DE19919124A1 - Nukleinsäuremolekül, umfassend eine für ein Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität kodierende Nukleinsäure - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine für ein Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität und Derivate davon kodierende Nukleinsäure, wobei die Derivate wenigstens 10% der Chorismatmutase-Aktivität der Chorismatmutase gemäß SEQ ID NO:2 aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren, Nukleinsäuremoleküle umfassende Wirtszellen und deren Verwendung in Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit Chorismatmutase-Aktivität. DOLLAR A Die Erfindung betrifft ferner die Polypeptide mit Chorismatmutase-Aktivität und Antikörper, die diese spezifisch erkennen. DOLLAR A Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung von auxotrophen Hefestämmen mit Hilfe der Nukleinsäuremoleküle und die Bereitstellung der Hefestämme. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der Hefestämme zusammen mit den erfindungsgemäßen Vektoren in Verfahren zur rekombinanten Expression heterologer Gene, die die leichte Selektierbarkeit der Transformanden durch funktionelle Komplementation ermöglichen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine für ein Po­ lypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität und Derivate davon kodierende Nukleinsäure, wobei die Derivate wenigstens 10% der Chorismatmutase-Aktivität der Chorismatmuta­ se gemäß SEQ ID NO: 2 aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuremolekü­ le enthaltende Vektoren, Nukleinsäuremoleküle umfassende Wirtszellen und Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit Chorismatmutase-Aktivität. Die vorliegende Erfin­ dung betrifft ferner die Polypeptide mit Chorismatmutase-Aktivität und Antikörper, die diese spezifisch erkennen. Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Herstellung von auxotrophen Hefestämmen mit Hilfe der Nukleinsäuremoleküle und deren Verwen­ dung in Verfahren zur rekombinanten Expression heterologer Gene.

Hefen als einzellige, eukaryontische Mikroorganismen sind problemlos kultivierbar und haben den großen Vorteil, leicht genetisch manipulierbar zu sein. Zudem können sie re­ kombinante Proteine entsprechend den aus höheren Organismen bekannten Mustern prozessieren und modifizieren. Sie enthalten, soweit bisher bekannt, keine pathogenen Substanzen und bieten sich daher auch für die Produktion therapeutischer Proteine an. So wurde beispielsweise der erste durch heterologe Genexpression produzierte Impf­ stoff, das Hepatitis B-Vakzin, in der gut charakterisierten Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae heterolog exprimiert (Lepetic et al., 1996).

Zwar ermöglicht S. cerevisiae die Produktion vieler verschiedener Proteine (zur Über­ sicht siehe Gellissen and Hollenberg, 1997), es bestehen jedoch auch einige begren­ zende Eigenschaften. So beträgt beispielsweise der maximale Anteil an heterologem Protein ungefähr 1-5% des Gesamtproteingehaltes der Zelle (Buckholz and Gleeson, 1991).

Verschiedene andere Hefen, wie etwa Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica und auch Hansenula polymorpha, wurden hinsichtlich ihrer Eignung als Expressionssystem charakterisiert und mit S. cerevisiae verglichen (Müller et al., 1998). Alle diese Hefen zeigten eine deutlich stärkere Sekretion an aktivem Prote­ in als S. cerevisiae, wobei die heterologe Genexpression abhängig vom jeweiligen Gen, jedoch unabhängig vom Donororganismus war. Grundsätzlich erweisen sich methylo­ trophe Hefen als attraktive Organismen für die Produktion rekombinanter Proteine. Man unterteilt die methylotrophen Hefen in die vier Gattungen Hansenula, Pichia, Candida und Torulopsis, die alle die Fähigkeit besitzen, Methanol, Methylamine, Formaldehyd oder Formiat als Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen.

Zu der verhältnismäßig kleinen Gruppe der methylotrophen Hefen gehört u. a. die Hefe Hansenula polymorpha aus der Familie der Saccharomycetaceae (Lodder, 1970). Han­ senula polymorpha vergärt Glukose nicht unter aeroben Bedingungen, ist also Crabtree- negativ (Verduyn et al., 1992) und zählt mit einem Wachstumstemperaturoptimum von 37°C zu den thermotoleranten Hefen; sie stellt damit eine Ausnahme unter den methy­ lotrophen Gattungen dar. Das natürliche Habitat der methylotrophen Hefen sind an or­ ganischem Material reiche Standorte.

Bisher wurden nur wenige Gene der Hefe Hansenula polymorpha kloniert und charakte­ risiert (Hansen and Hollenberg, 1996). Die Ähnlichkeiten dieser Gene mit den homolo­ gen Genen in Saccharomyces cerevisiae, soweit vorhanden, sind relativ begrenzt (Dobson et al., 1982). Die Schlüsselenzyme im methylotrophen Stoffwechsel sind die Enzyme Methanoloxidase (MOX), Dihydroxyacetonsynthase (DAS) und Formiatdehy­ drogenase (FMD), deren von sehr stark regulierten Promotoren gelenkte Expression vielseitig nutzbare Möglichkeiten der heterologen Genexpression eröffnet. Diese Tatsa­ chen machen Hansenula polymorpha zu einem industriell interessanten Organismus (Gellissen et al., 1994).

Bisher sind erst zwei auxotrophe Stämme von H. polymorpha verfügbar, deren Trans­ formation durch funktionelle Komplementation des ura3- bzw. leu2-Mangels selektioniert werden kann. Die Bereitstellung weiterer Transformationssysteme, bestehend aus au­ xotrophen Stämmen und zur Komplementation der Auxotrophie fähigen Nukleinsäuren scheiterte bislang daran, daß geeignete zur Komplementation fähige Gene nicht zur Verfügung stehen. Es sind zwar eine Reihe von Genen aus dem Aminosäure- oder Nu­ kleinsäurebiosyntheseweg der Bäckerhefe S. cerevisiae bekannt, doch hat sich in der Vergangenheit gezeigt, daß die Unterschiede zwischen den Genen der Bäckerhefe und den methylotrophen Hefen zum Teil beachtlich sind. Daher kann generell nicht erwartet werden, daß ein S. cerevisiae-Gen zur Komplementation einer Auxotrophie in einer methylotrophen Hefe geeignet ist, noch kann erwartet werden, daß Gene aus einer methylotrophen Hefe zur Komplementation einer Auxotrophie in S. cerevisiae fähig sind.

Es ist somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Gen aus H. polymorpha bereitzustellen, das als selektierbarer Marker für die Komplementation bei Transformation von entsprechenden auxotrophen Hefestämmen dienen kann. Eine weitere Aufgabe liegt in der Bereitstellung von Vektoren und Wirtszellen, die das Gen enthalten. Weiterhin sollen das von dem Gen kodierte Polypeptid und Antikörper, die das Polypeptid spezifisch erkennen, bereitgestellt werden. Schließlich sollen entspre­ chende auxotrophe Stämme bereitgestellt werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Nukleinsäure-Molekül, umfas­ send eine für ein Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität kodierende Nukleinsäure oder deren Gegenstrang, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus

• a) einer Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz bzw. der ihr entsprechenden RNA-Sequenz;
• b) einer Nukleinsäure, die mit dem Gegenstrang einer Nukleinsäure nach (a) hybridi­ siert;
• c) einer Nukleinsäure, die aufgrund des genetischen Codes zu den unter (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen degeneriert ist;
• d) einer Nukleinsäure, die mit einer der in (a) bis (c) angegebenen Nukleinsäuren hy­ bridisiert und deren Gegenstrang für ein Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität kodiert;
• e) einer Nukleinsäure, die wenigstens 60% homolog zu einer der in (a) bis (d) an­ gegebenen Nukleinsäuren ist;
• f) einer Variante der in (a) bis (e) angegebenen Nukleinsäuren, wobei die Variante gegenüber den in (a) bis (e) angegebenen Nukleinsäuren Additionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen aufweist;
• g) einem Fragment einer der in (a) bis (f) angegebenen Nukleinsäuren;
• h) eine Kombination mehrerer der unter (a) bis (g) angegebenen Nukleinsäuren,

wobei das von der Nukleinsäure oder deren Gegenstrang kodierte Polypeptid wenig­ stens 10% der Chorismatmutase-Aktivität der Chorismatmutase gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.

In Mikroorganismen und Pflanzen verläuft die Biosynthese aromatischer Aminosäuren zunächst über 7 enzymkatalysierte Reaktionen des Shikimatweges von Erythrose-4- Phosphat und Phosphoenolpyruvat hin zum Chorismat (Fig. 1). Chorismat ist das Substrat des ersten Verzweigungspunktes. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevi­ siae wird, ausgehend von diesem Verzweigungspunkt, einerseits durch das Enzym An­ thranilatsynthase (E.C. 4.1.3.27) Anthranilat und andererseits durch das Enzym Choris­ matmutase (E.C. 5.4.99.5) Prephenat gebildet. Aus Prephenat wird über weitere Zwi­ schenprodukte schließlich Tyrosin und Phenylalanin gebildet (Braus, 1991). In der Bäc­ kerhefe Saccharomyces cerevisiae wird die Chorismatmutase durch das ARO7-Gen (Schmidheini et al., 1989) kodiert, welches auf dem Chromosom XVI lokalisiert ist. ARO7 kodiert eine 0,95 kb mRNA und enthält ein 771 bp großes offenes Leseraster, das für ein aus 256 Aminosäuren bestehendes Protein kodiert.

Im nachfolgenden werden einige Begriffe näher erläutert, um klarzustellen, wie sie im Zusammenhang der vorliegenden Anmeldung verstanden werden sollen.

Der Begriff "Chorismatmutase", so, wie er nachfolgend in der Beschreibung verwendet wird, umfaßt vollständige Chorismatmutase, Chorismatmutase-Fragmente, Chorismat­ mutase-Mutanten und Fusionsproteine davon. Als erfindungsgemäß werden Polypepti­ de betrachtet, die wenigstens 10% der Chorismatmutase-Aktivität der Chorismatmutase gemäß SEQ ID NO: 2 aufweisen.

"Chorismatmutase-Aktivität" bedeutet die katalytische Umsetzung von Chorismat zu Prephenat als Teil der Phenylalanin- und Tyrosin-Biosynthese, die durch das Enzym Chorismatmutase (E.C. 5.4.99.5) katalysiert wird. Die Chorismatmutase-Aktivität des er­ findungsgemäßen Polypeptides kann beispielsweise spektralphotometrisch durch die Säure-katalysierte Umsetzung des Produktes Prephenat zu Phenylpyruvat, welches bei 320 nm absorbiert, gemessen werden (Schmidheini et al., 1989).

Ein "prototropher" Mikroorganismus benötigt für sein Wachstum bzw. seine Vermehrung nur einfache Nährstoffe (Kohlenstoff und Stickstoff) und Mineralien, kann jedoch alle benötigten Aminosäuren selbst aufbauen. Dementsprechend ist er in der Lage, auf "Minimalmedium" zu wachsen.

