CN110923272A - β-丙氨酸的生物合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及β‑丙氨酸的生物合成方法。本发明提供了能将丙烯酸转化为β‑丙氨酸的酶。以该酶进行β‑丙氨酸的生物合成，能够避免化学法涉及的高温、高压反应，且副反应得到了良好的控制；避免了丙烯腈的使用，丙烯腈毒性大，环境危害大，而本发明以丙烯酸为原料，不仅毒性小，对环境影响小；与现有的生物法相比，仅需一步反应，缩短了反应进程，24小时即可实现β丙烯酸的制备，提高了制备效率。

Description

β-丙氨酸的生物合成方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及β-丙氨酸的生物合成方法。
背景技术
β-丙氨酸(β-Alanine)是自然界中唯一存在的β型氨基酸，它是一种非蛋 白氨基酸，主要用于合成泛酸、辅酶A、肌肽和鹅肌肽等物质，对生物体的生 长和发育起着必不可少的作用。随着对β-丙氨酸及其衍生物的研究日趋成熟， 如喜树碱β-丙氨酸酯、聚β-丙氨酸等，在医药、精细化工、环境等领域发挥越 来越重要的作用。
国内外生产β-丙氨酸有化学合成法与生物合成法：
Figure BDA0001806573480000011
化学法合成β-丙氨酸路线
Figure BDA0001806573480000012
生物法合成β-丙氨酸路线
其中，化学合成法主要是丙烯腈法，是以丙烯腈和液氨为主要原料，在 100～109℃，1Mpa压力下保温4h，生成β-氨基丙腈，β-氨基丙腈在90～95℃下 碱解1h生成β-氨基丙酸钠，再用HCl中和，生产1吨β-丙氨酸大约需2吨NaOH 和2吨HCl。该方法的原料丙烯腈易燃、高毒、对环境有严重危害、且价格较 高。整个生产过程涉及高温、高压反应，能耗很大，同时有副产物生成，反 应需要两步完成，过程复杂，强酸、强碱、原料及中间体对人和环境危害很 大，并且其产品中含有一定的有害物质。反应产物中含有NaCl，需要反复精 制才能得到高纯度的β-丙氨酸，否则Cl-的存在会大大影响产物质量。
而生物合成法生产β-丙氨酸，主要是通过天冬氨酸酶与L-天冬氨酸-α-脱 羧酶双酶偶联，催化富马酸加氨合成L-天冬氨酸，而后脱羧生成β-丙氨酸。该 方法的原料富马酸转化为β-丙氨酸时有分子量损失，原子经济性差；反应需要 两步完成、过程复杂，影响收率；而且酶催化富马酸加氨合成L-天冬氨酸的 反应为可逆反应，不能完全转化，收率低。
进一步改进丙氨酸的合成工艺，既避免化学法的一系列危害，而克服现 有生物法步骤长、经济性差的缺陷，仍是目前研究的热点。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供β-丙氨酸的生物合成方法。 本发明利用突变的酶，以丙烯酸为底物生成β-丙氨酸。
本提供了能将丙烯酸转化为β-丙氨酸的酶。
本发明所述的酶为突变的天冬氨酸酶。
所述天冬氨酸酶(EC4.3.1.1)能够催化L-天冬氨酸生成富马酸的可逆反应。 野生型天冬氨酸酶的活性口袋中，有4个能够与α-羧基相结合的位点，为极 性氨基酸残基，通常为苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和天冬酰胺。天冬氨酸酶目 前广泛应用于天冬氨酸的生物法合成，并且是现有生物法合成β-丙氨酸第一 步所需的酶催化剂。其性质与催化机理已经得到了广泛研究。天冬氨酸酶具 有严格的底物特异性，只对富马酸表现出活力，文献报道与前期研究均表明， 其对丙烯酸不存在催化活力。本发明选择天冬氨酸酶作为改造起点，在野生 型天冬氨酸酶的基础上，通过人工引入突变，改变其催化性质，使其能够将 丙烯酸作为底物生成β-丙氨酸。
本发明所述的酶，下列位置至少由如下氨基酸之一组成：
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由苏氨酸突变为丙氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或 半胱氨酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由蛋氨酸突变为丙氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或 半胱氨酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由赖氨酸突变为丙氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或 半胱氨酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由天冬酰胺突变为丙氨 酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或 半胱氨酸。
一些实施例中，本发明所述的酶，下列位置至少由如下氨基酸之一组成：
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由苏氨酸突变为丙氨 酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由蛋氨酸突变为苯丙氨 酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由赖氨酸突变为异亮氨 酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由天冬酰胺突变为亮氨 酸。
一些具体实施例中，野生型天冬氨酸酶来源于芽孢杆菌YM55-1。
一个具体实施例中，所述酶为来源于一种芽孢杆菌菌株YM55-1的天冬 氨酸酶突变体，其至少包括如下突变之一：
187位由苏氨酸突变为丙氨酸；
321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸；
324位由赖氨酸突变为异亮氨酸；
326位由天冬酰胺突变为亮氨酸。
具体的，所述酶为：
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸的突变 体(记为T187A)；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸的突 变体(记为M321F)；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突 变体(记为K324I)；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突 变体(记为N326L)；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321 位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸的突变体；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第324 位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第326 位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第 324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第 326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸、第 326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321 位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321 位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第 324位由赖氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；
芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321 位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸、第326位 由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体。含有四个突变位点的天冬氨酸酶突变体 记为AFIL，的氨基酸序列如SEQ ID NO:4。
