CN1626665A - β－丙氨酸的生物合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种β－丙氨酸的生物合成方法，特别是在微生物酶的作用下合成β－丙氨酸的合成方法，所述的方法是用可产生氨基化酶的微生物分别在含丙烯酸的种子培养基和含丙烯酸的发酵培养基中培养出相应的氨基化酶，将所述的氨基化酶加入转化液中，所述的转化液为含有1％～50％(g/ml)丙烯酸的氨水溶液，在酶的作用下合成β－丙氨酸，经脱氨、纯化得β－丙氨酸产品。这种方法用微生物酶作催化剂，反应效率高，且无污染；反应原料易得，步骤简单，成本低；产物纯度高。

Description

β-丙氨酸的生物合成方法
(一)技术领域
本发明涉及β-丙氨酸的生物合成方法，特别是在微生物酶的作用下合成β-丙氨酸的合成方法。
(二)背景技术
β-丙氨酸，又名β-氨基丙酸。1972年由Ross和Monroe在尿嘧啶的降解产物中发现。它是一种非蛋白质的氨基酸，是自然界中唯一的β型氨基酸。β-丙氨酸主要的生理活性作用是合成泛酸、辅酶A。现代医学研究发现，在哺乳动物的神经系统中，它可作为大脑中神经传递者；具离子通道的激活作用；可治疗由组织缺氧引起的肝损伤。
在精细化工领域β-丙氨酸用于合成聚合β-丙氨酸，电镀缓冲剂，染料等生产。聚合β-丙氨酸在水处理工业中用作絮凝剂；在医药工业中，β-丙氨酸是可用作许多药物的中间体，例泛酸钙，系维生素b族物质，是多种代谢环节中，包括碳水化合物、蛋白质、脂肪及上皮功能维持正常所必需的辅酶a的组分部分。肌肽是一种十分有效的伤口愈合剂。N-(2，5-二氯-4-氰硫基苯)-β-丙氨酸是一种有效的抗真菌剂，β-丙氨酸具有较宽广的应用领域和市场前景。
目前β-丙氨酸采用化学合成法生产。化学合成法有三种工艺：(1)丙稀腈法：此法丙稀腈经与氨在二苯胺和叔丁醇溶液中反应，生产β-氨基丙腈，再进行碱解即得；此法的缺点是产物中存在有40％以上的NaCl和杂质，需要反复纯化，反应过程中产生的NH3污染大气；(2)β-氨基丙腈法：β-氨基丙腈与氢氧化钡反应生成β-氨基丙酸钡和氮气，通入CO2，钡盐析出，产生β-氨基丙酸，钡离子用树脂去除，此法的缺点是生产成本高；(3)琥珀酰亚胺降解法：琥珀酰亚胺在碱性氯酸钠溶液中生成β-氨基丙酸，反应液用盐酸调pH，用3倍量的95％乙醇使无机盐析出，滤液用4倍量的蒸馏水稀释，离子交换树脂交换，交换液脱色，浓缩结晶，此法需大量的乙醇，生产成本高，生产场地安全性要求高。总之化学合成法的原料、中间体及副产物有毒，对环境污染严重。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种β-丙氨酸的生物合成方法，以克服现有β-丙氨酸的化学合成方法对环境易造成污染且成本高的不足。
本发明达到发明目的所采用的技术方案是：
一种β-丙氨酸的生物合成方法，所述的方法是用可产生氨基化酶的微生物分别在含丙烯酸的种子培养基和含丙烯酸的发酵培养基中培养出相应的氨基化酶，将所述的氨基化酶加入转化液中，所述的转化液为含有1％～50％(g/ml)丙烯酸的氨水溶液，在酶的作用下合成β-丙氨酸，经脱氨、纯化得β-丙氨酸产品。转化液的pH保持在2.0～9.6，在20～80℃条件下搅拌转化反应2-40小时，然后转化液经脱氨、离子交换、纯化得到β-丙氨酸纯品。
所述的转化反应器在密闭环境下进行。
所述的微生物为藤黄八叠球菌或大肠杆菌。
所述的种子培养基为：终浓度百分含量(g/ml)0.01～10％丙烯酸，0.1～10％牛肉膏，0.1～2.0％玉米浆，0.1～10％蛋白胨，0.0.1～0.1％KH2PO4，0.011～0.15％MgSO4，0.05～0.5％NaCl，调pH3.0～9.5；
所述的发酵培养基为：终浓度百分含量(g/ml)0.01～10％丙烯酸，0.1～2.0％玉米浆，0.1～10％蛋白胨，0.0.1～0.1％KH2PO4，0.011～0.15％MgSO4，0.05～0.5％NaCl，调pH3.0～9.5。
所述的转化液可以是氨水及下式之一：
①磷酸缓冲液；②柠檬酸缓冲液；③醋酸缓冲液；④蒸馏水。
通常选用0.2M磷酸缓冲液，pH5.7～8.0；0.1M柠檬酸缓冲液，pH3.0～6.6；0.2M醋酸缓冲液，pH3.6～5.8。
所述的方法按如下步骤进行：
(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，25～40℃，150～300r/min摇床培养16～40小时，然后以1％～20％的接种量转入发酵培养基，20～60℃，100～300r/min发酵16～60小时；
(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，转化液中丙稀酸浓度1％～50％(g/ml)，用氨水控制转化液的pH为2.0～9.6，25～40℃下搅拌转化4～20小时，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应；
(3)反应后转化液经脱氨、离子交换，纯化得β-丙氨酸产品。
所述的所述的方法中的步骤(3)具体为：反应后转化液3000r/min25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，即可得β-丙氨酸样品。
所述的转化液为终浓度(g/ml)为0.03的丙烯酸，0.22×10-3的MgSO4.7H2O，余量为蒸馏水，用氨水调pH7.2～7.5。
所述的所述的方法按如下步骤进行：
(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，30～35℃，200～300r/min摇床培养16～20小时，然后以1％～20％的接种量转入发酵培养基，30～35℃，150～300r/min发酵16～20小时；