Im Gegensatz dazu benötigen "auxotrophe" Mikroorganismen zusätzliche Faktoren, bei­ spielsweise Aminosäuren, die sie auf Grund eines Defektes im Biosyntheseweg für den betreffenden Faktor nicht selbst synthetisieren können. In Zusammenhang mit der vor­ liegenden Erfindung ist die Auxotrophie vorzugsweise eine Phenylalanin/Tyrosin- Auxotrophie, die durch die verringerte oder fehlende Chorismatmutase-Aktivität z. B. ei­ nes erfindungsgemäß hergestellten auxotrophen Hefestammes verursacht wird.

"Minimalmedium" bedeutet eine Nährstofflösung, die nur die Bestandteile enthält, die zum Wachstum eines prototrophen Mikroorganismus notwendig sind. In Zusammen­ hang mit der vorliegenden Erfindung ist das Minimalmedium vorzugsweise ein Phenylalanin- und/oder Tyrosin-freies Medium, wodurch die Selektion der Phenylala­ nin/Tyrosin-auxotrophen Form des Mikroorganismus gegenüber der prototrophen Form des Mikroorganismus ermöglicht wird.

"His-Tag" bedeutet eine Sequenz von wenigstens 6 Histidin-Aminosäuren, die durch entsprechende Klonierung und Fusion mit einer exprimierbaren Sequenz zu einem Fu­ sionsprotein mit wenigstens 6 His-Resten am NH₂-Terminus führt, das leicht durch Komplexierung mit einer Ni²⁺-Säule aufgereinigt werden kann.

Unter einem "heterologen Gen" ist der kodierende Bereich eines Strukturgens zu ver­ stehen, der entweder nicht unter der Kontrolle des eigenen (homologen) Promotors oder nicht in dem Organismus, aus dem er abgeleitet ist, oder weder unter der Kontrolle des eigenen Promotors noch im ursprünglichen Organismus exprimiert wird.

"Klonierung" soll alle im Stand der Technik bekannten Klonierungsmethoden umfassen, die hier zum Einsatz kommen könnten, die jedoch nicht alle im einzelnen beschrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören.

Unter "rekombinanter Expression in einer geeigneten Wirtszelle" sollen alle im Stand der Technik bekannten Expressionsmethoden in bekannten Expressionssystemen verstan­ den werden, die hier zum Einsatz kommen könnten, jedoch nicht alle im einzelnen be­ schrieben werden, weil sie zum selbstverständlichen Handwerkszeug des Fachmanns gehören.

Den Erfindern ist es erstmals gelungen, durch Selektionierung und Sequenzierung eines genomischen Klons aus Hansenula polymorpha, der nach Transformation zur funktionel­ len Komplementation der Phenylalanin/Tyrosin-Auxotrophie des Saccharomyces cere­ visiae aro7Δ-Deletionsstammes fähig ist, eine erfindungsgemäße Nukleinsäure zu identifizieren und mit dieser Nukleinsäure auxotrophe Mutanten methylotropher Hefen herzustellen. Damit wird ein weiteres dringend benötigtes Transformationssystem für methylotrophe Hefen bereitgestellt, das die gezielte Selektion transformierter Hefe mit einfachen Mitteln ermöglicht.

Die Erfinder haben eine genomische Bank von H. polymorpha durch Klonierung von Restriktionsfragmenten chromosomaler H. polymorpha-DNA in einen Shuttle-Vektor hergestellt, wobei der Shuttle-Vektor eine hohe Kopienzahl in Hefe aufweist und die Hansenula-Gene in S. cerevisiae unter der Kontrolle ihres endogenen Promotors ex­ primiert werden. Diese genomische Bank wurde zur Komplementation auxotropher Sac­ charomyces cerevisiae-Stämme verwendet, obwohl es unbekannt war, daß der jeweils endogene Promotor des Hansenula polymorpha-Gens in S. cerevisiae aktiv ist.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß das Chorismatmutase-Gen aus Han­ senula polymorpha in S. cerevisiae transkribiert und translatiert wird und enzymatisch aktiv ist.

Daß gerade das Chorismatmutase-Gen in Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden konnte, war aus mehreren Gründen nicht zu erwarten.

So war unbekannt, ob das Chorismatmutase-Gen aus H. polymorpha Introns enthält und ob der S. cerevisiae-Spleißing-Apparat zur korrekten Prozessierung der möglichen Prä-RNA in der Lage ist. Nunmehr konnte gezeigt werden, daß das Chorismatmutase- Gen aus H. polymorpha keine Introns aufweist.

Weiterhin war nicht vorauszusehen, daß das Translationsprodukt in S. cerevisiae kor­ rekt gefaltet und gegebenenfalls assembliert werden kann, um eine ausreichend aktive Chorismatmutase zu ergeben, die in der Lage ist, die Reaktion von Chorismat zu Pre­ phenat zu katalysieren. Die fehlende Vorhersagbarkeit wird gestützt durch die Tatsache, daß HLEU2, das LEU2-Homologe aus H. polymorpha, nicht in der Lage ist, eine ent­ sprechende Mutation in S. cerevisiae zu komplementieren (Agaphonov et al., 1994).

Ferner war nicht bekannt, daß die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Phenylalanin in H. polymorpha überhaupt die Umsetzung von Chorismat zu Pre­ phenat mit Hilfe des Enzyms Chorismatmutase umfaßt. Tatsächlich ist bekannt, daß es bei der Biosynthese aromatischer Aminosäuren erhebliche Unterschiede gibt. So wird in einigen Cyanobakterien Prephenat zunächst durch Transaminierung zu Arogenat um­ gewandelt. Dieser Weg wird auch von Pflanzen genutzt (Jensen und Stenmark, 1975) und ist in der Natur weiter verbreitet als der Hydroxyphenylpyruvat-/Phenylpyruvatweg, der von Saccharomyces cerevisiae und E. coli genutzt wird.

Die im erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül enthaltene Nukleinsäure kann geno­ mische DNA, cDNA oder synthetische DNA sein, wobei unter einer synthetischen DNA- Sequenz auch eine solche verstanden wird, die modifizierte Internukleosid-Bindungen enthält. Weiter kann es sich bei der Nukleinsäure um eine RNA-Sequenz handeln, was z. B. für die Expression mittels rekombinanter Vektorsysteme erforderlich sein kann. Die Nukleinsäure gemäß (b) ist beispielsweise erhältlich durch Verwenden einer nachweis­ bar markierten Sonde, die einer der unter (a) angegebenen Sequenzen oder einem Fragment bzw. deren Gegenstrang entspricht, zum Screening von cDNA- bzw. genomi­ schen DNA-Bibliotheken aus Mikroorganismen. Vorzugsweise gehört der Mikroorganis­ mus, aus dem die Bank erstellt wird, zu einer Gattung ausgewählt aus: Pichia, Hansenu­ la, Candida, Torulopsis, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces und Yarrowia. Insbesondere gehört der Mikrooganismus zu einer Species ausgewählt aus:
Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis und Yarrowia lipolytica. Die Identifizierung positiver cDNA- bzw. genomischer DNA-Klone erfolgt dabei gemäß Standardverfahren. Vgl. Maniatis et al., Molecular Cloning (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die unter (b) oder (d) angegebene Hybridi­ sierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt. Stringente Hybridisierungsbedin­ gungen sind z. B. Inkubation bei 65°C über Nacht in 7% SDS, 1% BSA, 1 mM EDTA, 250 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) und nachfolgendes Waschen bei 65°C mit 2× SSC; 0,1% SDS.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Nukleinsäuren bereitgestellt, die wenig­ stens 60% homolog zu der in (a) angegebenen Nukleinsäuresequenz sind. Bevorzugt sind die Nukleinsäuren wenigstens 80% homolog zu der in (a) angegebenen Nuklein­ säuresequenz. Besonders bevorzugt sind die Nukleinsäuren wenigstens 90% oder 95% homolog zu der in (a) angegebenen Nukleinsäure.

Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck "Homologie" Homologie auf DNA-Ebene, die mittels bekannter Verfahren, z. B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Basic lo­ cal alignment search tool, S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) be­ stimmt werden kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine Kombination mehrerer der unter (a) bis (f) angegebenen Nukleinsäuren, die durch dem Fachmann bekannte Fusion und gegebenenfalls Klonierung erhalten werden können. Diese Kombinationen können z. B. für die Erzeugung immunogener Konstrukte von be­ sonderem Interesse sein.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodierte Polypeptid wenigsten 50% der Chorismatmutaseaktivität der Chorismatmutase SEQ ID NO: 2 auf. Besonders bevorzugt ist es, daß das Polypeptid wenigstens 75% der Chorismatmutaseaktivität gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist. Die Chorismatmutaseaktivität wird dabei, wie bereits angegeben, gemäß Schmidheini et al., 1989 gemessen.

In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Nukleinsäuremolekül einen zur Expres­ sion geeigneten Promotor, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle des Promotors steht. Die Wahl des Promotors hängt vom zur Expression verwendeten Expressionssy­ stem, insbesondere der Wahl des Wirtsorganismus ab. Erfindungsgemäß bevorzugt sind sowohl konstitutive Promotoren wie PGK- und G3PDH-Promotoren als auch indu­ zierbare Promotoren wie GAL4, ADH2 und der Cu-Metallothionein-Promotor (Überblick in Recombinant Gene Expression Protocols in Methods in Molecular Biology Vol. 63, Herausgeber R. S. Tuan, Kapitel III; Schena, M. et al. (1991) Vectors for constitutive and inducible expression in yeast, Methods in Enzymol. 194, 389-398). Von der Erfindung wird ferner die Verwendung von Säuger-Glucocorticoid-Response-Elementen (GRE) zur Erhöhung der Transkription in Betracht gezogen (Schena et al., Science 241 (1988), 965-967).

Weiterhin bevorzugt sind die Promotoren des Methanolstoffwechsels von methylotro­ phen Hefen, insbesondere Hansenula polymorpha. Die Gene für die Enzyme des Methanolstoffwechsels in Hansenula polymorpha gehören zu den am stärksten expri­ mierten und regulierten Genen, die bisher in Hefen beschrieben worden sind (Van der Klei et al., 1991). Die entsprechenden Proteine können bis zu 30% des Gesamtprotein­ gehaltes des Zelle ausmachen (Janowicz et al., 1985; Ledeboer et al., 1985). Die Ex­ pression der Gene des Methanolmetabolismus' läßt sich einerseits durch Methanol in­ duzieren, andererseits führt aber auch die Gegenwart von Glycerin zu einer Derepressi­ on. Auf diese Weise lassen sich also die starken Promotoren des Methanolmetabolis­ mus auch unter methanolfreien Kulturbedingungen für die heterologe Genexpression nutzen.

