KR20230091921A - 안트라닐산을 생산하는 재조합 숙주 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 안트라닐산을 생산하기 위해 유전적으로 변형된 재조합 박테리아로서 트립토판이 결여된 배양 배지에서 배양될 수 있는 재조합 박테리아에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 재조합 박테리아를 사용하여 안트라닐산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

안트라닐산을 생산하는 재조합 숙주 세포
본 발명은 안트라닐산의 생산, 특히 재조합 숙주세포를 이용한 안트라닐산의 생산 분야에 관한 것이다.
안트라닐산은 시킴익산 경로의 천연 중간체이며 방향족 아미노산 L-트립토판의 생합성을 위한 전구체이다. 그것은 산업적으로 염료, 향수, 의약품 및 기타 귀중한 제품의 합성을위한 중간체로 사용된다.
안트라닐레이트의 화학적 합성은 고온 및 고압의 조건과 재생 불가능한 나프탈렌 및 독성 부산물 생성을 필요로 하는 지속 불가능하고 값비싼 공정이다. 따라서 재생 가능하고 생물학적으로 파생된 안트라닐레이트 공급원을 제공하는 지속 가능한 기술에 대한 강력한 요구가 있다.
일부 미생물과 식물은 안트라닐레이트를 합성하는 대사 능력을 가지고 있다. 특히, 박테리아에서 안트라닐산과 방향족산의 생합성 경로는 매우 잘 알려져 있다. 도 1은 대장균에서 이 경로의 단순화된 계획을 나타낸다. 간단히 설명하면, 첫 번째 중간체인 3 데옥시-D-아라비노-헵툴로네이트-7-포스파스테는 DAHP 신타제(synthase) AroF, AroH 또는 AroG에 의해 오탄당 인산염 경로로부터 에리스로즈 4 포스페이트(erythrose-4-phosphate: E4P) 및 해당과정으로부터 포스포에놀피루베이트(PEP)의 두 전구체로부터 생성된다. 그런 다음 aroB, aroD 및 aroE는 DAHP의 세 가지 반응을 촉매하여 시키믹산(SHK)을 생성한다. 그 후, 초창산은 AroL/K, AroA 및 AroC에 의해 SHK에서 합성된다. 결국 TrpE와 TrpG는 초창산에서 안트라닐산의 생성을 촉매한다. 안트라닐산은 효소 TrpD, TrpC, TrpA 및 TrpB에 의해 연속적으로 촉매되는 여러 반응 후에 트립토판을 생성하는 데 사용된다. 따라서, 대사 중간체로서, 안트라닐산은 축적되지 않고 분비되지 않는다.
대장균의 L-트립토판 오페론에 대한 초기 연구에서는 안트라닐레이트를 분비하는 돌연변이를 확인했다(Yanofsky et al., Genetics, 1971, 69, 409-433). UV 돌연변이 유발에 의해 얻어진 균주 중 하나(W3110 trpD9923)의 특성화는 이관능성 단백질 TrpGD를 인코딩하는 유전자에 돌연변이가 존재하여 정지 코돈 및 비기능적 TrpD 도메인을 유도한다는 것을 밝혀냈다. 안트라닐레이트 생산을 위한 미생물 균주를 제공하기 위한 시도에서, 이 균주는 피드백 억제 내성 DAHP 신타제, 트랜스케톨라제, 글루코키나제 및 갈락토오스 퍼미아제를 인코딩하는 유전자를 과발현하도록 추가로 변형시켰다(Balderas-Hernandez et al. Microb Cell Fact. 2009 Apr 2;8:19). 유사하게, 돌연변이 바실러스 균주에서 안트라닐레이트 축적이 또한 관찰되었다 (미국 특허 5,422,256).
그러나 주요 단점으로 이러한 균주는 트립토판 영양요구 균주이다. 영양요구 균주를 사용하면 배양 배지에 트립토판을 첨가해야 하기 때문에 산업 생산 비용이 크게 증가한다. 결과적으로, 트립토판 비영양요구 박테리아 균주를 사용하여 산업적으로 관련된 안트라닐산의 생산성을 달성하는 훨씬 개선된 공정에 대한 강력한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명자들은 트립토판 비영양요구 균주, 즉 트립토판이 결여된 배양 배지에서 성장할 수 있는 균주인 재조합 박테리아 숙주 세포에서 안트라닐산을 생산하는 것을 목표로 한다.
따라서, 제1측면에서, 본 발명은 안트라닐레이트 신타제 활성에 유리하게 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 불균형을 유도하도록 유전적으로 변형되고 트립토판이 결여된 배양 배지에서 성장할 수 있는 재조합 박테리아를 배양하는 단계를 포함하고, 선택적으로, 안트라닐산을 회수하는 단계를 포함하는, 안트라닐산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 재조합 박테리아에 상응하는 비변형 박테리아는, TrpG 및 TrpD 활성을 나타내는 이관능성 단백질을 발현하고, 상기 재조합 박테리아는 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성(TrpG)을 나타내는 폴리펩티드와 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성(TrpD)을 나타내는 폴리펩티드를 각각 발현하도록 유전적으로 변형된다.
특히, 본 발명은, 재조합 박테리아를 배양하고 선택적으로 안트라닐산을 회수하는 단계를 포함하는 안트라닐산의 생산 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 재조합 박테리아에 상응하는 비변형 박테리아는 TrpG 및 TrpD 활성을 나타내는 이관능성 단백질을 발현하고, 상기 재조합 박테리아는, (i) 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성(TrpG)을 나타내고 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않는 폴리펩티드, 및 (ii) 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성(TrpD)을 나타내고 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않는 폴리펩티드를 각각(separately) 발현하도록, 및 변형되지 않은 박테리아와 비교하여 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 비율을 감소시키도록 유전적으로 변형되며, 상기 재조합 박테리아는 트립토판이 결핍된 배양 배지에서 성장할 수 있다.
바람직하게는, 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성(TrpG)을 나타내는 폴리펩티드는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않고, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내는 폴리펩티드(TrpD)는 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않는다.
재조합 박테리아는 내인성 이관능성 단백질 TrpGD의 TrpD 도메인의 발현을 억제하기 위해, 바람직하게는 상기 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 삭제함으로써 유전적으로 변형되었을 수 있다.
바람직하게는, 재조합 박테리아는 내인성 이관능성 단백질 TrpGD의 발현을 억제하기 위해, 바람직하게는 상기 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 삭제함으로써 추가로 유전적으로 변형된다.
특히, 상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다.
재조합 박테리아는 다음을 포함할 수 있다:
(i) 제1 프로모터의 제어 하에 글루타민 아미도트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 유전자 또는 제1 오페론을 포함하는 재조합 핵산, 여기서 상기 제1 오페론은 적어도 TrpG를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 임의로 안트라닐레이트 신타제(TrpE)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함함, 및/또는 (ii) 제2 프로모터의 제어 하에, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 유전자 또는 제2 오페론을 포함하는 재조합 핵산, 여기서 상기 제2 오페론은 적어도 TrpD를 인코딩하는 핵산 서열을 포함함. 일부 특정 실시양태에서, 제1 프로모터는 제2 프로모터보다 더 강하다. 바람직하게는, 제1 프로모터는 변형되지 않은 박테리아에서 TrpG를 인코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 프로모터이고/이거나, 제2 프로모터는 변형되지 않은 박테리아에서 TrpD를 인코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 프로모터이다. 제2 오페론은, 인돌 -3-글리세롤 포스페이트 신타제(TrpC)를 인코딩하는 핵산 서열, 포스포리보실 안트라닐레이트 이성화 효소(TrpF)를 인코딩하는 핵산 서열, 트립토판 신타제 (TrpA)의 α 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 핵산 서열 트립토판 신타제 (TrpB)의 β 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
대안적으로, 재조합 박테리아는 글루타민 아미도 트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 유전자 및 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있으며, 동일한 프로모터의 제어 하에 2개의 별개의 단백질 TrpG 및 TrpD를 발현시킨다.
재조합 박테리아는 또한 피드백 내성 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제를 인코딩하는 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있고/있거나 트랜스케톨라제 효소를 인코딩하는 내인성 유전자를 과발현하도록 유전적으로 변형되거나 트랜스케톨라제 효소를 인코딩하는 이종 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에서, 재조합 박테리아는 트립토판 또는 임의의 트립토판 공급원이 결여된 배양 배지에서 배양된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기에서 정의한 바와 같은 재조합 박테리아에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 제1 프로모터의 조절하에 글루타민 아미도트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 핵산 서열 및 제2 프로모터의 제어 하에 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 변형된 재조합 대장균 박테리아에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 재조합 박테리아는 (i) 제1 프로모터의 제어 하에, 글루타민 아미도 트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 유전자 또는 제1 오페론을 포함하고, 여기서 상기 제1 오페론은 적어도 TrpG를 인코딩하는 핵산 서열 및 선택적으로 안트라닐레이트 신타제(TrpE)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, (ii) 제2 프로모터의 제어 하에, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 유전자 또는 제2 오페론을 포함하고, 여기서 상기 제2 오페론은 적어도 TrpD를 인코딩하는 핵산 서열, 및 선택적으로 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제(TrpC)를 인코딩하는 핵산 서열, 포스포리보실안트라닐레이트 이성화효소(TrpF)를 인코딩하는 핵산 서열, 트립토판 신타제 (TrpA)의 α 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열, 및/또는 트립토판 신타제 (TrpB)의 β서브유닛 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 안트라닐산을 생산하는 본 발명의 재조합 박테리아의 용도에 관한 것이다.
도 1은 안트라닐산과 방향족 아미노산의 생합성을 단순화한 표현이다.
본 발명은 트립토판이 결핍된 배양액에서 성장할 수 있으면서 안트라닐산을 축적하기 위해 유전자 변형된 재조합 박테리아에 관한 것이다. 또한, 안트라닐산을 생산하기 위한 상기 재조합 박테리아의 용도 및 상기 재조합 박테리아를 사용하여 안트라닐산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본원에서, 본 발명자들은 트립토판 경로를 향한 탄소 플럭스가 트립토판 생산을 제한하고 안트라닐레이트를 축적하도록 변형 및 조절될 수 있음을 보여주었다. 실제로, 그들은 박테리아, 특히 대장균 균주가 (i) 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 (ii) 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 비율을 조절하기 위해 유전적으로 조작될 수 있음을 입증했다. 상기 비율을 감소시킴으로써, 본 발명자들은 조작된 균주가 트립토판이 결핍된 배양 배지에서 성장할 수 있는 동안 상당한 양의 안트라닐산을 생산 및 축적할 수 있음을 보여주었다. 종래 기술에 기재된 안트라닐산 생성 박테리아와는 반대로, 본 발명의 재조합 박테리아는 트립토판 영양요구성을 나타내지 않는다. 이들 박테리아는 어떠한 트립토판 보충도 필요로 하지 않으며, 따라서 안트라닐산의 산업적 생산을 위한 종래 기술의 균주에 비해 큰 이점을 제공한다.
정의
본 발명의 맥락에서, 용어 "재조합 박테리아"는 자연에서 발견되지 않고, 하나 또는 여러 유전 요소의 결실, 삽입 또는 변형의 결과로서 변형된 게놈을 함유하는 박테리아를 지칭한다.
"재조합 핵산" 또는 "재조합 핵산 분자"는 조작되어 자연 또는 야생형 박테리아에서 발견되지 않는 핵산(예를 들어, DNA, cDNA 또는 RNA 분자)을 지칭한다. 전형적으로, 이 용어는 재조합 DNA 기술, 예를 들어 분자 클로닝 및 핵산 증폭을 사용하여 함께 생성 및/또는 결합된 세그먼트를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 재조합 핵산 분자는 하나 이상의 비-자연적으로 발생하는 서열을 포함하고/하거나 상이한 본래의 공급원으로부터 접합된 핵산 분자를 함유하고 자연적으로 함께 부착되지 않는다.
용어 "유전자"는 단백질을 인코딩하는 임의의 핵산을 지칭한다. 이 용어는 RNA뿐만 아니라 cDNA 또는 gDNA와 같은 DNA를 포함한다. 유전자는 예를 들어, 재조합, 효소 및/또는 화학적 기술에 의해 먼저 제조될 수 있고, 후속적으로 숙주 세포 또는 시험관내 시스템에서 복제될 수 있다. 유전자는 전형적으로 목적하는 단백질을 인코딩하는 개방 판독 프레임을 포함한다. 유전자는 전사 종결자 또는 신호 펩티드와 같은 추가 서열을 함유할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "오페론"은 단일 프로모터의 제어 하에 2개 이상의 유전자를 함유하는 DNA의 기능 단위를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "발현 카세트"는 코딩 영역, 즉 하나 또는 여러 개의 유전자, 및 조절 영역, 즉 작동가능하게 연결된 전사 프로모터를 포함하는 하나 이상의 조절 서열을 포함하는 핵산 구축물을 나타낸다. 임의로, 발현 카세트는 여러 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 여러 코딩 영역을 포함할 수 있다. 특히, 발현 카세트는 여러 코딩 서열을 포함할 수 있으며, 이들 서열 각각은 동일한 프로모터 또는 별개의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 대안적으로, 발현 카세트는 하나 또는 여러 개의 코딩 서열을 포함할 수 있으며, 이들 서열 각각은 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 및 공통 프로모터에 작동가능하게 연결된 여러 다른 코딩 서열을 포함한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 제어 시퀀스가 코딩 시퀀스의 발현을 지시하는 방식으로, 제어 시퀀스가 코딩 서열에 대해 적절한 위치에 배치되는 구성을 의미한다.