(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，转化液中丙稀酸浓度(g/ml)1％～50％，用氨水控制转化液的pH为4.0～8.0，30～35℃下搅拌转化6～10小时，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应。
所述方法按如下步骤进行：
(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，30℃，200r/min摇床培养24小时，然后以1％～20％的接种量转入发酵培养基，30～35℃，200r/min发酵16～20小时；
(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，30～35℃下搅拌转化8小时，每2小时测一次pH值，用氨水调至pH7.2～7.5，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应；
(3)反应后转化液3000r/min 25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，即可得β-丙氨酸样品。
上述步骤中，所述的种子培养基为：终浓度(g/ml)为1.1％的玉米浆，0.02％的MgSO4.7H2O，0.1％的KH2PO4，0.145％的氯化钠，0.5％的牛肉膏，121℃灭菌20min，0.8％的丙烯酸，余量为水，用氨水调pH7.0；所述的种子培养基为：终浓度(g/ml)为1.1％的玉米浆，0.02％的MgSO4.7H2O，0.1％的KH2PO4，0.145％的氯化钠，121℃灭菌20min，0.8％的丙烯酸，余量为水，用氨水调pH7.0；所述的转化液为终浓度(g/ml)为0.03％的丙烯酸，0.22×10-3的MgSO4.7H2O，余量为水，用氨水调pH7.2～7.5。
培养基中采用MgSO4.7H2O，可提高菌体产酶的活性。
本发明所述的β-丙氨酸的生物合成方法的有益效果主要体现在：(1)用微生物酶做催化剂，反应效率高，且无污染；(2)反应原料易得，步骤简单，成本低；(3)产物纯度高。
(四)附图说明
图1为α-丙氨酸标准样品高效液相色谱图；
图2为β-丙氨酸标准样品高效液相色谱图；
图3为实施例1制得β-丙氨酸样品高效液相色谱图；
图4为实施例1所得样品红外图谱；
图5为Aldrich Condensed Phase数据库对样品红外图谱的匹配图；
图6为β-丙氨酸标准样品核磁共振图谱；
图7为实施例1所得样品核磁共振图谱；
图8、图9为纸层析结果示意图。其中：a1、a2分别代表大肠杆菌产生的酶转化的结果；d1、d2分别代表藤黄八叠球菌产生的酶转化的结果；d3为实施例1发酵液离心后的上清液；α代表α-丙氨酸标样；β代表β-丙氨酸标样。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：β-丙氨酸的生物合成
种子培养基：玉米浆1.1g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO4 0.1g，氯化钠0.145g，牛肉膏0.5g，水100mL 121℃灭菌20min，丙烯酸0.8g，氢氧化钠调pH7.0；
发酵培养基：玉米浆1.1g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO4 0.1g，氯化钠0.145g，水100mL121℃灭菌20min，丙烯酸0.8g，氢氧化钠调pH7.0；
转化液：丙烯酸15g，MgSO4.7H2O 0.11g，氨水调pH7.5，0.2M磷酸缓冲液定容500mL。
藤黄八叠球菌斜面菌种接入种子培养基，200r/min，30℃摇床培养24h。以20％的接种量转入发酵培养基，30℃，200r/min摇床培养18小时得发酵液。发酵液按50％的比例加入转化液，转化液中丙烯液浓度3％，用氨水控制转化液的pH为7.5，为防止丙烯酸和氨水的挥发，转化反应器密闭，在30℃条件下搅拌转化8小时，反应后转化液3000r/min25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，得纯度90％的β-丙氨酸样品。转化率达60％。
实施例2：β-丙氨酸的生物合成
种子培养基：玉米浆0.5g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO4 0.05g，氯化钠0.10g，牛肉膏0.8g，水100mL121℃灭菌20min，丙烯酸0.08g，盐酸调pH6.5；
发酵培养基：玉米浆0.5g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO4 0.05g，氯化钠0.10g，水100mL 121℃灭菌20min，丙烯酸0.08g，盐酸调pH6.5；转化液：丙烯酸10g，MgSO4.7H2O 0.10g，氨水调pH4.8，0.2M醋酸缓冲液定容500mL。
藤黄八叠球菌斜面菌种接入种子培养基，100r/min，25℃摇床培养20h。以15％的接种量转入发酵培养基，25℃，100r/min摇床培养16小时。发酵液按40％的比例加入转化液，转化液中丙烯液浓度2％，用氨水控制转化液的pH为4.8，为防止丙烯酸和氨水的挥发，转化反应器密闭，在25℃条件下搅拌转化10小时，反应后转化液3000r/min 25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，得纯度95％的β-丙氨酸样品。转化率达54％。
实施例3：β-丙氨酸的生物合成
种子培养基：玉米浆1.8g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO4 0.05g，氯化钠0.45g，牛肉膏6.5g，水100mL121℃灭菌20min，丙烯酸7.5g，盐酸调pH5.5；
