CN112779201B

CN112779201B - 重组微生物及其用途、制备莽草酸和奥司他韦的方法

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Publication number: CN112779201B
Application number: CN202110049963.0A
Authority: CN
Inventors: 蔡燕丰; 徐宇骋; 谢文平; 刘翠翠; 王鑫鑫; 梁在华; 温素萍; 鲍素敏
Original assignee: Yichang Dongyangguang Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Yichang Dongyangguang Biochemical Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2021-01-14
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2041-01-14
Also published as: CN112779201A

Abstract

本发明涉及用于生产莽草酸的重组微生物、该微生物在制备莽草酸中的用途、制备莽草酸的方法和制备奥司他韦的方法。所述重组微生物的PTS系统和莽草酸激酶被下调，并且所述重组微生物的3‑脱氢奎尼酸合成酶、3‑脱氢奎尼酸脱水酶、3‑脱氧‑D‑阿拉伯庚酮糖‑7‑磷酸合成酶、莽草酸脱氢酶、转酮醇酶I、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶被上调，其中，所述重组微生物进一步携带编码下列至少之一的外源核酸：(A)外源肌醇转运蛋白或其功能类似物；和(B)外源葡萄糖转运蛋白或其功能类似物。利用该重组微生物能够有效地生产莽草酸。

Description

重组微生物及其用途、制备莽草酸和奥司他韦的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及用于生产莽草酸的重组微生物、该微生物在制备莽草酸中的用途、制备莽草酸的方法和制备奥司他韦的方法。

背景技术

莽草酸(shikimic acid，在本文中有时简称为“SA”)是一种小分子有机酸，其具有下列化学结构：

莽草酸是多种重要化合物的关键中间体，例如芳香族氨基酸、泛酸、叶酸和维生素K12等芳香族化合物。另外，莽草酸是合成某些吲哚衍生物、生物碱和某些手性(如抗病毒药物)的重要前体，具有广泛的药用价值。目前，莽草酸也是合成抗病毒药物磷酸奥司他韦(达菲)的关键中间体。

在2005年世界禽流感大规模爆发时，以及H7N9型禽流感爆发期间，达菲对这些高致病性流感病毒均表现出了良好的治疗效果，被作为特效药身价倍增，莽草酸作为合成磷酸奥司他韦的前体，也因此备受关注。据相关数据显示，2014年全球达菲销售市场达10.50亿美元。而莽草酸的市场售价可从平时的$40/kg上涨至禽流感爆发时的$1,000/kg，而高纯度SA价格更是高达$50/g。由此可知，莽草酸的市场规模和销售前景是非常大。

莽草酸广泛存在于多种植物中，在木兰科植物八角茴香中含量较高，可达成熟干重的10％。野生八角中莽草酸含量较高，是很好的植物提取来源，所以现多采用可食用的八角进行工业提取。但由于其分布较为狭窄，仅在我国广西、福建等地区和越南部分地区分布，来源较为单一且具有季节性。另外，植物提取生产工艺复杂，得率较低，原料易受季节气候等因素限制，产量及价格波动较大，难以满足大规模生产需求。

莽草酸及其类似物也可通过化学方法合成，奎宁酸转化法则以奎宁酸衍生物和2,2-二甲基丙烷作为原初物质进行合成，其总收率最高可达62％。化学法虽然收率和纯度较高，但受原料来源限制，生产成本过高和化学废物难处理等因素的制约，并未得到广泛应用，因此，利用微生物来生产莽草酸具有极广阔的应用前景。

虽然已有诸多学者在大肠杆菌中构建莽草酸的表达途径，但部分菌株的表达需要IPTG和变温诱导，增加了大规模生产的成本与难度，且都未能够突破生产效率的瓶颈，也并未进行工业实验，仅停留在实验室阶段，离工业化应用尚有较大差距。由此，目前利用基因工程改造微生物合成莽草酸的手段仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。由此，本发明提出了一种能够有效提高生产莽草酸效率，尤其是对于大体积液体发酵生产莽草酸能够有效提高生产效率的重组微生物。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种用于生产莽草酸的重组微生物，根据本发明的实施例，所述重组微生物的PTS系统和莽草酸激酶被下调，并且所述重组微生物的3-脱氢奎尼酸合成酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶、莽草酸脱氢酶、转酮醇酶I、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶被上调，其中，所述重组微生物进一步携带编码下列至少之一的外源核酸：(A)外源肌醇转运蛋白或其功能类似物；和(B)外源葡萄糖转运蛋白或其功能类似物。根据本发明的实施例，利用该重组微生物能够有效地生产莽草酸。