Besonders bevorzugte Promotoren sind der in H. polymorpha beschriebene Methano­ loxidase MOX Promoter, der mit etwa 1,5 kb ungewöhnlich groß ist und zu den stärksten bisher beschriebenen Hefepromotoren gehört. Die Gegenwart von Glukose führt zu ei­ ner Repression des MOX Promoters, jedoch läßt sich die Aktivität dieses Promoters durch Glycerin bzw. Methanol mehr als 1000fach steigern (Gödecke et al., 1994). Wei­ terhin besonders bevorzugt ist der Dihydroxyacetonsynthase DAS-Promotor (Ledeboer et al., 1985) und der FMD-Promotor (Europäisches Patent 299108).

In einer ferner bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Nukleinsäuremolekül weiterhin eine Signalpeptid-kodierende Nukleinsäuresequenz, die den Export des exprimierten Proteins gewährleistet, wobei die Signalpeptid-kodierende Nukleinsäuresequenz vor­ zugsweise direkt 5' mit dem zu exprimierenden heterologen Gen verbunden ist. Für die Sekretion und Modifikation vieler eukaryontischer Proteine ist es erforderlich, die Proteinsequenz am N-Terminus mit einer Signalsequenz zu fusionieren, um die Poly­ peptide in den Sekretionsapparat zu lenken. Hier kommen beispielsweise Komponenten aus dem S. occidenfalis-Gen GAM1 (Dohmen et al., 1990) und aus einem hormonellen Gen der Krabbe Carcinus maenas (Weidemann et al., 1989) in Betracht, die für die Se­ kretion von Hirudin erfolgreich verwendet wurden (Weidemann et al., 1995).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Nukleinsäuremolekül ferner wenigstens ein Teil eines Vektors, insbesondere regulatorische Regionen, wobei der Vektor ausgewählt sein kann aus: Bacteriophagen wie λ-Derivaten, Plasmiden, Adeno­ viren, Vacciniaviren, Baculoviren, SV40-Viren und Retroviren, vorzugsweise MoMuLV (Moloney Murine Leukemia Virus).

Besonders bevorzugt sind Hefe-Transformationsvektoren, wobei sowohl integrative Hefeplasmide (YIp) als auch extrachromosomale Plasmidvektoren in Betracht kommen. Die extrachromosomalen Plasmidvektoren unterteilen sich in episomale Hefeplasmide (YEp), replikative Hefeplasmide (YRp) und Hefecentromer-Plasmide (YCp) (vgl. Singh, K. K. und Heinemann, J. A., Kapitel 11 in Recombinant Gene Expression Protocols, su­ pra). Weiterhin werden erfindungsgemäß künstliche Hefe-Chromosomen (YACs) als Expressionsvektoren in Betracht gezogen.

Besonders bevorzugte Vektoren sind weiterhin Hefe-Replikationsplasmide, die einen Replikationsursprung ori und eine Antibiotikaresistenz-Kassette enthalten, um in E. coli propagiert und selektioniert werden zu können. Desweiteren tragen sie eine ARS- Sequenz zur chromosomal unabhängigen Replikation in der Hefezelle, wie etwa HARS1 aus H. polymorpha, sowie einen metabolischen Hefeselektionsmarker, wie etwa URA3 oder HLEU2 (Gellissen and Hollenberg, 1997).

Es wurden bereits viele heterologe Proteine in H. polymorpha produziert (Gellissen und Hollenberg, 1997) und durch die Plazierung von mehr als einer Expressionskassette auf einem Transformationsvektor ist auch eine Co-Expression verschiedener Gene möglich (Gilbert et al., 1994).

Ferner ist ein Nukleinsäuremolekül bevorzugt, das zusätzlich eine His-Tag-kodierende DNA-Sequenz umfaßt, die bei Expression des Konstrukts zur Bildung eines Fusionspro­ teins mit einem His-Tag am NH₂-Terminus des Proteins führt, welches die Aufreinigung des Proteins an einer Nickel-Säule durch Chelat-Bildung erleichtert.

Erfindungsgemäß werden Wirtszellen bereitgestellt, die das Nukleinsäuremolekül ent­ halten und die zur Expression des heterologen Gens geeignet sind. Im Stand der Tech­ nik sind zahlreiche prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme bekannt, wobei die Wirtszellen beispielsweise ausgewählt sind aus prokaryontischen Zellen wie E. coli oder B. subtilis, aus eukaryontischen Zellen wie Hefezellen, Insektenzellen und Säugerzellen, z. B. CHO-Zellen, COS-Zellen oder HeLa-Zellen, sowie Derivaten davon. Im Stand der Technik sind beispielsweise bestimmte CHO-Produktionslinien bekannt, deren Glykosylierungsmuster im Vergleich zu CHO-Zellen verändert sind.

Vorzugsweise gehört die Hefe zu einer Gattung ausgewählt aus: Pichia, Hansenula, Candida, Torulopsis, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces und Yar­ rowia. Insbesondere gehört der Mikrooganismus zu einer Species ausgewählt aus: Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis und Yarrowia lipolytica (vergleiche Recombinant Gene Expression Protocols in Methods in Molecular Biology, supra).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiter ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptides mit Chorismatmutase-Aktivität. Dazu wird das erfindungsgemäße Nuklein­ säuremolekül in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert und das Protein aus der Wirtszel­ le oder dem Medium mittels üblicher Verfahren isoliert.

Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen be­ kannt; (vergleiche Recombinant Gene Expression Protocols in Methods in Molecular Biology, supra). Die Expression kann sowohl konstitutiv als auch induzierbar sein, wobei Induktoren wie beispielsweise IPTG und Zn²⁺ dem Fachmann bekannt sind. Das herge­ stellte Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität kann, falls ein His-Tag an den NH₂- Terminus des Polypeptids fusioniert wurde, durch Chelat-Bildung an einer Nickel-Säule aufgereinigt werden. Vorzugsweise wird das Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität durch Ionenaustausch-Chromatographie und/oder Gelfiltrations-Chromatographie auf­ gereinigt. Die Durchführung dieser Maßnahmen ist dem Fachmann bekannt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäß hergestellte Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität modifiziert. Die Modifikationen umfassen hier­ bei die Di-, Oligo- und Polymerisierung des monomeren Ausgangsprodukts beispiels­ weise durch Quervernetzung, z. B. durch Dicyclohexylcarbodiimid oder Pegylierung oder Assoziation (self assembly). Weitere Modifikationen umfassen Seitenketten- Modifikationen, beispielsweise von ε-Amino-Lysin-Resten des Polypeptides, oder Ami­ no- bzw. Carboxy-terminale Modifikationen. Weitere Modifikationen umfassen posttrans­ lationale Ereignisse, z. B. die Glykosylierung oder die partielle oder vollständige Degly­ kosylierung des Proteins.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erhaltene Polypeptid bei rekombinanter Expression in Prokaryonten oder Glykosylierungs-defizienten Eukaryonten nicht- glykosyliert. Ebenfalls in Betracht gezogen wird erfindungsgemäß ein Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität, das durch rekombinante Expression in zur Glykosylierung fähigen Eukaryonten wie Hefezellen, Insektenzellen oder Säugerzellen, wie CHO-Zellen oder HeLa-Zellen, glykosyliert ist.

In einer weiteren Ausführungsform werden Polypeptide mit Chorismatmutase-Aktivität zur Verfügung gestellt, die eine Aminosäuresequenz umfassen, wobei die Aminosäure­ sequenz von einer oder mehreren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle ko­ diert wird.

Bevorzugt werden Polypeptide mit Chorismatmutase-Aktivität zur Verfügung gestellt, die die in SEQ ID NO: 2 Aminosäuresequenz oder ein Fragment davon umfassen, das we­ nigstens 10% der Chorismatmutase Aktivität der der Chorismatmutase gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist, bevorzugt mehr als 50% und besonders bevorzugt mehr als 75%.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Polypeptide mit Chorismatmuta­ se-Aktivität, erhältlich durch das rekombinante Herstellungsverfahren oder Modifikatio­ nen davon, bereit.

Weiterhin wird nicht-glykosyliertes und glykosyliertes Polypeptid mit Chorismatmutase- Aktivität, erhältlich durch Expression in zur Glykosylierung fähigen bzw. unfähigen Wirts­ zellen, bereitgestellt. Je nach vorgesehener Verwendung des Polypeptids kann das Gly­ kosylierungsmuster von Hefe, inbesondere methylotropher Hefe wie Hansenula poly­ morpha, von COS- oder HeLa-Zellen bevorzugt sein.

Die Erfindung stellt ferner Antikörper bereit, die spezifisch mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität reagieren und erhältlich sind durch Immunisie­ ren eines Versuchstieres mit dem Polypeptid. Polyklonale Antikörper können durch Im­ munisieren beispielsweise von Kaninchen, Mäusen oder Ratten und anschließendes Gewinnen von Antiseren erhalten werden. Monoklonale Antikörper können gemäß Standardverfahren durch Immunisieren von z. B. Mäusen, Gewinnen und Immortalisie­ ren der Milzzellen und Klonieren der Hybridome, die für das Polypeptid spezifische Anti­ körper produzieren, erhalten werden.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung ei­ nes Phenylalanin- und Tyrosin-auxotrophen Hefestammes bereit, umfassend das Zer­ stören des endogenen Chorismatmutase-Gens des entsprechenden Hefestammes, wo­ bei die Mutante weniger als 10% der Chorismatmutase-Aktivität der Chorismatmutase gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.

Erfindungsgemäß wird die homologe Rekombination als Verfahren zur Erzeugung der Mutante in Betracht gezogen. Die Disruption des Chorismatmutase-Gens durch homo­ loge Rekombination beruht auf dem Ersetzen der endogenen chromosomalen Kopie des Gens durch eine inaktivierte Kopie. Zur Herstellung eines Disruptionskonstruktes ist die Klonierung größerer Bereiche des zu zerstörenden Gens für die effiziente homologe Rekombination, vorzugsweise umfassend die 5'- und 3'-Bereiche, erforderlich. Die klo­ nierten Bereiche sollten vorzugsweise wenigstens 2 kb umfassen.

Ein BgIII-Verdau genomischer DNA aus Hansenula polymorpha und nachfolgende Southern-Blot-Analyse mit einer Chorismatmutase-spezifischen Sonde wie z. B. SEQ ID NO: 3 ergab zwei Banden von 3,2 kb bzw. 3,0 kb. Die weitere Untersuchung zeigte, daß das 3,2 kb BgIII/BgIII-Fragment 690 bp von SEQ ID NO: 3 umfaßt und den flankierenden 5'-Bereich enthält. Das 3,0 kb-BgIII-Fragment umfaßt 960 bp von SEQ ID NO: 3 und ent­ hält den flankierenden 3'-Bereich.

Die Isolierung und gerichtete Fusion des 3,2 kb Fragmentes mit dem 3,0 kb Fragment mit Hilfe dem Fachmann bekannter Standardverfahren führt zu einem 6,2 kb-Fragment, das das Chorismatmutase-Gen und große 5' und 3' flankierende Bereiche umfaßt.

