Ala Val Thr Val Val Asp 65 70 75 80
Thr Pro Pro Val Val Val Val Gly Val Val Gly Tyr Val Glu Thr Pro 85 90 95
Arg Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Val Trp Ala Glu His Leu Ser Asp 100 105 110
Glu Val Lys Arg Arg Phe Tyr Lys Asn Trp Tyr Lys Ser Lys Lys Lys 115 120 125
Ala Phe Thr Lys Tyr Ser Ala Lys Tyr Ala Gin Asp Gly Ala Gly Ile 130 135 140 Glu Arg Glu Leu Ala Arg Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Val Val Arg Val 145 150 155 160
Leu Val His Thr Gin Ile Arg Lys Thr Pro Leu Ala Gin Lys Lys Ala 165 170 175
His Leu Ala Glu Ile Gin Leu Asn Gly Gly Ser Ile Ser Glu Lys Val 180 185 190
Asp Trp Ala Arg Glu His Phe Glu Lys Thr Val Ala Val Asp Ser Val 195 200 205
Phe Glu Gin Asn Glu Met Ile Asp Ala Ile Ala Val Thr Lys Gly His 210 215 220
Gly Phe Glu Gly Val Thr His Arg Trp Gly Thr Lys Lys Leu Pro Arg 225 230 235 240
Lys Thr His Arg Gly Leu Arg Lys Val Ala Cys Ile Gly Ala Trp His 245 250 255
Pro Ala His Val Met Trp Ser Val Ala Arg Ala Gly Gin Arg Gly Tyr 260 265 270
His Ser Arg Thr Ser Ile Asn His Lys Ile Tyr Arg Val Gly Lys Gly 275 280 285
Asp Asp Glu Ala Asn Gly Ala Thr Ser Phe Asp Arg Thr Lys Lys Thr 290 295 300
Ile Thr Pro Met Gly Gly Phe Val His Tyr Gly Glu Ile Lys Asn Asp 305 310 315 320
Phe Ile Met Val Lys Gly Cys Ile Pro Gly Asn Arg Lys Arg Ile Val 325 330 335
Thr Leu Arg Lys Ser Leu Tyr Thr Asn Thr Ser Arg Lys Ala Leu Glu 340 345 350
Glu Val Ser Leu Lys Trp Ile Asp Thr Ala Ser Lys Phe Gly Lys Gly 355 360 365
Arg Phe Gin Thr Pro Ala Glu Lys His Ala Phe Met Gly Thr Leu Lys 370 375 380
Lys Asp Leu 385 <210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 2 aatgaattca gtggtaatgc aacagcaag 29
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 3 gacttcgtca gacaaatgtt cag 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 4 tgccaagaaa gactcacaga gg 22
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 5 aagaattctg ttgtatgtag ctaacaatac ta 32
<210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 6 accaagcttc aatcatgtct cacagaaagt acga 34
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 7 gcaccaatac aagcaacc 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 8 cactccacca gttgtcgt 18
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 9 ctggtagcac cgttagc 17
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220> <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz : Primer
<400> 10 caacggtgac agcttcga 18

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Ribosomales Protein L3 (RPL3), dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an der Stelle Serin 2 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist.
2. RPL3 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an der Stelle Serin 2 eine Aminosäure mit einer aliphatischen Seitenkette aufweist.
3. RPL3 nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an Stelle des Serins ein Prolin aufweist.
4. RPL3, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an der Stelle Prolin 9 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist.
5. RPL3 nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an Stelle des Prolins eine andere Aminosäure mit einer aliphatischen Seitenkette aufweist.
6. RPL3 nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an Stelle des Prolins ein Leucin aufweist.
7. RPL3 , dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an der Stelle des Histidins 256 eine Mutation aufweist, so dass der Organismus, in dem das mutierte RPL3 exprimiert wird, eine erhöhte Trichothecen-Resistenz aufweist .
8. RPL3 nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an Stelle des Histidins eine Aminosäure mit einer aromatischen Seitenkette aufweist.
9. RPL3 nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz an Stelle des Histidins ein Tyrosin aufweist.
10. RPL3, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz zumindest an zwei Stellen eine Mutation gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 aufweist.
11. RPL3 nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Aminosäuresequenz eine Mutation im C-terminalen Bereich und eine im N-terminalen Bereich aufweist.
12. RPL3 nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass am C-Terminus der Aminosäuresequenz eine zusätzliche Sequenz angehängt ist.
13. DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es für ein RPL3 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 kodiert.
14. DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Teilsequenz des DNA-Moleküls gemäß Anspruch 13 umfasst, wobei es für eine Aminosäuresequenz kodiert, die zumindest den Bereich einer Mutation eines RPL3-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 12 umfasst .
