JP3484386B2 - 酵母におけるタンパク質の高レベル発現 - Google Patents
酵母におけるタンパク質の高レベル発現Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は，組換えＤＮＡ技術
により酵母内で異種タンパクを生産するのに有用な方
法，および材料に関する。より詳しくは，本発明は，酵
母が酵母アルコールデヒドロゲナーゼイソ酵素ＩＩ（Ａ
ＤＨＩＩ）遺伝子プロモーターまたはその上流の活性化
配列（ＵＡＳ）の制御下で発現される場合に，該酵母内
で作られる異種タンパクの収率を改善する方法および材
料に関する。
により酵母内で異種タンパクを生産するのに有用な方
法，および材料に関する。より詳しくは，本発明は，酵
母が酵母アルコールデヒドロゲナーゼイソ酵素ＩＩ（Ａ
ＤＨＩＩ）遺伝子プロモーターまたはその上流の活性化
配列（ＵＡＳ）の制御下で発現される場合に，該酵母内
で作られる異種タンパクの収率を改善する方法および材
料に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＡＤＨＩＩの発現を引き起こす系によっ
て調節される酵母の異種遺伝子の発現は，非常に有益で
あることが証明されている。このような発現は，通常，
異種タンパクをコードする配列を，ＡＤＨ２遺伝子由来
のプロモーター，あるいはハイブリッドプロモーターの
制御下に配置することを包含する。このハイブリッドプ
ロモーターは，強カな酵母プロモーター（例えば，グリ
セルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）プロモーター）
と組み合わせて，ＡＤＨ２プロモーターの上流の調節領
域を使用する。例えば，ＥＰＯ公開公報第１６４，５５
６号；ＥＰＯ公開公報第１９６，０５６号；および共有
する米国特許出願第８６８，６３９号（１９８６年５月
２９日付で出願）を参照されたい。ＡＤＨ２調節領域を
用いる異種タンパク用の発現カセットは，通常，高いコ
ピー数で酵母発現宿主中に存在する。このような発現系
を用いて良好な結果が得られてはいるが，依然として，
異種タンパクの収率を増す必要がある。
て調節される酵母の異種遺伝子の発現は，非常に有益で
あることが証明されている。このような発現は，通常，
異種タンパクをコードする配列を，ＡＤＨ２遺伝子由来
のプロモーター，あるいはハイブリッドプロモーターの
制御下に配置することを包含する。このハイブリッドプ
ロモーターは，強カな酵母プロモーター（例えば，グリ
セルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）プロモーター）
と組み合わせて，ＡＤＨ２プロモーターの上流の調節領
域を使用する。例えば，ＥＰＯ公開公報第１６４，５５
６号；ＥＰＯ公開公報第１９６，０５６号；および共有
する米国特許出願第８６８，６３９号（１９８６年５月
２９日付で出願）を参照されたい。ＡＤＨ２調節領域を
用いる異種タンパク用の発現カセットは，通常，高いコ
ピー数で酵母発現宿主中に存在する。このような発現系
を用いて良好な結果が得られてはいるが，依然として，
異種タンパクの収率を増す必要がある。
【０００３】酵母ＡＤＲ１遺伝子によるＡＤＨ２遺伝子
の調節に関して，若干の研究が報告されている。例え
ば，Ｓｈｕｓｔｅｒら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，６：１８９４−１９０２；Ｄｅｎｉｓら
（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：３６
０−３７０を参照されたいＡＤＲ１の発現レベルと，天
然のＡＤＨ２遺伝子の発現レベルとの間の関係を調べた
いくつかの研究が報告されている。Ｉｒａｎｉら（１９
８７）Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１２３３−
１２４１；Ｄｅｎｉｓ（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇ
ｅｎｅｔ２０８：１０１−１０６を参照されたい。しか
しながら，これらの研究は，ＡＤＲ１の発現の増加が，
ＡＤＨ２調節配列の制御下で発現される異種タンパクの
収率を，最終的に改善するかどうかは示していない。例
えば，１００を越えるＡＤＲ１のコピーが，多重ＡＤＨ
２プロモーターにより引き起こされるＡＤＨ２転写にお
ける３〜４倍の阻害を克服しなかったことが，Ｉｒａｎ
ｉら（１９８７）によって観察された。この結果によ
り，ＡＤＲ１とは別の，ＡＤＨ２の発現を積極的に制限
する因子が存在するＡＤＨＩＩ調節モデルが支持される
ことが示唆された。Ｄｅｎｉｓ（１９８７）も，ＡＤＲ
１遺伝子の用量増加が，明らかに酵母宿主に有毒であ
り，その結果，細胞倍加時間に有意の増加を生じるとい
うことを報告している。
の調節に関して，若干の研究が報告されている。例え
ば，Ｓｈｕｓｔｅｒら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，６：１８９４−１９０２；Ｄｅｎｉｓら
（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：３６
０−３７０を参照されたいＡＤＲ１の発現レベルと，天
然のＡＤＨ２遺伝子の発現レベルとの間の関係を調べた
いくつかの研究が報告されている。Ｉｒａｎｉら（１９
８７）Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１２３３−
１２４１；Ｄｅｎｉｓ（１９８７）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ Ｇ
ｅｎｅｔ２０８：１０１−１０６を参照されたい。しか
しながら，これらの研究は，ＡＤＲ１の発現の増加が，
ＡＤＨ２調節配列の制御下で発現される異種タンパクの
収率を，最終的に改善するかどうかは示していない。例
えば，１００を越えるＡＤＲ１のコピーが，多重ＡＤＨ
２プロモーターにより引き起こされるＡＤＨ２転写にお
ける３〜４倍の阻害を克服しなかったことが，Ｉｒａｎ
ｉら（１９８７）によって観察された。この結果によ
り，ＡＤＲ１とは別の，ＡＤＨ２の発現を積極的に制限
する因子が存在するＡＤＨＩＩ調節モデルが支持される
ことが示唆された。Ｄｅｎｉｓ（１９８７）も，ＡＤＲ
１遺伝子の用量増加が，明らかに酵母宿主に有毒であ
り，その結果，細胞倍加時間に有意の増加を生じるとい
うことを報告している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】異種タンパクの収率を
増すこと。
増すこと。
【０００５】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに，ＡＤＨ
２調節系を用いる異種タンパク用発現カセットで形質転
換された酵母宿主による異種タンパクの収率が，酵母宿
主中のＡＤＲ１遺伝子でコードされたタンパクの発現を
増加させることにより，有意に増加させ得ることが発見
された。この結果は，報告されているＡＤＲ１遺伝子の
用量増加による毒性と，多重ＡＤＨ２プロモーターで形
質転換された酵母宿主におけるＡＤＨＩＩ活性に対す
る，ＡＤＲ１遺伝子の１００を越えるコピーの効果が小
さいことから考えて，驚くべきことである。
２調節系を用いる異種タンパク用発現カセットで形質転
換された酵母宿主による異種タンパクの収率が，酵母宿
主中のＡＤＲ１遺伝子でコードされたタンパクの発現を
増加させることにより，有意に増加させ得ることが発見
された。この結果は，報告されているＡＤＲ１遺伝子の
用量増加による毒性と，多重ＡＤＨ２プロモーターで形
質転換された酵母宿主におけるＡＤＨＩＩ活性に対す
る，ＡＤＲ１遺伝子の１００を越えるコピーの効果が小
さいことから考えて，驚くべきことである。
【０００６】ある実施態様では，本発明は，酵母内で異
種タンパクを発現させる方法に関する。該発現方法は，
次の工程（ａ），（ｂ）および（ｃ）を包含する：
（ａ）次の（ｉ）および（ｉｉ）により形質転換された
酵母宿主を提供すること：（ｉ）酵母が認識し，該酵母
宿主内で機能する転写開始配列および転写終結配列の制
御下に，該非酵母タンパクのＤＮＡコード配列を有す
る，該非酵母タンパクの発現カセットであって，該転写
開始配列がさらに酵母ＡＤＨ２上流活性化部位を含む，
発現カセット；および（ｉｉ）酵母が認識し，該酵母宿
主内で機能する転写開始配列および転写終結配列の制御
下にＡＤＲＩのＤＮＡコード配列を有する，ＡＤＲＩの
発現カセット；（ｂ）該非酵母タンパクおよび該ＡＤＲ
Ｉが発現される条件下で，形質転換された該酵母宿主の
クローン集団を培養すること；（ｃ）該クローン集団か
ら該非酵母タンパクを回収すること。
種タンパクを発現させる方法に関する。該発現方法は，
次の工程（ａ），（ｂ）および（ｃ）を包含する：
（ａ）次の（ｉ）および（ｉｉ）により形質転換された
酵母宿主を提供すること：（ｉ）酵母が認識し，該酵母
宿主内で機能する転写開始配列および転写終結配列の制
御下に，該非酵母タンパクのＤＮＡコード配列を有す
る，該非酵母タンパクの発現カセットであって，該転写
開始配列がさらに酵母ＡＤＨ２上流活性化部位を含む，
発現カセット；および（ｉｉ）酵母が認識し，該酵母宿
主内で機能する転写開始配列および転写終結配列の制御
下にＡＤＲＩのＤＮＡコード配列を有する，ＡＤＲＩの
発現カセット；（ｂ）該非酵母タンパクおよび該ＡＤＲ
Ｉが発現される条件下で，形質転換された該酵母宿主の
クローン集団を培養すること；（ｃ）該クローン集団か
ら該非酵母タンパクを回収すること。
【０００７】他の実施態様では，本発明は，次の（ａ）
および（ｂ）により形質転換された酵母細胞に関する：
（ａ）酵母が認識し，該酵母宿主で機能する転写開始配
列および転写終結配列の制御下に，非酵母タンパクのＤ
ＮＡコード配列を有する発現カセットであって，該転写
開始配列がさらに酵母ＡＤＨ２上流活性化部位を含む，
発現カセット；および（ｂ）酵母が認識し，該酵母宿主
内で機能する転写開始配列および転写終結配列の制御下
に，ＡＤＲＩのＤＮＡコード配列を有する，ＡＤＲＩの
発現カセット。
および（ｂ）により形質転換された酵母細胞に関する：
（ａ）酵母が認識し，該酵母宿主で機能する転写開始配
列および転写終結配列の制御下に，非酵母タンパクのＤ
ＮＡコード配列を有する発現カセットであって，該転写
開始配列がさらに酵母ＡＤＨ２上流活性化部位を含む，
発現カセット；および（ｂ）酵母が認識し，該酵母宿主
内で機能する転写開始配列および転写終結配列の制御下
に，ＡＤＲＩのＤＮＡコード配列を有する，ＡＤＲＩの
発現カセット。
【０００８】さらに他の実施態様では，本発明は，酵母
が認識する転写開始配列および転写終結配列の制御下に
ＡＤＲＩのコード配列を含むゲノムに組込まれた発現カ
セットを有する形質転換された酵母を包含する。該転写
開始配列は，ＡＤＲ１プロモーター以外のプロモーター
である。上記酵母は、酵母における非酵母タンパク質
（異種タンパク質）の高収率発現のために、非酵母タン
パク質の発現カセットを用いて形質転換される。ここ
で、この発現カセットは、酵母において機能する、酵母