Erfindungsgemäß wird die zu zerstörende Nukleinsäure, vorzugsweise eine Nukleinsäu­ re gemäß SEQ ID NO: 1 oder eine dazu homologe Nukleinsäure, besonders bevorzugt die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 3 oder eine dazu homologe Nukleinsäure, insbe­ sondere die Nukleinsäure das 6,2 kb genomische DNA-Fragment, eine dazu homologe Nukleinsäure oder Teile davon, umfassend, kloniert und durch Oligonukleotidaustausch mutiert, wobei die Mutation Additionen, Deletionen, Inversionen oder Substitutionen umfassen kann, die die Expression des Gens verringern oder zu einem inaktiven Translationsprodukt führen. Die Mutation erfolgt vorzugsweise wenigstens in einem Be­ reich oder Teilen davon, die ausgewählt sind aus den Nukleinsäurepositionen, korre­ spondierend zu den Aminosäurepositionen (SEQ ID NO: 2) 10 bis 20, 154 bis 167, 192 bis 196 und 240 bis 247; diese Bereiche bilden mutmaßlich das katalytische Zentrum der Chorismatmutase. Es ist bevorzugt die für die Chorismatmutase kodierende Nu­ kleinsäure durch Einklonieren eines längeren Oligonukleotides zu inaktivieren.

Vorzugsweise liegt das endogene Chorismatmutase-Gen als Einzelkopie-Gen vor.

Vorzugsweise umfaßt das zum Oligonukleotidaustausch verwendete Oligonukleotid wenigstens einen selektierbaren Marker wie eine Antibiotikaresistenz oder einen Stoff­ wechselmarker. Erfindungsgemäß werden sämtliche im Stand der Technik bekannten selektierbaren Marker umfaßt. Alternativ kann das Konstrukt auch synthetisch herge­ stellt werden. Das Konstrukt sollte zur effizienten homologen Rekombination eine Länge von wenigstens 2 kb aufweisen.

Das einklonierte Oligonukleotid ist 5' und 3' jeweils von Chorismatmutase-spezifischen Fragmenten flankiert, deren Sequenzen den in Anspruch 1(a) bis 1(h) angegebenen Sequenzen entsprechen oder zu diesen komplementär sind und mit der ursprünglichen chromosomalen Kopie hybridisieren können.

Das Konstrukt wird zur Herstellung einer Disruptionsmutante zunächst linearisiert. An­ schließend wird der zur Erzeugung der Disruptionsmutante vorgesehene prototrophe Hefestamm mit dem Konstrukt transformiert. Sofern das Konstrukt einen selektierbaren Marker umfaßt, werden die Transformanden durch entsprechenden Selektionsdruck selektioniert. Die Phenylalanin/Tyrosin-auxotrophen Transformanden werden durch Wachstum auf Phenylalanin-/Tyrosin-freiem Medium identifiziert.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Schritte:

• a) Herstellen eines Konstruktes, umfassend wenigstens zwei Fragmente einer zur homologen Rekombination geeignete Nukleinsäure gemäß Anspruch 1(a) bis 1(h), die eine zur homologen Rekombination nicht geeignete Nukleinsäure flankieren;
• b) Transformieren von Zellen eines Hefestammes mit intaktem endogenen Choris­ matmutase-Gen mit diesem Konstrukt
  und
• c) Identifizieren der Phenylalanin- und Tyrosin-auxotrophen Transformanden.

Besonders bevorzugt umfaßt das Konstrukt ferner ein Selektionsmarkergen. Weiterhin kann das Konstrukt eine oder mehrere Rekombinationsstellen umfassen, die vorzugs­ weise den selektierbaren Marker 5' und 3' flankieren und das Herausschneiden des se­ lektierbaren Markers aus dem Konstrukt nach erfolgter Disruption des endogenen Cho­ rismatmutase-Gens ermöglichen.

Vorzugsweise ist die Rekombinationsstelle loxP. In einer besonders bevorzugten Aus­ führungsform umfaßt das Verfahren ferner in Schritt b), daß die Zellen des Hefestam­ mes in Schritt b) mit zur Expression von Cre-Rekombinase geeigneter Nukleinsäure in Kontakt gebracht werden, wodurch das Herausschneiden der selektierbaren Marker­ gens mit Hilfe des loxP/Cre-Rekombinase-Systems ermöglicht wird.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Hefestamm Hansenula poly­ morpha.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Phenylalanin- und Tyrosin- auxotrophen Hefestamm bereit, wie er z. B. durch das erfindungsgemäße Verfahren er­ hältlich ist.

In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen bereitgestellt, umfassend:

• a) Transformieren eines erfindungsgemäßen auxotrophen Hefestammes mit einer Kombination eines zur Expression geeigneten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremole­ küls und einem zur Expression geeigneten heterologen Gen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors;
• b) Kultivieren der Transformanden unter zur Expression des heterologen Gens und des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls geeigneten Bedingungen und gegeben­ falls Isolieren des Proteins, welches von dem heterologen Gen kodiert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren ferner den Schritt des Se­ lektionierens der Transformanden auf Phenylalanin- und/oder Tyrosin-Mangelmedium. Das erfindungsgemäße rekombinante Herstellungsverfahren ist durchführbar mit räum­ lich voneinander getrenntem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül und heterologen Gen, wobei die beiden in zwei Vektoren bereitgestellt werden (binäres Vektor-System) und unabhängig voneinander transformiert werden können. Alternativ liegen das erfin­ dungsgemäße Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit Chorismatmutase- Aktivität kodiert, und das heterologe Gen in einem Vektor vor. Diese Kointegrat- Vektoren weisen den Vorteil auf, daß das selektierbare Markergen und das heterologe Gen kovalent miteinander verbunden sind, so daß alle nach Transformation prototro­ phen Klone auch das heterologe Gen enthalten, wodurch der Aufwand des Absuchens (Screenings) reduziert wird.

Erfindungsgemäß bevorzugte Promotoren und Vektoren für die Expression des hetero­ logen Gens entsprechen den für die Expression des erfindungsgemäßen Nukleinsäu­ remoleküls vorstehend angegebenen Promotoren und Vektoren. Der Vektor enthält ge­ gebenenfalls weiterhin eine Signalpeptid-kodierende Nukleinsäuresequenz, die die Se­ kretion des rekombinanten Proteins in das Medium bewirkt, und die direkt 5' mit dem heterologen Gen verbunden ist. Weiterhin vorteilhaft ist das Hinzufügen einer His-Tag kodierenden Nukleinsäuresequenz an das 5'-Ende des heterologen Gens, das nach re­ kombinanter Expression die Aufreinigung über eine Nickel-Chelat-Säule ermöglicht.

Die Erfindung stellt ferner rekombinante Proteine bereit, die durch das vorstehend an­ gegebene Verfahren erhältlich sind.

Es ist beabsichtigt, mit den nachfolgenden Figuren und Beispielen die Erfindung zu er­ läutern, diese jedoch in keiner Weise einzuschränken. Dem Fachmann sind aufgrund der Beschreibung und der Beispiele weitere Ausführungsformen zugänglich, die eben­ falls umfaßt sind.

Fig. 1 zeigt die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren über den Shikimatweg.

Fig. 2 zeigt die Ligation der DNA-Fragmente in den Vektor pRS426. Der Vektor wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI linearisiert und in diese Schnittstelle wurden die ge­ nomischen Sau3A DNA-Fragmente aus H. polymorpha ligiert. Dies ist möglich, da die Schnittstellen BamHI und Sau3A kompatibel sind.

Fig. 3 zeigt den Wachstumsvergleich von mit 2 komplementierenden DNA- Fragmenten transformierten Zellen. Zur Verdeutlichung der unterschiedlichen Wachs­ tumsgeschwindigkeiten wurde Zellmaterial der mit einem 5 kb-(pME1524) oder einem 1,8 kb-(pME1525; Subklon von pME1524) DNA-Fragment komplementierten Zellen in Wasser verdünnt und von jeder Verdünnungsstufe 20 µl auf Minimalmedium aufgetra­ gen. Die optische Dichte der verschiedenen Verdünnungsstufen ist jeweils gleich, da je­ doch nur die grundsätzlich verschiedenen Wachstumsgeschwindigkeiten veranschau­ licht werden sollten, wurden keine genauen Wachstumsparameter ermittelt.

Fig. 4 zeigt die Autoradiographie einer Hybridisierung chromosomaler DNA aus ver­ schiedenen Pilzen mit einem 1,8 kb DNA-Fragment aus H. polymorpha, das zur Kom­ plementation der Phenylalamin-/Tyrosin-Auxotrophie des S. cerevisiae aro7Δ- Selektionsstammes fähig ist. Chromosomale DNA von S. cerevisiae (1), A. nidulans (2) und H. polymorpha (3) wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV geschnitten und mit ei­ ner ³²P-radioaktiv markierten DNA-Sonde, hergestellt unter Verwendung des genomi­ schen 1,8 kb DNA-Fragmentes aus H. polymorpha, hybridisiert.

Fig. 5 zeigt die Sequenz eines genomischen 1,8 kb-Fragmentes (SEQ ID NO: 3), das zur Komplementation der Phenylalamin-/Tyrosin-Auxotrophie des S. cerevisiae aro7Δ- Selektionsstammes fähig ist. Die 5'- und 3'-Region sind in Kleinbuchstaben dargestellt, das offene Leseraster (SEQ ID NO: 1) und die Primärsequenz (SEQ ID NO: 2) des abge­ leiteten Genproduktes in Großbuchstaben.

Fig. 6 zeigt die Amplifizierung der flankierenden Regionen des HARO7-ORFs'. Die flankierenden Regionen des HARO7-Gens wurden mit den Primem OLSK34/T7 bzw. OLSK35/T3 amplifiziert und anschließend mit Apal/BgIII bzw. BgIII/XbaI geschnitten. Dies ist möglich, da die Primer OLSK34 und OLSK35 BgIII-Erkennungssequenzen bein­ halten.

Fig. 7 zeigt die Herstellung verschiedener Deletionskonstrukte. Die flankierenden Re­ gionen des HARO7-ORFs' wurden als Apal/BgIII- bzw. BgIII/XbaI-Fragmente in den ApaI/XbaI-geschnittenen Vektor pBluescriptKSll ligiert. Der Vektor pBluescript II KS wird von der Firma STRATAGENE, USA, vertrieben. Der Vektor wurde mit BgIII wieder ge­ öffnet und die mit BamHI bzw. BgIII geschnittenen Disruptionskassetten hineinligiert.

Material und Methoden 1. Material 1.1 Chemikalien

Chemikalien zur Herstellung von Lösungen, Puffern und Medien wurden von den Fir­ men Merck (Darmstadt, Deutschland), Boehringer Ingelheim Bioproducts (Heidelberg, Deutschland), Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Deutschland), Gibco BRL (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Deutschland), Fluka (Neu-Ulm, Deutschland) und Sig­ ma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland) bezogen.