根据本发明的实施例，上述重组微生物还可以进一步具有下列附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，编码所述外源肌醇转运蛋白的外源核酸为iolT1和iolT2的至少之一。

根据本发明的实施例，所述外源外源核酸为源自谷氨酸棒杆菌的iolT1。

根据本发明的实施例，编码所述葡萄糖转运蛋白的外源核酸包括源自运动发酵单胞菌的glf和glk的至少之一。

根据本发明的实施例，所述外源核酸整合在所述重组微生物的基因组中。

根据本发明的实施例，所述外源核酸分别独立地插入至所述莽草酸激酶和所述PTS系统至少之一对应的位点中，并且阻断所述莽草酸激酶和所述PTS系统至少之一的表达。

根据本发明的实施例，编码所述莽草酸激酶的基因包括aroL和aroK，所述PTS系统包括ptsHIcrr操纵子。

根据本发明的实施例，所述外源核酸可操作地与启动子相连，所述启动子包括选自大肠杆菌来源启动子、T7、tac、trc、lac和trp启动子的至少之一。

根据本发明的实施例，所述启动子为组成型T7启动子。

根据本发明的实施例，所述重组微生物的基因组中整合有依次串联的第一组成型T7启动子、iolT1、第二组成型T7启动子、glf和glk。

根据本发明的实施例，所述重组微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母，优选大肠杆菌。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种表达载体，所述表达载体整合有依次串联的第一组成型T7启动子、iolT1、第二组成型T7启动子、glf和glk。

在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的重组微生物在制备莽草酸中的用途。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种制备莽草酸的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：前面的重组微生物进行液体培养；和从所述液体培养的培养产物中分离莽草酸。根据本发明的实施例，利用该方法能够有效地制备莽草酸。

根据本发明的实施例，上述制备莽草酸的方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述液体培养包括：菌体生长阶段，所述菌体生长阶段是在约37摄氏度下进行10～30小时；莽草酸合成阶段，所述莽草酸合成阶段是在约28～33摄氏度下进行的。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备奥司他韦的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：按照前面所述的方法，制备莽草酸；和利用所述莽草酸作为中间体，合成奥司他韦。根据本发明的实施例，利用该方法能够有效地制备奥司他韦。

根据本发明的实施例，发明人惊奇地发现，通过采用本发明的重组微生物，相对于未经本发明提出方案改造的出发菌株，生产莽草酸的能力可以得到有效地提高，尤其是当表达外源的谷氨酸棒杆菌来源的肌醇转运蛋白时，莽草酸的产量与出发菌株相比可以提高达到大约16％。另外，根据本发明的实施例，通过采用外源葡萄糖转运蛋白以及肌醇转运蛋白采用T7强启动子联合表达，所得到的微生物的碳源摄取能力进一步加强，最终的莽草酸产量也得到了可观的水平，与出发菌株相比，莽草酸产量在5L罐水平提高了25％。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了莽草酸代谢途径的路线图。

图2显示了根据本发明实施例重组微生物中经过改造的莽草酸代谢途径。

图3显示了根据本发明实施例的CRISPR-Cas9系统两个基本质粒pCas-lac和pTargetF2的结构示意图。

图4显示了根据本发明实施例的敲除质粒pTargetF2-ptsH的结构示意图。

图5显示了根据本发明实施例的ptsHIcrr-T7-glf-glk-Donor的结构示意图。

图6显示了根据本发明实施例的ptsHIcrr-T7-iolT1-Donor的结构示意图。

图7显示了根据本发明实施例的ptsHIcrr-T7-iolT2-Donor的结构示意图。

图8显示了根据本发明实施例的ptsHIcrr-T7-iolT1-T7-glf-glk-Donor的结构示意图。

图9显示了根据本发明实施例的pSA-14质粒的结构示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

定义

如无特别说明，在本文中使用的术语或表达方式具有下列的含义。

在本文中使用的术语“重组微生物”指代如下的微生物，所述微生物经遗传修饰或者遗传改造以便内源核酸的序列或者表达发生改变、或表达外源核酸(外源核酸可以包含在载体中也可以整合在微生物的基因组中)。其中，所谓“改变”是指基因的表达、或RNA分子水平或编码一种或多种多肽或多肽亚单位的等效RNA分子水平、或一种或多种多肽或多肽亚单位的活性被上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在没有该变化时所观察到的。