が認識する転写開始配列および転写終結配列の制御下
に、非酵母タンパク質のＤＮＡコード配列を含み、転写
開始配列は酵母ＡＤＨ２上流活性化部位をさらに含む。
したがって、さらに別の実施形態において、本発明は、
非酵母タンパク質の高収率発現に使用されるキットであ
って、（ａ）酵母が認識する転写開始配列および転写終
結配列の制御下にＡＤＲＩのコード配列を含む発現カセ
ットを有する形質転換された酵母（ただし、転写開始配
列はＡＤＲ１プロモーター以外である）と；（ｂ）
（ａ）の酵母を、非酵母タンパク質の発現カセットを用
いて形質転換するよう指示する指示書を含む、キットに
関する。ここで、この非酵母タンパク質の発現カセット
は、酵母において機能する、酵母が認識する転写開始配
列および転写終結配列の制御下に、非酵母タンパク質の
ＤＮＡコード配列を含み、転写開始配列は酵母ＡＤＨ２
上流活性化部位をさらに含む。本発明は、さらに、上記
形質転換された酵母細胞を作製するためのキットであっ
て、（ｉ）第１の酵母が認識する転写開始配列および転
写終結配列の制御下にあるＡＤＲ ＩのＤＮＡコード配
列を含む、第１のベクター；ならびに（ｉｉ）非酵母タ
ンパク質のＤＮＡコード配列が挿入されるべきクローニ
ング部位を、第２の酵母が認識する転写開始配列および
転写終結配列の制御下に含む、第２のベクターを含むキ
ットに関する。ここで、上記第２の転写開始配列は酵母
ＡＤＨ２上流活性化部位を含む。
が認識する転写開始配列および転写終結配列の制御下に
ＡＤＲＩのコード配列を含むゲノムに組込まれた発現カ
セットを有する形質転換された酵母を包含する。該転写
開始配列は，ＡＤＲ１プロモーター以外のプロモーター
である。上記酵母は、酵母における非酵母タンパク質
（異種タンパク質）の高収率発現のために、非酵母タン
パク質の発現カセットを用いて形質転換される。ここ
で、この発現カセットは、酵母において機能する、酵母
が認識する転写開始配列および転写終結配列の制御下
に、非酵母タンパク質のＤＮＡコード配列を含み、転写
開始配列は酵母ＡＤＨ２上流活性化部位をさらに含む。
したがって、さらに別の実施形態において、本発明は、
非酵母タンパク質の高収率発現に使用されるキットであ
って、（ａ）酵母が認識する転写開始配列および転写終
結配列の制御下にＡＤＲＩのコード配列を含む発現カセ
ットを有する形質転換された酵母（ただし、転写開始配
列はＡＤＲ１プロモーター以外である）と；（ｂ）
（ａ）の酵母を、非酵母タンパク質の発現カセットを用
いて形質転換するよう指示する指示書を含む、キットに
関する。ここで、この非酵母タンパク質の発現カセット
は、酵母において機能する、酵母が認識する転写開始配
列および転写終結配列の制御下に、非酵母タンパク質の
ＤＮＡコード配列を含み、転写開始配列は酵母ＡＤＨ２
上流活性化部位をさらに含む。本発明は、さらに、上記
形質転換された酵母細胞を作製するためのキットであっ
て、（ｉ）第１の酵母が認識する転写開始配列および転
写終結配列の制御下にあるＡＤＲ ＩのＤＮＡコード配
列を含む、第１のベクター；ならびに（ｉｉ）非酵母タ
ンパク質のＤＮＡコード配列が挿入されるべきクローニ
ング部位を、第２の酵母が認識する転写開始配列および
転写終結配列の制御下に含む、第２のベクターを含むキ
ットに関する。ここで、上記第２の転写開始配列は酵母
ＡＤＨ２上流活性化部位を含む。
【０００９】本発明のこれらの実施態様および他の実施
態様は，以下の記述から当業者には容易に明らかとな
る。
態様は，以下の記述から当業者には容易に明らかとな
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明を実施するためには，特に
指示しない限り，当該技術分野の範囲内の通常の分子生
物学，微生物学，および組換えＤＮＡ技術を用いるもの
とする。このような技術は，文献に詳細に説明されて
る。例えば，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８
２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．
Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ
編，１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．
Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉ
ｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ
プレス，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照されたい。
指示しない限り，当該技術分野の範囲内の通常の分子生
物学，微生物学，および組換えＤＮＡ技術を用いるもの
とする。このような技術は，文献に詳細に説明されて
る。例えば，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８
２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．
Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ
編，１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．
Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉ
ｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ
プレス，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照されたい。
【００１１】本発明を記述するにあたって，以下の用語
は下記の定義に従って使用される。
は下記の定義に従って使用される。
【００１２】「ＡＤＨ ＩＩ」は，酵母（特にサッカロ
ミセス属，特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する
グルコース抑制性アルコールデヒドロゲナーゼＩＩを意
味する。「ＡＤＨ２」は，ＡＤＨＩＩをコードする酵母
遺伝子およびその関連調節配列を意味する。例えば．Ｒ
ｕｓｓｅｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５８：２６７４−２６８２を参照されたい。
ミセス属，特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する
グルコース抑制性アルコールデヒドロゲナーゼＩＩを意
味する。「ＡＤＨ２」は，ＡＤＨＩＩをコードする酵母
遺伝子およびその関連調節配列を意味する。例えば．Ｒ
ｕｓｓｅｌｌら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５８：２６７４−２６８２を参照されたい。
【００１３】「ＵＡＳ」は，上流活性化配列またはエン
ハンサー領域に対して当該技術分野で認められた用語で
ある。これらは，通常，プロモーターのＴＡＴＡボック
スの上流に位置する短い反復ＤＮＡ配列である。本発明
で特に興味深いのは，ＡＤＨ２ ＵＡＳである。これ
は，ＡＤＨ２ ＴＡＴＡボックスから上流に位置する，
２２ｂｐの完全逆転反復配列である。Ｓｈｕｓｔｅｒら
（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：１８
９４−１９０２を参照されたい。
ハンサー領域に対して当該技術分野で認められた用語で
ある。これらは，通常，プロモーターのＴＡＴＡボック
スの上流に位置する短い反復ＤＮＡ配列である。本発明
で特に興味深いのは，ＡＤＨ２ ＵＡＳである。これ
は，ＡＤＨ２ ＴＡＴＡボックスから上流に位置する，
２２ｂｐの完全逆転反復配列である。Ｓｈｕｓｔｅｒら
（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：１８
９４−１９０２を参照されたい。
【００１４】「ＡＤＲ１」は，ＡＤＨＩＩの発現に必要
な酵母由来の正の調節遺伝子を意味する。例えば、Ｄｅ
ｎｉｓら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
３：３６０−３７０を参照されたい。ＡＤＲ１遺伝子に
よりコードされるタンパクは，ここでは「ＡＤＲＩ」と
呼ばれる。
な酵母由来の正の調節遺伝子を意味する。例えば、Ｄｅ
ｎｉｓら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
３：３６０−３７０を参照されたい。ＡＤＲ１遺伝子に
よりコードされるタンパクは，ここでは「ＡＤＲＩ」と
呼ばれる。
【００１５】「レプリコン」は，インビボでのＤＮＡ複
製の自律的単位として機能する（すなわち，それ自体の
制御下で複製が可能である）遺伝子学的要素（例えば，
プラスミド，コスミド，染色体，ウイルス）である。
製の自律的単位として機能する（すなわち，それ自体の
制御下で複製が可能である）遺伝子学的要素（例えば，
プラスミド，コスミド，染色体，ウイルス）である。
【００１６】「ベクター」は，他のＤＮＡセグメントが
付着することにより，該付着セグメントの複製が引き起
こされるレプリコン（例えば，プラスミド，ファージ，
またはコスミド）である。
付着することにより，該付着セグメントの複製が引き起
こされるレプリコン（例えば，プラスミド，ファージ，
またはコスミド）である。
【００１７】「二本鎖ＤＮＡ分子」とは，その正常な二
本らせん構造のデオキシリボヌクレオチド（アデニン，
グアニン，チミジン，またはシトシン）の重合形態を意
味する。この用語は，分子の一次構造および二次構造に
ついてのみ用いられており，この分子を特定の三次元形
態に限定するものではない。従って，この用語は，特に
鎖状ＤＮＡ分子（例えば，制限断片），ウイルス，プラ
スミド，および染色体中に見られる二本鎖ＤＮＡを包含
する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について考察する
際には，ＤＮＡの非転写鎖に沿って５’から３’の方向
の配列のみを記述するという通常の慣行に従って配列を
記載する。つまり，鎖は，特定のコード配列から産生さ
れたｍＲＮＡと相同の配列を有する。
本らせん構造のデオキシリボヌクレオチド（アデニン，
グアニン，チミジン，またはシトシン）の重合形態を意
味する。この用語は，分子の一次構造および二次構造に
ついてのみ用いられており，この分子を特定の三次元形
態に限定するものではない。従って，この用語は，特に
鎖状ＤＮＡ分子（例えば，制限断片），ウイルス，プラ
スミド，および染色体中に見られる二本鎖ＤＮＡを包含
する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について考察する
際には，ＤＮＡの非転写鎖に沿って５’から３’の方向
の配列のみを記述するという通常の慣行に従って配列を
記載する。つまり，鎖は，特定のコード配列から産生さ
れたｍＲＮＡと相同の配列を有する。