Restriktionsenzyme, DNA-modifizierende Enzyme und Polymerasen wurden von MBI Fermentas (Vilnius, LIT), RNase A bei der Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland) erworben. Als DNA-Größenstandard wurde die "1 kb DNA-Leiter" (Gene Ruler Plus) von MBI Fermentas verwendet. Agarose wurde von Roth bezogen.

Zur Präparation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und zur Extraktion von DNA aus Agarosegelen wurden Kits der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) verwendet.

Synthetische Oligonukleotide wurden bei Nucleic Acid Products Supply Göttingen GmbH (Göttingen, Deutschland) und Gibco BRL (Life Technologies GmbH, Karlsruhe, Deutschland) erworben.

Auftragssequenzierungen wurden von der Firma MWG-Biotech-GmbH (Ebersberg, Deutschland) durchgeführt.

1.2 Stämme, Plasmide und Oligonukleotide

Für Klonierungen wurde der E. coli-Stamm DH5α [F',ϕ80dlacZΔM15,Δ(lacZY A­ argF),U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17,(r_K-,m_K ⁺),supE44,λ-,thi-1,gyrA96,re1A1 (verwen­ det (Woodcock, 1989). Für diese Arbeit wurde der H. polymorpha Stamm RB11 (ura3) verwendet (Weydemann et al., 1995).

Die verwendeten S. cerevisiae Stämme sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die im Rahmen dieser Arbeit benötigten Plasmide und Oligonukleotide sind in den Ta­ bellen 2 und 3 aufgelistet.

Tab. 1

Verwendete S. cerevisiae Stämme

Tab. 2

Verwendete Plasmide

Tab. 3

Verwendete Oligonukleotide

2. Methoden 2.1 Kultivierung der Mikroorganismen 2.1.1 Escherichia coli

Die Zellen wurden in Luria-Bertani-Medium (LB: 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl) bei 37°C kultiviert. Für Stämme mit dem Ampicillin-Resistenzmarker wurde dem Medium 50 mg/l Ampicillin zugegeben.

2.1.2 Hansenula polymorpha

Die Zellen wurden bei 37°C entweder in "yeast extract peptone dextrose Medium" (YEPD: 2% Pepton, 1% Hefeextrakt, 2% Glukose) oder in "yeast-nitrogen-base- Medium" (YNB: 0,15% Yeast Nitrogen Base, 0,5% (NH₄)₂SO₄, 0,1% myo-Inositol (200 mM), 5% Glukose, für den vorliegenden Stamm supplementiert mit Uracil), kultiviert. Alle Medien wurden vor Gebrauch autoklaviert und für feste Medien wurde 2% Agar hinzu­ gegeben.

2.1.3 Saccharomyces cerevisiae

Die Zellen wurden bei 30°C entweder in "yeast extract peptone dextrose Medium" (YEPD: 2% Pepton, 1% Hefeextrakt, 2% Glukose) oder in "minimal vitamins Medium" (MV: 0,15% Yeast Nitrogen Base, 0,52% Ammoniumsulfat, 2% Glukose, 1% Succinat, 0,3% KOH) kultiviert. Supplemente wie L-Aminosäuren oder Uracil wurden entspre­ chend Sherman et al. (1986) zugesetzt und, ebenso wie auch Antibiotika, steril filtriert bzw. autoklaviert und dem sterilen Medium zugegeben. Für feste Medien wurde 2% Ag­ ar hinzugegeben. Das Wachstum der Hefezellen wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm verfolgt.

2.2 Isolierung von Nukleinsäuren 2.2.1 Qiagen Plasmid-DNA Präparation aus Escherichia coli

Es wurden zunächst die kultivierten Bakterien abzentrifugiert und das entstandene Se­ diment wurde in 0,3 ml Puffer P1 (Bezeichnung der Puffer gemäß Hersteller) resuspen­ diert. Dann wurden 0,3 ml Puffer P2 hinzugegeben und das Gemisch für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Im nächsten Schritt wurden 0,3 ml des gekühlten Puffers P3 hinzugefügt und erneut für 5 min diesmal auf Eis, inkubiert. Anschließend wurde das Gemisch für 10 min zentrifugiert (12 000 UpM) und der Überstand auf eine zuvor mit Puffer QBT äquilibrierte QIAGEN-tip 20 Säule gegeben. Nachdem der Überstand die Säule durchlaufen hatte, wurde diese viermal mit je 1 ml Puffer QC gewaschen. Die ge­ bundene DNA wurde mit 0,8 ml Puffer QF eluiert. Die eluierte DNA wurde mit 0,7 Volu­ men Isopropanol gefällt und abzentrifugiert (30 min. 10 000 UpM). Schließlich wurde die DNA mit 1 ml 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in H₂O aufgenommen.

2.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli (Birnboim and Doly, 1979)

Die E. coli-Kulturen wurden über Nacht in 5 ml LB-Amp bei 37°C auf einem Rotations­ schüttler kultiviert. 1,5 ml der Kultur wurden in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß abzen­ trifugiert und die Zellen in 100 µl Lösung I (50 mM Glukose, 10 mM EDTA, 20 mM Tris- HCl, pH 8,4, 4 mg/ml Lysozym) resuspendiert. Nach 7 min Inkubation bei RT wurden 200 µl Lösung II (0,2 mM NaOH, 1% w/v SDS) zugegeben, das Gemisch leicht geschüt­ telt und auf Eis 5 min lang inkubiert. 50 µl Lösung III (3 M Na-Acetat, pH 4,8) wurden zu­ gegeben, die Mischung erneut leicht geschüttelt und weitere 7 min auf Eis inkubiert. Die Zelltrümmer wurden abzentrifugiert und der Überstand mit 450 µl CH₂Cl₂-gesättigtem Phenol in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) und anschließend mit 450 µl CH₂Cl₂ extrahiert. Das Plasmid wurde durch Zugabe von 1 ml kaltem EtOH und Inkuba­ tion bei -20°C gefällt. Der Niederschlag wurde nach 30 min Zentrifugation bei 4°C mit 200 µl 70%igem EtOH gewaschen, in vacuo getrocknet und in 50 µl TE-Puffer (inkl. 25 µg/ml RNase A) aufgenommen. Zum Lösen der DNA wurde für 5 min auf 65°C erhitzt, der RNA-Abbau erfolgte mit Hilfe der hitzestabilen RNase A durch Inkubation für 20 min bei 37°C. Die erhaltene Plasmid-DNA-Lösung wurde bei -20°C aufbewahrt.

2.2.3 Isolierung chromosomaler DNA aus Hansenula polymorpha (Hoffman and Winston, 1987)

Es wurden 10 ml YEPD-Medium angeimpft und für etwa 15 h bei 37°C inkubiert. Die Zeilen wurden abzentrifugiert, in 0,5 ml destilliertem Wasser resuspendiert und erneut abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und es wurden 0,2 ml Lysis-Puffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA), 0,2 ml Phenol/­ MeCl₂/TE und 0,3 g Glaskugeln hinzugegeben. Zum Aufbrechen der Zellen wurde 3-4 min geschüttelt und anschließend wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert (5 min. 13 000 UpM). Die wäßrige Phase wurde in ein neues Gefäß gegeben und nach Zugabe von 1 ml Ethanol wurde die DNA gefällt und erneut abzentrifugiert. Das Sediment wurde in 0,4 ml TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert und es wurden 3 µl RNase A (10 mg/ml) zugegeben, woraufhin der Ansatz für 5 min bei 37°C inkubiert wurde. Nun wurden 10 µl 4 M Ammoniumacetat und 1 ml Ethanol hinzugefügt, die ausgefallene DNA wurde abzentrifugiert, der Überstand verworfen, getrocknet und in 50 µl TE aufge­ nommen.

2.3 Klonierungstechniken 2.3.1 Polymerase-Kettenreaktion ("PCR"; Saiki et al., 1985)

Polymerase-Kettenreaktionen wurden mit dem thermostabilen Enzym Taq-Polymerase (Fermentas) in GeneAmpTM-Reaktionsgefäßen (Eppendorf) durchgeführt. Üblicherwei­ se wurden jeweils 5-50 nmol Primer-Oligonukleotid und 10-100 ng DNA als Matrize in 20-50 µl Reaktionspuffer entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet. In der Regel wurden 30 Zyklen des folgenden Temperaturproflls durchlaufen: 30 s Denaturie­ rung bei 94°C/30 s Hybridisierung bei spezifischer Anlagerungstemperatur/30 s-3 min Synthese bei 72°C für Taq-DNA-Polymerase. Die PCR-Zyklen wurden durch einen 3- minütigen Denaturierungsschritt eingeleitet und durch einen finalen Syntheseschritt von 5 min abgeschlossen.

2.3.2 Restriktion von DNA

Für analytische Restriktionsreaktionen wurden ca. 0,5 µg DNA mit 1-2 Einheiten Restrik­ tionsenzym in einem Volumen von 20 µl bei 37°C 2-3 h inkubiert. Für die Restriktion präparativer Mengen an DNA wurden entsprechend größere Volumina und Mengen En­ zym eingesetzt. Reaktionspuffer wurden nach den Angaben des Herstellers verwendet.

2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese

Zu dem Restriktionsansatz wurden 0,1 Vol. DNA-Dye (25% w/v Ficoll 400, 0,25% w/v Bromphenolblau, 0,25% w/v Xylencyanol, 200 mM EDTA, pH 8,0) gegeben und die DNA-Fragmente in einem horizontalen Agarosegel in TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 20 mM NaOAc, 2 mM EDTA, pH 8,3) in Gegenwart von 0,5 µg/ml Ethidiumbromid elektro­ phoretisch getrennt. DNA-Banden wurden mittels eines UV-Transilluminators (254 nm) detektiert.

2.3.4 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose

Um DNA-Fragmente aus dem Agarosegel zu isolieren, wurden die Säulen und Puffer des QIAquick Gel Extraktion Kit Protocols gemäß der Gebrauchsanweisung des Herstel­ lers verwendet. Hierbei wurden zunächst die DNA-Fragmente aus dem Gel herausge­ schnitten und gewogen. Es wurden 3 Volumen des Puffers QX1 hinzugegeben und für 10 min bei 50°C inkubiert. Sobald sich das Gelfragment vollständig gelöst hatte, wurde 1 Volumen Isopropanol hinzugegeben und das Gemisch wurde auf die QIAquick-Säule gegeben und abzentrifugiert. Um die an die Säule gebundene DNA zu waschen, wurden 0,75 ml PE-Puffer hinzugegeben und erneut zentrifugiert. Schließlich wurde die DNA mit 50 µl H₂O eluiert.