发酵培养基：玉米浆1.8g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO4 0.05g，氯化钠0.45g，水100mL 121℃灭菌20min，丙烯酸7.5g，盐酸调pH5.5；
转化液：丙烯酸200g，MgSO4.7H2O 0.12g，氨水调pH6.0，0.1M柠檬酸缓冲液定容500mL。
大肠杆菌斜面菌种接入种子培养基，300r/min，55℃摇床培养18h。以15％的接种量转入发酵培养基，55℃，300r/min摇床培养16小时。发酵液按50％的比例加入转化液，转化液中丙烯液浓度45％，用氨水控制转化液的pH为6.0，为防止丙烯酸和氨水的挥发，转化反应器密闭，在55℃条件下搅拌转化3小时，反应后转化液3000r/min25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，得纯度80％的β-丙氨酸样品。转化率达50％。
实施例4：β-丙氨酸的生物合成
种子培养基：玉米浆1.0g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO4 0.04g，氯化钠0.30g，牛肉膏8.5g，121℃灭菌20min，丙烯酸4.5g，水100mL氢氧化钠调pH9.0；
发酵培养基：玉米浆1.0g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO4 0.04g，氯化钠0.30g，121℃灭菌20min，丙烯酸4.5g，氢氧化钠调pH9.0；
转化液：丙烯酸90g，MgSO4.7H2O 0.10g，氨水调pH9.0蒸馏水定容500mL。
大肠杆菌斜面菌种接入种子培养基，250r/min，20℃摇床培养50h。以20％的接种量转入发酵培养基，20℃，250r/min摇床培养45小时。发酵液按30％的比例加入转化液，转化液中丙烯液浓度18％，用氨水控制转化液的pH为8.5，为防止丙烯酸和氨水的挥发，转化反应器密闭，在20℃条件下搅拌转化36小时，反应后转化液3000r/min 25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，得纯度98％的β-丙氨酸样品。转化率达58％。
实施例5：β-丙氨酸含量测定
(1)高效液相色谱：
分别取实施例1所得冷冻干燥结晶样品、β-丙氨酸标准样品(1mg/ml)、a-丙氨酸标准样品，进行高效液相色谱分析：
柱型号：SB-804
柱温：30℃
梯度方式：恒流0.5ml/min
检测器：蒸发光
计算方法：面积归一法
实施例1所得冷冻干燥结晶样品色谱图如图3所示，β-丙氨酸标准样品色谱图如图2所示，a-丙氨酸标准样品色谱图如图1所示。结果分析分别见表1、表2、表3：
表1  a-丙氨酸标准样品高效液相色谱图分析结果
峰号    保留时间    峰高        峰面积      含量
 1        0.115    1700.250    9173.483     0.1082        0.198    2242.083    17262.813    0.2033        0.432    3032.417    21173.766    0.2494        0.640    2788.000    21139.232    0.2495        0.773    2755.333    9991.200     0.1176        0.865    2226.750    8519.967     0.1007        0.965    3270.750    21364.021    0.251
 8     1.182    3619.917    29223.500    0.3449     1.248    3740.583    12792.467    0.15010    1.357    3751.167    18715.045    0.22011    1.407    3987.667    16780.637    0.19712    1.540    3523.000    21033.518    0.24713    1.615    3364.250    9596.650     0.11314    1.673    4364.333    31716.250    0.37315    1.890    4975.500    34103.246    0.40116    1.982    5831.917    29109.287    0.34217    2.048    5970.583    30176.578    0.35518    2.140    5566.000    18443.570    0.21719    2.223    5668.833    46070.266    0.54220    2.673    15945.038   99602.148    1.17121    2.840    20433.115   258071.953   3.03422    3.023    12299.400   195660.094   2.30023    3.323    9029.139    46897.672    0.55124    3.432    9028.489    56445.047    0.66425    3.648    10352.188   119731.188   1.40826    3.915    14876.512   313796.500   3.68927    4.182    8518.835    78775.023    0.92628    4.390    4813.432    15380.441    0.18129    4.682    358473.063  4979341.000  58.54430    