【００１８】ＤＮＡ「コード配列」は，適切な調節配列
の制御下に配置された場合，インビボで転写され，ポリ
ペプチドヘ翻訳され得るＤＮＡ配列である。コード配列
の境界は，５’（アミノ）末端の翻訳開始コドンおよび
３’（カルボキシ）末端の翻訳終結コドンにより決定さ
れ，かつこれらを包含する。コード配列は，原核ＤＮＡ
配列，ウイルスＤＮＡ配列，真核細胞源（例えば，哺乳
動物のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列，および合成Ｄ
ＮＡ配列さえ包含し得るが，これらに限定はされない。
の制御下に配置された場合，インビボで転写され，ポリ
ペプチドヘ翻訳され得るＤＮＡ配列である。コード配列
の境界は，５’（アミノ）末端の翻訳開始コドンおよび
３’（カルボキシ）末端の翻訳終結コドンにより決定さ
れ，かつこれらを包含する。コード配列は，原核ＤＮＡ
配列，ウイルスＤＮＡ配列，真核細胞源（例えば，哺乳
動物のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列，および合成Ｄ
ＮＡ配列さえ包含し得るが，これらに限定はされない。
【００１９】「酵母が認識する転写開始配列および転写
終結配列」は，コード化配列に隣接し，該コード配列と
相同なｍＲＮＡの酵母内における転写に関与するＤＮＡ
調節領域を意味する。該ｍＲＮＡは，次いで該コード配
列によりコードされたポリペプチドに翻訳され得る。転
写開始配列は，酵母プロモーター配列を有する。これら
は，細胞中の酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し，下流
（３’方向）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調
節配列である。本発明を定義するために，プロモーター
配列は，その３’末端においてコード配列の翻訳開始コ
ドンに接しており（ただし，該翻訳開始コドンは含まれ
ない），上流（５’方向）はバックグラウンドを越えて
検知し得るレベルで転写を開始させるのに必要な最少数
のヌクレオチドまたは要素を包含する範囲まで及んでい
る。プロモーター配列内には，転写開始部位（Ｓ１ヌク
レアーゼを用いてマッピングすることにより都合よく定
義される）および酵母ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与
するタンパク結合ドメイン（コンセンサス配列，例えば
ＴＡＴＡボックス）が見られる。転写開始配列はまた，
例えばプロモーターの調節または増強に関与する他の調
節領域（例えば，ＵＡＳ）を含んでいてもよい。
終結配列」は，コード化配列に隣接し，該コード配列と
相同なｍＲＮＡの酵母内における転写に関与するＤＮＡ
調節領域を意味する。該ｍＲＮＡは，次いで該コード配
列によりコードされたポリペプチドに翻訳され得る。転
写開始配列は，酵母プロモーター配列を有する。これら
は，細胞中の酵母ＲＮＡポリメラーゼを結合し，下流
（３’方向）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調
節配列である。本発明を定義するために，プロモーター
配列は，その３’末端においてコード配列の翻訳開始コ
ドンに接しており（ただし，該翻訳開始コドンは含まれ
ない），上流（５’方向）はバックグラウンドを越えて
検知し得るレベルで転写を開始させるのに必要な最少数
のヌクレオチドまたは要素を包含する範囲まで及んでい
る。プロモーター配列内には，転写開始部位（Ｓ１ヌク
レアーゼを用いてマッピングすることにより都合よく定
義される）および酵母ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与
するタンパク結合ドメイン（コンセンサス配列，例えば
ＴＡＴＡボックス）が見られる。転写開始配列はまた，
例えばプロモーターの調節または増強に関与する他の調
節領域（例えば，ＵＡＳ）を含んでいてもよい。
【００２０】本発明において有用なプロモーターには，
野生型ＡＤＲ１プロモーターおよび他の酵母プロモータ
ーが含まれる。特に好ましいものとしては，解糖経路の
酵素（例えば，ホスホグルコイソメラーゼ，ホスホフル
クトキナーゼ，ホスホトリオースイソメラーゼ，ホスホ
グルコムターゼ，エノラーゼ，ピルビン酸キナーゼ，グ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡ
ＰＤ），ＡＤＨＩ，ＡＤＨＩＩ）と関連するプロモータ
ー、およびこれらのプロモーターのハイブリッドがあ
る。特に好ましいハイブリッドプロモーターは，ＡＤＨ
２遺伝子の５’調節配列（ＵＡＳを含む）と，ＧＡＰＤ
プロモーターの転写開始部位およびコンセンサス配列と
から形成されたハイブリッドである。これらは，「ＡＤ
Ｈ２／ＧＡＰＤハイブリッドプロモーター」と呼ばれ
る。例えば，ＥＰＯ公開公報第１２０，５５１号および
第１６４，５５６号，そして第１９６，０５６号を参照
されたい。同様に，翻訳終結コドンの３’側に位置する
転写終結配列は，野生型ＡＤＲ１，ＡＤＨ２，またはＧ
ＡＰＤ転写終結配列か，あるいは酵母が認識する他の終
結配列（例えば，他の解糖酵素の遺伝子由来の終結配
列）のいずれかであり得る。
野生型ＡＤＲ１プロモーターおよび他の酵母プロモータ
ーが含まれる。特に好ましいものとしては，解糖経路の
酵素（例えば，ホスホグルコイソメラーゼ，ホスホフル
クトキナーゼ，ホスホトリオースイソメラーゼ，ホスホ
グルコムターゼ，エノラーゼ，ピルビン酸キナーゼ，グ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡ
ＰＤ），ＡＤＨＩ，ＡＤＨＩＩ）と関連するプロモータ
ー、およびこれらのプロモーターのハイブリッドがあ
る。特に好ましいハイブリッドプロモーターは，ＡＤＨ
２遺伝子の５’調節配列（ＵＡＳを含む）と，ＧＡＰＤ
プロモーターの転写開始部位およびコンセンサス配列と
から形成されたハイブリッドである。これらは，「ＡＤ
Ｈ２／ＧＡＰＤハイブリッドプロモーター」と呼ばれ
る。例えば，ＥＰＯ公開公報第１２０，５５１号および
第１６４，５５６号，そして第１９６，０５６号を参照
されたい。同様に，翻訳終結コドンの３’側に位置する
転写終結配列は，野生型ＡＤＲ１，ＡＤＨ２，またはＧ
ＡＰＤ転写終結配列か，あるいは酵母が認識する他の終
結配列（例えば，他の解糖酵素の遺伝子由来の終結配
列）のいずれかであり得る。
【００２１】コード配列は，ＲＮＡポリメラーゼが転写
開始配列に結合し，かつコード配列をｍＲＮＡに転写
し，この転写が転写終結配列において終結する場合，転
写開始配列および転写終結配列の「制御下にある」。次
いで，ｍＲＮＡは，コード配列によりコードされたポリ
ペプチドヘ翻訳される（すなわち，「発現」）。
開始配列に結合し，かつコード配列をｍＲＮＡに転写
し，この転写が転写終結配列において終結する場合，転
写開始配列および転写終結配列の「制御下にある」。次
いで，ｍＲＮＡは，コード配列によりコードされたポリ
ペプチドヘ翻訳される（すなわち，「発現」）。
【００２２】「発現カセット」は，転写開始配列および
転写終結配列の制御下にコード配列を有するＤＮＡ構築
物である。本発明の実施において，このような構築物
は，酵母が認識する転写開始配列および転写終結配列を
包含する。該発現カセットは，例えばＡＤＲ１タンパク
または非酵母タンパク，あるいはこれらの両方のコード
配列を含む。適切なベクターに発現カセットを都合よく
クローニングするために与えられる制限部位を，該発現
カセットに隣接するように配置することが特に好まし
い。
転写終結配列の制御下にコード配列を有するＤＮＡ構築
物である。本発明の実施において，このような構築物
は，酵母が認識する転写開始配列および転写終結配列を
包含する。該発現カセットは，例えばＡＤＲ１タンパク
または非酵母タンパク，あるいはこれらの両方のコード
配列を含む。適切なベクターに発現カセットを都合よく
クローニングするために与えられる制限部位を，該発現
カセットに隣接するように配置することが特に好まし
い。
【００２３】外来ＤＮＡがある細胞内に導入されている
場合，この細胞は該外来ＤＮＡにより「形質転換され
る」という。外来ＤＮＡを維持するような細胞の後代
を，ここでは同様に「形質転換された」細胞と呼ぶ。外
来ＤＮＡは，必ずしも細胞のゲノムを構成する染色体Ｄ
ＮＡに組込む（共有結合させる）必要はない。外来ＤＮ
Ａは，形質転換された細胞中で，染色体外のプリコン
（例えば，プラスミド）上に維持されてもよい。外来Ｄ
ＮＡが染色体に組込まれた場合，該外来ＤＮＡは染色体
の複製により娘細胞に受け継がれる。染色体中に組込ま
れた外来ＤＮＡにより形質転換された細胞は，「安定
に」形質転換された細胞と呼ばれる。
場合，この細胞は該外来ＤＮＡにより「形質転換され
る」という。外来ＤＮＡを維持するような細胞の後代
を，ここでは同様に「形質転換された」細胞と呼ぶ。外
来ＤＮＡは，必ずしも細胞のゲノムを構成する染色体Ｄ
ＮＡに組込む（共有結合させる）必要はない。外来ＤＮ
Ａは，形質転換された細胞中で，染色体外のプリコン
（例えば，プラスミド）上に維持されてもよい。外来Ｄ
ＮＡが染色体に組込まれた場合，該外来ＤＮＡは染色体
の複製により娘細胞に受け継がれる。染色体中に組込ま
れた外来ＤＮＡにより形質転換された細胞は，「安定
に」形質転換された細胞と呼ばれる。
【００２４】「クローン」または「クローン集団」は，
単一の細胞または共通の祖先細胞から有糸分裂により誘
導された細胞集団である。
単一の細胞または共通の祖先細胞から有糸分裂により誘
導された細胞集団である。
【００２５】２つのＤＮＡ配列は，ヌクレオチドの少な
くとも約６０％（好ましくは少なくとも約７５％，最も
好ましくは少なくとも９０％）が，これらの分子の一定
の長さ（例えば，１００ｂｐ，２００ｂｐ，５００ｂ
ｐ，１ｋｂ，２ｋｂまたはそれ以上）にわたって一致す
る場合に，「実質的に相同」である。実質的に相同な配
列は，特定の系について定義される選択された厳密性の
条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において
同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の決
定は，当該技術分野の範囲内のものである。例えば，Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら（前出）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ
（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照されたい。
くとも約６０％（好ましくは少なくとも約７５％，最も
好ましくは少なくとも９０％）が，これらの分子の一定
の長さ（例えば，１００ｂｐ，２００ｂｐ，５００ｂ
ｐ，１ｋｂ，２ｋｂまたはそれ以上）にわたって一致す
る場合に，「実質的に相同」である。実質的に相同な配
列は，特定の系について定義される選択された厳密性の
条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において