용어 "조절 서열"은 유전자의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 제어 서열은 천연 또는 이종성일 수 있다. 현재 당업자에 의해 사용되는 잘 알려진 조절 서열이 바람직할 것이다. 이러한 조절 서열은 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 제어 서열은 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 발현 카세트를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 의미한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 선형 또는 원형 이중 가닥 DNA 분자이다.
본원에 사용된 용어 "천연" 또는 "내인성"은 숙주 세포와 관련하여, 상기 숙주 세포에 자연적으로 존재하는 유전적 요소 또는 단백질을 지칭한다. 용어 "이종성"은, 숙주 세포와 관련하여, 상기 숙주 세포에 자연적으로 존재하지 않는 유전적 요소 또는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 이 용어는 숙주 세포와 상이한 종 또는 상이한 속의 세포로부터 제공되는 유전적 요소 또는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 폴리펩티드 서열의 정렬로부터 위치에서의 일치 (동일한 아미노산 잔기)의 수 (%)를 의미한다. 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 중첩 및 동일성을 최대화하기 위해 정렬될 때 서열을 비교함으로써 결정된다. 특히, 서열 동일성은 2개의 서열의 길이에 따라 다수의 수학적 글로벌 또는 로컬 정렬 알고리즘 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 전역 정렬 알고리즘(예를 들어, Needleman 및 Wunsch 알고리즘; Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol 48:443)은 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열은 국소 정렬 알고리즘 (예를 들어 Smith and Waterman 알고리즘 (Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) 또는 Altschul 알고리즘 (Altschul et al. 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Altschul et al. 2005, FEBS J. 272:5101-5109))을 사용하여 바람직하게 정렬된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 목적의 정렬은 당업자 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/와 같은 인터넷 웹 사이트에서 이용가능하며 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 바람직하게는, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 2개의 서열의 최적 전역 정렬을 생성하는 페어와이즈 서열 정렬 프로그램 엠보스 니들(EMBOSS Needle)을 사용하여 생성된 값을 지칭하며, 여기서 모든 검색 파라미터는 디폴트 값, 즉 스코어링 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 개방 = 10, 갭 확장 = 0.5, 엔드 갭 페널티 = 거짓, 끝 간격 열림 = 10 및 끝 간격 확장 = 0.5으로 설정된다. 몇몇 특정 실시양태에서, 본 출원에서 언급된 모든 서열 동일성은 동일하고, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%로 설정된다. 일부 보다 구체적인 실시양태에서, 본 출원에서 언급된 모든 서열 동일성은 동일하고, 적어도 80% 서열 동일성으로 설정된다. 몇몇 다른 특정 실시양태에서, 본 출원에서 언급된 모든 서열 동일성은 동일하고, 서열 동일성 90% 이상으로 설정된다.
용어 "펩티드", "올리고펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 상기 사슬을 형성하는 아미노산의 수에 관계없이, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산의 사슬을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 효소 또는 효소 복합체의 용어 "활성"은 그의 기능을 지칭하고, 본 발명의 맥락에서, 상기 효소 또는 복합체에 의해 촉매되는 반응을 지칭한다. 효소 활성은 당업자에 의해 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "과발현" 및 "발현 증가"는 상호교환적으로 사용되며, 유전자 또는 효소의 발현이 변형되지 않은 박테리아에 비해 증가된 것을 의미한다. 효소의 발현 증가는 일반적으로 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 발현 증가에 의해 얻어진다. 본 발명의 박테리아에 유전자 또는 효소가 자연적으로 존재하지 않는 실시양태에서, 용어 "과발현" 및 "발현"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 유전자의 발현을 증가시키기 위해, 당업자는 박테리아 내의 유전자의 복제 수를 증가시키거나, 유전자의 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터, 즉 강력한 프로모터를 사용하거나, 상응하는 메신저 RNA를 안정화시키는 요소를 사용하거나, 또는 리보솜 결합 부위 (RBS) 서열 및 이들을 둘러싼 서열을 변형시키는 것과 같은 임의의 공지된 기술을 사용할 수 있다. 특히, 과발현은 박테리아에서 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 얻어질 수 있다. 유전자의 하나 또는 여러 카피는 유전자 대체 또는 다중 카피 삽입을 포함하는, 해당 분야의 전문가에게 공지된 재조합 방법에 의해 게놈 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 유전자를 포함하는 발현 카세트는, 바람직하게는 강력한 프로모터의 제어 하에 배치되고, 게놈 내로 통합된다. 대안적으로, 유전자는 바람직하게는 강력한 프로모터의 조절하에 배치된 관심있는 유전자와 함께 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터, 바람직하게는 플라스미드에 의해 운반될 수 있다. 발현 벡터는 복제 기점의 성질에 따라 하나 또는 여러 개의 카피로 박테리아에 존재할 수 있다. 상기 유전자의 과발현은 또한 상기 유전자의 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터를 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 내인성 유전자의 프로모터는 더 강한 프로모터, 즉 더 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터로 대체될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 촉진제는 당업자에 의해 공지되어 있고, 구성적 또는 유도성일 수 있으며, 바람직하게는 구성적이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "발현 감소"는 유전자 또는 효소의 발현이 변형되지 않은 박테리아에 비해 감소된 것을 의미한다. 효소의 발현 감소는 일반적으로 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 발현을 감소시킴으로써 얻어진다. 유전자의 발현을 감소시키기 위해, 당업자는 박테리아에서 유전자의 복제 수를 감소시키는 것과 같은 임의의 공지된 기술을 사용할 수 있고, 및/또는 유전자의 더 낮은 수준의 발현을 유도하는 프로모터, 즉 약한 프로모터를 사용하는 것과 같은 임의의 공지된 기술을 사용할 수 있고, 바람직하게는 유전자의 감소된 발현은 유전자의 낮은 수준의 발현을 유도하는 프로모터를 사용함으로써 얻어진다. 예를 들어, 내인성 유전자의 프로모터는 더 약한 프로모터, 즉 더 낮은 수준의 발현을 유도하는 프로모터로 대체될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 촉진제는 당업자에 의해 공지되어 있고, 구성적 또는 유도성일 수 있으며, 바람직하게는 구성적이다.
본원에 사용된 용어 "변형되지 않은 박테리아"는 야생형 박테리아 (즉, 자연 발생 박테리아) 또는 안트라닐레이트를 축적하기 위해 유전자 변형되지 않은 상응하는 박테리아, 특히 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 (TrpD), 글루타민 아미도트랜스퍼라제 (TrpG) 및/또는 안트라닐레이트 신타제 (TrpE)를 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 조절하도록, 및/또는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성 및/또는 안트라닐레이트 신타제 활성을 조절하도록 유전적으로 변형되지 않은 상응하는 박테리아를 의미한다. 특히, 야생형 박테리아와 비교하여, 상응하는 박테리아는 안트라닐레이트의 생산과 직접적으로 관련되지는 않지만 기질 범위를 확대하는 항생제 내성 또는 효소 활성과 같은 안트라닐레이트의 산업적 생산에 이점을 제공하는 유전자 변형을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 용어는 야생형 박테리아(즉, 자연 발생 박테리아)를 의미한다.
용어 "안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제" 또는 "TrpD"는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성(EC: 2.4.2.18)을 나타내는, 즉 5-포스포릴리보스-1-피로포스페이트의 포스포리보실 그룹을 안트라닐레이트로 전달하여 N-(5'-포스포리보실)-안트라닐레이트를 형성하는 폴리펩티드를 지칭한다. 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성은 당업자에 의해 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 활성은 분광광형광계에서 안트라닐레이트(여기 파장, 310nm, 방출, 400nm)의 소비율을 측정하여 25℃에서 형광 측정법으로 평가할 수 있다.
용어 "글루타민 아미도트랜스퍼라제" 또는 "TrpG"는 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내는 폴리펩티드, 즉 코리스메이트(chorismate)와 함께 제2 단계에서 사용되는 기질로서 암모니아를 생성하는 폴리펩티드를 지칭하며, TrpE에 의해 촉매되어 안트라닐레이트를 생성한다. 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성은 당업자에 의해 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 활성은 분광광도계를 사용하여 384nm에서 L-y-글루타밀-p-니트로아닐리드로부터 p-니트로아닐리드 형성을 모니터링 함으로써 평가할 수 있다.
용어 "안트라닐레이트 신타제" 또는 "TrpE"는 안트라닐레이트 신타제 활성 (EC:4.1.3.27)을 나타내는, 즉 코리스메이트 및 글루타민의 안트라닐레이트, 글루타메이트 및 피루베이트로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드를 의미한다. 대장균에서 이 폴리펩티드는 trpE 유전자에 의해 인코딩된다. 본원에 사용된 용어 "안트라닐레이트 신타제 활성"은 코리스메이트 및 글루타민을 안트라닐레이트, 글루타메이트 및 피루베이트로 전환시키는 활성, 즉 TrpE 및 TrpG 활성의 조합으로부터 기인하는 활성을 의미한다. 안트라닐레이트 신타제 활성은 당업자에 의해 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 활성은 분광광형광계에서 형광(여기 파장, 310 nm; 방출, 400 nm)의 증가를 따름으로써 코리스메이트로부터 안트라닐레이트 형성을 모니터링 함으로써 평가될 수 있다.
용어 "인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제" 또는 "TrpC"는 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제 활성을 나타내는 폴리펩티드를 지칭한다(EC: 4.1.1.48). 용어 "포스포리보실 안트라닐레이트 이성질화효소" 또는 "TrpF"는 포스포리보실 안트라닐레이트 이성화효소 활성을 나타내는 폴리펩티드를 지칭한다(EC: 5.3.1.24). 대장균을 포함한 다양한 박테리아에서 TrpC와 TrpF는 트립토판 생합성 경로의 두 단계를 촉매하는 이관능성 효소의 일부이다. 첫 번째 반응은 TrpF 도메인에 의해 코딩된 이성질화 효소에 의해 촉매된다. 두 번째 반응은 TrpC 도메인에 의해 코딩된 신타제에 의해 촉매된다.
용어 "트립토판 신타제의 α 서브유닛" 또는 "TrpA"는 트립토판 신타제의 알파-서브유닛, 즉 1-C-(인돌-3-일)글리세롤 3-포스페이트를 인돌 및 D-글리세르알데히드 3-포스페이트로 전환시키는 것을 촉매하는 폴리펩티드를 의미한다 (EC: 4.2.1.20). 용어 "트립토판 신타제의 β 서브유닛" 또는 "TrpB"는 트립토판 신타제의 베타 서브유닛을 지칭한다. 알파-서브유닛에 의해 형성된 인돌은 베타-서브유닛으로 이동하여 피리독살 5'-포스페이트가 존재할 때 L-세린과 결합하여 L-트립토판을 형성한다.
유기체에 따르면, 상기 확인된 효소 및 인코딩 유전자의 명명법은 다양할 수 있다. 그러나, 명확성을 기하기 위해, 본 명세서에서, 이들 용어는 효소 또는 유전자의 기원과 독립적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "트립토판 영양요구균주"(tryptophan auxotroph)는 그의 성장에 필요한 트립토판을 합성할 수 없는 박테리아를 의미한다. 이러한 박테리아는 트립토판 또는 트립토판 공급원이 부족한 배양 배지에서 성장할 수 없다. 반대로, 용어 "트립토판 비-영양요구균주"는 그의 성장에 필요한 트립토판을 합성할 수 있는 박테리아를 의미한다. 이러한 박테리아는 트립토판 또는 임의의 트립토판 공급원이 결여된 배양 배지에서 성장할 수 있다.
본원에 있어서, 용어 "안트라닐산", "o-아미노벤조산", "2-아미노벤조산" 및 "안트라닐산"은 혼용하여 사용할 수 있으며, 하기 화학식 1을 갖는 방향족산(CAS 번호: 118-92-3)을 의미한다.
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(I)
본 발명자들은 박테리아가 트립토판 경로를 향한 탄소 플럭스를 제어하고 안트라닐레이트를 축적하도록 유전적으로 조작될 수 있음을 발견했다. 실제로, 그들은 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 불균형을 유도하기 위해 유전자 변형된 박테리아가 안트라닐레이트를 축적할 수 있는 동안 트립토판 없이 배양 배지에서 성장할 수 있음을 입증했다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 안트라닐레이트 신타제 활성에 유리하게 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 불균형을 유도하도록 유전적으로 변형된 재조합 박테리아에 관한 것이다. 또한 변형되지 않은 박테리아와 비교하여 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 비율을 감소시키기 위해 유전적으로 변형된 재조합 박테리아에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 박테리아는 여전히 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내며, 따라서 트립토판이 결여된 배양 배지에서 성장할 수 있고, 즉 트립토판 영양요구균주가 아니다. 즉, 본 발명의 박테리아에서, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 비는 0보다 크다. 실제로, TrpD 활성은 트립토판 합성을 허용하고 따라서 트립토판 또는 임의의 트립토판 공급원이 결여된 배양 배지에서 박테리아의 성장을 허용하기에 충분하다.