5.265    48932.336   871589.500   10.24831    5.848    5542.605    68417.617    0.80432    6.015    5505.682    24397.492    0.28733    6.232    5706.382    20933.061    0.24634    6.532    5929.121    30912.625    0.36335    6.815    5376.652    77384.391    0.91036    6.898    6045.690    47495.656    0.55837    7.098    5652.183    43641.211    0.51338    7.232    5115.844    40899.234    0.48139    7.382    4447.713    54353.414    0.63940    7.715    5312.868    65990.922    0.77641    7.848    4530.529    40760.832    0.47942    8.032    4402.814    35346.094    0.41643    8.232    3960.306    72598.391    0.85444    8.582    3259.668    25392.615    0.29945    8.915    3930.822    39040.234    0.45946    9.282    4098.391    63817.641    0.75047    9.398    4061.845    38422.938    0.45248    9.615    3826.545    35873.441    0.42249    9.782    3313.622    34588.539    0.40750    9.982    3736.115    21026.479    0.24751    10.165   3137.399    54667.484    0.643
 52    10.632    2731.215    29320.207   0.34553    10.898    1963.538    25650.387   0.30254    11.532    2010.431    32923.195   0.38755    11.698    2279.508    20862.555   0.24556    12.065    1601.778    18898.500   0.222
表2 β-丙氨酸标准样品高效液相色谱图分析结果
峰号    保留时间    峰高      峰面积         含量
 1      0.148    1620.605    7669.391        0.0512      0.282    1628.560    4879.640        0.0333      0.340    1543.165    4407.230        0.0294      0.432    3639.259    26543.029       0.1775      0.607    3168.075    15925.931       0.1066      0.732    2634.658    13466.766       0.0907      0.815    2313.380    8296.318        0.0558      0.907    3570.474    24290.539       0.1629      1.098    3372.034    20468.037       0.13710     1.182    3394.756    16484.279       0.11011     1.265    4131.478    32089.504       0.21412     1.490    3742.526    29959.570       0.20013     1.640    4657.226    25467.473       0.17014     1.715    4494.575    29704.072       0.19815     1.840    3825.158    18772.084       0.12516     1.990    4783.857    25627.811       0.17117     2.048    6351.462    48346.859       0.32318     2.190    5200.790    33594.852       0.22419     2.798    25601.000   542744.813      3.62320     3.198    11669.000   56640.898       0.37821     3.265    12421.000   77564.297       0.51822     3.373    9851.000    36196.500       0.24223     3.532    15168.000   186700.500      1.24624     3.865    52416.000   893984.625      5.96725     4.232    13667.000   90115.203       0.60126     4.365    9453.000    32023.500       0.21427     