同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の決
定は，当該技術分野の範囲内のものである。例えば，Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら（前出）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ
（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照されたい。
【００２６】ＤＮＡ分子の「異種」領域は、天然の大き
なＤＮＡ分子には見られない該ＤＮＡ分子内の同定可能
なＤＮＡセグメントである。同定可能なセグメントは、
大きな該ＤＮＡ分子またはその起源である生物に対して
外来となる起源を有するものとして同定するのに充分な
長さの配列である。従って，異種領域が哺乳動物タンパ
クをコードする場合、該異種領域には，起源である生物
のゲノム中では哺乳動物ＤＮＡ配列に隣接していないＤ
ＮＡが通常隣接している。異種コード配列の他の例とし
て，コード配列自体が天然には存在しない構築物がある
（例えば，ゲノムのコード配列がイントロンを含むｃＤ
ＮＡ，あるいは同じタンパクまたは類似のタンパクをコ
ードする，生物とは異なるコドンを有する合成配列）。
対立遺伝子変異，点突然変異，あるいは自然に発生する
突然変異現象は，ここで用いられているようなＤＮＡの
「異種」領域を生じない。ある生物に対する「異種」タ
ンパクは，該生物のゲノムにより天然ではコードされな
いタンパクである。「非酵母」タンパクは，問題の酵母
に対して異種である。
なＤＮＡ分子には見られない該ＤＮＡ分子内の同定可能
なＤＮＡセグメントである。同定可能なセグメントは、
大きな該ＤＮＡ分子またはその起源である生物に対して
外来となる起源を有するものとして同定するのに充分な
長さの配列である。従って，異種領域が哺乳動物タンパ
クをコードする場合、該異種領域には，起源である生物
のゲノム中では哺乳動物ＤＮＡ配列に隣接していないＤ
ＮＡが通常隣接している。異種コード配列の他の例とし
て，コード配列自体が天然には存在しない構築物がある
（例えば，ゲノムのコード配列がイントロンを含むｃＤ
ＮＡ，あるいは同じタンパクまたは類似のタンパクをコ
ードする，生物とは異なるコドンを有する合成配列）。
対立遺伝子変異，点突然変異，あるいは自然に発生する
突然変異現象は，ここで用いられているようなＤＮＡの
「異種」領域を生じない。ある生物に対する「異種」タ
ンパクは，該生物のゲノムにより天然ではコードされな
いタンパクである。「非酵母」タンパクは，問題の酵母
に対して異種である。
【００２７】ここで使用されているように，「酵母」に
は，有子嚢胞子酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ），
有担子胞子酵母，および不完全菌類に属する酵母（Ｂｌ
ａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）が含まれる。有子嚢胞子酵母
は，２つの科（すなわち，Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａ
ｃｅａｅ科およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａ
ｅ科）に分けられる。後者は，４つの亜科〔すなわち，
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ亜科
（例えば，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
属），Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ亜科，Ｌｉｐｏｍｙ
ｃｏｉｄｅａｅ亜科，およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏ
ｉｄｅａｅ亜科，（例えば，Ｐｉｃｈｉａ属，Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
属）〕からなる。有担子胞子酵母には，Ｌｅｕｃｏｓｐ
ｏｒｉｄｉｕｍ属，Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属，
Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属，Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉ
ｕｍ属，およびＦｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ属が含ま
れる。不完全菌類に属する酵母は，２つの科〔すなわ
ち，Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科（例え
ば，Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属，Ｂｕｌｌｅｒａ
属）およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科（例え
ば，Ｃａｎｄｉｄａ属）〕に分けられる。本発明で特に
興味があるのは，Ｐｉｃｈｉａ属，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ属，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｓｃｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，およびＣａｎｄｉ
ｄａ属に属する種である。特に興味があるのは，Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，
Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ，Ｓ．ｄｉａｓｔａ
ｔｉｃｕｓ，Ｓ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ，Ｓ．ｋｌｕｙｖ
ｅｒｉ，Ｓ．ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ，およびＳ．ｏｖｉｆ
ｏｒｍｉｓである。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属で特
に興味のある種には，Ｋ．ｌａｃｔｉｓが含まれる。酵
母の分類は将来変わるかもしれないので，本発明では，
酵母は，Ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｆ．Ａ．Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｓ．
Ｍ．Ｐａｓｓｍｏｒｅ＆Ｒ．Ｒ．Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ
編，１９８０年）（Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ.９）に記載されて
いるように定義されるものとする。上記のことに加え
て，当業者は，酵母の生物学および酵母の遺伝子操作に
ついて，おそらく熟知している。例えば，Ｂｉｏ−ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｙ
ｅａｓｔ（Ｍ．Ｂａｃｉｌａ，Ｂ．Ｌ．Ｈｏｒｅｃｋｅ
ｒ＆Ａ．Ｏ．Ｍ．Ｓｔｏｐｐａｎｉ編，１９７８年）：
Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ（Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅ＆Ｊ．Ｓ．Ｈ
ａｒｒｉｓｏｎ編，第２版，１９８７年）：Ｔｈｅ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓｔｒａｔｈ
ｅｒｎら編，１９８１年）を参照されたい。
は，有子嚢胞子酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ），
有担子胞子酵母，および不完全菌類に属する酵母（Ｂｌ
ａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）が含まれる。有子嚢胞子酵母
は，２つの科（すなわち，Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａ
ｃｅａｅ科およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａ
ｅ科）に分けられる。後者は，４つの亜科〔すなわち，
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ亜科
（例えば，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
属），Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ亜科，Ｌｉｐｏｍｙ
ｃｏｉｄｅａｅ亜科，およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏ
ｉｄｅａｅ亜科，（例えば，Ｐｉｃｈｉａ属，Ｋｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
属）〕からなる。有担子胞子酵母には，Ｌｅｕｃｏｓｐ
ｏｒｉｄｉｕｍ属，Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属，
Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属，Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉ
ｕｍ属，およびＦｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ属が含ま
れる。不完全菌類に属する酵母は，２つの科〔すなわ
ち，Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科（例え
ば，Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属，Ｂｕｌｌｅｒａ
属）およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科（例え
ば，Ｃａｎｄｉｄａ属）〕に分けられる。本発明で特に
興味があるのは，Ｐｉｃｈｉａ属，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ
ｙｃｅｓ属，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，Ｓｃｈｉ
ｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属，およびＣａｎｄｉ