안트라닐레이트는 트립토판 생합성 경로의 중간체이며 트립토판 영양요구성을 나타내지 않는 야생형 박테리아에 축적되지 않는다. 본 발명의 재조합 박테리아는 트립토판 경로를 통해 탄소 플럭스를 변경하도록 설계된 유전자 변형을 포함한다. 이러한 유전자 변형은 안트라닐레이트 신타제 활성에 유리하게 안트라닐레이트 신타제 활성과 TrpD 활성 사이의 불균형을 유도하는 것을 목표로 한다. 따라서 재조합 박테리아는 트립토판 생합성, 즉 TrpD의 기질로 필요한/사용되는 것보다 더 많은 안트라닐레이트를 생성한다. 이러한 불균형은 안트라닐산 축적 및 분비로 이어지는 반면 트립토판은 TrpD 잔류 활성 덕분에 박테리아에 의해 여전히 생성된다.
안트라닐레이트 신타제 활성은 안트라닐레이트의 2단계 생합성을 촉매하는 다량체 복합체의 결과이다. 첫 번째 단계에서 TrpG는 코리스메이트와 함께 두 번째 단계에서 사용되는 기질로서 암모니아를 생성하는 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 제공하고 TrpE에 의해 촉매되어 안트라닐레이트를 생성한다. 따라서 안트라닐레이트 신타제 활성은 TrpG 및 TrpE 활성의 결과이다. 대장균에서, 안트라닐레이트 신타제는 trpE 유전자에 의해 인코딩되고, trpGD 유전자에 의해 인코딩되는 이관능성 단백질의 아미노 말단 영역은 글루타민 아미도트랜스퍼라제(TrpG) 활성을 담당한다. 실제로, 대장균을 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 박테리아에서 이관능성 단백질은 TrpG 및 TrpD 활성을 담당한다. 예를 들어, 대장균에서 trpGD 유전자에 의해 인코딩된 이관능성 단백질의 아미노 말단 영역은 TrpG 활성을 담당하는 반면 이 단백질의 카르복시 말단 영역은 TrpD 활성을 담당한다. 본 발명을 통해, 본 발명자들은 이러한 이관능성 단백질의 TrpG 도메인의 발현이 TrpD 도메인의 발현으로부터 분리될 수 있다는 것을 발견하여, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 균형의 미세 조정을 가능하게 하였다.
본 발명의 재조합 박테리아에서, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 불균형은 다양한 상이한 방법으로 얻어질 수 있지만, 항상 안트라닐레이트 신타제 활성에 유리하다. 이러한 불균형에도 불구하고, 재조합 박테리아는 여전히 그의 성장에 필요한 트립토판을 합성하기에 충분한 수준의 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, TrpE 및/또는 TrpG 활성이 증가된다. 이들 실시양태에서, TrpD 활성은 변경되지 않은 채로 유지될 수 있거나, 감소될 수 있거나, 또는 증가될 수 있지만, TrpE 및 TrpG 활성으로부터 기인하는 안트라닐레이트 신타제 활성보다 적은 정도로 증가될 수 있다. 바람직하게는, 이들 실시양태에서, TrpD 활성은 변경되지 않은 채로 유지되거나 감소된다. 일부 바람직한 구체예에서, TrpD 활성은 감소된다. 이들 실시양태에서, TrpE 및 TrpG 활성으로부터 기인하는 안트라닐레이트 신타제 활성은 변경되지 않은 채로 유지될 수 있거나, 증가될 수 있거나, 또는 감소될 수 있지만, TrpD 활성보다 적은 정도로 감소될 수 있다. 바람직하게는, 이들 실시양태에서, TrpE 및 TrpG 활성으로부터 기인하는 안트라닐레이트 신타제 활성은 변경되지 않은 채로 유지되거나 증가된다.
본원에 사용된 용어 "증가된 활성"은 변형되지 않은 박테리아와 비교하여 본 발명의 재조합 박테리아에서 증가되는 효소 활성을 의미한다. 이러한 증가는 증가된 특정 촉매 활성, 기질에 대한 증가된 특이성, 증가된 단백질 또는 RNA 안정성 및/또는 이러한 활성을 담당하는 효소 또는 효소 복합체의 증가된 세포내 농도로 인한 것일 수 있다. 바람직하게는, 증가된 활성은 상기 효소를 인코딩하는 유전자를 과발현시킴으로써 얻어지는 효소의 증가된 세포내 농도(내인성 유전자의 과발현 또는 이종 유전자의 발현)에 기인한다. 효소 활성이 2개의 별개의 폴리펩티드 (예를 들어, 안트라닐레이트 신타제 활성에 대한 TrpE 및 TrpG)의 활성으로부터 기인하는 경우, 증가된 활성은 상기 폴리페티드(들)를 인코딩하는 유전자(들)를 과발현시킴으로써 얻어진 이들 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 모두, 바람직하게는 둘 다의 증가된 세포내 농도에 기인할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "감소된 활성"은 변형되지 않은 박테리아와 비교하여 본 발명의 재조합 박테리아에서 감소되는 효소 활성을 의미한다. 이러한 감소는 특정 촉매 활성 감소, 기질에 대한 특이성 감소, 단백질 또는 RNA 안정성 감소 및/또는 이 활성을 담당하는 효소 또는 효소 복합체의 세포 내 농도 감소로 인한 것일 수 있다. 일부 구체예에서, 감소된 활성은 효소의 감소된 세포내 농도에 기인할 수 있다. 효소의 감소된 세포내 농도는 상기 효소를 인코딩하는 유전자의 발현 수준을 감소시킴으로써 또는 RNA 안정성 및 따라서 번역 효율에 영향을 미치는 변화에 의해 얻어질 수 있다. 효소 활성이 2개의 별개의 폴리펩티드 (예를 들어, 안트라닐레이트 신타제 활성에 대한 TrpE 및 TrpG)의 활성으로부터 기인하는 경우, 감소된 활성은 이들 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 다의 감소된 세포내 농도에 기인할 수 있다. 일부 다른 구체예에서, 감소된 활성은 효소의 감소된 특정 활성에 기인할 수 있다. 특히, 특정 활성은 구조적 변화로 인해, 예를 들어 이관능성 단백질의 도메인이 다른 도메인과 별도로 발현되는 경우에 감소될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 이 용어는 상기 효소 활성의 완전한 억제를 배제한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명자들은 TrpG 폴리펩티드의 발현을 TrpD 폴리펩티드의 발현으로부터 분리하는 것이 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성 및 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 균형의 미세 조정을 허용한다는 것을 발견하였다. 따라서, 보다 구체적인 측면에서, 본 발명은 TrpG 폴리펩티드의 발현을 TrpD 폴리펩티드의 발현으로부터 분리하도록 유전적으로 변형된 재조합 박테리아에 관한 것이다.
재조합 박테리아는 글루타민 아미도트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 핵산 서열과 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 이는 두 개의 별개의 폴리펩티드, 즉 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내는 폴리펩티드(TrpG; 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않음) 및 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내는 폴리펩티드(TrpD; 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않음)의 발현을 유도한다. 글루타민 아미도트랜스퍼라제(TrpG) 및 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 (TrpD)를 인코딩하는 상기 핵산 서열의 발현은 동일한 프로모터의 제어 하에 또는 2개의 상이한 프로모터의 제어하에 놓일 수 있다. 바람직하게는, 재조합 박테리아는 제1 프로모터의 제어 하에 글루타민 아미도트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 핵산 서열 및 제2 프로모터의 제어 하에 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함/발현한다.
본원에 사용된 바와 같이, "TrpG를 인코딩하는 핵산 서열", "글루타민 아미도트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산 서열" 또는 "TrpG를 인코딩하는 유전자 "라는 용어는 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내고 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 지칭한다, 예를 들어, 이관능성 단백질 TrpGD의 TrpG 도메인에만 상응하는 폴리펩티드를 의미한다. 유사하게, "TrpD를 인코딩하는 핵산 서열", "안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 핵산 서열" 또는 "TrpD를 인코딩하는 유전자"라는 용어는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내고 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 지칭한다, 예를 들어 이관능성 단백질 TrpGD의 TrpD 도메인에만 상응하는 폴리펩티드를 의미한다.
바람직하게는, 박테리아는 그들의 야생형 형태에서, 내인성 TrpG 및 TrpD 활성이 이관능성 단백질 TrpGD로서 발현되고, 본 발명의 재조합 박테리아는 상기 내인성 이관능성 단백질 TrpGD의 발현을 억제하도록 유전적으로 변형된다. 내인성 TrpGD 유전자는 예를 들어 이 유전자의 전부 또는 일부를 결실시키거나, 넌센스 코돈 또는 프레임시프트를 유도하는 돌연변이를 도입함으로써, 또는 유전자 또는 발현 카세트의 삽입에 의해, 또는 당업자에 의해 공지된 임의의 방법에 의해 불활성화될 수 있다. 특정 양태에서, 내인성 이관능성 단백질 TrpGD의 도메인 중 하나, 즉 TrpD 또는 TrpG의 발현만이 억제되고, 보다 바람직하게는 TrpD 도메인만의 발현이 억제된다. TrpD 도메인의 발현은 통상의 기술자에 의해 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 상기 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 삭제함으로써, 넌센스 코돈 또는 프레임시프트를 유도하는 돌연변이를 도입함으로써, 또는 유전자 또는 발현 카세트의 삽입에 의해 억제될 수 있다. 바람직하게는, TrpD 도메인의 발현은 상기 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 억제된다. 일부 실시양태에서, 특히 박테리아가 대장균 인 경우, TrpD 도메인의 발현은 트립토판에 의해 억제되지 않는 내부 저효율 프로모터인 내부 프로모터 TrpCp의 활성을 보존하면서 상기 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 일부를 삭제함으로써 억제된다 (Horowitz and Platt, Journal of Molecular Biology, 156.2 (1982), 257-67).
TrpD를 인코딩하는 내인성 핵산 서열 활성이 불활성화되는 실시양태에서, 재조합 박테리아는 TrpD를 인코딩하는 내인성 또는 이종 유전자를 포함하는 발현 카세트를 도입함으로써 추가로 변형될 수 있다. 상기 실시양태에서, 내인성 TrpG 폴리펩티드의 발현은 유지되는 것이 바람직하다.
TrpD 및 TrpG를 인코딩하는 내인성 유전자(들) 활성이 불활성화되는 실시양태에서, 재조합 박테리아는 TrpG를 인코딩하는 내인성 또는 이종 유전자 및 TrpD를 인코딩하는 내인성 또는 이종 유전자를 포함하는 하나 또는 여러 개의 발현 카세트를 도입함으로써 추가로 변형될 수 있으며, 상기 유전자는 2개의 별개의 폴리펩티드의 발현을 유도한다. 특히, 재조합 박테리아는 TrpG를 인코딩하는 내인성 또는 이종 유전자를 포함하는 발현 카세트 및 TrpD를 인코딩하는 내인성 또는 이종 유전자를 포함하는 발현 카세트를 도입함으로써 추가로 변형될 수 있다.
TrpG 및 TrpD 활성이 이관능성 단백질 TrpGD로서 자연적으로 발현되는 박테리아에서, 용어 "TrpG를 인코딩하는 내인성 유전자" 및 "TrpD를 인코딩하는 내인성 유전자"는 이관능성 단백질의 도메인 TrpG를 인코딩하는 내인성 핵산 서열 및 이관능성 단백질의 도메인 TrpD를 인코딩하는 내인성 핵산 서열을 각각 지칭한다. TrpD 도메인 또는 폴리펩티드는 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않고, TrpG 도메인 또는 폴리펩티드는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않는다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 재조합 박테리아에서 발현된 TrpG 및 TrpD 폴리펩티드는 내인성 또는 이종성 폴리펩티드일 수 있다 (둘 다 내인성 또는 이종성일 수 있거나, 또는 하나는 내인성이고 다른 하나는 이종성일 수 있다). 특히, TrpG 및 TrpD 폴리펩티드는 임의의 공지된 TrpG 및 TrpD 폴리펩티드일 수 있으며, 바람직하게는 박테리아 TrpG 및 TrpD 폴리펩티드로부터 선택된다. 특히, TrpG 및 TrpD 폴리펩티드는 박테리아 이관능성 단백질 TrpGD의 TrpG 및 TrpD 도메인으로부터 선택될 수 있다.