在本文中使用的术语“出发菌株”是指可以进行遗传修饰或者遗传改造，从而获得重组微生物的菌株。例如，出发菌株可以是野生型菌株，也可以是已经事先进行了一个或者多个遗传修饰或者遗传改造与野生型菌株相比已经发生核酸改变的菌株。在本文中，出发菌株的类型并不受特别限制，其中，优选CN111057675A中所公开的ESA-pSA-14作为出发菌株。

在本文中使用的术语“外源”是指在出发菌株中原始并不存在的物质，或者与出发菌株中对应的物质有所区别的物质，例如在出发菌株中不存在的核酸，或者与出发菌株中的相应基因序列相比存在突变的核酸。根据本发明的实施例，“外源核酸”包括来自与出发菌株相同物种的核酸，也包括异源核酸(即来自与出发菌株不同物种的核酸)。

在本文中使用的术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指由两种或更多种单体(包括核苷酸、核苷或其类似物)组成的有机聚合物，包括但不限于任意长度的单链或双链、有义或反义脱氧核糖核酸(DNA)，有义或反义核糖核酸(RNA)包括siRNA。术语“核苷酸”是指由结合到嘌呤或嘧啶碱基并结合到磷酸基团的核糖或脱氧核糖组成的多种化合物的任一种，并且它们是核酸的基本结构单元。术语“核苷”是指由与脱氧核糖或核糖组合的嘌呤或嘧啶碱基组成的化合物(如鸟苷或腺苷)，并且其存在于核酸中。

应当理解，本文描述的“核酸”的含义中包括“基因”，并且本文描述的核酸还包括“载体”或“质粒”。

在本文中所使用的术语“基因”，是指编码特定氨基酸序列的多核苷酸，其包含一种或多种蛋白质或酶的全部或部分，并且可以包括调节性(非转录的)DNA序列，诸如启动子序列，其确定例如在何种条件下表达基因。基因的转录区可以包括非翻译区(包括内含子、5'-非翻译区(UTR)和3'UTR)以及编码序列。

在本文中使用的术语“PTS系统”是指磷酸烯醇丙酮酸(PEP)-磷酸转移酶系统(PTS)，其普遍存在于细菌、真菌和一些古细菌中。截至目前，在已研究物种中PTS的基本组成都比较相似，基本上都由两个胞质磷酸转移酶[酶I(EI)和组氨酸磷酸载体蛋白(HPr)]以及糖特异性酶II复合物(EIIA，EIIB，EIIC，EIID)组成。其中，编码EI和HPr蛋白的基因通常在同一个操纵子上，即ptsHIcrr操纵子。

在本文中使用的术语“莽草酸途径”是指莽草酸途径是微生物中芳香族化合物生物合成的主要途径。参考图1，该途径起始于D-赤藓糖-4-磷酸(E4P)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，经3-脱氧-δ-阿拉伯糖庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶(AroG/F/H)催化，羟醛缩合生成DAHP，其中E4P来源于戊糖磷酸途径，PEP来源于糖酵解途径。DAHP在3-脱氢奎尼酸合成酶(AroB)作用下去磷酸，分子内羟醛缩合生成3-脱氢奎尼酸(DHQ)。随后，DHQ在3-脱氢奎尼酸脱水酶(AroD)作用下，脱一分子H₂O生成3-脱氢莽草酸(DHS)，最后，莽草酸脱氢酶(AroE)催化DHS生成莽草酸(SA或SHK)，伴随着副产物奎尼酸的生成，而奎尼酸多以游离、酯化、生物碱结合等形式存在。在分支途径中，DHS经脱H₂O、烯醇化反应，可生成原儿茶酸，或脱氢、烯醇化反应合成没食子酸。在莽草酸激酶(AroK/AroL)的催化下，莽草酸磷酸化生成莽草酸-3-磷酸(S3P)。S3P在5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合成酶(,AroA)催化下，与PEP缩合，生成5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)。EPSP在分支酸合成酶(AroC)催化下，去磷酸形成分支酸(CHA)。CHA是芳香族氨基酸L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-色氨酸(L-Trp)生物合成途径到分支点。