ｄａ属に属する種である。特に興味があるのは，Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，
Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ，Ｓ．ｄｉａｓｔａ
ｔｉｃｕｓ，Ｓ．ｄｏｕｇｌａｓｉｉ，Ｓ．ｋｌｕｙｖ
ｅｒｉ，Ｓ．ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ，およびＳ．ｏｖｉｆ
ｏｒｍｉｓである。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属で特
に興味のある種には，Ｋ．ｌａｃｔｉｓが含まれる。酵
母の分類は将来変わるかもしれないので，本発明では，
酵母は，Ｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｆ．Ａ．Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｓ．
Ｍ．Ｐａｓｓｍｏｒｅ＆Ｒ．Ｒ．Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ
編，１９８０年）（Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ.９）に記載されて
いるように定義されるものとする。上記のことに加え
て，当業者は，酵母の生物学および酵母の遺伝子操作に
ついて，おそらく熟知している。例えば，Ｂｉｏ−ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｙ
ｅａｓｔ（Ｍ．Ｂａｃｉｌａ，Ｂ．Ｌ．Ｈｏｒｅｃｋｅ
ｒ＆Ａ．Ｏ．Ｍ．Ｓｔｏｐｐａｎｉ編，１９７８年）：
Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔｓ（Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅ＆Ｊ．Ｓ．Ｈ
ａｒｒｉｓｏｎ編，第２版，１９８７年）：Ｔｈｅ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙ
ｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓｔｒａｔｈ
ｅｒｎら編，１９８１年）を参照されたい。
【００２８】本発明は，一例として，Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ属（特に，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵
母に関して記載される。しかしながら，本発明はこれら
の酵母に限定されない。
ｍｙｃｅｓ属（特に，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の酵
母に関して記載される。しかしながら，本発明はこれら
の酵母に限定されない。
【００２９】本発明（すなわち，酵母における異種タン
パクの増強発現）は，異種タンパクのコード配列を酵母
宿主内のＡＤＨ２調節配列の制御下に配置し．該酵母宿
主におけるＡＤＲＩ発現を増強することにより達成され
る。ＡＤＨ２プロモーター（ＡＤＨ２／ＧＡＰＤハイブ
リッドプロモーターのようなハイブリッドＡＤＨ２プロ
モーターを包含する）を用いる非酵母タンパク用の発現
カセットの構築は，ＥＰＯ公開公報第１２０，５５１号
および第１６４，５５６号に詳細に記載されている。
パクの増強発現）は，異種タンパクのコード配列を酵母
宿主内のＡＤＨ２調節配列の制御下に配置し．該酵母宿
主におけるＡＤＲＩ発現を増強することにより達成され
る。ＡＤＨ２プロモーター（ＡＤＨ２／ＧＡＰＤハイブ
リッドプロモーターのようなハイブリッドＡＤＨ２プロ
モーターを包含する）を用いる非酵母タンパク用の発現
カセットの構築は，ＥＰＯ公開公報第１２０，５５１号
および第１６４，５５６号に詳細に記載されている。
【００３０】本発明は，野生型酵母株と比べてＡＤＲＩ
発現が増強された酵母宿主を用いるこのような酵母宿主
を，ＡＤＨ２プロモーターに基づく上記の発現カセット
と共に用いた場合，ＡＤＨ２カセットから産生される異
種タンパクの生産量が実質的に増加する。ＡＤＲＩ発現
が増強された酵母宿主は，数多くの方法で提供すること
ができる。
発現が増強された酵母宿主を用いるこのような酵母宿主
を，ＡＤＨ２プロモーターに基づく上記の発現カセット
と共に用いた場合，ＡＤＨ２カセットから産生される異
種タンパクの生産量が実質的に増加する。ＡＤＲＩ発現
が増強された酵母宿主は，数多くの方法で提供すること
ができる。
【００３１】ある好ましい実施態様では，増強されたＡ
ＤＲＩ発現は，（通常，ＡＤＲ１遺伝子に由来する）Ａ
ＤＲＩのコード配列を含む発現カセットで酵母宿主を形
質転換することにより与えられる。該発現カセットは，
宿主におけるＡＤＲＩのより高い発現レベルを与える。
該発現カセットは，ＡＤＲ１転写開始配列および転写終
結配列の制御下にあるコード配列を含み得る。あるい
は，異種の転写開始配列および転写終結配列を用いても
よい。ある好ましい実施態様では，ＡＤＲＩカセット
は，ＡＤＲ１プロモーターの代わりに，強力な酵母プロ
モーター（すなわち，ＡＤＲ１プロモーターに比べて，
コード配列の転写を少なくとも５倍増加させるプロモー
ターである）を用いて構築される。このようなプロモー
ターの例として，ＧＡＰＤプロモーターがある。
ＤＲＩ発現は，（通常，ＡＤＲ１遺伝子に由来する）Ａ
ＤＲＩのコード配列を含む発現カセットで酵母宿主を形
質転換することにより与えられる。該発現カセットは，
宿主におけるＡＤＲＩのより高い発現レベルを与える。
該発現カセットは，ＡＤＲ１転写開始配列および転写終
結配列の制御下にあるコード配列を含み得る。あるい
は，異種の転写開始配列および転写終結配列を用いても
よい。ある好ましい実施態様では，ＡＤＲＩカセット
は，ＡＤＲ１プロモーターの代わりに，強力な酵母プロ
モーター（すなわち，ＡＤＲ１プロモーターに比べて，
コード配列の転写を少なくとも５倍増加させるプロモー
ターである）を用いて構築される。このようなプロモー
ターの例として，ＧＡＰＤプロモーターがある。
【００３２】ＡＤＲＩカセットは，カセットを染色体外
ベクター（例えば，コピー数の多いベクター）上に維持
するか，あるいは組込みベクターを用いて酵母宿主ゲノ
ム内に組込むことにより，酵母宿主を形質転換するのに
用いることができる。ＡＤＲＩカセットおよび非酵母タ
ンパクカセットは，酵母宿主の内部における同じベクタ
ーまたは異なるベクター上に維持するか，あるいは同じ
組込みベクターまたは異なる組込みベクターを用いて宿
主ゲノム内に組込むことができる。
ベクター（例えば，コピー数の多いベクター）上に維持
するか，あるいは組込みベクターを用いて酵母宿主ゲノ
ム内に組込むことにより，酵母宿主を形質転換するのに
用いることができる。ＡＤＲＩカセットおよび非酵母タ
ンパクカセットは，酵母宿主の内部における同じベクタ
ーまたは異なるベクター上に維持するか，あるいは同じ
組込みベクターまたは異なる組込みベクターを用いて宿
主ゲノム内に組込むことができる。
【００３３】特に好ましい実施態様では，酵母宿主は，
強力な酵母プロモーターを用いたＡＤＲＩカセットを有
する組込みベクターにより形質転換され，異種タンパク
カセットは，染色体外の高コピーベクター上に維持され
る。例えば，組込まれたＡＤＲＩカセットは，ＧＡＰＤ
プロモーターを用いることができ，染色体外非酵母タン
パクカセットは，ＡＤＨ２プロモーターまたはＡＤＨ２
／ＧＡＰＤハイブリッドプロモーターを用いることがで
きる。
強力な酵母プロモーターを用いたＡＤＲＩカセットを有
する組込みベクターにより形質転換され，異種タンパク
カセットは，染色体外の高コピーベクター上に維持され
る。例えば，組込まれたＡＤＲＩカセットは，ＧＡＰＤ
プロモーターを用いることができ，染色体外非酵母タン
パクカセットは，ＡＤＨ２プロモーターまたはＡＤＨ２
／ＧＡＰＤハイブリッドプロモーターを用いることがで
きる。
【００３４】本発明において使用されるレプリコン（通
常，プラスミド）は，１つまたはそれ以上の複製系，望
ましくは発現用の酵母宿主とクローニング用の細菌宿主
（例えば，Ｅ．ｃｏｌｉとの両方において，レプリコン
の維持を可能にする２つの複製系を包含する。このよう
な酵母−細菌シャトルベクターの例には，ＹＥｐ２４
〔Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ，８：１７
−２４〕，ｐＣ１／１〔Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒ
ｏｃ.Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：４
６４２−４６４６〕，およびＹＲｐ１７〔Ｓｔｉｎｃｈ
ｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．１５８：
１５７〕が挙げられる。さらに，染色体外ベクターは，
コピー数が多いかまたは少ないベクターであってもよ
い。コピー数は，一般に約１〜約５００である。高コピ
ー数酵母ベクターを用いると，単一宿主内におけるコピ
ー数は，一般に少なくとも１０，好ましくは少なくとも
２０であり，通常は約１５０〜５００を越えない。選択
された非酵母タンパクによって，宿主に対するベクター
および異質タンパクの影響により，コピー数の多いベク
ターまたはコピー数の少ないベクターが望ましい。例え
ば，Ｂｒａｋｅら（前出）を参照されたい。本発明のＤ
ＮＡ構築物はまた，組込みベクターによって酵母ゲノム
内に組込むことができる。このようなベクターの例は，
当該技術分野で知られている。例えば，Ｂｏｔｓｔｅｉ
ｎら（前出）を参照されたい。ゲノムに組込まれるカセ
ットのコピー数は，好ましくは５０より少なく，より好
ましくは約１０より少なく，通常は約５より少ない（野
生型遺伝子に加えて）。典型的には，組込まれるカセッ
トのコピー数は，１または２である。
常，プラスミド）は，１つまたはそれ以上の複製系，望
ましくは発現用の酵母宿主とクローニング用の細菌宿主
（例えば，Ｅ．ｃｏｌｉとの両方において，レプリコン
の維持を可能にする２つの複製系を包含する。このよう
な酵母−細菌シャトルベクターの例には，ＹＥｐ２４
〔Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９７９）Ｇｅｎｅ，８：１７
−２４〕，ｐＣ１／１〔Ｂｒａｋｅら（１９８４）Ｐｒ
ｏｃ.Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：４
６４２−４６４６〕，およびＹＲｐ１７〔Ｓｔｉｎｃｈ
ｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ１．１５８：
１５７〕が挙げられる。さらに，染色体外ベクターは，
コピー数が多いかまたは少ないベクターであってもよ
い。コピー数は，一般に約１〜約５００である。高コピ
ー数酵母ベクターを用いると，単一宿主内におけるコピ