4.582    20791.000   341163.594      2.27728     4.815    13829.000   69644.898       0.46529     4.915    13089.000   57102.000       0.38130     5.182    359788.000  5718041.000     38.16731     5.765    18524.000   145309.000      0.97032     5.932    19685.000   253335.094      1.69133     6.165    18268.000   267904.906      1.78834     6.432    16684.000   136319.203      0.91035     6.682    16339.000   219523.094      1.46536     6.848    15023.000   182350.703      1.217
 37    7.098    13854.000   281462.406    1.87938    7.415    11235.000   132027.797    0.88139    7.682    8414.000    58167.602     0.38840    7.882    7673.000    102299.797    0.68341    8.148    6974.000    87284.898     0.58342    8.482    5290.000    70697.797     0.47243    8.648    4604.000    42188.898     0.28244    8.832    5878.000    62213.898     0.41545    9.115    5856.000    82054.203     0.54846    9.332    5525.000    41471.602     0.27747    9.548    5619.000    65698.398     0.43948    9.748    6327.000    61195.699     0.40849    10.065   7273.000    133415.703    0.89150    10.498   7218.000    194430.594    1.29851    10.765   7322.000    53504.602     0.35752    10.932   8172.000    112392.898    0.75053    11.198   7430.000    75472.703     0.50454    11.565   8074.000    147993.203    0.98855    13.132   24336.000   1533847.375   10.23856    13.265   25553.000   1915890.500   12.78857    15.098   3757.000    35430.199     0.236
表3实施例1所得冷冻干燥结晶样品色谱图分析结果
峰号    保留时间    峰高       峰面积       含量
 1       0.148    1773.279    4766.188     0.1512       0.248    263.117     611.053      0.0193       0.365    2013.094    15522.643    0.4934       0.540    2494.060    9551.315     0.3035       0.623    2865.759    11462.492    0.3646       0.732    3419.166    17714.973    0.5627       0.848    2730.143    4609.992     0.1468       0.873    3493.853    17039.363    0.5419       1.040    4184.249    29474.188    0.93610      1.182    4889.936    25402.732    0.80611      1.315    3437.053    19189.893    0.60912      1.398    3782.751    15066.446    0.47813      1.523    4666.298    37167.727    1.18014      1.615    4304.566    28442.961    0.90315      1.782    3579.962    18023.635    0.57216      1.882    4538.800    22384.160    0.71117      1.948    4830.358    19291.045    0.61218      2.040    5244.626    22746.883    0.72219      2.107    5127.185    22914.973    0.72720      2.182    4870.313    38164.719    1.211