2.3.5 Ligation von DNA-Fragmenten (Maniatis et al., 1989)

Lineare DNA-Fragmente mit kohäsiven oder glatten Enden wurden in einem Reaktions­ gemisch in einem Gesamtvolumen von 20 µl mit Ligationspuffer (20 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,6 mM ATP, pH 7,6) und 5 Einheiten T4-DNA-Ligase über Nacht bei 15°C oder für 5 h bei Raumtemperatur ligiert. Die Konzentration an DNA be­ trug zwischen 1 und 10 µg/ml, das molare Verhältnis Vektor/Insert-DNA zwischen 1 : 5 und 1 : 10. Im Anschluß an die Ligationsreaktion wurde die DNA ohne weitere Reinigung zur Transformation eingesetzt.

2.4 Transformationsmethoden 2.4.1 Transformation von E. coIi (Inoue et al., 1990)

Zellen einer 250 ml SOB-Kultur (2% Trypton, 0,5% Yeast Extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄) wurden in der exponentiellen Phase 10 min bei 4°C abzentrifugiert (1000 xg) und in 80 ml TB-Puffer (10 mM PIPES, 15 mM CaCl₂ × H₂O, 250 mM KCl, pH 6,7, 55 mM MnCl₂ × H₂O) resuspendiert. Nach Inkubation (10 min auf Eis) wurden die Zellen nochmal bei 4°C und 2500 UpM abzentrifugiert. Danach wurde das Sediment vorsichtig in 20 ml TB-Puffer resuspendiert und ebenso vorsichtig mit 7% DMSO durchmischt. Nach 10 min Inkubation auf Eis wurden die nun kompetenten Zel­ len aliquotiert, in flüssigem N₂ schockgefroren und bei -70°C aufbewahrt.

Zu 1-10 µg DNA wurden 200 µl kompetente Zellen gegeben und 30 min auf Eis inku­ biert. Nach 30 s Hitzeschock bei 42°C wurde der Ansatz auf Eis abgeschreckt, mit 800 µl SOC-Medium (SOB, inkl. 20 mM Glukose) versetzt und 1 h bei 37°C geschüttelt. Ver­ schiedene Mengen (10-900 µl) der Zellkultur wurden auf festem Selektivmedium (Agar-Platten mit LB-Vollmedium, supplementiert mit 50 µg/ml Ampicillin) ausplattiert und schließlich die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert, um transformierten Zellen die Zeit zur Koloniebildung zu geben.

2.4.2. S. cerevisiae-Transformation (modifiziert nach Ito et al., 1983)

Je Transformationsansatz wurden 0,5 ml einer frischen, über Nacht gewachsenen Hefe­ kultur verwendet. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur abzentrifugiert (5 min. 3500 UpM) und der Überstand wurde entfernt. Nun wurde die zu transformierende DNA und 50 µg Carrier-DNA hinzugegeben und vermischt. Schließlich wurden 0,5 ml PEG (40% PEG3350, 0,1 M LiOAc, 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1 M DTT) hinzugegeben, und die Transformationsansätze wurden geschüttelt und für mindestens 12 h bei Raumtem­ peratur inkubiert. Nach einem 20minütigen Hitzeschock (42°C) wurden die Zellen vor­ sichtig anzentrifugiert und in 1 ml YEPD für 1 h bei 30°C inkubiert. Schließlich wurden die Zellen für 5 s in der Tischzentrifuge anzentrifugiert, nach Verwerfen des Überstan­ des in der verbleibenden Flüssigkeit resuspendiert und auf Selektionsmedien ausplat­ tiert.

2.5 Hybridisierungstechniken 2.5.1 Southern-Hybridisierung (Southern, 1975)

Für die Southem-Hybridisierung wurden ca. 10 µg chromosomaler DNA in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,5) gelöst und für 12 h in einem Restriktionsverdau mit einem geeigneten Restriktionsenzym eingesetzt. Die geschnittene DNA wurde in einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt. Das Agarosegel wurde dreimal für jeweils 20 min ge­ waschen, zunächst in 0,25 M HCl, dann in 5 M NaOH/1,0 M NaCl und schließlich in 1 M NH₄OAc. Nun wurde die aufgetrennte DNA durch einem 12stündigen Trockenblot auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Diese wurde anschließend für 2 min in 2× SSC (0,1 M NaCl, 10 mM NaOAc, pH 7,0) gewaschen, an der Luft getrocknet, und schließlich wurde unter UV-Licht (254 nm) für 5 min "cross-linking" durchgeführt.

Die Membran wurde mit 50 ml Church-Puffer (7% SDS, 1% BSA, 1 mM EDTA, 250 mM Na-Phosphat, pH 7,2) für 30 min bei 65°C prähybridisiert, wobei anschließend die Hälfte der Hybridisierungslösung verworfen wurde. Nun wurde die radioaktiv markierte DNA- Probe hinzugegeben und die Hybridisierung wurde bei 65°C über Nacht durchgeführt.

Im Anschluß an die Hybridisierung wurde die Membran für 30 min bei 65°C mit 2× SSC­ /0,1% SDS gewaschen und dann auf einem Röntgenfilm oder auf einer Phosphor- Imaging-plate exponiert.

2.5.2 Herstellung der Sonden-DNA

Zur Herstellung der Sonden-DNA wurde das Prime-lt (Random Primer Labeling Kit) der Firma Stratagene gemäß der Anleitung des Herstellers verwendet. Die benötigte DNA wurde zuvor durch PCR amplifiziert und dann für die Sondenherstellung eingesetzt.

2.6 Charakterisierung der Chorismatmutase von Hansenula polymorpha 2.6.1 Rohextrakt-Präparation

Die Hefezellen wurden in YNB-Medium, für die einzelnen Hefestämme individuell supp­ lementiert, kultiviert und bei einer OD₅₄₆ von ca. 4 geerntet. Rohextrakte wurden herge­ stellt wie bei Kradolfer et al. (1977) beschrieben, unter Verwendung einer Amicon French Press.

2.6.2 Bestimmung des Proteingehaltes

Der Proteingehalt der Proteinlösungen wurde nach der Methode von Bradford (1976) mit BSA als Proteinstandard bestimmt.

2.6.3 Messung der Enzymaktivität

Zur Messung der Chorismatmutaseaktivität wurden Stopptests, wie von Schmidheini et al. (1989) entwickelt, mit einigen Modifikationen durchgeführt. Sämtliche Enzymtests und Messungen der Extinktion wurden bei 30°C durchgeführt. Die Reaktionsansätze von 500 µl enthielten 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,6, 2 mM EDTA, 20 mM DTT und 10 µl der jeweiligen Proteinfraktion. Die Reaktion, d. h. die Umwandlung von Chorismat zu Prephenat, wurde durch Zugabe von Chorismat in einer Endkonzentration von 1 mM gestartet und nach 10 min mit 500 µl 1 M HCl gestoppt, welches außerdem die Umset­ zung von Prephenat in das bei OD₃₂₀ meßbare Phenylpyruvat bewirkt. Neutralisierung durch Zusatz von 4 ml 1 M NaOH beendete die Reaktion. Die Messung der OD₃₂₀ erfolg­ te gegen H₂O, als Nullwerte wurden entsprechende Lösungen ohne Enzym verwendet. Die Messungen wurden auch in Gegenwart von 5 µM L-Tryptophan durchgeführt. Die Nullwerte der Messungen ohne Enzym wurden von den Absorptionswerten subtrahiert. Mit dem molekularen Extinktionskoeffizienten von Phenylpyruvat bei 30°C von 13095 µl/(mol × cm) konnte die Umsatzgeschwindigkeit (µmol Produkt/(min × mg Protein) und damit die spezifische Aktivität (U/mg Protein) berechnet werden.

Resultate 1. Herstellung einer genomischen Genbank von Hansenula polymorpha

Zur Herstellung einer genomischen Genbank wurde chromosomale DNA aus Hansenu­ la polymorpha RB11 isoliert und diese in einer partiellen Restriktion mit dem Enzym Sau3A eingesetzt. Die Erkennungssequenz dieses Restriktionsenzyms ist relativ häufig im Genom vorhanden, da sie nur aus 4 Basen besteht. Während der 5stündigen Reak­ tionszeit wurden in Intervallen von 15 min Aliquots entnommen und die Reaktion jeweils durch Zugabe von EDTA gestoppt. Auf diese Weise wurde sichergestellt, daß die chro­ mosomale DNA in Fragmente unterschiedlicher Größe zerschnitten wurde. Die geschnit­ tene DNA wurde in einem Agarosegel aufgetrennt, in verschiedene Größenfraktionen zwischen 1 kb und 10 kb eingeteilt und entsprechend aus dem Gel extrahiert. Die ex­ trahierten Fragmentfraktionen wurden in den zuvor mit BamHI linearisierten Vektor pRS426 (Sikorski and Hieter, 1989) ligiert (Fig. 2).

Die so erhaltene Plasmid-Bibliothek wurde in E. coli transformiert, wobei in Gegenwart von Ampicillin auf die durch das bla-Gen kodierte Antibiotikaresistenz selektioniert wur­ de. Insgesamt wurden ungefähr 150 000 Transformanden erhalten. Diese wurden mit LB-Medium von den Platten gewaschen und nach Zugabe von Glycerin bei -20°C auf­ bewahrt.

2. Ein genomisches 1,8 kb DNA-Fragment aus H. polymorpha komplementiert den aro7Δ-Phänotyp in S. cerevisiae

Die Plasmide der genomischen H. polymorpha-Bank wurden aus E. coli isoliert und in den S. cerevisiae-Stamm RH2185 (MATα Δaro7::LEU2 suc2-δ9 ura3-52 leu2-3 leu2- 112 his4-519) transformiert, um dessen Tyr/Phe-Auxotrophie zu komplementieren, die auf eine Deletion im ARO7-Gen zurückzuführen ist. Die transformierten Hefezellen wur­ den zunächst auf Uracil-Prototrophie und damit auf das Vorhandensein des URA3-Gens des Vektors pRS426 selektioniert (SC-Ura) und anschließend auf Minimalmedium (YNB + Trp + His) überführt. Nach ungefähr 5 Inkubationstagen bei 30°C konnten 3 transfor­ mierte Hefekolonien isoliert werden, welche in der Lage waren, in Abwesenheit von Uracil, Tyrosin und Phenylalanin zu wachsen. Die Plasmide wurden isoliert und waren auch nach einer Retransformation in der Lage, die ARO7-Deletion in RH2185 zu kom­ plementieren. Durch Restriktionsanalyse wurde ein ungefähr 5 kb großes zusätzliches DNA-Fragment in dem Vektor pRS426 identifiziert. Zur weiteren Eingrenzung des DNA- Fragmentes wurde eine Subklonierung durchgeführt, wobei die erhaltenen Fragmente erneut in den Vektor pRS426 ligiert wurden. Diese unterschiedlichen Plasmide wurden nun, analog zu den Plasmiden der genomischen Bank, auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Tyr/Phe-Auxotrophie in RH2185 zu komplementieren. Hierbei wurde ein ungefähr 1,8 kb großes ApaI/XbaI-Fragment erhalten, welches hierzu in der Lage war. Dieser Befund wurde durch mehrmalige Retransformation bestätigt. Auffällig war, daß das 1,8 kb H. polymorpha DNA-Fragment (im Plasmid pME1525) in transformierten Hefezellen ein mit dem Wildtyp vergleichbares Wachstum aufwies, während das 5 kb H. polymor­ pha-Fragment (im Plasmid pME1524) in transformierten Hefezellen zu deutlich langsa­ merem Wachstum führte (Fig. 3).