ー数は，一般に少なくとも１０，好ましくは少なくとも
２０であり，通常は約１５０〜５００を越えない。選択
された非酵母タンパクによって，宿主に対するベクター
および異質タンパクの影響により，コピー数の多いベク
ターまたはコピー数の少ないベクターが望ましい。例え
ば，Ｂｒａｋｅら（前出）を参照されたい。本発明のＤ
ＮＡ構築物はまた，組込みベクターによって酵母ゲノム
内に組込むことができる。このようなベクターの例は，
当該技術分野で知られている。例えば，Ｂｏｔｓｔｅｉ
ｎら（前出）を参照されたい。ゲノムに組込まれるカセ
ットのコピー数は，好ましくは５０より少なく，より好
ましくは約１０より少なく，通常は約５より少ない（野
生型遺伝子に加えて）。典型的には，組込まれるカセッ
トのコピー数は，１または２である。
【００３５】本発明を実施するのに適切な酵母および他
の微生物宿主（例えば，二倍体，一倍体，栄養要求株な
ど）の選択は，当該技術の範囲内のことである。発現用
の酵母宿主を選択する場合，適切な宿主には，特に，良
好な分泌能力，低いタンパク分解活性，および全体的な
強さを有することが知られているものが含まれる。酵母
および他の微生物は，一般に様々な供給源から入手でき
る。これらの中には，カリフォルニア州バークレーのカ
リフォルニア大学生物物理および医学物理学部の酵母遺
伝子ストックセンター，およびメリーランド州ロックビ
ルのアメリカンタイプカルチャーコレクションが含まれ
る。
の微生物宿主（例えば，二倍体，一倍体，栄養要求株な
ど）の選択は，当該技術の範囲内のことである。発現用
の酵母宿主を選択する場合，適切な宿主には，特に，良
好な分泌能力，低いタンパク分解活性，および全体的な
強さを有することが知られているものが含まれる。酵母
および他の微生物は，一般に様々な供給源から入手でき
る。これらの中には，カリフォルニア州バークレーのカ
リフォルニア大学生物物理および医学物理学部の酵母遺
伝子ストックセンター，およびメリーランド州ロックビ
ルのアメリカンタイプカルチャーコレクションが含まれ
る。
【００３６】外来ＤＮＡを酵母宿主内に導入する方法
は，当該技術分野でよく知られている。酵母を形質転換
するには，種々様々な方法がある。例えば，スフェロプ
ラスト形質転換が教示されている（例えば，Ｈｉｎｎｅ
ｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７５，１９１９−１９３３；およびＳｔｉ
ｎｃｈｃｏｍｂら，ＥＰＯ公開公報第４５，５７３
号）。形質転換体は，適切な栄養培地で増殖し，適切な
場所で，内存ＤＮＡの保持を確実にする選択圧下で維持
される。発現を誘発させ得る場合，酵母宿主を増殖させ
て細胞密度を高くすることができ，次いで発現を誘発さ
せる。非酵母タンパクは，従来の手段により採集され，
クロマトグラフィー，電気泳動，透析，溶媒抽出などに
より精製される。
は，当該技術分野でよく知られている。酵母を形質転換
するには，種々様々な方法がある。例えば，スフェロプ
ラスト形質転換が教示されている（例えば，Ｈｉｎｎｅ
ｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７５，１９１９−１９３３；およびＳｔｉ
ｎｃｈｃｏｍｂら，ＥＰＯ公開公報第４５，５７３
号）。形質転換体は，適切な栄養培地で増殖し，適切な
場所で，内存ＤＮＡの保持を確実にする選択圧下で維持
される。発現を誘発させ得る場合，酵母宿主を増殖させ
て細胞密度を高くすることができ，次いで発現を誘発さ
せる。非酵母タンパクは，従来の手段により採集され，
クロマトグラフィー，電気泳動，透析，溶媒抽出などに
より精製される。
【００３７】
【実施例】以下の実施例は，単に例示を目的とするもの
であり本発明の範囲を限定するものではない。この発明
を実施するのに必要な生物学的出発材料は，同一もしく
は同等物を公に入手できるので，寄託する必要はないと
思われる。本願明細書に引用されているすべての文献に
記載されている内容は，当業者が熟知していると思わ
れ，特に本願に引用文献として用いる。
であり本発明の範囲を限定するものではない。この発明
を実施するのに必要な生物学的出発材料は，同一もしく
は同等物を公に入手できるので，寄託する必要はないと
思われる。本願明細書に引用されているすべての文献に
記載されている内容は，当業者が熟知していると思わ
れ，特に本願に引用文献として用いる。
【００３８】実施例１
この実施例では，ＡＤＲＩの発現が強化された発現カセ
ットの構築，自律的に複製する酵母ベクターへの該カセ
ットの挿入，および該ベクターによる酵母株の形質転換
について述べる。第１図は，ベクター構築の流れ図を示
し，第２図は，得られたベクターの部分制限地図を示
す。
ットの構築，自律的に複製する酵母ベクターへの該カセ
ットの挿入，および該ベクターによる酵母株の形質転換
について述べる。第１図は，ベクター構築の流れ図を示
し，第２図は，得られたベクターの部分制限地図を示
す。
【００３９】プラスミドＹＰｐ７−ＡＤＲ１−４１１
〔デニス（Ｄｅｎｉｓ）ら．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３巻，３６０〜３７０頁，１９８３年〕は酵母ＡＤ
Ｒ１遺伝子を有する。このプラスミドを，制限酵素Ｈｉ
ｎｃIIで切断し，５’末端の最初の１６個のアミノ酸の
コドンを欠いたＡＤＲ１遺伝子を含む断片を単離した。
標準方法で，Ｎ末端コドンを置換してＢｇｌII制限部位
を含む５’延長部分を付与し，ひとつのオリゴヌクレオ
チドを合成した。ＡＤＲ１遺伝子に通常存在するコドン
の代わりに酵母に好ましいコドンを用いて調製したオリ
ゴヌクレオチドアダプターの配列は下記のとおりであ
る。
〔デニス（Ｄｅｎｉｓ）ら．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３巻，３６０〜３７０頁，１９８３年〕は酵母ＡＤ
Ｒ１遺伝子を有する。このプラスミドを，制限酵素Ｈｉ
ｎｃIIで切断し，５’末端の最初の１６個のアミノ酸の
コドンを欠いたＡＤＲ１遺伝子を含む断片を単離した。
標準方法で，Ｎ末端コドンを置換してＢｇｌII制限部位
を含む５’延長部分を付与し，ひとつのオリゴヌクレオ
チドを合成した。ＡＤＲ１遺伝子に通常存在するコドン
の代わりに酵母に好ましいコドンを用いて調製したオリ
ゴヌクレオチドアダプターの配列は下記のとおりであ
る。
【００４０】
【化１】
【００４１】このアダプターを，ＹＰｐ７−ＡＤＲ１−
４１１由来の上記ＨｉｎｃII断片に，標準条件下で連結
した。リガーゼを不活性化した後，得られた混合物をＢ
ｇｌIIで切断し，ＡＤＲＩの最初の６４１個のアミノ酸
のコード配列を有する１．９ｋｂのＢｇｌII断片を創製
した。次にこのＢｇｌII断片を精製し，再クローン化
し，プラスミドｐＡＢ２７のＧＡＰＤプロモーターとＧ
ＡＰＤターミネーターとの間のＢｇｌII部位に連結し
た。上記連結は，このプロモーターが，ＡＤＲＩをコー
ドする配列の正確な転写を指示するように行なわれた。
得られたプラスミドをｐＪＳ１１８と命名した。
４１１由来の上記ＨｉｎｃII断片に，標準条件下で連結
した。リガーゼを不活性化した後，得られた混合物をＢ
ｇｌIIで切断し，ＡＤＲＩの最初の６４１個のアミノ酸
のコード配列を有する１．９ｋｂのＢｇｌII断片を創製
した。次にこのＢｇｌII断片を精製し，再クローン化
し，プラスミドｐＡＢ２７のＧＡＰＤプロモーターとＧ
ＡＰＤターミネーターとの間のＢｇｌII部位に連結し
た。上記連結は，このプロモーターが，ＡＤＲＩをコー
ドする配列の正確な転写を指示するように行なわれた。
得られたプラスミドをｐＪＳ１１８と命名した。
【００４２】プラスミドｐＡＢ２７は，酵母の２ミクロ
ンプラスミド，Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＲ３２２プラスミ
ド，酵母の標識遺伝子ＵＲＡ３およびＬＥＵ−２ｄ由来
の配列，そして，ＧＡＰＤプロモーターおよびＧＡＰＤ
ターミネーターの配列の間に配置されたＢｇｌII挿入部
位を有する”空の”（ｅｍｐｔｙ）ＧＡＰＤ発現カセッ
トを含む酵母シャトル発現ベクターである。
ンプラスミド，Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＢＲ３２２プラスミ
ド，酵母の標識遺伝子ＵＲＡ３およびＬＥＵ−２ｄ由来
の配列，そして，ＧＡＰＤプロモーターおよびＧＡＰＤ
ターミネーターの配列の間に配置されたＢｇｌII挿入部
位を有する”空の”（ｅｍｐｔｙ）ＧＡＰＤ発現カセッ
トを含む酵母シャトル発現ベクターである。
【００４３】プラスミドｐＪＳ１１８は，ＡＤＲＩの最
初の６４１個のアミノ酸のみをコードするので，中間体
である。次に，ＡＤＲ１遺伝子由来のコード配列の残り
の部分をこのベクターに付加してｐＪＳ１１９を得た。
まず，ＹＲｐ７−ＡＤＲ１−４１１をＳａｃＩで切断
し，ＡＤＲ１由来の残りのコード配列と，ＡＤＲ１の
３’隣接配列とを有する４ｋｂの断片を単離した。次い
でこの４ｋｂの断片を，ＳａｃＩで切断してアルカリホ
スファターゼで処理したｐＪＳ１１８に連結して，プラ
スミドｐＪＳ１１９を創製した。ＡＤＲ１コード配列の
完全性を制限酵素分析法で試験して，断片が正しい方向
に挿入されていることを確認した。プラスミドｐＪＳ１
１９を，標準法を用いて，２種の異なる酵母宿主株ＡＢ
１１０およびＪＣ４８２に形質転換した。〔例えばヒネ
ン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９頁，１９７８
年，を参照〕。
初の６４１個のアミノ酸のみをコードするので，中間体
である。次に，ＡＤＲ１遺伝子由来のコード配列の残り
の部分をこのベクターに付加してｐＪＳ１１９を得た。
まず，ＹＲｐ７−ＡＤＲ１−４１１をＳａｃＩで切断
し，ＡＤＲ１由来の残りのコード配列と，ＡＤＲ１の
３’隣接配列とを有する４ｋｂの断片を単離した。次い
でこの４ｋｂの断片を，ＳａｃＩで切断してアルカリホ
スファターゼで処理したｐＪＳ１１８に連結して，プラ
スミドｐＪＳ１１９を創製した。ＡＤＲ１コード配列の
完全性を制限酵素分析法で試験して，断片が正しい方向
に挿入されていることを確認した。プラスミドｐＪＳ１
１９を，標準法を用いて，２種の異なる酵母宿主株ＡＢ
１１０およびＪＣ４８２に形質転換した。〔例えばヒネ
ン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９頁，１９７８
年，を参照〕。
【００４４】エス．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）２１５０−２−３（ワシントン大学のリー ハー
トウェルより入手）と，ｐＣｌ／ｌ誘導体を有するエ
ス．セレビシエＡＢｌ０３．１形質転換体とを交雑させ
ることによって酵母株ＡＢ１１０を得た。二倍体の胞子
が形成され，四分染色体は全裂であった。酵母株は，プ
ラスミドの保持を確実にするためにロイシン選択プレー
ト上に維持した。なぜなら親株が栄養素要求体だからで
ある。一連のコロニーを，いくつかの標識（Ｍａｔα，
ｕｒａ３，ｌｅｕ２，ｐｅｐ４−３）について，その遺
伝子型を選別した。得られた雑種株を，ロイシンの存在