 21    2.665    17708.121   120517.172    3.82622    2.815    21484.361   304087.438    9.65323    3.123    10663.078   80574.320     2.55824    3.215    8990.669    59610.180     1.89225    3.332    8201.968    55128.859     1.75026    3.557    10006.328   130379.930    4.13927    3.890    19144.752   196313.453    6.23228    3.957    17696.637   144151.938    4.57629    4.140    9008.820    77547.383     2.46230    4.357    5270.945    22487.828     0.71431    4.598    18404.777   298696.219    9.48232    4.923    4441.966    18031.266     0.57233    5.198    40545.738   652815.188    20.72334    5.648    5116.462    42712.152     1.35635    5.832    3115.645    15211.271     0.48336    5.998    3035.357    26278.145     0.83437    6.132    2960.126    25354.783     0.80538    6.415    2715.136    47526.852     1.50939    6.748    3114.560    21373.900     0.67840    6.948    2982.214    39188.758     1.24441    7.215    3223.753    27249.039     0.86542    7.465    3376.821    35140.613     1.11543    7.682    2475.946    45255.887     1.43744    7.982    2393.428    11981.143     0.38045    8.115    2250.197    16028.441     0.50946    8.315    2179.851    15155.613     0.48147    8.448    2509.621    10761.125     0.34248    8.598    1820.861    12903.803     0.41049    8.815    2087.987    28550.764     0.90650    9.082    2143.526    9677.630      0.30751    9.215    2031.295    11242.437     0.35752    9.415    2903.949    25617.553     0.81353    9.698    2247.959    29371.543     0.93254    10.032   1954.383    22529.953     0.71555    10.265   1828.980    18145.275     0.57656    10.465   752.634     5603.715      0.17857    10.665   1785.288    16379.523     0.52058    11.132   1058.714    15166.057     0.48159    11.632   1392.571    16915.742     0.53760    11.998   1212.154    13116.923     0.41661    12.132   1277.385    5894.876      0.187
(2)红外光谱
取实施例1所得样品进行红外光谱分析，红外图谱如图4所示，图5为Aldrich Condensed Phase数据库对样品红外图谱的匹配图；
分析结果见表4：
表4实施例1所得样品红外分析结果
指数(index) 配合度(match) 化合物名称(Compound Name)
1  9821  86.55  β-丙氨酸
2  9399  54.13  醋酸铯
3  9918  51.48  L-胱氨酸
4  2092  48.91  醋酸四乙基铵
5  9916  47.98  甲硫氨酸
6  9730  46.31  巯基醋酸钠盐
7  9834  46.13  L-亮氨酸
8  9783  45.64  硫代苹果酸钠
9  9836  45.60  L-异亮氨酸
10  9833  45.60  D-亮氨酸
(3)核磁共振谱
分别取实施例1所得样品、β-丙氨酸标准样品进行核磁共振谱检测；β-丙氨酸标准样品核磁共振图谱如图6所示，实施例1所得样品核磁共振图谱如图7所示。
(4)纸层析
分别取实施例1～4所得样品进行纸层析，以α-丙氨酸和β-丙氨酸标准样品为对照，实验结果见图8、图9。其中：a1、a2分别代表实施例3、4大肠杆菌产生的酶转化的结果；d1、d2分别代表实施例1、2藤黄八叠球菌产生的酶转化的结果；d3为实施例1发酵液离心后的上清液，α代表α-丙氨酸标样；β代表β-丙氨酸标样。结果表明a1、a2中含β-丙氨酸，d1、d2中也含β-丙氨酸，而d3中不含β-丙氨酸。
(5)结论：
根据以上检测数据，分析表明所制得产物成分为β-丙氨酸。

Claims (10)