在本文中使用的术语“aroB”是指3-脱氢奎尼酸合成酶对应基因。

在本文中使用的术语“aroD”是指3-脱氢奎尼酸脱水酶对应基因。

本文中使用的术语“aroF”是指3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶对应基因。

在本文中使用的术语“aroE”是指莽草酸脱氢酶对应基因。

在本文中使用的术语“tktA”是指转酮醇酶I对应基因。

在本文中使用的术语“ppsA”是指磷酸烯醇式丙酮酸合成酶对应基因。

在本文中使用的术语“上调”是指特定功能蛋白的活性与出发菌株的相应活性相比得到升高，其可以通过增加该特定功能蛋白在微生物细胞内的表达量(例如额外转入编码该功能蛋白的外源核酸，也可以通过调整该功能蛋白编码核酸的调控元件诸如启动子等)，也可以通过也可以通过改造该功能蛋白的氨基酸序列使其生物活性得到提高。

在本文中使用的术语“下调”是指是指特定功能蛋白的活性与出发菌株的相应活性相比得到下降，其可以通过降低该特定功能蛋白在微生物细胞内的表达量(例如敲除编码该功能蛋白的核酸，也可以通过调整该功能蛋白编码核酸的调控元件诸如启动子等)，也可以通过也可以通过改造该功能蛋白的氨基酸序列使其生物活性得到降低。例如，根据本发明的实施例，可以完全敲除ptsHIcrr操纵子，也可以在该位点插入额外的外源核酸例如aroB、aroD、aroE或ppsA，从而破坏原有ptsHIcrr操纵子的功能，同时可以实现引入额外的功能蛋白。

在本文中所提到的“上调”或“下调”可以是组成型的，例如由于稳定的永久转基因表达，或者由于编码核酸或核酸的相应内源基因的稳定突变，或者由于对赋予多肽或用于多肽表达的基因的表达或行为的调控；也可以是瞬时的，例如由于瞬时转化或临时添加调节物(如激动剂或拮抗剂)；或者是可诱导型的，例如用携带位于诱导型启动子控制下的核酸分子或可诱导构建体转化并加入诱导物。

在本文中使用的术语“表达”是指编码基因片段或基因的转录和/或翻译。通常，所得到的产物是mRNA或者蛋白质。然而，表达产物也可包括功能性RNA，如反义链核酸、tRNA、snRNA、rRNA、RNAi、siRNA、核酶等。表达可以是整体的、局部的或瞬时的，例如局限于特定细胞类型、组织、器官或时间阶段。

在本文中使用的术语“插入对应的位点”是指在原有基因的位点额外引入其他的外源核酸，从而使得外源核酸可以整合到微生物的基因组中，从而发挥功能。

在本文中使用的术语“阻断”是指原有基因在被修饰或者改造后，不再发挥原有功能，或者原有功能被下调。

在本文中使用的术语“操纵子”是指由共同的启动子作为单一转录单元而转录的两种或更多种基因。在一些实施方案中，构成操纵子的基因是相邻的基因。应当理解，可以通过修饰该共同的启动子而改变整个操纵子的转录(即，增加、减少或消除)。作为另外一种选择，可以修饰操纵子中的任何基因或基因的组合以改变所编码的多肽的功能或活性。。

在本文中使用的术语“启动子”是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，通常启动子本身不被转录。启动子位于控制基因表达的调控序列中、基因转录起始位点的上游(朝向DNA正义链的5′方向)，长约100～1000个碱基对。通常用于微生物基因工程的启动子根据其作用方式及功能分为三类：组成型启动子(在多数或全部组织中保持持续的活性)、特异型启动子(组织特异性或者发育时期的特异性)和诱导型启动子(受外界化学或物理信号调控)。

在本文中使用的术语“可操作地与启动子相连”是指与启动子相连的核酸分子能够受到启动子的控制。

在本文中使用的术语“约”是指数值上下浮动5％范围内。例如数值为约100的含义是该数值可以为100上下浮动5。

重组微生物和表达载体

根据本发明的实施例，发明人发现，参考图2，通过下调微生物的PTS系统和上调磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，可以提高磷酸烯醇式丙酮酸的合成量，另外，通过上调3-脱氢奎尼酸合成酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶、莽草酸脱氢酶、转酮醇酶I，可以提高莽草酸(SA或SHK)的合成量。另外通过下调莽草酸激酶(例如AroL和AroK)，可以减少莽草酸的消耗，从而最终提高了莽草酸的积累量。