下（すなわち選択圧なし）で増殖することによってその
常在性プラスミドを除去（ｃｕｒｅ）し，次にレプリカ
平板法でｌｅｕコロニーを選別することによって，ＡＢ
１１０株を得た。ＡＢ１１０は，遺伝子型Ｍａｔα，ｕ
ｒａ３−５２，ｌｅｕ２−０４，またはｌｅｕ２−３と
ｌｅｕ２−１１２，ｐｅｐ４−３，ｈｉｓ４−５８０，
ｃｉｒ°を有する。種々の非相同プラスミドを有する上
記の株の試料は，１９８４年５月９日付でＡＴＣＣに寄
託番号第２０７０９号で寄託された。ＥＰＯ公開公報第
１６４，５５６号を参照されたい。
ａｅ）２１５０−２−３（ワシントン大学のリー ハー
トウェルより入手）と，ｐＣｌ／ｌ誘導体を有するエ
ス．セレビシエＡＢｌ０３．１形質転換体とを交雑させ
ることによって酵母株ＡＢ１１０を得た。二倍体の胞子
が形成され，四分染色体は全裂であった。酵母株は，プ
ラスミドの保持を確実にするためにロイシン選択プレー
ト上に維持した。なぜなら親株が栄養素要求体だからで
ある。一連のコロニーを，いくつかの標識（Ｍａｔα，
ｕｒａ３，ｌｅｕ２，ｐｅｐ４−３）について，その遺
伝子型を選別した。得られた雑種株を，ロイシンの存在
下（すなわち選択圧なし）で増殖することによってその
常在性プラスミドを除去（ｃｕｒｅ）し，次にレプリカ
平板法でｌｅｕコロニーを選別することによって，ＡＢ
１１０株を得た。ＡＢ１１０は，遺伝子型Ｍａｔα，ｕ
ｒａ３−５２，ｌｅｕ２−０４，またはｌｅｕ２−３と
ｌｅｕ２−１１２，ｐｅｐ４−３，ｈｉｓ４−５８０，
ｃｉｒ°を有する。種々の非相同プラスミドを有する上
記の株の試料は，１９８４年５月９日付でＡＴＣＣに寄
託番号第２０７０９号で寄託された。ＥＰＯ公開公報第
１６４，５５６号を参照されたい。
【００４５】ＪＣ４８２株は，米国，ペンシルヴェニア
州，フィラデルフィアのペンシルヴェニア大学のジョン
キャノン博士（Ｄｒ．Ｊｏｈｎ Ｃａｎｎｏｎ）から
入手した。この株は常在性２ミクロンプラスミドが除去
されている。
州，フィラデルフィアのペンシルヴェニア大学のジョン
キャノン博士（Ｄｒ．Ｊｏｈｎ Ｃａｎｎｏｎ）から
入手した。この株は常在性２ミクロンプラスミドが除去
されている。
【００４６】上記の株は，ＡＤＨII活性が増強されてい
るので，ＡＤＨ２調節配列，特に組込みベクター上の発
現カセットの制御下にある，非相同タンパクの発現カセ
ットで形質転換するのに適している。あるいは，このよ
うな発現カセットは，ｐＪＳ１１９の通常の制限部位に
挿入され，得られたベクターを適当な酵母株を形質転換
するのに使用することができる。
るので，ＡＤＨ２調節配列，特に組込みベクター上の発
現カセットの制御下にある，非相同タンパクの発現カセ
ットで形質転換するのに適している。あるいは，このよ
うな発現カセットは，ｐＪＳ１１９の通常の制限部位に
挿入され，得られたベクターを適当な酵母株を形質転換
するのに使用することができる。
【００４７】実施例II
この実施例では，ＡＤＲＩの発現カセットを有する組込
みベクターの構築と，そのベクターによる，酵母株の形
質転換について述べる。組込みプラスミドｐDＭ１５を
第３図に示し，その構築を第１図の流れ図に示す。
みベクターの構築と，そのベクターによる，酵母株の形
質転換について述べる。組込みプラスミドｐDＭ１５を
第３図に示し，その構築を第１図の流れ図に示す。
【００４８】プラスミドｐＪＳ１３２は，ｐＢＲ３２２
配列と；クライベロミセス ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）ＡＤＨ１のプロモータ
ーおよびターミネーター配列の制御下で酵母のＧ４１８
耐性をコードする遺伝子と；を有するプラスミドであ
る。このプラスミドをＳｍａＩとＳａｌＩとで切断し，
得られた大きい方の線状断片を精製した。
配列と；クライベロミセス ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）ＡＤＨ１のプロモータ
ーおよびターミネーター配列の制御下で酵母のＧ４１８
耐性をコードする遺伝子と；を有するプラスミドであ
る。このプラスミドをＳｍａＩとＳａｌＩとで切断し，
得られた大きい方の線状断片を精製した。
【００４９】プラスミドｐＪＳ１１９をＰｓｔＩで切断
した。このＰｓｔＩは，ＡＤＲＩをコードする配列の
３’末端から下流の部位で切断する。次に，切断された
プラスミドを一重鎖に特異的に作用するＳ１ヌクレアー
ゼで処理して平滑断端をつくり出し，次にＳａｌＩで切
断してＡＤＲＩ発現カセットを有する６．２ｋｂの断片
を得た。フェノールによる抽出とエタノールによる沈澱
とを，各逐次工程の間に行った。ＳａｌＩによる平滑断
端を有する断片を，前記の大きい方のｐＪＳ１３２断片
に連結してプラスミドｐＤＭ１５を作製した。
した。このＰｓｔＩは，ＡＤＲＩをコードする配列の
３’末端から下流の部位で切断する。次に，切断された
プラスミドを一重鎖に特異的に作用するＳ１ヌクレアー
ゼで処理して平滑断端をつくり出し，次にＳａｌＩで切
断してＡＤＲＩ発現カセットを有する６．２ｋｂの断片
を得た。フェノールによる抽出とエタノールによる沈澱
とを，各逐次工程の間に行った。ＳａｌＩによる平滑断
端を有する断片を，前記の大きい方のｐＪＳ１３２断片
に連結してプラスミドｐＤＭ１５を作製した。
【００５０】次にプラスミドｐＤＭ１５を用い，標準方
法を使用して酵母を形質転換することによって，ＡＤＲ
Ｉを過剰生産するサッカロミセスを作製した。例えば，
ＡＢ１１０株を，Ｇ４１８耐性株に形質転換し，ＡＤＲ
Ｉ過剰生産性を示す株を分離した。この株をＪＳＣ３０
０と命名した。もうひとつのＡＤＲＩ過剰生産株ＪＳＣ
３０２を、常在性プラスミドを除去したＢＪ２１６８
（前出のＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ）
から同様の方法で作製した。さらに他のＡＤＲＩ過剰生
産株はＪＳＣ３０８である。
法を使用して酵母を形質転換することによって，ＡＤＲ
Ｉを過剰生産するサッカロミセスを作製した。例えば，
ＡＢ１１０株を，Ｇ４１８耐性株に形質転換し，ＡＤＲ
Ｉ過剰生産性を示す株を分離した。この株をＪＳＣ３０
０と命名した。もうひとつのＡＤＲＩ過剰生産株ＪＳＣ
３０２を、常在性プラスミドを除去したＢＪ２１６８
（前出のＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｅｎｔｅｒ）
から同様の方法で作製した。さらに他のＡＤＲＩ過剰生
産株はＪＳＣ３０８である。
【００５１】実施例III
以下の実施例では，非相同性タンパクの発現宿主とし
て，ＡＤＲＩ生産性を強化された酵母株が有用であるこ
とを証明する。
て，ＡＤＲＩ生産性を強化された酵母株が有用であるこ
とを証明する。
【００５２】酵母株ＪＳＣ３００を，スーパーオキシド
ジスムターゼ（ＳＤＤ）／インスリン様増殖因子II（Ｉ
ＧＦII）融合タンパクの発現カセットと，塩基性ヒト繊
維芽細胞増殖因子（ｈＦＧＦ）の発現カセットとで形質
転換した。
ジスムターゼ（ＳＤＤ）／インスリン様増殖因子II（Ｉ
ＧＦII）融合タンパクの発現カセットと，塩基性ヒト繊
維芽細胞増殖因子（ｈＦＧＦ）の発現カセットとで形質
転換した。
【００５３】ＳＯＤ／ＩＧＦII発現ベクターであるｐＹ
ＬＵＩＧＦ２−１４はＥＰＯ公開公報第１９６，０５６
号に記載されている。またこのベクターは，ＡＴＣＣ寄
託番号第２０７４５号で寄託されている（１９８５年２
月２７日）。
ＬＵＩＧＦ２−１４はＥＰＯ公開公報第１９６，０５６
号に記載されている。またこのベクターは，ＡＴＣＣ寄
託番号第２０７４５号で寄託されている（１９８５年２
月２７日）。
【００５４】塩基性ｈＦＧＦ発現ベクターのｐＡ／Ｇ−
ｈＦＧＦは次のようにして作製した。最初に，標準的な
方法で下記の配列を有する合成ｈＦＧＦ遺伝子を作製し
た。
ｈＦＧＦは次のようにして作製した。最初に，標準的な
方法で下記の配列を有する合成ｈＦＧＦ遺伝子を作製し
た。
【００５５】
【化２】
【００５６】プラスミドｐＢＳｌ００（ＥＰＯ公開公報
第１８１，１５０号）はＡＤＨ２／ＧＡＰＤハイブリッ
ドプロモーターカセットを有する。合成ｈＦＧＦ配列を
ゲルで精製し，Ｎｃｏｌ／Ｓａｌｌで消化したｐＢＳｌ
００にクローン化して，ｈＦＧＦ配列をカセット中に配
置した。このカセットを，ＢａｍＨＩで，ｐＢＳｌ００
／ＦＧＦプラスミドから切取り，次いで酵母シャトルベ
クターｐＡＢ２４のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。
ＥＰＯ特許出願第８８３１２３０６．９および特願昭６
３−３３５６８５号、ならびにＢｒｏｓｃｈ、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓ
ｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、第１巻、４４５頁
（１９８１）を参照されたい。得られたベクターをｐＡ
／Ｇ−ｈＦＧＦと命名した。
第１８１，１５０号）はＡＤＨ２／ＧＡＰＤハイブリッ
ドプロモーターカセットを有する。合成ｈＦＧＦ配列を
ゲルで精製し，Ｎｃｏｌ／Ｓａｌｌで消化したｐＢＳｌ
００にクローン化して，ｈＦＧＦ配列をカセット中に配
置した。このカセットを，ＢａｍＨＩで，ｐＢＳｌ００
／ＦＧＦプラスミドから切取り，次いで酵母シャトルベ
クターｐＡＢ２４のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。
ＥＰＯ特許出願第８８３１２３０６．９および特願昭６
３−３３５６８５号、ならびにＢｒｏｓｃｈ、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓ
ｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、第１巻、４４５頁
（１９８１）を参照されたい。得られたベクターをｐＡ
／Ｇ−ｈＦＧＦと命名した。
【００５７】上記発現カセットは，ＡＤＨ２遺伝子由来
のＵＡＳをもっていた。酵母株を形質転換後増殖させ，
標準法で非相同性タンパクを回収した。分離したタンパ
クをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析し
た。酵母株ＡＢ１１０（対照）およびＪＳＣ３００内
に，ＳＯＤ／ＩＧＦII融合タンパクとｈＦＧＦとが発現
したということが，ＪＳＣ３００を宿主として用いた時
に非酵母のタンパクの収量が３００倍も増加したことに
よって証明された。
のＵＡＳをもっていた。酵母株を形質転換後増殖させ，
標準法で非相同性タンパクを回収した。分離したタンパ
クをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分析し
た。酵母株ＡＢ１１０（対照）およびＪＳＣ３００内
に，ＳＯＤ／ＩＧＦII融合タンパクとｈＦＧＦとが発現
したということが，ＪＳＣ３００を宿主として用いた時
に非酵母のタンパクの収量が３００倍も増加したことに
よって証明された。
【００５８】高収量発現の他の例としては，ヒト免疫不
全症ウイルス（ＨＩＶ）タイプ１由来のポリペプチドが
ある。例えば，ＨＩＶ ｇｐ１２０ｅｎｖの１／２のカ