Um sicherzustellen, daß das komplementierende 1,8 kb-Fragment aus Hansenula po­ lymorpha stammte, wurde dieses als Sonde in einer Southern-Hybridisierung eingesetzt. Die chromosomale DNA von H. polymorpha, A. nidulans und S. cerevisiae wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV geschnitten und nach der Hybridisierung mit der Sonde konnte ein deutliches Signal bei H. polymorpha, ein schwaches Signal bei S. cerevisiae und kein Signal bei A. nidulans festgestellt werden. Desweiteren konnte durch die Southern Hybridisierung gezeigt werden, daß das Gen nur einmal im Genom von H. polymorpha vorkommt (Fig. 4).

Das 1,8 kb DNA-Fragment aus H. polymorpha RB11 wurde vollständig sequenziert und es konnte ein aus 843 bp bestehendes offenes Leseraster identifiziert werden (Fig. 5), welches eine Übereinstimmung von 58% mit dem ARO7-Gen aus S. cerevisiae aufwies. Es kann also davon ausgegangen werden, daß es sich um das zu ARO7 homologe Gen der Hefe Hansenula polymorpha handelt, welches im folgenden als HARO7 berzeichnet wird.

3. Herstellung verschiedener Deletionskonstrukte

Anhand der Sequenz des 1,8 kb DNA-Fragmentes aus H. polymorpha wurden die Pri­ mer OLSK34 und OLSK35 zur Herstellung verschiedener haro7Δ-Deletionskonstrukte verwendet. Die verschiedenen Deletionskonstrukte wurden in H. polymorpha transfor­ miert, um die Identität des Gens zu belegen und um sicherzustellen, daß in H. polymor­ pha keine Isoenzyme der Chorismatmutase existieren.

Durch eine Deletion von HARO7 in Hansenula polymorpha kann die Identität dieses Gens endgültig bewiesen und die Existenz alternativer Gene überprüft werden. Zugleich eröffnet die Konstruktion einer solchen Deletionsmutante neue Selektionsmöglichkeiten. Zur Herstellung eines haro7Δ-Deletionsstammes wurden drei unterschiedliche Disrupti­ onskassetten konstruiert. Für die erforderliche Integration in das Hansenula polymorpha Genom wurden für alle drei Konstrukte die flankierenden Bereiche des HARO7-Gens verwendet, welche durch homologe Rekombination die Deletion des HARO7-Gens be­ wirken sollen. Der flankierende Bereich in 3'-Richtung wurde unter Verwendung der Primer OLSK34 und T7 amplifiziert und anschließend mit den Restriktionsenzymen Apal und BgIII geschnitten. Der flankierende Bereich in 5'-Richtung wurde mit den Primern OLSK35 und T3 amplifiziert und mit den Restriktionsenzymen XbaI und BgIII geschnit­ ten. Dies ist möglich, da die Primer OLSK34 und OLSK35 eine BgIII-Schnittstelle bein­ halten (Fig. 6).

Beide Fragmente wurden in den ApaI/XbaI geschnittenen Vektor pBluescript KSII ligiert und anschließend wurde der Vektor mit BgIII wieder geöffnet, um verschiedene Disrupti­ onskassetten einzufügen (Fig. 7).

Die hisG::URA3::hisG-Disruptionskassette (Schneider et al., 1996) wurde mit BgIII ge­ schnitten und in den oben beschriebenen Vektor ligiert. Anhand des URA3-Markers läßt sich eine Integration der Kassette in das Genom von H. polymorpha überprüfen. Ob tat­ sächlich eine homologe Integration, also eine Deletion von HARO7, stattgefunden hat, kann durch Selektion hinsichtlich einer Phenylalanin/Tyrosin-Auxotrophie und durch Southern Hybridisierung gezeigt werden. Die hisG-Elemente begünstigen die abschlie­ ßende Excision des URA3-Markers, was durch Gegenselektion mit 5-FOA (5-Fluor-Orot- Säure) überprüft werden kann, da das URA3-Genprodukt eine toxische Umsetzung von 5-FOA bewirkt, so daß lediglich Zellen ohne den URA3-Marker in der Lage sind zu überleben (Boeke et al., 1984).

Die loxP::kanMX::loxP-Disruptionskassette (Güldener et al., 1996) wurde mit BamHI ge­ schnitten und in den oben beschriebenen Vektor ligiert. Anhand des kanMX Markers läßt sich eine Integration der Kassette in das Genom von Hansenula polymorpha durch Selektion hinsichtlich einer Kanamycinresistenz (G418) überprüfen. Das kan^r-Gen ist flankiert vom Translationselongationsfaktor (TEF)-Promotor und -Terminator (Steiner and Philippsen, 1994) des filamentösen Pilzes Ashbya gossypii. Ob tatsächlich eine homologe Integration stattgefunden hat, kann durch Selektion auf Phenylalanin/Tyrosin- Auxotrophie und durch Southern Hybridisierung gezeigt werden. Bei diesem System besteht die Möglichkeit, den Marker nach erfolgter Deletion wieder aus dem Genom zu entfernen. Dies geschieht durch das Cre-loxP-Rekombinationssystem des Bakteriopha­ gen P1 (Austin et al., 1981). Das Plasmid pSH47 (Güldener et al., 1996). enthält das Cre-Rekombinase-Gen mit einem vorgeschalteten GAL1-Promotor und desweiteren die Elemente ARS, CEN und einen URA3-Marker. Galaktose induziert die Expression der Rekombinase und diese bewirkt die Entfernung des Markers aus dem Genom durch Rekombination der flankierenden loxP-Regionen.

Die loxP::ODC1::loxP-Disruptionskassette ist analog zur loxP::kanMX::loxP- Disruptionskassette (Güldener et al., 1996), außer daß das kanMX Gen durch das ODC1-Gen (= URA3) aus Hansenula polymorpha ersetzt wurde (M. Hiller, persönliche Mitteilung). Auch in diesem Fall besteht die Möglichkeit, den Marker nach erfolgter Dele­ tion wieder aus dem Genom zu entfernen. Die Entfernung des Markers kann in diesem Fall durch Selektion auf 5-Fluor-Orot-Säure (5-FOA)-Medium überprüft werden, da das ODC1-Genprodukt eins toxische Umsetzung von 5-FOA bewirkt, so daß lediglich Zellen ohne den ODC1-Marker in der Lage sind, zu überleben (Boeke et al., 1984).

Die Transformation der hisG::URA3::hisG-Disruptionskassette in H. polymorpha RB11 führte zu einer Mutante, die eine Tyrosin/Phenylalanin-Auxotrophie und eine Uracil- Prototrophie aufwies, also den zu erwartenden Phänotyp besaß.

4. Beispiel für die rekombinante Expression von Proteinen unter Verwendung au­ xotropher Hefestämme und der funktionellen Komplementation zur Plasmidselek­ tionierung

Zur Expression eines rekombinanten Proteins in H. polymorpha unter Verwendung ei­ nes erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls können entsprechende Expressions­ plasmide hergestellt werden. als Grundlage dient dabei z. B. das Plasmid pMOX (Weydemann et al., 1995). Dieses trägt das URA3-Gen aus S. cerevisiae zur Selektion in H. polymorpha nach Transformation Uracil-auxotropher Stämme wie z. B. RB11 (Weydemann et al., 1995) (odc1 bzw. ura3). Als Expressionsmodul dient der MOX- Promotor (EP-B-O 299 108) aus H. polymorpha, gefolgt von der MOX- Terminatorsequenz (Gödecke et al., 1994).

Aus pMOX kann nach Verdauung mit dem Restriktionsenzym Ndel ein 5 kb großes DNA-Fragment isoliert werden. Dieses entspricht dem Plasmid ohne die URA3- kodierende Sequenz. Nach Auffüllen der Überhänge dieses DNA-Fragmentes durch Klenow-Behandlung kann dieses mit einem 1,3 kb Eco72I/Sspl-Fragment aus pSK69 (SEQ ID NO: 3) ligiert werden. Das resultierende Plasmid trägt nun als selektionierbares Markergen das Chorismatmutase-Gen aus H. polymorpha, das für das Enzym Choris­ matmutase kodiert. Die Selektion erfolgt auf Prototrophie bezüglich Tyrosin und Phenylalanin.

Alternativ kann in das mit Smal linearisierte Plasmid pMOX das 1,3 kb Eco72I/Sspl- Fragment einkloniert werden. Dieses Vorgehen führt zu einem Expressionsplasmid, das zwei Markergene trägt, URA3 und HARO7.

In diese Plasmide kann nun in eine geeignete Restriktionsschnittstelle unmittelbar hinter dem MOX-Promotorbereich ein rekombinantes DNA-Fragment zur Expression eines heterologen Proteins einkloniert werden. Die kodierende DNA-Sequenz wird dabei vor­ zugsweise mit einer DNA-Sequenz fusioniert, die die Sekretion und Prozessierung des Expressionsproduktes in H. polymorpha garantiert, als Beispiel einer derartigen Füh­ rungssequenz sei die des MFα1-Gens aus S. cerevisiae (Arnold et al., 1998) genannt.

Zur heterologen Expression wird ein Phe/Tyr-auxotropher H. polymorpha Stamm, er­ zeugt durch Disruption des endogenen Chorismatmutase-Gens, mit einem der oben dargestellten Expressionsplasmide transformiert und positive Transformanden durch Wachstum auf Minimalmedium selektioniert. Durch abwechselndes Wachstum in Mini­ malmedium und Vollmedium können nach einer Vielzahl von Generationen aus diesen solche identifiziert werden, in denen das Expressionskonstrukt mitotisch stabil in das Genom integriert wurde. Als Expressionsstamm wird dann vorzugsweise derjenige ver­ wendet, in dem das Expressionsmodul in höchster Kopienzahl innerhalb des Wirtsge­ noms vorliegt. Die Expression des heterologen Proteins erfolgt bevorzugt nach Anzucht des Stammes in Glukose-haltigem Medium durch Wechsel zu Medium mit Glycerin als einziger C-Quelle. Unter diesen Bedingungen liegt Derepression des FMD-Promotors vor, verbunden mit der starken Expression des heterologen Proteins. Dieses kann schließlich aus dem gereinigten Kulturüberstand durch chromatographische Standard­ methoden in reiner Form isoliert werden.