根据本发明的实施例，所述3-脱氢奎尼酸合成酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶、莽草酸脱氢酶、转酮醇酶I、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶是通过控制其相对应的基因，进而控制其含量的，例如，通过上调aroB的表达上调3-脱氢奎尼酸合成酶，上调aroD的表达上调3-脱氢奎尼酸脱水酶，上调aroF的表达上调3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶，上调aroE的表达上调莽草酸脱氢酶，上调tktA的表达上调转酮醇酶I，上调ppsA的表达上调磷酸烯醇式丙酮酸合成酶。

根据本发明的实施例，所述控制相对基因是通过基因沉默或使基因过表达的方式实现的。例如，通过基因沉默的方式使aroL和aroK基因下调，进而下调莽草酸激酶。所述基因沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR/Cas9和锌指核酸酶至少之一实现的。优选地，所述基因沉默是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现的。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除部分或全部aroK或aroL基因片段，实现aroK或aroL基因的沉默，脱靶效率低，沉默效率高。

需要说明的是，本申请所述的“基因沉默”既可以指基因功能区的沉默，也可指基因启动子的沉默，只要是基因不表达或表达量极低，均在本申请“基因沉默”的限定范围内。

根据本发明的实施例，所述基因上调是通过过表达的方式实现的，例如，将表达载体导入待改造微生物细胞，所述表达载体携带aroB、aroD、aroE、aroF或tktA基因的至少之一；在适宜基因表达的条件下，对所述待改造微生物细胞进行培养。根据本发明实施例的上述基因上调方式，表达载体中所携带的aroB、aroD、aroE、aroF或tktA基因可整合入工程菌的基因组，随着工程菌基因组的复制而复制或表达载体在工程菌细胞内自由复制，通过这两种方式均可有效实现上述基因在待改造菌株细胞内的过表达，进而实现相应蛋白的上调。任选地，表达载体可使用增强子等基因表达调控元件，进一步增强相应基因的表达。

根据本发明的实施例，编码所述外源肌醇转运蛋白的外源核酸为iolT1和iolT2的至少之一，其中，优选所述外源核酸为源自谷氨酸棒杆菌的iolT1。虽然iolT1和iolT2均为编码肌醇转运蛋白的核酸，根据本发明的实施例，增强源自谷氨酸棒杆菌的iolT1的表达可以获得令人意外的高莽草酸生产效率。

另外，根据本发明的实施例，编码所述葡萄糖转运蛋白的外源核酸包括源自运动发酵单胞菌的glf和glk的至少之一。根据本发明的实施例，所述外源核酸整合在所述重组微生物的基因组中。根据本发明的实施例，所述外源核酸分别独立地插入至所述莽草酸激酶和所述PTS系统至少之一对应的位点中，并且阻断所述莽草酸激酶和所述PTS系统至少之一的表达。根据本发明的实施例，所述莽草酸激酶包括AroL和AroK，所述PTS系统包括ptsHIcrr操纵子。

根据本发明的实施例，所述外源核酸整合在所述重组微生物的基因组中，所述外源核酸整合在微生物基因组中的方式可以为定点整合，分别独立地插入至所述莽草酸激酶和所述PTS系统至少之一对应的位点中，并且阻断所述莽草酸激酶和所述PTS系统至少之一的表达。

根据本发明的实施例，所述外源核酸可操作地与启动子相连，所述启动子包括选自大肠杆菌来源启动子、T7、tac、trc、lac和trp启动子的至少之一。根据本发明的实施例，所述启动子为组成型T7启动子。根据本发明的实施例，所述重组微生物的基因组中整合有依次串联的第一组成型T7启动子、iolT1、第二组成型T7启动子、glf和glk。根据本发明的实施例，所述重组微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母，优选大肠杆菌。根据本发明的实施例，所述T7启动子是处于无lacO操纵子控制下的组成型表达，无需添加诱导物即可以实现T7启动子的功能。由此，根据本发明的实施例，通过调整培养温度，即可实现莽草酸的合成和积累。