ルボキシ末端に相当するポリペプチドを，高レベルで発
現することができる。適切な発現ベクターの例は，ＥＰ
Ｏ公開公報第１８１，１５０号および特願昭６０−２４
６１０２号に開示されている。これらの文献に開示され
る特に好ましいベクターは，ｐＢＳ２４／ＳＯＤ−ＳＦ
２ｅｎｖ４である。 生物材料の寄託 下記の株およびプラスミドの試料は，Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ）（米国，メリーランド州，ロックビル，パ
ークローン ドライブ１２３０１）に寄託され，ブダペ
スト条約の規定に基づいて保管されている。これらの寄
託番号と寄託日を以下に別記する。 寄託物 ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ． 寄託日 S.Cerevisiae JSC300 ２０８７８ １９８８年５月５日 S.Cerevisiae JSC308 ２０８７９ １９８８年５月５日 pDM15 DNA ４０４５３ １９８８年５月５日 pJS119 DNA ４０４５４ １９８８年５月５日 これらの寄託は,当業者の便宜のために行われるもので
ある。これらの寄託は，このような寄託物がこの発明を
実施するのに必要であることを認めるものではなく，ま
た，同等の実施態様が，本願の開示からみて，当該技術
分野に含まれていないということを認めるものではな
い。これらの寄託物が公に入手できるとはいえ，この特
許もしくは他の特許に基づいて寄託された材料を使用し
て，製造，使用もしくは販売する認可を承認しているわ
けではない。寄託された材料の核酸配列は参照のため本
願に組み込まれ，本願に記載の配列と矛盾するか否かを
コントロールされている。
全症ウイルス（ＨＩＶ）タイプ１由来のポリペプチドが
ある。例えば，ＨＩＶ ｇｐ１２０ｅｎｖの１／２のカ
ルボキシ末端に相当するポリペプチドを，高レベルで発
現することができる。適切な発現ベクターの例は，ＥＰ
Ｏ公開公報第１８１，１５０号および特願昭６０−２４
６１０２号に開示されている。これらの文献に開示され
る特に好ましいベクターは，ｐＢＳ２４／ＳＯＤ−ＳＦ
２ｅｎｖ４である。 生物材料の寄託 下記の株およびプラスミドの試料は，Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ）（米国，メリーランド州，ロックビル，パ
ークローン ドライブ１２３０１）に寄託され，ブダペ
スト条約の規定に基づいて保管されている。これらの寄
託番号と寄託日を以下に別記する。 寄託物 ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ． 寄託日 S.Cerevisiae JSC300 ２０８７８ １９８８年５月５日 S.Cerevisiae JSC308 ２０８７９ １９８８年５月５日 pDM15 DNA ４０４５３ １９８８年５月５日 pJS119 DNA ４０４５４ １９８８年５月５日 これらの寄託は,当業者の便宜のために行われるもので
ある。これらの寄託は，このような寄託物がこの発明を
実施するのに必要であることを認めるものではなく，ま
た，同等の実施態様が，本願の開示からみて，当該技術
分野に含まれていないということを認めるものではな
い。これらの寄託物が公に入手できるとはいえ，この特
許もしくは他の特許に基づいて寄託された材料を使用し
て，製造，使用もしくは販売する認可を承認しているわ
けではない。寄託された材料の核酸配列は参照のため本
願に組み込まれ，本願に記載の配列と矛盾するか否かを
コントロールされている。
【００５９】本発明は，明確さと理解を目的として，図
示と実施例とでいくぶん詳細に説明したが，添付の特許
請求の範囲から逸脱することなく改変および修飾が行な
われ得ることは明らかである。
示と実施例とでいくぶん詳細に説明したが，添付の特許
請求の範囲から逸脱することなく改変および修飾が行な
われ得ることは明らかである。
【図１】図１は，プラスミドｐＪＳ１１９およびｐＤＭ
１５の構築を示すフローチャートである。
１５の構築を示すフローチャートである。
【図２】図２は，プラスミドｐＪＳ１１９の制限地図で
ある。すべての制限部位が示されているわけではない。
この図では以下の略号が用いられている：ＵＲＡ３，酵
母ＵＲＡ３遺伝子；ＬＥＵ２−ｄ，酵母ＬＥＵ２−ｄ遺
伝子；ＧＡＰ−ｔ，グリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼｍＲＮＡ終結配列；ＡＤＲ１，酵母ＡＤ
Ｒ１遺伝子；ｐ−ＧＡＰ，グリセルアルデヒド−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡプロモーター開始配列；
ｐＢＲ３２２，Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド配列；２μｍ，
酵母２ミクロンプラスミド配列。
ある。すべての制限部位が示されているわけではない。
この図では以下の略号が用いられている：ＵＲＡ３，酵
母ＵＲＡ３遺伝子；ＬＥＵ２−ｄ，酵母ＬＥＵ２−ｄ遺
伝子；ＧＡＰ−ｔ，グリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼｍＲＮＡ終結配列；ＡＤＲ１，酵母ＡＤ
Ｒ１遺伝子；ｐ−ＧＡＰ，グリセルアルデヒド−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡプロモーター開始配列；
ｐＢＲ３２２，Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド配列；２μｍ，
酵母２ミクロンプラスミド配列。
【図３】図３は，プラスミドｐＤＭ１５の制限地図であ
る。すべての制限部位が示されているわけではない。略
号は第２図と同じであるが，以下のものが付け加えられ
ている。：Ｇ４１８，Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）
に対する耐性を与える遺伝子；（Ｓｍａ／Ｐｓｔ），Ｓ
ｍａＩとＰｓｔＩとの制限部位間の融合部位。
る。すべての制限部位が示されているわけではない。略
号は第２図と同じであるが，以下のものが付け加えられ
ている。：Ｇ４１８，Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）
に対する耐性を与える遺伝子；（Ｓｍａ／Ｐｓｔ），Ｓ
ｍａＩとＰｓｔＩとの制限部位間の融合部位。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭61−268193（ＪＰ，Ａ)
Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．,
208（１−２）， 101−106 （1987)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12N 1/19
C12P 21/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 形質転換された酵母であって、ＡＤＨ２
調節系のもとでの異種タンパク質の発現を増強するため
の発現カセットを含み、 該カセットは、酵母が認識する転写開始配列および転写
終結配列の制御下にあるＡＤＲＩのコード配列を含み、 該転写開始配列がＡＤＲ１プロモーター以外である、 形質転換された酵母。 - 【請求項２】 前記発現カセットがゲノムに組み込まれ
ている、請求項１に記載の酵母。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の酵母であっ
て、前記転写開始配列が強力な酵母プロモーターであ
り、 該強力な酵母プロモーターは、該プロモーターの制御下
にあるコード配列の転写を、ＡＤＲ１プロモーターと比
較して少なくとも５倍増加させる、 酵母。 - 【請求項４】 前記強力な酵母プロモーターが酵母解糖
酵素プロモーターである、請求項３に記載の酵母。 - 【請求項５】 前記強力な酵母プロモーターがＧＡＰＤ
プロモーターである、請求項３に記載の酵母。 - 【請求項６】 キットであって、以下： （ａ）請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の酵
母；および （ｂ）（ａ）の酵母を、非酵母タンパク質の発現カセッ
トを用いて形質転換するよう指示する指示書であって、 該発現カセットが、該酵母において機能する、酵母が認
識する転写開始配列および転写終結配列の制御下に、該
非酵母タンパク質のＤＮＡコード配列を含み、 該転写開始配列は酵母ＡＤＨ２上流活性化部位をさらに
含む、 指示書、 を含む、キット。
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| WO2003027280A1 (fr) * | 2001-09-20 | 2003-04-03 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Systeme de surexpression genique |
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| NZ555386A (en) | 2004-12-22 | 2011-01-28 | Ambrx Inc | Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid |
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| CA3005835C (en) | 2004-12-22 | 2023-01-31 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
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| DE102005029170A1 (de) * | 2005-06-23 | 2006-12-28 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | System zur Genexpression in Hefen der Gattung Sporidiobolus |
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| CA2630220C (en) | 2005-11-22 | 2020-10-13 | Doris Coit | Norovirus and sapovirus antigens |
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| CN101511856B (zh) * | 2006-09-08 | 2016-01-20 | Ambrx公司 | 脊椎动物细胞中抑制因子trna的转录 |
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-
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