TrpG를 인코딩하는 핵산 서열은 대장균의 TrpGD 단백질의 TrpG 도메인 (서열번호 1의 위치 3 내지 위치 196까지), 바실러스 서브틸리스의 TrpG (Uniprot accession number: P28819; 서열번호 2), 살모넬라 티피뮤리움의 TrpGD 단백질의 TrpG 도메인 (Uniprot accession number: P00905; 서열번호 3의 위치 3 내지 위치 196), 큐프리아비두스 네카토르의 TrpG (Uniprot accession number: Q0K6I2; 서열번호 4) 및 코리네박테리움 글루타미쿰의 TrpG (Uniprot accession number: P06558; 서열번호 5)를 인코딩하는 핵산 서열로 구성된 군에서 선택될 수 있다. TrpG 폴리펩티드는 또한 TrpG 활성을 나타내고, 서열번호 2, 4 및 5, 서열번호 1의 위치 3 내지 위치 196까지의 서열, 및 서열번호 3의 위치 3 내지 위치 196의 서열 중 어느 것과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%, 상동성을 가지는, 임의의 폴리펩티드일 수 있다:
TrpD를 인코딩하는 핵산 서열은 대장균(균주 K12)의 TrpGD 단백질의 TrpD 도메인(서열번호 1의 위치 202 내지 위치 531까지), 바실러스 서브틸리스의 TrpD (Uniprot accession number: P03947; 서열번호 6), 살모넬라 티피뮤리움의 TrpGD 단백질의 TrpD 도메인(Uniprot accession number: P00905;서열번호 3의 위치 202 내지 위치 531), Cupriavidus necator의 TrpD(Uniprot accession number: Q0K6I1; 서열번호 7) 및 코리네박테리움 글루타미쿰의 TrpD (Uniprot accession number: P06559; 서열번호 8) 의 TrpD 도메인을 인코딩하는 핵산 서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. TrpD 폴리펩티드는 또한 TrpD 활성을 나타내고 서열번호 6, 7 및 8, 서열번호 1의 위치 202 내지 위치 531까지의 서열 및 서열번호 3의 위치 202 내지 위치 531까지의 서열 중 어느 것과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 상동성을 가지는 임의의 폴리펩티드일 수 있다.
다른 TrpD 및 TrpG 폴리펩티드는 예를 들어 상기 열거된 폴리펩티드와의 상동성에 기초하여 일상적인 방법을 사용하여 용이하게 확인될 수 있다.
바람직하게는, TrpD 및 TrpG 폴리펩티드는 동일한 박테리아 종으로부터 유래한다. 보다 바람직하게는, TrpD 및 TrpG 폴리펩티드는 본 발명의 재조합 박테리아보다 동일한 종으로부터 유래한다.
본 발명의 재조합 박테리아는 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 불균형을 유도하여 안트라닐레이트 신타제 활성에 유리하도록 유전적으로 변형되었다.
일부 실시양태에서, 이러한 불균형은 TrpD의 발현 수준 및 TrpG 및/또는 TrpE의 발현 수준, 바람직하게는 TrpG의 발현 수준, 더욱 바람직하게는 TrpG 및 TrpE의 발현 수준을 조절함으로써 유도된다. 실제로, 이들 실시양태에서, TrpD의 발현 수준은 TrpG 및/또는 TrpE의 발현 수준보다 낮고, 바람직하게는 TrpG의 발현 수준보다 낮고, 더욱 바람직하게는 TrpG 및 TrpE의 발현 수준보다 낮다. 특히, TrpD의 발현 수준은 TrpG 또는 TrpE의 발현 수준보다 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 또는 90% 이상 낮을 수 있으며, TrpG의 발현 수준보다 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상, 보다 바람직하게는 TrpG의 발현 수준보다 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 낮고 Trp E의 발현 수준보다 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 낮다.
폴리펩티드의 발현 수준은 다양한 기술에 의해 결정될 수 있다. 특히, 발현 수준은 상기 폴리펩티드 또는 상응하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 바람직하게는, 발현 수준은 상응하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정된다. mRNA의 양을 결정하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 박테리아에 함유된 핵산은 먼저 표준 방법에 따라, 예를 들어 용해 효소 또는 화학 용액을 사용하여 추출되거나, 제조자의 지시에 따라 핵산 결합 수지에 의해 추출된다. 이어서, 추출된 mRNA는 혼성화 (예를 들어, 노던 블롯 분석) 및/또는 증폭 (예를 들어, RT-PCR)에 의해 검출된다. 바람직하게는, 폴리펩티드에 상응하는 mRNA는 정량적 또는 반정량적 RT-PCR에 의해 검출 및 정량화된다. 실시간 정량적 또는 반정량적 RT-PCR이 특히 유리하다. 프라이머 쌍은 관심 있는 폴리펩티드(들)을 특이적으로 검출하고 정량화하기 위해 설계된다.
본 발명의 재조합 박테리아는 제1 프로모터의 제어 하에 TrpG를 인코딩하는 유전자 및 제2 프로모터의 제어 하에 TrpD를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 프로모터는 상이한 전사 강도/속도를 나타내는 2개의 상이한 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 제1 프로모터는 변형되지 않은 박테리아에서 TrpG를 인코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 프로모터이고/이거나, 제2 프로모터는 변형되지 않은 박테리아에서 TrpD를 인코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 프로모터이다.
특정 양태에서, 본 발명의 재조합 박테리아는
- 제1 프로모터의 제어 하에 TrpG를 인코딩하는 유전자 또는 제1 오페론을 포함하고, 상기 제1 오페론은 적어도 TrpG를 인코딩하는 핵산 서열 및 임의로 TrpE를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 및
- 제2 프로모터의 제어 하에 TrpD인코딩하는 유전자 또는 제2 오페론을 포함하고, 상기 제2 오페론은 적어도 TrpD를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
상기 실시양태에서, 본 발명의 재조합 박테리아는 제1 프로모터의 제어 하에 TrpG를 인코딩하는 유전자 또는 제1 오페론을 포함하는 재조합 핵산 및/또는 제2 프로모터의 제어 하에 TrpD를 인코딩하는 유전자 또는 제2 오페론을 포함하는 재조합 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 제1 프로모터는 변형되지 않은 박테리아에서 TrpG를 인코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 프로모터이고/이거나, 제2 프로모터는 변형되지 않은 박테리아에서 TrpD를 인코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 프로모터이다.
제1 또는 제2 오페론, 바람직하게는 제2 오페론은 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제(TrpC)를 인코딩하는 핵산 서열 및/또는 포스포리보실 안트라닐레이트 이성화효소(TrpF)를 인코딩하는 핵산 서열, 및/또는 트립토판 신타제 (TrpA)의 서브유닛 α를 인코딩하는 핵산 서열, 및/또는 트립토판 신타제의 서브유닛 (TrpB) β를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
TrpG 및 TrpD를 인코딩하는 유전자 또는 제1 및 제2 오페론은 하나 또는 여러 개의 발현 카세트를 포함하는 하나 또는 여러 개의 재조합 핵산으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 발현 카세트는 적어도 유전자 또는 오페론에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 전사를 종결시키기 위해 박테리아에 의해 인식되는 전사 종결자를 포함한다. 터미네이터는 인코딩 핵산의 3'-말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서 기능하는 임의의 터미네이터는 본 발명에서 사용될 수 있으며, 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로 터미네이터는 프로모터와 관련하여 선택된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 재조합 박테리아는 TrpG를 인코딩하는 유전자 또는 상기 정의된 제1 오페론를 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 재조합 핵산, 및 TrpD를 인코딩하는 유전자 또는 상기 정의된 바와 같은 상기 제2 오페론를 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 재조합 핵산을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 박테리아는 TrpG를 인코딩하는 유전자 또는 상기 정의된 제1 오페론을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산, 및 TrpD를 인코딩하는 유전자 또는 상기 정의된 바와 같은 제2 오페론을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함한다.
TrpG를 인코딩하는 핵산 서열 및 임의로 TrpE를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 오페론은, TrpD를 불활성화시키거나 발현하지 않도록 변형된 염색체 내인성 오페론일 수 있다. 이때, 상기 오페론의 발현을 조절하는 프로모터는 변형되지 않은 박테리아에서 TrpG, 및 임의로 TrpE의 발현을 조절하는 프로모터일 수 있다.
일부 실시양태에서, 특히 변형되지 않은 박테리아가 2개의 별개의 폴리펩티드를 발현하는 경우, 하나는 TrpD 활성을 나타내고 다른 하나는 TrpG 활성을 발현하는 경우, 본 발명의 재조합 박테리아 내 TrpG 및/또는 TrpE의 발현 수준, 바람직하게는 TrpG 및 TrpE의 발현 수준은, TrpD의 발현 수준보다 더 높다. 선택적으로, TrpG 및/또는 TrpE의 발현 수준은, 바람직하게는 TrpG 및 TrpE의 발현 수준은, 또한 TrpC, TrpF, TrpA 및/또는 TrpB, 바람직하게는 TrpD, TrpF, TrpA, TrpC 및 TrpB의 발현 수준보다 더 높을 수 있다.
일부 다른 구체예에서, 특히 변형되지 않은 박테리아가 TrpD 및 TrpG 활성을 나타내는 이관능성 단백질을 발현하는 경우, 본 발명의 재조합 박테리아에서 TrpG 및/또는 TrpE, 바람직하게는 TrpG 및 TrpE의 발현 수준은, TrpD의 발현 수준에 대해 더 높거나, 더 낮거나, 실질적으로 동일하거나, 바람직하게는 더 높거나 실질적으로 동일할 수 있다. 실제로, 본 발명자들은 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내는 폴리펩티드(및 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않음)와 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내는 폴리펩티드(TrpD)(글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않음)는, TrpD의 발현이 강력한 프로모터에 의해 조절되는 경우에도 안트라닐산을 축적한다.
유전자 또는 오페론의 발현 수준은 통상의 기술자에 의해 공지된 임의의 방법에 의해, 특히 유전자 또는 오페론의 복제 수를 조정하고/하거나 그의 발현을 조절하는 프로모터의 강도를 조절함으로써 변경될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 프로모터는 돌연변이체, 절단된 프로모터, 및 하이브리드 프로모터를 포함하는 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 내인성 또는 이종 유전자로부터 얻을 수 있다. 상기 유전자를 포함하는 TrpD 또는 오페론을 인코딩하는 유전자의 발현을 조절하기 위해 사용되는 프로모터 및 상기 유전자를 포함하는 TrpG 또는 오페론을 인코딩하는 유전자의 발현은 구성적이거나 유도성일 수 있다. 특히, 상기 유전자를 포함하는 TrpD 또는 이의 오페론을 인코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터의 활성은, 트립토판 농도에 의해 조절될 수 있다.
바람직한 구체예에서, TrpG를 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론의 발현을 조절하는 프로모터는 TrpD을 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론의 발현을 조절하는 프로모터보다 더 강하다. 특히, TrpG를 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론의 발현을 조절하는 프로모터는 강력한 프로모터, 즉 높은 전사 개시율을 유도하는 프로모터일 수 있고, 반면 상기 프로모터는 TrpD를 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론의 발현을 조절하는 프로모터가 약한 프로모터일 수 있으며, 즉, 낮은 전사 개시 속도를 유도하는 프로모터일 수 있다. 대안적으로, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성 및 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 불균형이 안트라닐레이트 신타제 활성에 유리하게 유지된다면, 두 프로모터 모두 강한 프로모터 또는 약한 프로모터일 수 있다. 이러한 강력한 프로모터의 예에는 T7 프로모터, pTac, pRecA 및 pTrp가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이러한 약한 프로모터의 예에는 pLac 및 pLacUV5가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 추가의 프로모터는 Sambrook et al., 2012; 분자 복제: 실험실 매뉴얼, 4판, 콜드 스프링 하버(Sambrook et al., 2012; Molecular cloning: a laboratory manual, fourth, Edition Cold Spring Harbor)에 기재되어 있다. 특정 양태에서, TrpG를 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론의 발현을 조절하는 프로모터는 pTrp 또는 동일한 강도의 프로모터, 바람직하게는 pTrp이고, TrpD를 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론의 발현을 조절하는 프로모터은 pTac 또는 동일한 강도의 프로모터, 바람직하게는 pTac이다.
보다 구체적인 양태에서, 재조합 박테리아, 바람직하게는 대장균에 상응하는 야생형 박테리아는 TrpG 및 TrpD 활성을 나타내는 이관능성 단백질을 발현하고, 재조합 박테리아는 제1 프로모터의 통제하에 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성(TrpG)을 나타내는(및 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않는) 폴리펩티드 및, 제2 프로모터의 통제하에 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성(TrpD)을 나타내는(및 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않는) 폴리펩티드를 각각 발현하도록 유전적으로 변형되었고, 두 프로모터 모두 강력한 프로모터이다. 바람직하게는, TrpG를 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론의 발현을 조절하는 프로모터는 pTrp 또는 동일한 강도의 프로모터, 바람직하게는 pTrp이고, TrpD를 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론의 발현을 제어하는 프로모터는 pTac 또는 동일한 강도의 프로모터, 바람직하게는 pTac이다.