本发明实验表明，含有T187A、M321F、K324I、N326L突变位点之一的 天冬氨酸酶突变体即可实现催化丙烯酸向β-丙氨酸的转变，转化率为 15.2％～24.3％。而含有四个突变位点的天冬氨酸酶突变体能够使丙烯酸向β- 丙氨酸的转化率达到99.8％。以其他物种来源的天冬氨酸酶为野生型酶进行突 变，或引入突变位点，也能够实现丙烯酸向β-丙氨酸的转变，催化效率与本 申请的效果相似甚至更高。
本发明还提供了编码本发明所述酶的DNA分子。
所述编码本发明所述酶的DNA分子采用人工合成的方法，具体实施例 中，采用人工设计引物对野生型天冬氨酸酶的DNA分子进行扩增，引入突变 位点。
本发明还提供了一种质粒载体，包括骨架载体和编码本发明所述酶的 DNA分子。
一些实施例中，所述骨架载体为pET-24a。
本发明还提供了一种重组菌株，其表达编码本发明所述酶的DNA分子。
一些实施例中，所述重组菌株的底盘菌为大肠杆菌JM109(DE3)。
本发明所述酶的制备方法，其为诱导本发明所述重组菌株表达酶。
一些实施例中，所述诱导的培养基为自诱导培养基，诱导的条件为30℃， 24h。
具体的，本发明所述酶的制备方法为，
将所述重组菌株接种至含有卡那霉素的LB培养基，使OD600达到 0.4～0.5，作为种子液；
然后将种子液以1％的接种量接种于自诱导培养基中，30℃培养24小时 后，将菌液以超声波破碎，离心后取上清也，即为含有酶的酶液。
本发明所述酶用于制备β-丙氨酸。
采用上述方法制得的含有酶的酶液促进丙烯酸转化为β-丙氨酸。
本发明还提供了一种β-丙氨酸的制备方法，其以本发明所述酶使丙烯酸 转化为β-丙氨酸。
本发明实施例中，所述丙烯酸转化为β-丙氨酸的反应体系包括：25wt％ 氨水、冰乙酸、丙烯酸、MgSO4·7H2O和所述酶。
所述氨水与冰乙酸的体积比为18:1。
丙烯酸与氨水的质量-体积比为1g:2mL。
丙烯酸与酶液的质量体积比为18g：9mL。
MgSO4·7H2O与酶液的质量-体积比为0.13mg:9mL。
本发明实施例中，所述丙烯酸转化为β-丙氨酸的反应条件为：pH值 8.9～9.1，48℃～51℃反应24小时。
具体的，β-丙氨酸的制备方法包括：
20～30rpm搅拌条件下，在4倍体积的25wt％氨水中依次加入2/9倍体积 的冰乙酸、丙烯酸，即热至48℃～51℃，调节pH值为9.0～9.2；丙烯酸与氨水 的质量-体积比为1g:2mL；
然后加入MgSO4·7H2O、1倍体积的酶液，调节pH值为8.9～9.1，48℃～51℃ 保温反应24小时后；MgSO4·7H2O与酶液的质量-体积比为0.13mg:9mL。
本发明提供了能将丙烯酸转化为β-丙氨酸的酶，以该酶进行β-丙氨酸的 生物合成，至少存在如下有益效果：
1、能够避免化学法涉及的高温、高压反应，且副反应得到了良好的控制；
2、避免了丙烯腈的使用，丙烯腈毒性大，环境危害大，而本发明以丙烯 酸为原料，不仅毒性小，对环境影响小；
3、与现有的生物法相比，且仅需一步反应，缩短了反应进程，24小时即 可实现β丙烯酸的制备，提高了制备效率。
附图说明
图1示发酵前样品检测图谱；
图2示发酵后样品的检测图谱。
具体实施方式
本发明提供了β-丙氨酸的生物合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文 内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动 对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明 的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本 发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1突变生成与筛选
制备天冬氨酸酶的突变体：T187、M321、K324、N326和AFIL(四突变 体)。
野生型天冬氨酸酶(Gen Bank号为AB028242.1)来源于芽孢杆菌(Bacillus sp)YM55-1，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO： 3，以含有该野生天冬氨酸酶基因的pET-24a(核苷酸序列如SEQ ID NO：2 所示)的重组质粒为模板，对T187、M321、K324和N326位点进行定点饱 和突变。
利用软件Oligo7设计平末端引物，简并引物如下(其中N＝A、G、C或 T；K＝G或T)：
突变T187位氨基酸：
正向引物：5’-NNKGGTATCGGCGGTTTTG-3’
反向引物：5’-ACCACCCAGACCCAGTGCCGGA-3’
突变M321位氨基酸：
正向引物：5’-NNKCAATATATCGTAAAAGCTGCTG-3’
反向引物：5’-ATGTTCTTTATCGAGTAAGCCAACT-3’
突变K324位氨基酸：
正向引物：5’-NNKCCGCGATATTGAACGTATTGCC-3’
反向引物：5’-AAATTCTTTATCGAGTAAGCCAACT-3’
突变N326位氨基酸：
正向引物：5’-NNKATTGAACGTATTGCCAATACGA-3’
反向引物：5’-AACTTCTTTATCGAGTAAGCCAACT-3’
进行PCR定点突变，本次PCR突变采用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶试 剂盒(东洋纺科技有限公司，上海)。
单突变体采用单次PCR获得，四突变体采用迭代PCR获得。
使用PCR cleaning试剂盒(捷瑞生物工程有限公司，上海)进行PCR产 物回收，将产物清洗后使用PNK激酶(捷瑞生物工程有限公司，上海)连接 入pET-24a空载体。将连接有PCR产物的质粒转化大肠杆菌JM109(DE3)， 平板培养后，挑选长出的单克隆送测序，验证序列正确，得到了含有突变体 的大肠杆菌。
实施例2天冬氨酸酶突变体的表达
将实施例1制备获得的各转化子(含有突变体的大肠杆菌，以表达野生 型天冬氨酸酶的大肠杆菌为对照)分别接种于装有5ml含卡那霉素(50μg/ml) 的LB培养基中，置于37℃、200rpm摇床中震荡培养，至OD600达到0.4～0.5 左右，获得种子液。
将各种子液分别以1％的接种量接种于自诱导培养基(青岛海博)中，30℃ 培养24小时。将菌液超声波破碎，离心后获得上清，即为相应的酶液。
实施例3天冬氨酸酶突变体对丙烯酸的催化
Figure BDA0001806573480000081
β-丙氨酸合成路线
在100ml三颈烧瓶中加入25％氨水23ml，25rpm开启搅拌，缓慢加入 冰乙酸(AR)5ml，加入丙烯酸6.0g，搅拌并水浴加热至48～51℃，体系pH 9.0-9.2，加入MgSO4·7H2O0.13mg，加入是实施例2制得的酶液9ml，复测 pH 8.9-9.1，48～51℃保温反应24小时后，取100μl反应液经流动相稀释1000 倍进行HPLC液相分析。
液相条件：C18柱(25cm)，[3％NaH2PO4·2H2O(pH3.3-3.5):水＝1：3]: 乙腈＝85：15；流速1ml/min，检测波长：205nm。
保留时间：β-丙氨酸：2.66min；丙烯酸：5.17min
转化率＝[1-(残留的丙烯酸含量/初始的丙烯酸含量)]×100％
其中，以AFIL进行催化，反应前的检测谱图如附图1，其中，丙烯酸的 浓度为276.9mg/mL；24h反应后谱图如图2所示，其中，丙烯酸的浓度为 0.55mg/mL。各突变体催化丙烯酸向β-丙氨酸转化的转化率如表1：
表1突变体检测结果
突变体 丙烯酸转化率
野生型 Nd(未检到)
T187A 15.2％
M321F 24.3％
K324I 20.5％
N326L 18.4％
AFIL 99.8％
结果表明，各突变体能够催化丙烯酸向β-丙氨酸的转变，而同时存在四 个突变位点的天冬氨酸酶突变体能够使丙烯酸向β-丙氨酸的转化率达到 99.8％。四种单突变的突变体的转化效率依次为15.2％、24.3％、20.5％、18.4％， 而四突变体的转化率为99.8％，不仅显著性的高于四种但突变体，也显著性的 高于四种突变体的转化率之和。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 台州酶易生物技术有限公司
<120> β-丙氨酸的生物合成方法
<130> MP1818931
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2106
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌YM55-1(Bacillus sp.YM55-1)
<400> 1