15. DNA-Molekül nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass es kovalent mit einer nachweisbaren Markierungssubstanz assoziiert ist.
16. Biologisch funktioneller Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15 umfasst .
17. Verfahren zur Herstellung von Trichothecen-toleranten re- kombinanten Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15 oder ein Vektor gemäß Anspruch 16 in die Zelle eingeschleust und das mutierte RPL3 exprimiert wird.
18. Verfahren zur Herstellung von Trichothecen-toleranten re- kombinanten Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15 oder ein Vektor gemäß Anspruch 16 in die Pflanze bzw. Pflanzenzellen eingeschleust und das mutierte RPL3 exprimiert wird .
19. Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie im Genom ein DNA- Molekül bzw. eine Mutation gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15 umfassen, so dass sie ein mutiertes RPL3 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 exprimieren und dadurch eine Trichothecen-Toleranz aufweisen.
20. Zellen nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Typ B-Trichothecen-Toleranz aufweisen.
21. Zellen nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Deoxynivalenol (DON) -Toleranz aufweisen.
22. Zellen nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine erhöhte Trichothecen-Resistenz von über 50 %, vorzugsweise über 200 %, verglichen mit dem jeweiligen Wildtyp aufweisen.
23. Pflanze bzw. Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie im Genom ein DNA-Molekül bzw. eine Mutation gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15 umfasst bzw. umfassen, so dass sie ein mutiertes RPL3 gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 exprimiert bzw. exprimieren und eine Trichothecen-Toleranz aufweist bzw. aufweisen.
24. Pflanze bzw. Pflanzenzellen nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Typ B-Trichothecen-Toleranz aufweist bzw. aufweisen.
25. Pflanze bzw. Pflanzenzellen nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Deoxynivalenol (DON) -Toleranz aufweist bzw. aufweisen.
26. Pflanze bzw. Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine erhöhte Trichothecen- Resistenz von über 50 %, vorzugsweise über 200 %, verglichen mit dem jeweiligen Wildtyp aufweist bzw. aufweisen.
27. Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls umfassend eine für RPL3 codierende Region, das in dem Organismus, in dem es exprimiert wird, zu einer erhöhten Trichothecen-Resistenz führt, dadurch gekennzeichnet, dass ein Wildtyp-RPL3-Gen, ausgenommen an der Stelle Tryptophan 255, punktmutiert wird, wonach das mutierte Gen in einen TestOrganismus eingeschleust wird, der daraufhin mutiertes RPL3 exprimiert, wobei der Testorganismus anschließend auf einem Nährmedium, umfassend Trichothecen, kultiviert und selektiert wird, wonach mutierte DNA-Moleküle aus den selektierten Klonen isoliert und gereinigt und gegebenenfalls sequenziert werden.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Testorganismus, in den das mutierte DNA-Molekül eingeschleust ist, eine Hypersensitivität gegenüber Trichothecene aufweist .
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Testorganismus, in den das mutierte DNA-Molekül eingeschleust ist, eine Genunterbrechung im genomischen RPL3 aufweist .
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass das mutierte DNA-Molekül zumindest einen Se- lektions-Marker umfasst.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation mittels Hydroxylamin durchgeführt wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutation in einem E. coli-Mu-tationsstamm, z.B. XLI-Red, durchgeführt wird.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium zur Selektion der transformierten Wirtsorganismen zumindest 100 ppm Deoxynivalenol (DON) , vorzugsweise zumindest 200 ppm DON, umfasst.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass nach Isolierung und Reinigung der mutierten DNA-Moleküle diese in Wirtszellen eingeschleust werden, die auf Nährmedium umfassend Trichothecen kultiviert und selektiert werden, wonach mutierte DNA-Moleküle gegebenenfalls wiederum isoliert und gereinigt werden.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass das Wildtyp-RPL3-Gen an der Stelle Serin 2 punktmutiert wird.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass das Wildtyp-RPL3-Gen an der Stelle Prolin 9 punktmutiert wird.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Wildtyp-RPL3-Gen an der Stelle Histidin 256 punktmutiert wird.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass nach Isolierung und Reinigung der mutierten DNA-Moleküle diese in Pflanzen bzw. Pflanzenzellen transformiert werden .
39. Zellen, ausgenommen eine W255C-Mutation umfassende Saccharomyces cerevisiae-Zellen Stamm CLPl, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem mutierten DNA-Molekül, das gemäß einem der Ansprüche 27 bis 37 hergestellt wurde, transformiert wurden, mutiertes RPL3 exprimieren und eine Trichothecen-Toleranz aufweisen.
40. Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem mutierten DNA-Molekül, das gemäß einem der Ansprüche 27 bis 37 hergestellt wurde, transformiert wurden, mutiertes RPL3 exprimieren und eine Trichothecen-Toleranz aufweisen.
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