在此，本发明人以ESA-pSA-14-为出发宿主，在ptsHIcrr位点依次单独表达了运动发酵单胞菌来源的非PEP消耗的葡萄糖转运蛋白和谷氨酸棒杆菌来源的肌醇转运蛋白，所表达的基因优选的是采用T7强启动子。令人惊奇的是，所得重组大肠杆菌ESA01-pSA-14和ESA02-pSA-14产莽草酸能力得到进一步提高，尤其是表达谷氨酸棒杆菌来源的肌醇转运蛋白所对应iolT1基因时，莽草酸产量提高达到16％。因此，我们将葡萄糖转运蛋白和肌醇转运蛋白采用T7强启动子联合表达，构建了新的重组大肠杆菌ESA03-pSA-14。正如我们的猜测，所得重组大肠杆菌ESA03-pSA-14的碳源摄取能力进一步加强，最终的莽草酸产量也得到了可观的水平，与出发菌相比，莽草酸产量在5L罐水平提高了25％。

由此，根据本发明的实施例，本发明提出了采用一株产莽草酸的重组大肠杆菌ESA-pSA-14(专利号CN111057672A)作为出发菌株，该菌株中，aroK、aroL与ptsHIcrr基因下调以及aroB、aroD、aroE、aroF、tktA、ppsA基因上调。在该出发菌株的基础上，所使用的策略是改造其碳源摄取转运能力，包括异源表达运动发酵单胞菌来源的葡萄糖转运蛋白glf和glk基因，以及异源表达谷氨酸棒杆菌来源的肌醇转运蛋白iolT1基因。基因操作所使用的异源表达采用以下方式：葡萄糖转运蛋白glf和glk基因的异源表达，所整合的位点包括但不限于阻断莽草酸下游合成关键基因aroL、aroK位点以及葡萄糖转运系统ptsHIcrr位点。另外，所用启动子可以选择采用大肠杆菌自身启动子或其他如T7、tac、trc、lac和trp启动子，优选的是采用T7强启动子控制基因的表达；肌醇转运蛋白iolT1的异源表达，所整合的位点包括但不限于阻断莽草酸下游合成关键基因aroL、aroK位点以及葡萄糖转运系统ptsHIcrr位点。另外，所用启动子可以选择采用大肠杆菌自身启动子或其他如T7、tac、trc、lac和trp启动子，优选的是采用T7强启动子控制基因的表达；葡萄糖转运蛋白所对应基因glf-glk和肌醇转运蛋白所对应基因iolT1的联合表达，所整合的位点包括但不限于阻断莽草酸下游合成关键基因aroL、aroK位点以及葡萄糖转运系统ptsHIcrr位点。另外，所用启动子可以选择采用大肠杆菌自身启动子或其他如T7、tac、trc、lac和trp启动子，优选的是采用T7强启动子控制基因的表达；所述三个基因的异源表达，包括但不限于处于同一个T7强启动子控制下的串联表达，或者任一基因的表达均由单独的T7强启动子控制。所述T7强启动子是处于无lacO操纵子控制下的组成型表达，从而无需添加诱导物。

由此，根据本发明的实施例，实现了高密度发酵工程菌株生产莽草酸的方法。将构建好的重组大肠杆菌在液体培养基中高密度发酵，全程补碳源采用分阶段控温的方式促进莽草酸的形成，在发酵前期控制37℃促进菌体的生长，15-25h左右降温至28-33℃促进莽草酸合成至发酵结果。

根据本发明的实施例，令人惊奇的是，通过外源表达葡萄糖糖转运蛋白和肌醇转运蛋白所得到的重组微生物所具有的产莽草酸能力得到进一步提高，尤其是表达谷氨酸棒杆菌来源的肌醇转运蛋白所对应基因iolT1时，莽草酸产量可以提高达到16％。因此，另外，将葡萄糖转运蛋白和肌醇转运蛋白采用T7强启动子联合表达在重组微生物中时，所构建得到的重组微生物(具体实施例中的重组大肠杆菌ESA04-pSA-14)的碳源摄取能力进一步加强，最终的莽草酸产量也得到了可观的水平，与出发菌相比，莽草酸产量在5L罐水平提高了25％。

需要说明的是，本领域技术人员能够理解的是，莽草酸途径作为比较长和复杂的途径，其调整和基因改造需要考虑众多因素。根据2007年6月《复旦大学学报》第46卷第3期366～370页大肠杆菌aroL基因敲除及其对莽草酸合成的影响的描述，基因工程菌发酵生产莽草酸同时敲除aroL和aroK，将莽草酸途径从中间完全切断，这样就完全阻断了芳香族氨基酸和芳香维生素的合成，则需要在培养基中补充这些物质，但补充又会引起一个矛盾：添加的量少会引起菌体生长不良，发酵产量难以增加；添加的量多又会引起反馈抑制。然而，本发明的发明人惊奇地发现，通过本发明设置的重组微生物不需要在培养体系中添加额外的芳香族维生素和芳香族氨基酸，就能够实现菌体的快速生长以及莽草酸的积累。