tctacagcag gaatccctgt attcactgta aataaaccga tggaaccaaa aatggccata 60
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tatcctataa ttttccgaaa actctgaaat aaaacaatat agaatctatt aaataacatt 180
tatgtgaatt tggcaatact attacaaaat attattagga aacagggctc tttttatatt 240
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaggagtcg cataagggag agcgtcgaga tcccggacac catcgaatgg cgcaaaacct 660
ttcgcggtat ggcatgatag cgcccggaag agagtcaatt cagggtggtg aatgtgaaac 720
cagtaacgtt atacgatgtc gcagagtatg ccggtgtctc ttatcagacc gtttcccgcg 780
tggtgaacca ggccagccac gtttctgcga aaacgcggga aaaagtggaa gcggcgatgg 840
cggagctgaa ttacattccc aaccgcgtgg cacaacaact ggcgggcaaa cagtcgttgc 900
tgattggcgt tgccacctcc agtctggccc tgcacgcgcc gtcgcaaatt gtcgcggcga 960
ttaaatctcg cgccgatcaa ctgggtgcca gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg 1020
gcgtcgaagc ctgtaaagcg gcggtgcaca atcttctcgc gcaacgcgtc agtgggctga 1080
tcattaacta tccgctggat gaccaggatg ccattgctgt ggaagctgcc tgcactaatg 1140
ttccggcgtt atttcttgat gtctctgacc agacacccat caacagtatt attttctccc 1200
atgaagacgg tacgcgactg ggcgtggagc atctggtcgc attgggtcac cagcaaatcg 1260
cgctgttagc gggcccatta agttctgtct cggcgcgtct gcgtctggct ggctggcata 1320
aatatctcac tcgcaatcaa attcagccga tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca 1380
tgtccggttt tcaacaaacc atgcaaatgc tgaatgaggg catcgttccc actgcgatgc 1440
tggttgccaa cgatcagatg gcgctgggcg caatgcgcgc cattaccgag tccgggctgc 1500
gcgttggtgc ggatatctcg gtagtgggat acgacgatac cgaagacagc tcatgttata 1560
tcccgccgtt aaccaccatc aaacaggatt ttcgcctgct ggggcaaacc agcgtggacc 1620
gcttgctgca actctctcag ggccaggcgg tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac 1680
tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg 1740
ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc 1800
aacgcaatta atgtaagtta gctcactcat taggcaccgg gatctcgacc gatgcccttg 1860
agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca 1920
cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc gctctgggtc 1980
attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc gcttgcggta 2040
ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac caaacgtttc 2100
ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccccac gggtgcgcat gatcgtgctc 2160
ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca 2220
ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca 2280
acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc 2340
tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct 2400
acatctgtat taacgaagcg ctggcattga ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc 2460
atccataccg ccagttgttt accctcacaa cgttccagta accgggcatg ttcatcatca 2520
gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt ttcatcggta tcattacccc catgaacaga 2580
aatccccctt acacggaggc atcagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc 2640
cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat 2700
gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc 2760
ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 2820
acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 2880
gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact 2940
ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatata tgcggtgtga 3000
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct 3060
cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 3120
ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 3180
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 3240
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 3300
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 3360
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 3420
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 3480
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 3540
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 3600