5. Das 1,8 kb-Fragment aus Hansenula polymorpha kodiert für ein Protein mit Chorismatmutase-Aktivität

Um zu überprüfen, ob das 1,8 kb Fragment ein Gen enthält, das für ein Protein mit Cho­ rismatmutaseaktivität kodiert, wurden mittels einer French-Press Zellextrakte verschie­ dener Plasmid-tragender Hefestämme hergestellt und die Chorismatmutaseaktivitäten gemessen. Für die Messung der spezifischen Enzymaktivität wurden Zellextrakte von S. cerevisiae RH2185(pRS426), H. polymorpha RB11, S. cerevisiae RH2185(pME1524) und S. cerevisiae RH2185(pME1525) hergestellt. Es konnte gezeigt werden, daß so­ wohl das 5 kb-Fragment (pME1524), als auch das 1,8 kb-Fragment (pME1525) aus H. poiymorpha für Gene für eine Chorismatmutase-Aktivität kodieren (Tab. 4).

Tabelle 4

Spezifische Chorismatmutase-Aktivitäten (U/mg Protein) verschiedener Zellextrakte

In der Tabelle sind jeweils die Mittelwert aus 4 Aktivitätsmessungen aufgeführt. Es wurden die Werte der Zellextrakte von S. cerevisiae RH2185 + pRS426, S. c. + pME1524, S. c. + pME1525 und H. polymorpha RB11 gemessen. Die Messungen wurden jeweils ohne und mit 500 µM Tryptophan durchgeführt.

6. Identifizierung des HARO7-Gens der Hefe Hansenula polymorpha

Das komplementierende 1,8 kb DNA-Fragment wurde vollständig unter Verwendung ei­ nes T3- und eines T7-Primers sequenziert (Fig. 5).

Das Enzym Chorismatmutase wird in der Hefe Hansenula polymorpha durch ein Gen kodiert, das aus 843 bp besteht und den Namen HARO7 erhalten hat. Dieses Gen wur­ de kloniert, indem die Phenylalanin/Tyrosin-Auxotrophie eines Saccharomyces cerevi­ siae aro7Δ-Deletionsstammes durch eine genomische Genbank von Hansenula poly­ morpha komplementiert wurde. Der H. polymorpha-Promotor ist also in S. cerevisiae funktionell. Es sind keine Introns vorhanden, und aus der Sequenz läßt sich ein aus 280 Aminosäuren bestehendes 32 kDA-Protein ableiten. Die Aminosäuresequenz der Cho­ rismatmutase aus Hansenula polymorpha weist 58% Identität zu der aus Saccharomy­ ces cerevisiae und 44% zu der aus Aspergillus nidulans auf. Auffällig im Vergleich die­ ser Aminosäuresequenzen ist ein aus 23 Aminosäuren bestehendes Endstück in der Sequenz von H. polymorpha, das weder bei S. cerevisiae oder A. nidulans, noch bei anderen eukaryontischen Chorismatmutase-Aminosäuresequenzen vorhanden ist.

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims (38)

1. Nukleinsäure-Molekül, umfassend eine für ein Polypeptid mit Chorismatmutase- Aktivität kodierende Nukleinsäure oder deren Gegenstrang, wobei die Nukleinsäure ausgewählt ist aus

• a) einer Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Sequenz bzw. der ihr entsprechenden RNA-Sequenz;
• b) einer Nukleinsäure, die mit dem Gegenstrang einer Nukleinsäure nach (a) hybridi­ siert;
• c) einer Nukleinsäure, die aufgrund des genetischen Codes zu den in (a) und (b) defi­ nierten DNA-Sequenzen degeneriert ist;
• d) einer Nukleinsäure, die mit einer der in (a) bis (c) angegebenen Nukleinsäuren hy­ bridisiert und deren Gegenstrang für ein Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität kodiert;
• e) eine Nukleinsäure, die wenigstens 60% homolog zu einer der in (a) bis (d) angege­ benen Nukleinsäuren ist;
• f) einer Variante der in (a) bis (e) angegebenen Nukleinsäuren, wobei die Variante gegenüber den in (a) bis (e) angegebenen Nukleinsäuren Additionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen aufweist;
• g) einem Fragment einer der in (a) bis (f) angegebenen Nukleinsäuren;
• h) einer Kombination mehrerer der in (a) bis (g) angegebenen Nukleinsäuren,

wobei das von der Nukleinsäure oder deren Gegenstrang kodierte Polypeptid wenig­ stens 10% der Chorismatmutase-Aktivität der Chorismatmutase gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.

2. Nukleinsäure-Molekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein De­ soxyribonukleinsäure-Molekül ist.

3. Nukleinsäure-Molekül gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die unter (b) oder (d) angegebene Hybridisierung unter stringenten Bedingungen durchge­ führt wird.

4. Nukleinsäure-Molekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die unter (e) angegebene Nukleinsäure wenigstens 80% homolog zu einer der unter (a) angege­ benen Nukleinsäuren ist.

5. Nukleinsäure-Molekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die unter (e) angegebene Nukleinsäure wenigstens 90% homolog zu einer der unter (a) angege­ benen Nukleinsäuren ist.

6. Nukleinsäure-Molekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die unter (e) angegebene Nukleinsäure wenigstens 95% homolog zu einer der unter (a) angege­ benen Nukleinsäuren ist.

7. Nukleinsäure-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich­ net, daß das von der Nukleinsäure kodierte Polypeptid wenigstens 50% der Choris­ matmutase-Aktivität der Chorismatmutase gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.

8. Nukleinsäure-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich­ net, daß das von der Nukleinsäure kodierte Polypeptid wenigstens 75% der Choris­ matmutase-Aktivität der Chorismatmutase gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.

9. Nukleinsäure-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, weiterhin umfassend ei­ nen zur Expressionskontrolle geeigneten Promotor, wobei die für ein Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität kodierende Nukleinsäure unter der Kontrolle des Promotors steht.

10. Nukleinsäure-Molekül gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der MOX-Promotor oder der FMD-Promotor aus Hansenula polymorpha ist.

11. Nukleinsäure-Molekül gemäß Anspruch 9 oder 10, weiterhin umfassend eine zur Expression und gegebenenfalls Sekretion geeignete heterologe Nukleinsäuresequenz.

12. Nukleinsäure-Molekül gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei das Nukleinsäu­ remolekül wenigstens einen Teil eines Vektors enthält, wobei der Vektor ausgewählt ist aus: Bakteriophagen, Plasmiden, Adenoviren, Vacciniaviren, Baculoviren, SV40-Virus und Retroviren.

13. Nukleinsäure-Molekül gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das Nukleinsäu­ re-Molekül weiterhin eine His-Tag-kodierende Nukleinsäuresequenz umfaßt und die Ex­ pression des Nukleinsäure-Moleküles zur Bildung eines Fusionsproteins mit einem His- Tag führt.

14. Wirtszelle, enthaltend ein Nukleinsäure-Molekül gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Wirtszelle eine zur Expression des Nukleinsäure-Moleküls geeignete pro­ karyontische oder eukaryontische Zelle ist.

15. Wirtszelle gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die prokaryontische Wirtszelle ausgewählt ist aus E. coli und Bacillus subtilis.

16. Wirtszelle gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryontische Wirtszelle ausgewählt ist aus Hefezellen wie Hansenula polymorpha und Saccharomy­ ces cerevisiae, Insektenzellen und Säugerzellen, bevorzugt aus CHO-Zellen, COS- Zellen und HeLa-Zellen.

17. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptides mit Chorismatmutase-Aktivität, wobei das Nukleinsäure-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird und das Protein gegebenenfalls isoliert wird.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das hergestellte Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität natürlich oder chemisch modifiziert wird.

19. Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Ex­ pression in einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 durchgeführt wird.

20. Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität, umfassend eine Aminosäuresequenz, die von einem oder mehreren der Nukleinsäure-Moleküle nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kodiert wird.

21. Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität gemäß Anspruch 20, umfassend die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz oder ein Fragment davon, das wenig­ stens 10% der Chorismatmutase-Aktivität der Chorismatmutase gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.

22. Rekombinantes Polypeptid mit Chorismatmutase-Aktivität, erhältlich durch das Ver­ fahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19 oder Modifikationen davon.

23. Antikörper, erhältlich durch Immunisieren eines Versuchstieres mit dem rekombinan­ ten Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22.

24. Verfahren zur Herstellung eines Phenylalanin- und Tyrosin-auxotrophen Hefestam­ mes, umfassend das Zerstören des endogenen Chorismatmutase-Gens des entspre­ chenden Hefestammes, wobei die Mutante weniger als 10% der Chorismatmutase- Aktivität der Chorismatmutase gemäß SEQ ID NO: 2 aufweist.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, umfassend die folgenden Schritte:

• a) Herstellen eines Konstruktes, umfassend wenigstens zwei Fragmente einer zur ho­ mologen Rekombination geeigneten Nukleinsäure gemäß Anspruch 1(a) bis 1(h); die eine zur homologen Rekombination nicht geeignete Nukleinsäure flankieren;
• b) Transformieren von Zellen eines Hefestammes mit intaktem endogenen Chorismat­ mutase-Gen mit diesem Konstrukt und
• c) Identifizieren von Phenylalanin- und Tyrosin-auxotrophen Transformanden.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren wei­ terhin das Selektionieren der Transformanden auf Phenylalanin/Tyrosin-Mangelmedium umfaßt.

27. Verfahren gemäß Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Kon­ strukt ferner ein Selektionsmarkergen umfaßt.

28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Konstrukt weiterhin eine oder mehrere Rekombinationsstellen umfaßt.

29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß eine Rekombinati­ onsstelle loxP ist.

30. Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen des He­ festammes in Schritt b) ferner mit zur Expression von Cre-Rekombinase geeigneter Nukleinsäure in Kontakt gebracht werden.

31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Hefestamm Hansenula polymorpha ist.

32. Phenylalanin- und Tyrosin-auxotropher Hefestamm, erhältlich durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 31.

33. Auxotropher Hefestamm gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß er ei­ ne Mutante eines prototrophen Hefestammes von Hansenula polymorpha ist.

34. Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Proteinen, umfassend:

• a) Transformieren des auxotrophen Hefestammes gemäß Anspruch 32 oder 33 mit einer Kombination von einem zur Expression geeigneten Nukleinsäure-Molekül gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13 und einem zur Expression geeigneten heterologen Gen unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors; und
• b) Kultivieren der Transformanden unter zur Expression des heterologen Gens und des Nukleinsäure-Moleküls geeigneten Bedingungen und gegebenfalls Isolieren des Proteins, welches von dem heterologen Gen kodiert wird.

35. Verfahren gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ferner den Schritt des Selektionierens der Transformanden auf Phenylalanin- und/oder Tyrosin-Mangelmedium umfaßt.

36. Verfahren gemäß Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Nuklein­ säure-Molekül und das heterologe Gen voneinander getrennt sind.

37. Verfahren gemäß Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Nuklein­ säure-Molekül und das heterologe Gen und in einem Vektor vorliegen.

38. Rekombinantes Protein, erhältlich durch das Verfahren gemäß einem der An­ sprüche 34 bis 37.