선택적으로, 본 발명에 사용되는 재조합 핵산(들)은 또한 재조합 숙주 세포의 용이한 선택을 허용하는 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 전형적으로, 선택가능한 마커는 항생제 내성을 인코딩하는 유전자이다.
상기 개시된 바와 같은 재조합 핵산(들)을 포함하는 발현 벡터(들)는 박테리아를 형질 전환시키는데 사용될 수 있다. 발현 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 상용성에 의존한다. 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉, 염색체 외 실체로서 존재하는 벡터일 수 있으며, 그 복제는 염색체 복제와 무관하며, 예를 들어, 플라스미드, 염색체 외 요소, 미니 염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자기-복제를 보장하기 위한 임의의 수단을 포함할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입될 때, 게놈 내로 통합되고, 그것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 하나 이상의 재조합 핵산을 포함하는 벡터, 또는 이의 일부는 박테리아의 게놈에 삽입된다. 숙주 세포 게놈 내로의 통합이 일어날 때, 게놈 내로의 서열의 통합은 상동성 또는 비상동성 재조합에 의존할 수 있다. 한편, 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로의 정확한 위치에서 상동성 재조합에 의한 통합을 지시하기 위한 추가의 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 이러한 추가 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈에서 표적 서열과 상동성인 임의의 서열일 수 있다. 한편, 벡터는 비상동 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 자율적 복제를 위해, 벡터는 벡터가 문제의 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있도록 하는 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 복제 기점은 세포에서 기능하는 자율적 복제를 매개하는 임의의 플라스미드 복제자일 수 있다. 벡터는 바람직하게는 벡터를 포함하는 숙주 세포의 용이한 선택을 허용하는 하나 이상의 선택가능한 마커를 포함한다. 전형적으로, 선택가능한 마커는 항생제 내성을 인코딩하는 유전자이다. 숙주 세포에 따라 이들 요소를 선택하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려진 분자 생물학의 고전적 기술에 의해 구축될 수 있다. 본 발명의 재조합 박테리아에 포함되는 재조합 핵산(들)은 박테리아의 게놈 내로 통합될 수 있거나, 또는 하나 또는 다수의 발현 벡터 내로 에피솜 형태로 유지될 수 있다. 에피솜 형태로 유지되는 재조합 핵산(들)이 구체예에서, 발현 벡터(들)는 복제 기점의 성질에 따라 하나 또는 여러 개의 사본으로 박테리아 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 재조합 핵산(들)은 박테리아의 게놈 내로 통합된다. 재조합 핵산(들)의 하나 또는 여러 사본은 유전자 치환을 포함하는, 해당 분야의 전문가에게 공지된 재조합 방법에 의해 게놈 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제2 재조합 핵산이 발현 벡터 내로 에피솜 형태로 유지되는 실시양태에서, 상기 발현 벡터는 박테리아 내에 25 카피 미만, 더욱 바람직하게는 10 카피 미만으로 존재한다.
특정 양태에서, 본 발명의 재조합 박테리아는 TrpG를 인코딩하는 유전자 또는 상기 정의된 제1 오페론을 포함하는 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 재조합 핵산을 포함하고, 상기 제1 재조합 핵산은 게놈 내로 통합되고, TrpD를 인코딩하는 유전자 또는 상기 정의된 바와 같은 제2 오페론을 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 재조합 핵산을 포함하며, 상기 제2 재조합 핵산은 발현 벡터 내로 에피솜 형태로 유지된다.
재조합 박테리아는 안트라닐산으로의 탄소 플럭스를 증가시키기 위해 추가로 유전적으로 변형될 수 있다.
특히, 본 발명의 재조합 박테리아는 피드백 내성 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제를 인코딩하는 이종 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 효소 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase)(DAHP synthase, EC 4.1.2.15)는 포스포(에놀)피루베이트(phospho(enol)pyruvate:PEP) 및 에리스로즈-4-포스페이트(erythrose-4-phosphate:E4P)가 DAHP 및 무기 인산염으로 응축되는 것을 촉매한다. 이 반응은 미생물에서 방향족 화합물의 생합성에서 첫 번째 커밋 단계이다. 대장균은 3개의 DAHP 신타제 동종 효소를 가지고 있으며, 각각은 방향족 아미노산, 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판 중 하나에 의해 피드백 조절된다. 본원에 사용된 용어 "피드백 내성 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제" 또는 "피드백 내성 DAHP 신타제"는 시키메이트 경로의 생성물, 즉 티로신-, 페닐알라닌- 및/또는 트립토판- 둔감성(insensitive) DAHP 신타제에 의해 음성적으로 조절되지 않는 DAHP 신타제를 의미한다. 피드백 내성 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제는 당업자에게 공지된 임의의 피드백 내성 DAHP 신타제일 수 있으며, 바람직하게는 박테리아 피드백 내성 DAHP 신타제이다. 피드백 내성 DAHP 신타제의 예로는, Asn-8을 Lys-8로 치환한 대장균 AroF(Jossek et al. FEMS Microbiol Lett, 2001 Aug 7;202(1):145-8), Ala-146을 Ans-146으로 치환한 AroG (Mascarenhas et al. Applied and Environmental Microbiology, 1991 oct, 57;10:2995-2999), Pro-18을 Lys-18로 치환, Val-147를 Met-147로 치환, Gly-149를 Asp-149로 치환, Gly-149를 Cys-149로 치환 또는 Ala-177를 Tyr-177로 치환한 AroH (Ray et al. Journal of Bacteriology, 1988 Dec 170(12) 5500-5506)을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다.
대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명의 재조합 박테리아는 트랜스케톨라제 효소를 인코딩하는 내인성 유전자를 과발현시키거나 트랜스케톨라제 효소를 인코딩하는 이종 유전자를 발현하도록 추가로 유전적으로 변형될 수 있다. 트랜스케톨라제(EC 2.2.1.1)는 여러 공여체 및 수용체 기질 사이에서 케톨기의 가역적 전달을 촉매한다. 이 효소는 해당 과정과 오탄당 인산염 경로 사이의 가역적 인 연결이다. 이 효소는 오탄당의 이화 작용과 방향족 아미노산의 전구체인 에리스로즈-4-포스페이트 (E4P)의 제공에 관여한다. 대장균은 두 개의 트랜스케톨라제 동종효소인 TktA와 TktB를 함유하고 있다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 트랜스케톨라제 효소를 인코딩하는 내인성 유전자를 과발현하도록 유전적으로 변형된다.
상기 개시된 재조합 핵산(들) 또는 발현 벡터(들)는 전기천공, 접합, 형질도입, 적격 세포 형질전환, 원형질체 형질전환 또는 원형질체 융합과 같은 당업자에 의해 공지된 임의의 방법에 의해 박테리아 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포의 성질에 따라, 통상의 기술자는 적합한 방법을 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 재조합 박테리아는 트립토판을 합성할 수 있는 대사 능력을 갖는 박테리아의 유전자 변형을 통해 얻어지는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명의 재조합 박테리아는 트립토판을 합성할 수 있는 대사 능력을 갖는 박테리아로부터 수득하는 것이 바람직하며, 이때 변형되지 않은 박테리아에서 내인성 TrpG 및 TrpD 활성은 이관능성 단백질인 TrpGD로 발현된다.
재조합 박테리아는 임의의 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 적합한 박테리아의 예로는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 에스케리치아(Escherichia) 속의 박테리아 (예를 들어 대장균, Escherichia coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 바실러스(Bacillus), 쿠프리다비두스(Cupridavidus), 코리네박테리움 마이코박테리움(Corynebacterium Mycobacterium), 키타사토스포라(Kitasatospora), 루테이풀베라투스(Luteipulveratus), 테르모비피다(Thermobifida), 테르모모노스포라(Thermomonospora), 프랑키아(Frankia), 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 사카로트릭스(Saccharothrix, 쿠츠네리아(Kutzneria), 렌체아(Lentzea), 프라우세렐라(Prauserella), 살리니스포라(Salinispora), 마이크로모노스포라(Micromonospora), 악티노플레인(Actinoplanes), 카테눌리스포라(Catenulispora), 미콜리시박테리움(Mycolicibacterium), 디에지아(Dietzia), 에어로미크로비움(Aeromicrobium), 노노무라에아(Nonomuraea), 블라스토코쿠스(Blastococcus), 모데스토박테이터(Modestobacter), 사카로폴리포라(Saccharopolyspora), 아미콜라톱스포라(Amycolatopsis), 악티노폴리스포라(Actinopolyspora), 아시미크로비움(Acidimicrobium), 포토하브두스(Photorhabdus), 호에플레아(Hoeflea), 아조스피럼(Azospirillum), 크리날륨(Crinalium) 또는 실린더로스퍼뮴(Cylindrospermum)를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 에스케리치아(Escherichia), 스트렙토미세스(Streptomyces), 코리네박테리움(Corynebacterium) 및 바실러스(Bacillus) 속의 박테리아로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 에스케리치아(Escherichia), 스트렙토미세스(Streptomyces) 및 바실러스(Bacillus) 속의 박테리아로부터 선택된다. 더욱 더 바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 대장균(Escherichia coli)이다.
특정 양태에서, 재조합 박테리아는 제1 프로모터의 제어 하에 글루타민 아미도트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 핵산 서열 및 제2 프로모터의 제어 하에 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 변형된 대장균(에스케리치아 콜리) 박테리아이다. 바람직하게는, 상기 재조합 박테리아는 (i) 제1 프로모터의 제어 하에, 글루타민 아미도 트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 유전자 또는 제1 오페론을 포함하고, 상기 제1 오페론은 적어도 TrpG를 인코딩하는 핵산 서열 및 임의로 안트라닐레이트 신타제(TrpE)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, (ii) 제2 프로모터의 제어 하에 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 유전자 또는 제2 오페론을 포함하고, 상기 제2 오페론은 적어도 TrpD 를 인코딩하는 핵산 서열, 및 선택적으로 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제(TrpC)를 인코딩하는 핵산 서열, 포스포리보실안트라닐레이트 이성화효소(TrpF)를 인코딩하는 핵산 서열, 트립토판 신타제 (TrpA)의 α 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열, 및/또는 트립토판 신타제 (TrpB)의 서브유닛 β를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 두 프로모터 모두 강력한 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, TrpG를 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론의 발현을 조절하는 프로모터는 pTrp 또는 동일한 강도의 프로모터, 바람직하게는 pTrp이고, TrpD를 인코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 오페론의 발현을 제어하는 프로모터는 pTac 또는 동일한 강도의 프로모터, 바람직하게는 pTac이다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 살리실레이트 5-하이드록실라제(S5H) 활성을 나타내지 않거나 및/또는 5-하이드록시안트라닐레이트 (5-HAA)를 생성하지 않는다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아는 탄소원으로서 글루코스의 존재 하에서 48시간 동안 2L 유가식 발효기에서 배양될 때 적어도 1 g/L의 안트라닐레이트 또는 20L 유가식 발효기에서 배양될 때 적어도 4 g/L의 안트라닐레이트를 생산할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 재조합 박테리아는 탄소원으로서 글루코스의 존재 하에 30시간 동안 5 mL 배양으로 배양될 때, 적어도 300 mg/L, 바람직하게는 적어도 400 mg/L, 더욱 바람직하게는 적어도 500 mg/L를 생산할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 안트라닐산을 생산하는, 본 발명의 재조합 박테리아의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 화합물을 생산하기에 적합한 조건 하에서 본 발명의 재조합 박테리아를 배양하고, 임의로 상기 안트라닐산을 회수하는 단계를 포함하는, 안트라닐산의 생산 방법에 관한 것이다. 안트라닐산은 박테리아에 의해 분비된다. 따라서, 안트라닐산은 배양 배지 및 특히 배양 상청액을 수집함으로써 회수될 수 있다. 상기 방법은 상기 안트라닐산을 단리 또는 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 안트라닐산은 침전, 난교환, 역삼투 및 여과와 같은 당업자에 의해 공지된 임의의 방법을 사용하여 단리 또는 정제될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 재조합 박테리아는 5-하이드록시안트라닐레이트 (5-HAA) 및 안트라닐산을 생산하고 임의로 회수하지 않으며, 5-HAA를 박탈한다.
본 발명의 재조합 박테리아에 대해 상술한 모든 실시양태가 또한 이들 측면에서 고려된다.
안트라닐산을 생산하기에 적합한 조건은 사용된 재조합 박테리아에 따라 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특히, 통상의 기술자는 박테리아에 따라 적합한 배양 배지 및 성장 조건을 용이하게 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 박테리아와 함께 안트라닐산을 생산하기 위해 사용되는 배양 배지는 트립토판 또는 임의의 트립토판 공급원이 박탈되거나 트립토판으로 보충되지 않는다.
본 발명의 추가의 측면 및 장점들은 다음의 실시예들에서 설명될 것이며, 이는 예시적인 것으로 간주되어야 하며 제한적인 것이 아니다.