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gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 3840
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga acaataaaac 3900
tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt 3960
cttgctctag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga tttatatggg tataaatggg 4020
ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg attgtatggg aagcccgatg 4080
cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc caatgatgtt acagatgaga 4140
tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc gaccatcaag cattttatcc 4200
gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc cgggaaaaca gcattccagg 4260
tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga tgcgctggca gtgttcctgc 4320
gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa cagcgatcgc gtatttcgtc 4380
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caccggattc agtcgtcact catggtgatt tctcacttga taaccttatt tttgacgagg 4560
ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat cgcagaccga taccaggatc 4620
ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc attacagaaa cggctttttc 4680
aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca gtttcatttg atgctcgatg 4740
agtttttcta agaattaatt catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 4800
caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgaaattgt aaacgttaat 4860
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ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 5040
accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg 5100
tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga 5160
cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct 5220
agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat 5280
gcgccgctac agggcgcgtc ccattcgcca 5310
<210> 3
<211> 468
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌 YM55-1(Bacillus sp.YM55-1)
<400> 3
Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu
1 5 10 15
Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu
20 25 30
Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser
35 40 45
Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly
50 55 60
Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu
65 70 75 80
Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln
85 90 95
Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala
100 105 110
Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys
115 120 125
Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala
130 135 140
Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu
145 150 155 160
Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp
165 170 175
Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Thr His Leu Gln Asp Ala
180 185 190
Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile
195 200 205
Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp
210 215 220
Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro
225 230 235 240
Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His
245 250 255
Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp
260 265 270
Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met
275 280 285
Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala
290 295 300
Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile
305 310 315 320
Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val
325 330 335
Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu
340 345 350
Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn
355 360 365
Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr
370 375 380
Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu
385 390 395 400
Tyr Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val
405 410 415
Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly
420 425 430
Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu
435 440 445
Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile
450 455 460
Ala Gly Arg Lys
465
<210> 4
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu
1 5 10 15
Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu
20 25 30
Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser
35 40 45
Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly
50 55 60
Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu
65 70 75 80
Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln
85 90 95
Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala
100 105 110
Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys
115 120 125
Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala
130 135 140
Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu
145 150 155 160
Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp
165 170 175
Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Ala His Leu Gln Asp Ala
180 185 190
Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile
195 200 205
Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp
210 215 220
Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro
225 230 235 240
Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His
245 250 255
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260 265 270
Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met
275 280 285
Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr
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385 390 395 400
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420 425 430
Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu
435 440 445
Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile
450 455 460
Ala Gly Arg Lys
465
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n=a、g、cort
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n=a、g、cort
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n=gort
<400> 5
nnnggtatcg gcggttttg 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accacccaga cccagtgccg ga 22
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n=a、g、cort
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n=a、g、cort
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n=gort
<400> 7
nnncaatata tcgtaaaagc tgctg 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgttcttta tcgagtaagc caact 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n=a、g、cort
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n=a、g、cort
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n=gort
<400> 9
nnnccgcgat attgaacgta ttgcc 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
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aaattcttta tcgagtaagc caact 25
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n=a、g、cort
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n=gort
<400> 11
nnnattgaac gtattgccaa tacga 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacttcttta tcgagtaagc caact 25

Claims (10)

1.能将丙烯酸转化为β-丙氨酸的酶。
2.根据权利要求1所述的酶，其特征在于，其为突变的天冬氨酸酶。
3.根据权利要求2所述的酶，其特征在于，下列位置至少由如下氨基酸之一组成：
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由苏氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由蛋氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由赖氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由天冬酰胺突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸。
4.编码权利要求1～3任一项所述酶的DNA分子。
5.一种重组菌株，其特征在于，表达权利要求4所述的DNA分子。
6.权利要求1～3任一项所述酶的制备方法，其特征在于，诱导权利要求5所述的重组菌株表达酶。
7.权利要求1～3任一项所述酶用于制备β-丙氨酸。
8.一种β-丙氨酸的制备方法，其特征在于，以权利要求1～3任一项所述酶使丙烯酸转化为β-丙氨酸。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸转化为β-丙氨酸的反应体系包括：25wt％氨水、冰乙酸、丙烯酸、MgSO4·7H2O和权利要求1～3任一项所述的酶。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述丙烯酸转化为β-丙氨酸的反应条件为：pH值8.9～9.1，48℃～51℃反应24小时。
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