另外，本领域技术人员能够理解，在确定需要改造的基因位点和相应的序列后，本领域技术人员可以采用常用分子生物学手段实现对特定基因的修饰或者改造。例如，可以采用基因编辑的手段。在本文中使用的术语“基因编辑”是指能对生物体基因组特定目标基因(也称为“靶基因”或者“靶标”)进行修饰(包括但不限于插入、删除或者替换)，根据本发明的实施例，例如，采用CRISPR/Cas9技术。具体的，在sgRNA(识别目标基因)的引导下，采用作为“分子剪刀”的核酸酶Cas9，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂(DSB)，进一步诱导生物体通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)(也称为“HDR”(Homologydirected repair，同源介导的双链DNA修复))来修复DSB，从容实现特定的修饰，其中，为了提高同源重组介导的双链DNA修复(HDR)的效率会添加额外的基于靶基因序列设计的“供体(donor)”或修复模板作为同源重组修复模板，从而实现了将供体的序列替换原有基因组特定序列的目的。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种表达载体，所述表达载体整合有依次串联的第一组成型T7启动子、iolT1、第二组成型T7启动子、glf和glk。根据本发明的实施例，所述表达载体可以在原核生物、真核生物、哺乳动物细胞等媒介中表达莽草酸，并且可以得到较高的莽草酸生产效率，对媒介本身不造成损害。

重组微生物的用途

如前所述，采用根据本发明实施例的重组微生物制备莽草酸，能够实现高产率，并且微生物的生长不需要添加额外的芳香族氨基酸和芳香族维生素。

根据本发明的实施例，液体培养所采用的培养基不额外添加芳香族化合物，例如芳香族维生素和芳香族氨基酸(例如L-Phe、L-Tyr或L-Ser)的至少之一。从而避免了这些额外物质对莽草酸途径的反馈抑制作用，进一步有利于提高莽草酸的合成效率。根据本发明的具体的实施例，可以采用改良SOC发酵培养基，其含有葡萄糖15.0g/L，酵母蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钾2.0g/L，硫酸镁1.0g/L。

关于液体培养以及分离莽草酸的其他条件，可以按照本领域中公知的培养微生物尤其是大肠杆菌的操作进行，在此不再赘述。

根据本发明的实施例，可以采用高密度发酵工程菌株生产莽草酸的方法。将构建好的重组大肠杆菌在液体培养基中高密度发酵，全程补碳源采用分阶段控温的方式促进莽草酸的形成，在发酵前期控制37℃促进菌体的生长，15-25h左右降温至28-33℃促进莽草酸合成至发酵结果。目前报道的大肠杆菌发酵法产莽草酸的产量较低或发酵成本过高，不利于规模化生产。本发明主要通过基因工程改造技术，对大肠杆菌莽草酸合成过程中的碳源转运系统进行改造，在提高碳源利用效率的同时，使其产莽草酸能力得到进一步的提高，进而提高莽草酸的发酵产量，且发酵成本较低，适合工厂大规模生产，从而实现发酵法莽草酸的产业化。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备奥司他韦的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：按照前面所述的方法，制备莽草酸；和利用所述莽草酸作为中间体，合成奥司他韦。根据本发明的实施例，利用该方法能够有效地制备奥司他韦。在获得莽草酸后，本领域技术人员能够理解的是，可以将莽草酸作为中间体用于制备奥司他韦，关于该制备方法的其他细节，在此不再赘述。由于本领域提高了制备莽草酸的效率，从而该制备奥司他韦的方法的效率也得到了进一步提高，降低了成本。

根据本发明的实施例，发明人惊奇地发现，通过采用本发明的重组微生物，相对于未经本发明提出方案改造的出发菌株，生产莽草酸的能力可以得到有效地提高，尤其是当表达外源的谷氨酸棒杆菌来源的肌醇转运蛋白所对应基因iolT1时，莽草酸的产量与出发菌株相比可以提高达到大约16％。另外，根据本发明的实施例，通过采用外源葡萄糖转运蛋白以及肌醇转运蛋白采用T7强启动子联合表达，所得到的微生物的碳源摄取能力进一步加强，最终的莽草酸产量也得到了可观的水平，与出发菌株相比，莽草酸产量在5L罐水平提高了25％。