실시예
예 1
재료 및 방법
스트레인 구축
균주 K1은 람다 레드 방법을 사용하여 클로람페니콜 카세트에 의해 MG1655 E.coli 균주의 trpD의 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 도메인을 대체함으로써 구축되었다 (Kirill et al. PNAS, Jun 2000, 97(12) 6640-6645). 간략하게, trpD 유전자와의 서열 상동성을 포함하는 프라이머 1 및 2 (하기 표 1 참조)를 사용하여 pKD3 플라스미드의 클로람페니콜 카세트를 증폭하였다 (Kirill et al. PNAS, Jun 2000, 97(12) 6640-6645). 이어서, MG1655 세포를 pKD46 플라스미드 (Kirill et al. PNAS, Jun 2000, 97(12) 6640-6645)로 형질전환시키고, 이를 사용하여 람다 레드 재조합을 허용하였다.
K2 균주는 pCP20 플라스미드를 사용하여 K1 균주의 클로람페니콜 카세트를 제거하여 제작하였다(Kirill et al. PNAS, Jun 2000, 97(12) 6640-6645). 이어서, 균주 K2는 p002 플라스미드 (하기 참조)에 의해 형질전환되어, K3 균주를 유도하였다.
플라스미드 구축
저복제 플라스미드 pBAC-LacZ(addgene n°13422)를 골격으로 사용하였다. lacZ 유전자는 pBAC-LacZ 플라스미드의 SalI 소화에 의해 제거되어 pBAC-△(LacZ) 플라스미드로 이어졌다. 그런 다음 소화/결찰법(SalI/HpaI 및 SalI/ZraI)에 의해 pTAC 프로모터(대장균 trp 및 lac 프로모터의 하이브리드) 및 rrnB T1 터미네이터(대장균 rrnB 유전자의 전사 터미네이터 T1)를 이 플라스미드에 첨가했다. trpD의 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 도메인은 프라이머 3 및 4(아래 표 1 참조)로 대장균 염색체에서 증폭된 후 소화/결찰(NheI/HindIII)에 의해 pTAC 프로모터와 rrnB T1 터미네이터 사이의 pBAC-△(LacZ)에 클로닝되어 플라스미드 p002로 이어졌다.
프라이머 목록
프라이머 이름 서열
1 gcgcagcagaaactagagccagccaacacgctgcaaccgattctgtaagtgtaggctggagctgcttc (서열번호: 9)
2 aatcgccttgtctgcgacgattttcgctaaaacggtttgcatcatatgggaattagccatggtcc (서열번호: 10)
3 agtatggctagcttaccctcgtgccgccagtg (서열번호: 11)
4 gactagaagcttcctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagaatcgatatgaacacgctgcaaccgattctg (서열번호: 12)
배양 조건
K2 및 K3 균주를 8시간 동안 5ml의 LB 배지에서 배양한 다음, 10ml의 미네랄 배지 M9에서 밤새 배양하였다(배지의 조성은 표 2에 기재되어 있음). 20mg/l의 트립토판을 K2 배양물에 첨가하였다. 각 전배양 100μl를 사용하여 전배양과 동일한 조건에서 25ml의 미네랄 배지 M9를 접종했다. 이어서, 균주를 37℃에서 31시간 동안 배양하였다.
M9 배지의 조성
g/l
Na2HPO4 6.9
KH2PO4 3.03
NaCl 0.51
NH4Cl 2.04
MgSO4, 7H2O 0.49
CaCl2, 2H2O 0.00438
Na2MoO4, 2H2O 0.015
ZnSO4, 7H2O 0.0045
CoCl2, 6H2O 0.0003
MnCl2, 4H2O 0.001
H3BO3 0.001
Na2MoO4, 2H2O 0.0004
FeSO4, 7H2O 0.003
CuSO4, 5H2O 0.0003
Thiamine HCl 0.1
분석
배양물의 상층액에서 안트라닐레이트의 양은 LC-UV 방법을 이용하여 측정하였다. HPLC 기기는 컬럼 (Waters Acquity BEH C18 (50*2.1 mm; 1.7 μm))을 장착하고, UV 검출기에 결합시켰다: [190-400 nm]. H2O/ACN 용액은 40℃에서 0.5ml/의 유속, 8분에 걸쳐 5%에서 100% ACN까지의 선형 용리 구배 및 UV 검출기(λ210nm)에서 이동상으로 사용되었다.
결과
트립토판 없이 M9 배지에서 배양된 균주 K2는 성장하지도 않았고 안트라닐레이트를 생성하지도 않았다. 트립토판이 보충된 M9 배지에서 배양된 균주 K2는 6.3에서 600nm(OD600nm)에서 광학 밀도까지 성장했으며 31시간 내에 311mg/l의 안트라닐산을 생성했다.
트립토판이 없는 M9 배지에서 배양된 균주 K3는 6.8에서 OD600nm까지 성장했으며 31시간 내에 375mg/l의 안트라닐산을 생성했다. 따라서 균주 K3는 트립토판 영양요구성 없이 안트라닐레이트를 축적하고 분비할 수 있는 박테리아 균주이다.
예 2
재료 및 방법
배양 조건 - 2L-Fed-batch 발효
유가식 발효는 30g/L의 포도당, 1M의 IPTG 및 50μg/L의 클로람페니콜이 보충된 1.35L의 M9 배양 배지를 포함하는 2L-생물반응기 Sartorius® Stedim Biostat C에서 수행되었다. 세포를 cryostock(20% 글리세롤의 존재 하에 - 80℃에서 보존된 균주)에서 접종하고, 100μL를 1L-배플 플라스크에 1M의 IPTG 및 50μg/L의 클로람페니콜의 LB 배지 100mL에 접종하고 8시간 동안 37℃ 및 200rpm의 회전 쉐이커에서 배양했다. 이어서, 30 g/L의 포도당, 1M의 IPTG 및 50μg/L의 클로람페니콜로 보충된 200 mL의 M9 배지를 함유하는 2L-배플 플라스크에, 종자 배양물의 2 mL 분취량을 접종하였다. 세포는 OD600이 ~4에 도달할 때까지 37℃ 및 200rpm에서 배양되었고, 0.2에서 초기 OD600에 도달하기 위해 발효기로 옮겨졌다. 배양 pH는 17%(v/v) 암모니아 용액 또는 2M H3PO4를 자동 공급하여 6.8로 조절하고, 온도를 37℃로 유지하였다. 용존 산소 농도(DO)는 공기 포화도의 20%에서 제어되었다.
바이오매스는 600nm에서 OD를 측정하여 모니터링하였다. 안트라닐레이트의 세포외 농도는 배양 48시간 후에 HPLC-UV에 의해 측정하였다.
배양 조건 - 20L-Fed-batch 발효
유가식 발효는 30g/L의 포도당, 1M의 IPTG 및 50μg/L의 클로람페니콜이 보충된 16L의 M9 배양 배지를 포함하는 20L-생물반응기 생물반응기 Sartorius® Stedim Biostat C에서 수행되었다. 세포를 1L-배플 플라스크에 100mL의 LB 배지 1M의 IPTG와 50μg/L의 클로람페니콜에 극저온 스톡 100μL를 접종하고 37℃ 및 200rpm의 회전 쉐이커에서 8시간 동안 배양했다. 그런 다음 30g/L의 포도당, 1M의 IPTG 및 50μg/L의 클로람페니콜이 보충된 2 x 1L M9 배지를 포함하는 2 x 5L-배플 플라스크에 2 x 50mL의 종자 배양물을 접종했다. 세포는 OD600이 ~4에 도달할 때까지 37℃ 및 200rpm에서 배양되었고, 0.2에서 초기 OD600에 도달하기 위해 발효기로 옮겨졌다. 배양 pH는 35%(v/v) 암모니아 용액 또는 2M H3PO4를 자동 공급하여 6.8로 제어하고, 온도를 37℃로 유지하였다. 용존 산소 농도(DO)는 공급 공기를 0.2vvm에서 1vvm으로 자동으로 증가시키고 교반 속도를 최대 1800rpm으로 변경하여 공기 포화도의 20%에서 제어되었다. 배양 중 잔류 포도당 농도는 10 내지 30 g/L 사이로 유지된다.
바이오매스는 600nm에서 OD를 측정하여 모니터링하였다. 안트라닐레이트의 세포외 농도는 배양 48시간 후에 HPLC-UV에 의해 측정하였다.
결과
2L 및 20L 유가식 발효기에서 균주 K3의 안트라닐레이트 생산은 표 3에 제시되어 있다.
2L 및 20L 유가식 발효기에서 균주 K3의 안트라닐레이트 생산
2L 유가식 발효기 20L유가식 발효기
안트라닐레이트(g/L) 2.3 5.2
수율 안트라닐레이트/포도당(g/g) 0.02 0.02
생산성 (g/L/h) 0.07 0.11
예 3
재료 및 방법
스트레인 구축
실시예 1에 개시된 균주 K2는 내인성 tktA 효소를 과발현하기 위해 트랜스케톨라제 효소를 인코딩하는 tktA 유전자의 천연 프로모터를 더 강력한 프로모터로 대체하도록 조작하여, 균주 K51을 유도하였다.
그런 다음 균주 K51은 (i) 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제를 인코딩하는 aroG 유전자의 천연 프로모터를 더 강력한 프로모터로 대체하고 (ii) 피드백 내성 aroG 효소를 유도하는 돌연변이를 도입하여 염색체에 직접 내인성 유전자 aroG를 음소거하도록 추가로 조작되었다. 이를 위해, 대장균 w로부터의 aroG 유전자를 증폭시키고, 제한/결찰법에 의해 플라스미드 내로 클로닝하였다. 이어서, 이 플라스미드에 대해 QuickChange 방법에 의한 돌연변이유발을 수행하여 aroG를 aroGfbr(G436A)로 뮤트시켰다. 결국, 대체 프로모터를 aroGfbr 유전자 앞에 PCR로 삽입하고 플라스미드에 클로닝하여 염색체와 재조합할 수 있게 하였다. 이러한 재조합 카세트는 천연 프로모터보다 더 강한 프로모터의 제어 하에 aroGfbr 유전자를 포함하는 카세트로 K77 균주를 유도하는 K51 균주를 도입하였다. 균주 K77은 p002 플라스미드에 의해 형질전환되어 K91 균주로 이어졌다.
배양 조건
K91 균주를 8시간 동안 5ml의 LB 배지에서 배양한 다음, 10ml의 미네랄 배지 M9에서 밤새 배양하였다(배지의 조성은 표 2에 기재되어 있음). 20mg/l의 트립토판을 K2 배양에 첨가하였다. 각 전배양 100μl를 사용하여 전배양과 동일한 조건에서 25ml의 미네랄 배지 M9를 접종했다. 이어서, 균주를 37℃에서 31시간 동안 배양하였다.
분석
배양물의 상층액에서 안트라닐레이트의 양은 LC-UV 방법을 이용하여 측정하였다. HPLC 기기는 컬럼 (Waters Acquity BEH C18 (50*2.1 mm; 1.7 μm))을 장착하고, UV 검출기에 결합시켰다: [190-400 nm]. H2O/ACN 용액은 40℃에서 0.5ml/의 유속, 8분에 걸쳐 5%에서 100% ACN까지의 선형 용리 구배 및 UV 검출기(λ210nm)에서 이동상으로 사용되었다.
결과
트립토판이 없는 M9 배지에서 배양된 균주 K91은 7.0에서 OD600nm까지 성장하여 32시간 내에 573mg/l의 안트라닐산을 생산했다. 따라서 균주 K91은 트립토판 영양요구성 없이 안트라닐레이트를 축적하고 분비할 수 있는 박테리아 균주이다.