1.一种β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的方法是用可产生氨基化酶的微生物分别在含丙烯酸的种子培养基和含丙烯酸的发酵培养基中培养出相应的氨基化酶，将所述的氨基化酶加入转化液中，所述的转化液为含有1％～50％丙烯酸的氨水溶液，在酶的作用下合成β-丙氨酸，经脱氨、纯化得β-丙氨酸产品。
2.如权利要求1所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的转化液的pH保持在2.0～9.6，在20～80℃条件下搅拌转化反应2～40小时，然后转化液经脱氨、离子交换、纯化得到β-丙氨酸纯品。
3.如权利要求2所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的转化反应器在密闭环境下进行。
4.如权利要求1～3之一所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的微生物为藤黄八叠球菌或大肠杆菌。
5.如权利要求4所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的种子培养基为：终浓度百分含量(g/ml)0.01～10％丙烯酸，0.1～10％牛肉膏，0.1～2.0％玉米浆，0.1～10％蛋白胨，0.0.1～0.1％KH2PO4，0.011～0.15％MgSO4，0.05～0.5％NaCl，调pH3.0～9.5；
所述的发酵培养基为：终浓度重量百分含量0.01～10％丙烯酸，0.1～2.0％玉米浆，0.1～10％蛋白胨，0.0.1～0.1％KH2PO4，0.011～0.15％MgSO4，0.05～0.5％NaCl，调pH3.0～9.5。
6.如权利要求5所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行：
(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，25～40℃，150～300r/min摇床培养16～40小时，然后以1～20％的接种量转入发酵培养基，20～60℃，100～300r/min发酵16～60小时，得发酵液；
(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，转化液中丙稀酸浓度1％～50％(g/ml)，用氨水控制转化液的pH为2.0～9.6，25～40℃下搅拌转化4～20小时，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应；
(3)反应后转化液经脱氨、离子交换，纯化得β-丙氨酸产品。
7.如权利要求6所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的方法中的步骤(3)为：反应后转化液3000r/min 25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，即可得β-丙氨酸样品。
8.如权利要求6所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的转化液为终浓度(g/ml)为0.03的丙烯酸，0.22×10-3的MgSO4.7H2O，余量为蒸馏水，用氨水调pH7.2～7.5。
9.如权利要求6所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的所述的方法按如下步骤进行：
(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，30～35℃，200～300r/min摇床培养16～20小时，然后以1～20％的接种量转入发酵培养基，30～35℃，150～300r/min发酵16～20小时；
(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，转化液中丙稀酸浓度1％～50％(g/ml)，用氨水控制转化液的pH为4.0～8.0，30～35℃下搅拌转化6～10小时，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应。
10.如权利要求8所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：
(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，30℃，200r/min摇床培养24小时，然后以1％～20％的接种量转入发酵培养基，30～35℃，200r/min发酵16～20小时；
(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，30～35℃下搅拌转化8小时，每2小时调一次pH值，用氨水调至pH7.2～7.5，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应；
(3)反应后转化液3000r/min 25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，即可得β-丙氨酸样品。
所述的种子培养基为：终浓度(g/ml)为1.1％的玉米浆，0.02％的MgSO4.7H2O，0.1％的KH2PO4，0.145％的氯化钠，0.5％的牛肉膏，121℃灭菌20min，0.8％的丙烯酸，余量为水，用氨水调pH7.0；
所述的种子培养基为：终浓度(g/ml)为1.1％的玉米浆，0.02％的MgSO4.7H2O，0.1％的KH2PO4，0.145％的氯化钠，121℃灭菌20min，0.8％的丙烯酸，余量为水，用氨水调pH7.0；
所述的转化液为终浓度(g/ml)为0.03％的丙烯酸，0.22×10-3的MgSO4.7H2O，余量为水，用氨水调pH7.2～7.5。
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