SEQUENCE LISTING <110> PILI <120> RECOMBINANT HOST CELLS TO PRODUCE ANTHRANILIC ACID <130> IP20234291FR <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 531 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ala Asp Ile Leu Leu Leu Asp Asn Ile Asp Ser Phe Thr Tyr Asn 1 5 10 15 Leu Ala Asp Gln Leu Arg Ser Asn Gly His Asn Val Val Ile Tyr Arg 20 25 30 Asn His Ile Pro Ala Gln Thr Leu Ile Glu Arg Leu Ala Thr Met Ser 35 40 45 Asn Pro Val Leu Met Leu Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro Ser Glu Ala 50 55 60 Gly Cys Met Pro Glu Leu Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Pro Ile 65 70 75 80 Ile Gly Ile Cys Leu Gly His Gln Ala Ile Val Glu Ala Tyr Gly Gly 85 90 95 Tyr Val Gly Gln Ala Gly Glu Ile Leu His Gly Lys Ala Ser Ser Ile 100 105 110 Glu His Asp Gly Gln Ala Met Phe Ala Gly Leu Thr Asn Pro Leu Pro 115 120 125 Val Ala Arg Tyr His Ser Leu Val Gly Ser Asn Ile Pro Ala Gly Leu 130 135 140 Thr Ile Asn Ala His Phe Asn Gly Met Val Met Ala Val Arg His Asp 145 150 155 160 Ala Asp Arg Val Cys Gly Phe Gln Phe His Pro Glu Ser Ile Leu Thr 165 170 175 Thr Gln Gly Ala Arg Leu Leu Glu Gln Thr Leu Ala Trp Ala Gln Gln 180 185 190 Lys Leu Glu Pro Ala Asn Thr Leu Gln Pro Ile Leu Glu Lys Leu Tyr 195 200 205 Gln Ala Gln Thr Leu Ser Gln Gln Glu Ser His Gln Leu Phe Ser Ala 210 215 220 Val Val Arg Gly Glu Leu Lys Pro Glu Gln Leu Ala Ala Ala Leu Val 225 230 235 240 Ser Met Lys Ile Arg Gly Glu His Pro Asn Glu Ile Ala Gly Ala Ala 245 250 255 Thr Ala Leu Leu Glu Asn Ala Ala Pro Phe Pro Arg Pro Asp Tyr Leu 260 265 270 Phe Ala Asp Ile Val Gly Thr Gly Gly Asp Gly Ser Asn Ser Ile Asn 275 280 285 Ile Ser Thr Ala Ser Ala Phe Val Ala Ala Ala Cys Gly Leu Lys Val 290 295 300 Ala Lys His Gly Asn Arg Ser Val Ser Ser Lys Ser Gly Ser Ser Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Ala Phe Gly Ile Asn Leu Asp Met Asn Ala Asp Lys Ser 325 330 335 Arg Gln Ala Leu Asp Glu Leu Gly Val Cys Phe Leu Phe Ala Pro Lys 340 345 350 Tyr His Thr Gly Phe Arg His Ala Met Pro Val Arg Gln Gln Leu Lys 355 360 365 Thr Arg Thr Leu Phe Asn Val Leu Gly Pro Leu Ile Asn Pro Ala His 370 375 380 Pro Pro Leu Ala Leu Ile Gly Val Tyr Ser Pro Glu Leu Val Leu Pro 385 390 395 400 Ile Ala Glu Thr Leu Arg Val Leu Gly Tyr Gln Arg Ala Ala Val Val 405 410 415 His Ser Gly Gly Met Asp Glu Val Ser Leu His Ala Pro Thr Ile Val 420 425 430 Ala Glu Leu His Asp Gly Glu Ile Lys Ser Tyr Gln Leu Thr Ala Glu 435 440 445 Asp Phe Gly Leu Thr Pro Tyr His Gln Glu Gln Leu Ala Gly Gly Thr 450 455 460 Pro Glu Glu Asn Arg Asp Ile Leu Thr Arg Leu Leu Gln Gly Lys Gly 465 470 475 480 Asp Ala Ala His Glu Ala Ala Val Ala Ala Asn Val Ala Met Leu Met 485 490 495 Arg Leu His Gly His Glu Asp Leu Gln Ala Asn Ala Gln Thr Val Leu 500 505 510 Glu Val Leu Arg Ser Gly Ser Ala Tyr Asp Arg Val Thr Ala Leu Ala 515 520 525 Ala Arg Gly 530 <210> 2 <211> 194 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Ile Leu Met Ile Asp Asn Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr Asn Leu Val 1 5 10 15 Gln Tyr Leu Gly Glu Leu Gly Glu Glu Leu Val Val Lys Arg Asn Asp 20 25 30 Ser Ile Thr Ile Asp Glu Ile Glu Glu Leu Ser Pro Asp Phe Leu Met 35 40 45 Ile Ser Pro Gly Pro Cys Ser Pro Asp Glu Ala Gly Ile Ser Leu Glu 50 55 60 Ala Ile Lys His Phe Ala Gly Lys Ile Pro Ile Phe Gly Val Cys Leu 65 70 75 80 Gly His Gln Ser Ile Ala Gln Val Phe Gly Gly Asp Val Val Arg Ala 85 90 95 Glu Arg Leu Met His Gly Lys Thr Ser Asp Ile Glu His Asp Gly Lys 100 105 110 Thr Ile Phe Glu Gly Leu Lys Asn Pro Leu Val Ala Thr Arg Tyr His 115 120 125 Ser Leu Ile Val Lys Pro Glu Thr Leu Pro Ser Cys Phe Thr Val Thr 130 135 140 Ala Gln Thr Lys Glu Gly Glu Ile Met Ala Ile Arg His Asn Asp Leu 145 150 155 160 Pro Ile Glu Gly Val Gln Phe His Pro Glu Ser Ile Met Thr Ser Phe 165 170 175 Gly Lys Glu Met Leu Arg Asn Phe Ile Glu Thr Tyr Arg Lys Glu Val 180 185 190 Ile Ala <210> 3 <211> 531 <212> PRT <213> Salmonella typhimurium <400> 3 Met Ala Asp Ile Leu Leu Leu Asp Asn Ile Asp Ser Phe Thr Trp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Asp Gln Leu Arg Thr Asn Gly His Asn Val Val Ile Tyr Arg 20 25 30 Asn His Ile Pro Ala Gln Thr Leu Ile Asp Arg Leu Ala Thr Met Lys 35 40 45 Asn Pro Val Leu Met Leu Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro Ser Glu Ala 50 55 60 Gly Cys Met Pro Glu Leu Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Pro Ile 65 70 75 80 Ile Gly Ile Cys Leu Gly His Gln Ala Ile Val Glu Ala Tyr Gly Gly 85 90 95 Tyr Val Gly Gln Ala Gly Glu Ile Leu His Gly Lys Ala Ser Ser Ile 100 105 110 Glu His Asp Gly Gln Ala Met Phe Ala Gly Leu Ala Asn Pro Leu Pro 115 120 125 Val Ala Arg Tyr His Ser Leu Val Gly Ser Asn Val Pro Ala Gly Leu 130 135 140 Thr Ile Asn Ala His Phe Asn Gly Met Val Met Ala Val Arg His Asp 145 150 155 160 Ala Asp Arg Val Cys Gly Phe Gln Phe His Pro Glu Ser Ile Leu Thr 165 170 175 Thr Gln Gly Ala Arg Leu Leu Glu Gln Thr Leu Ala Trp Ala Gln Gln 180 185 190 Lys Leu Glu Pro Thr Asn Thr Leu Gln Pro Ile Leu Glu Lys Leu Tyr 195 200 205 Gln Ala Gln Thr Leu Thr Gln Gln Glu Ser His Gln Leu Phe Ser Ala 210 215 220 Val Val Arg Gly Glu Leu Lys Pro Glu Gln Leu Ala Ala Ala Leu Val 225 230 235 240 Ser Met Lys Ile Arg Gly Glu His Pro Asn Glu Ile Ala Gly Ala Ala 245 250 255 Thr Ala Leu Leu Glu Asn Ala Ala Pro Phe Pro Arg Pro Glu Tyr Leu 260 265 270 Phe Ala Asp Ile Val Gly Thr Gly Gly Asp Gly Ser Asn Ser Ile Asn 275 280 285 Ile Ser Thr Ala Ser Ala Phe Val Ala Ala Ala Cys Gly Leu Lys Val 290 295 300 Ala Lys His Gly Asn Arg Ser Val Ser Ser Lys Ser Gly Ser Ser Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Ala Phe Gly Ile Asn Leu Asp Met Asn Ala Asp Lys Ser 325 330 335 Arg Gln Ala Leu Asp Glu Leu Gly Val Cys Phe Leu Phe Ala Pro Lys 340 345 350 Tyr His Thr Gly Leu Arg His Ala Met Pro Val Arg Gln Gln Leu Lys 355 360 365 Thr Arg Thr Leu Phe Asn Val Leu Gly Pro Leu Ile Asn Pro Ala His 370 375 380 Pro Pro Leu Ala Leu Ile Gly Val Tyr Ser Pro Glu Leu Val Leu Pro 385 390 395 400 Ile Ala Glu Thr Leu Arg Val Leu Gly Tyr Gln Arg Ala Ala Val Val 405 410 415 His Ser Gly Gly Met Asp Glu Val Ser Leu His Ala Pro Thr Ile Val 420 425 430 Ala Glu Leu His Asp Gly Glu Ile Lys Ser Tyr Gln Leu Thr Ala Glu 435 440 445 Asp Phe Gly Leu Thr Pro Tyr His Gln Asp Gln Leu Ala Gly Gly Thr 450 455 460 Pro Glu Glu Asn Arg Asp Ile Leu Thr Arg Leu Leu Gln Gly Lys Gly 465 470 475 480 Asp Ala Ala His Glu Ala Ala Val Ala Ala Asn Val Ala Met Leu Met 485 490 495 Arg Leu His Gly Gln Glu Asp Leu Lys Ala Asn Ala Gln Thr Val Leu 500 505 510 Asp Val Leu Arg Asn Gly Thr Ala Tyr Asp Arg Val Thr Ala Leu Ala 515 520 525 Ala Arg Gly 530 <210> 4 <211> 189 <212> PRT <213> Cupriavidus necator <400> 4 Met Leu Leu Met Ile Asp Asn Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr Asn Leu Val 1 5 10 15 Gln Tyr Phe Gly Glu Leu Gly Glu Asp Val Arg Thr Tyr Arg Asn Asp 20 25 30 Glu Ile Thr Ile Glu Glu Ile Glu Ala Leu Lys Pro Asp His Ile Cys 35 40 45 Val Ser Pro Gly Pro Cys Ser Pro Lys Glu Ala Gly Ile Ser Val Ala 50 55 60 Ala Leu Gln His Phe Ala Gly Lys Ile Pro Leu Leu Gly Val Cys Leu 65 70 75 80 Gly His Gln Ala Ile Gly Glu Ala Phe Gly Gly Lys Val Ile Arg Ala 85 90 95 Lys Gln Val Met His Gly Lys Val Ser Thr Ile Glu Thr Thr Gln Gln 100 105 110 Gly Val Phe Ala Gly Leu Pro Arg His Phe Asp Val Thr Arg Tyr His 115 120 125 Ser Leu Ala Ile Glu Arg Glu Thr Leu Pro Asp Cys Leu Glu Ile Thr 130 135 140 Ala Trp Thr Pro Asp Gly Glu Ile Met Gly Val Arg His Lys Thr Leu 145 150 155 160 Ala Val Glu Gly Val Gln Phe His Pro Glu Ser Ile Leu Ser Glu His 165 170 175 Gly His Ala Leu Leu Ala Asn Phe Val Lys Ala Pro Arg 180 185 <210> 5 <211> 208 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 Met Thr His Val Val Leu Ile Asp Asn His Asp Ser Phe Val Tyr Asn 1 5 10 15 Leu Val Asp Ala Phe Ala Val Ala Gly Tyr Lys Cys Thr Val Phe Arg 20 25 30 Asn Thr Val Pro Val Glu Thr Ile Leu Ala Ala Asn Pro Asp Leu Ile 35 40 45 Cys Leu Ser Pro Gly Pro Gly Tyr Pro Ala Asp Ala Gly Asn Met Met 50 55 60 Ala Leu Ile Glu Arg Thr Leu Gly Gln Ile Pro Leu Leu Gly Ile Cys 65 70 75 80 Leu Gly Tyr Gln Ala Leu Ile Glu Tyr His Gly Gly Lys Val Glu Pro 85 90 95 Cys Gly Pro Val His Gly Thr Thr Asp Asn Met Ile Leu Thr Asp Ala 100 105 110 Gly Val Gln Ser Pro Val Phe Ala Gly Leu Ala Thr Asp Val Glu Pro 115 120 125 Asp His Pro Glu Ile Pro Gly Arg Lys Val Pro Ile Gly Arg Tyr His 130 135 140 Ser Leu Gly Cys Val Val Ala Pro Asp Gly Ile Glu Ser Leu Gly Thr 145 150 155 160 Cys Ser Ser Glu Ile Gly Asp Val Ile Met Ala Ala Arg Thr Thr Asp 165 170 175 Gly Lys Ala Ile Gly Leu Gln Phe His Pro Glu Ser Val Leu Ser Pro 180 185 190 Thr Gly Pro Val Ile Leu Ser Arg Cys Val Glu Gln Leu Leu Ala Asn 195 200 205 <210> 6 <211> 338 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 6 Met Asn Arg Phe Leu Gln Leu Cys Val Asp Gly Lys Thr Leu Thr Ala 1 5 10 15 Gly Glu Ala Glu Thr Leu Met Asn Met Met Met Ala Ala Glu Met Thr 20 25 30 Pro Ser Glu Met Gly Gly Ile Leu Ser Ile Leu Ala His Arg Gly Glu 35 40 45 Thr Pro Glu Glu Leu Ala Gly Phe Val Lys Ala Met Arg Ala His Ala 50 55 60 Leu Thr Val Asp Gly Leu Pro Asp Ile Val Asp Thr Cys Gly Thr Gly 65 70 75 80 Gly Asp Gly Ile Ser Thr Phe Asn Ile Ser Thr Ala Ser Ala Ile Val 85 90 95 Ala Ser Ala Ala Gly Ala Lys Ile Ala Lys His Gly Asn Arg Ser Val 100 105 110 Ser Ser Lys Ser Gly Ser Ala Asp Val Leu Glu Glu Leu Glu Val Ser 115 120 125 Ile Gln Thr Thr Pro Glu Lys Val Lys Ser Ser Ile Glu Thr Asn Asn 130 135 140 Met Gly Phe Leu Phe Ala Pro Leu Tyr His Ser Ser Met Lys His Val 145 150 155 160 Ala Gly Thr Arg Lys Glu Leu Gly Phe Arg Thr Val Phe Asn Leu Leu 165 170 175 Gly Pro Leu Ser Asn Pro Leu Gln Ala Lys Arg Gln Val Ile Gly Val 180 185 190 Tyr Ser Val Glu Lys Ala Gly Leu Met Ala Ser Ala Leu Glu Thr Phe 195 200 205 Gln Pro Lys His Val Met Phe Val Ser Ser Arg Asp Gly Leu Asp Glu 210 215 220 Leu Ser Ile Thr Ala Pro Thr Asp Val Ile Glu Leu Lys Asp Gly Glu 225 230 235 240 Arg Arg Glu Tyr Thr Val Ser Pro Glu Asp Phe Gly Phe Thr Asn Gly 245 250 255 Arg Leu Glu Asp Leu Gln Val Gln Ser Pro Lys Glu Ser Ala Tyr Leu 260 265 270 Ile Gln Asn Ile Phe Glu Asn Lys Ser Ser Ser Ser Ala Leu Ser Ile 275 280 285 Thr Ala Phe Asn Ala Gly Ala Ala Ile Tyr Thr Ala Gly Ile Thr Ala 290 295 300 Ser Leu Lys Glu Gly Thr Glu Leu Ala Leu Glu Thr Ile Thr Ser Gly 305 310 315 320 Gly Ala Ala Ala Gln Leu Glu Arg Leu Lys Gln Lys Glu Glu Glu Ile 325 330 335 Tyr Ala <210> 7 <211> 341 <212> PRT <213> Cupriavidus necator <400> 7 Met Ile Thr Pro Gln Glu Ala Leu Thr Arg Cys Ile Glu His Arg Glu 1 5 10 15 Ile Phe His Asp Glu Met Leu His Leu Met Arg Gln Ile Met Gln Gly 20 25 30 Gln Ile Ser Pro Val Met Ala Ala Ala Ile Leu Thr Gly Leu Arg Val 35 40 45 Lys Lys Glu Thr Ile Gly Glu Ile Ser Ala Ala Ala Gln Val Met Arg 50 55 60 Glu Phe Ala Asn Lys Val Pro Val Ala Asp Arg Glu Asn Phe Val Asp 65 70 75 80 Ile Val Gly Thr Gly Gly Asp Gly Ser His Thr Phe Asn Ile Ser Thr 85 90 95 Ala Ser Met Phe Val Ala Ala Ala Ala Gly Ala Lys Ile Ala Lys His 100 105 110 Gly Asn Arg Gly Val Ser Ser Lys Ser Gly Ser Ala Asp Val Leu Glu 115 120 125 Ala Leu Gly Val Asn Ile Met Leu Thr Pro Glu Gln Val Gly Gln Cys 130 135 140 Ile Glu Glu Thr Gly Ile Gly Phe Met Phe Ala Pro Thr His His Pro 145 150 155 160 Ala Met Lys Asn Val Ala Pro Ile Arg Lys Glu Met Gly Val Arg Thr 165 170 175 Ile Phe Asn Ile Leu Gly Pro Leu Thr Asn Pro Ala Asp Ala Pro Asn 180 185 190 Ile Leu Met Gly Val Phe His Pro Asp Leu Val Gly Ile Gln Val Arg 195 200 205 Val Met Gln Arg Leu Gly Ala Lys His Ala Ile Val Val Tyr Gly Lys 210 215 220 Asp Gly Met Asp Glu Val Ser Leu Gly Ala Ala Thr Leu Val Gly Glu 225 230 235 240 Leu Lys Asp Gly Glu Val Arg Glu Tyr Glu Ile His Pro Glu Asp Phe 245 250 255 Gly Leu Gln Met Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Val Ala Asp Ala Thr 260 265 270 Glu Ser Lys Glu Met Leu Leu Glu Ala Leu Thr Asn Val Pro Gly Thr 275 280 285 Pro Arg Glu Ile Val Ser Leu Asn Ala Gly Thr Ala Leu Tyr Ala Ala 290 295 300 Asn Val Ala Asp Ser Val Glu Asp Gly Ile Arg Arg Ala Arg Glu Ala 305 310 315 320 Ile Ala Ser Gly Ala Ala Gln Glu Lys Leu Asp Gln Phe Val Arg Ala 325 330 335 Thr Gln Gln Phe Lys 340 <210> 8 <211> 348 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8 Met Thr Ser Pro Ala Thr Leu Lys Val Leu Asn Ala Tyr Leu Asp Asn 1 5 10 15 Pro Thr Pro Thr Leu Glu Glu Ala Ile Glu Val Phe Thr Pro Leu Thr 20 25 30 Val Gly Glu Tyr Asp Asp Val His Ile Ala Ala Leu Leu Ala Thr Ile 35 40 45 Arg Thr Arg Gly Glu Gln Phe Ala Asp Ile Ala Gly Ala Ala Lys Ala 50 55 60 Phe Leu Ala Ala Ala Arg Pro Phe Pro Ile Thr Gly Ala Gly Leu Leu 65 70 75 80 Asp Ser Ala Gly Thr Gly Gly Asp Gly Ala Asn Thr Ile Asn Ile Thr 85 90 95 Thr Gly Ala Ser Leu Ile Ala Ala Ser Gly Gly Val Lys Leu Val Lys 100 105 110 His Gly Asn Arg Ser Val Ser Ser Lys Ser Gly Ser Ala Asp Val Leu 115 120 125 Glu Ala Leu Asn Ile Pro Leu Gly Leu Asp Val Asp Arg Ala Val Lys 130 135 140 Trp Phe Glu Ala Ser Asn Phe Thr Phe Leu Phe Ala Pro Ala Tyr Asn 145 150 155 160 Pro Ala Ile Ala His Val Gln Pro Val Arg Gln Ala Leu Lys Phe Pro 165 170 175 Thr Ile Phe Asn Thr Leu Gly Pro Leu Leu Ser Pro Ala Arg Pro Glu 180 185 190 Arg Gln Ile Met Gly Val Ala Asn Ala Asn His Gly Gln Leu Ile Ala 195 200 205 Glu Val Phe Arg Glu Leu Gly Arg Thr Arg Ala Leu Val Val His Gly 210 215 220 Ala Gly Thr Asp Glu Ile Ala Val His Gly Thr Thr Leu Val Trp Glu 225 230 235 240 Leu Lys Glu Asp Gly Thr Ile Glu His Tyr Thr Ile Glu Pro Glu Asp 245 250 255 Leu Gly Leu Gly Arg Tyr Thr Leu Glu Asp Leu Val Gly Gly Leu Gly 260 265 270 Thr Glu Asn Ala Glu Ala Met Arg Ala Thr Phe Ala Gly Thr Gly Pro 275 280 285 Asp Ala His Arg Asp Ala Leu Ala Ala Ser Ala Gly Ala Met Phe Tyr 290 295 300 Leu Asn Gly Asp Val Asp Ser Leu Lys Asp Gly Ala Gln Lys Ala Leu 305 310 315 320 Ser Leu Leu Ala Asp Gly Thr Thr Gln Ala Trp Leu Ala Lys His Glu 325 330 335 Glu Ile Asp Tyr Ser Glu Lys Glu Ser Ser Asn Asp 340 345 <210> 9 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 9 gcgcagcaga aactagagcc agccaacacg ctgcaaccga ttctgtaagt gtaggctgga 60 gctgcttc 68 <210> 10 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 10 aatcgccttg tctgcgacga ttttcgctaa aacggtttgc atcatatggg aattagccat 60 ggtcc 65 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 11 agtatggcta gcttaccctc gtgccgccag tg 32 <210> 12 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 12 gactagaagc ttcctctaga aataattttg tttaacttta agaaggagaa tcgatatgaa 60 cacgctgcaa ccgattctg 79

Claims (16)

  1. 재조합 박테리아를 배양하고, 선택적으로 안트라닐산을 회수하는 단계를 포함하는 안트라닐산의 생산 방법으로서, 상기 재조합 박테리아의 상응하는 비변형 박테리아는 TrpG 및 TrpD 활성을 나타내는 이관능성 단백질을 발현하고, 상기 재조합 박테리아는, (i) 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성(TrpG)을 나타내고 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않는 폴리펩티드, 및 (ii) 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성(TrpD)을 나타내고 글루타민 아미도트랜스퍼라제 활성을 나타내지 않는 폴리펩티드를 각각(seperately) 발현하고 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 활성과 안트라닐레이트 신타제 활성 사이의 비율이 비변형 박테리아와 비교하여 감소되도록 유전적으로 변형되며, 상기 재조합 박테리아는 트립토판이 결핍된 배양 배지에서 성장할 수 있는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는, 내인성 이관능성 단백질 TrpGD의 TrpD 도메인의 발현을 억제하도록, 바람직하게는 상기 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 삭제함으로써, 유전적으로 변형되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는, 내인성 이관능성 단백질 TrpGD의 발현을 억제하도록, 바람직하게는 상기 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 전부 또는 일부를 삭제함으로써, 유전적으로 변형되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 박테리아는 대장균(Escherichia coli)인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는,
    (i) 제1 프로모터의 제어 하에 글루타민 아미도트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 유전자 또는 제1 오페론을 포함하는 재조합 핵산으로, 상기 제1 오페론이 TrpG를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열 및 선택적으로 안트라닐레이트 신타제(TrpE)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산을 포함하고/포함하거나,
    (ii) 제2 프로모터의 제어 하에, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 유전자 또는 제2 오페론을 포함하는 재조합 핵산으로서, 상기 제2 오페론은 TrpD를 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산, 을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1 프로모터는 변형되지 않은 박테리아에서 TrpG를 인코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 프로모터 이고/이거나, 제2 프로모터는 변형되지 않은 박테리아에서 TrpD를 인코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되지 않은 프로모터인, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 제2 오페론은, 인돌 -3-글리세롤 포스페이트 신타제(TrpC)를 인코딩하는 핵산 서열, 포스포리보실 안트라닐레이트 이성화 효소(TrpF)를 인코딩하는 핵산 서열, 트립토판 신타제(TrpA)의 α 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열, 및/또는 트립토판 신타제(TrpB)의 β 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는, 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 프로모터는 제2 프로모터보다 강한, 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는 동일한 프로모터의 제어 하에 글루타민 아미도 트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 유전자 및 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 유전자를 포함하여, 2개의 별개의 단백질 TrpG 및 TrpD를 발현시키는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는 또한, 피드백 내성 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제를 인코딩하는 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형되고/되거나, 트랜스케톨라제 효소를 인코딩하는 내인성 유전자를 과발현하거나 트랜스케톨라제 효소를 인코딩하는 이종 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형되며, 바람직하게는 피드백 내성 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제를 인코딩하는 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형되고 트랜스케톨라제 효소를 인코딩하는 내인성 유전자를 과발현하도록 유전적으로 변형되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는, 트립토판 또는 임의의 트립토판 공급원이 결여된 배양 배지에서 배양되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는 탄소원으로서 글루코스의 존재 하에서 48시간 동안, 2L 유가식 발효기에서 배양될 때 적어도 1 g/L의 안트라닐레이트, 또는 20L 유가식 발효기에서 배양될 때 적어도 4 g/L의 안트라닐레이트를 생산할 수 있는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에서 정의된 재조합 박테리아.
  14. 제13항에 있어서,
    제1 프로모터의 제어 하에 글루타민 아미도트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 핵산 서열 및 제2 프로모터의 제어 하에 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 변형된 대장균 박테리아인, 재조합 박테리아.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아는, (i) 제1 프로모터의 제어 하에, 글루타민 아미도 트랜스퍼라제(TrpG)를 인코딩하는 유전자 또는 제1 오페론을 포함하고, 여기서, 상기 제1 오페론은 적어도 TrpG를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고 선택적으로 안트라닐레이트 신타제(TrpE)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, (ii) 제2 프로모터의 제어 하에, 안트라닐레이트 포스포리보실 트랜스퍼라제(TrpD)를 인코딩하는 유전자 또는 제2 오페론을 포함하고, 여기서, 상기 제2 오페론은 적어도 TrpD를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고 선택적으로 인돌-3-글리세롤 포스페이트 신타제(TrpC)를 인코딩하는 핵산 서열, 포스포리보실안트라닐레이트 이성화효소(TrpF)를 인코딩하는 핵산 서열, 트립토판 신타제(TrpA)의 α 서브유닛을 인코딩하는 핵산 서열, 및/또는 트립토판 신타제(TrpB)의 β서브유닛 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 박테리아.
  16. 안트라닐산을 생산하기 위한 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 재조합 박테리아의 용도.
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