实施例1大肠杆菌基因编辑载体pTargetF2-ptsH构建

在后面的实施例中，参考Multigene editing in the Escherichia coli genomevia the CRISPR-Cas9 system,Appl Environ Microbiol 2015Apr；81(7):2506-2514采用CRISPR-Cas9系统对大肠杆菌进行基因编辑。大肠杆菌所用的CRISPR-Cas9系统由两个基本质粒pCas-lac和pTargetF2组成。参考图3，pCas-lac质粒主要包括L-阿拉伯糖诱导表达Red重组酶元件、Cas9蛋白的编码基因Cas9、温敏型元件及诱导消除质粒pTargetF所使用的sgRNA、卡那霉素抗性基因KanR等，用于产生具有切割活性的cas9蛋白和提高重组效率。而pTargetF2质粒主要包含抗性基因aadA和sgRNA表达框，用于指导cas9编辑位点。

采用在线软件(http://crispr.dbcls.jp/)设计N20序列：

SEQ ID NO.1：GCAGAAAGCGGTTGAACATC，其靶向大肠杆菌ptsH基因ORF区域。

通过设计如下引物，采用引物退火方式构建pTargetF2-ptsH。

SEQ ID NO.2：TAGTGCAGAAAGCGGTTGAACATC

SEQ ID NO.3：AAACGATGTTCAACCGCTTTCTGC

以上两条引物退火得到N20-ptsH片段，利用限制性内切酶BsaI酶切消化载体pTargetF2质粒，采用Gel Extraction Kit试剂盒(OMEGA，America)按厂商说明纯化回收酶切消化产物。利用试剂盒DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的载体片段和N20片段连接，构建得到敲除质粒pTargetF2-ptsH，图4显示了敲除质粒pTargetF2-ptsH的结构示意图。

实施例2大肠杆菌供体片段(Donor)的制备

制备ptsHIcrr-T7-glf-glk-Donor

根据大肠杆菌BL21(DE3)ptsHIcrr基因上下游序列和pUC57-glf-glk载体(glf-glk序列见SEQ ID NO.4)设计引物如下：

SEQ ID NO.5：AAAGGCACCAAAGGCAAGAC

SEQ ID NO.6：CCTATAGTGAGTCGTATTATGTATTTCCCCAACTTATA

SEQ ID NO.7：TAATACGACTCACTATAGGTGTGGATCTCCTTCTTAAAGT

SEQ ID NO.8：CAAAGATTTTCAAAAAACCCCTCAAGACCC

SEQ ID NO.9：GTTTTTTGAAAATCTTTGAAACCAACCACG

SEQ ID NO.10：CCAGCAGCATGAGAGCGATG

ATGAGCAGCGAAAGCAGTCAGGGTCTGGTGACCCGTCTGGCCCTGATTGCAGCCATTGGCGGCCTGCTGTTTGGCTATGATAGCGCAGTGATCGCCGCCATTGGCACACCGGTTGATATTCACTTCATCGCCCCGCGCCATTTAAGCGCAACCGCAGCCGCCAGCCTGAGTGGTATGGTGGTTGTTGCAGTGCTGGTGGGCTGCGTGACCGGTAGCTTACTGAGCGGTTGGATCGGTATTCGTTTCGGCCGCCGTGGTGGTCTGCTGATGAGTAGCATCTGCTTTGTGGCAGCCGGTTTTGGCGCAGCCCTGACCGAAAAACTGTTTGGCACAGGTGGTAGCGCCCTGCAGATCTTCTGCTTCTTTCGTTTCCTGGCCGGCCTGGGTATTGGTGTTGTTAGCACACTGACACCGACCTACATTGCCGAAATCCGCCCTCCGGATAAACGCGGTCAGATGGTGAGCGGCCAGCAGATGGCAATCGTGACCGGTGCACTGACCGGCTATATCTTTACCTGGCTGCTGGCCCACTTTGGTAGCATTGACTGGGTGAACGCAAGTGGTTGGTGCTGGAGCCCGGCAAGCGAGGGTCTGATTGGTATTGCCTTCCTGCTGCTGCTGCTGACCGCACCGGACACCCCGCATTGGCTGGTGATGAAAGGTCGTCACAGCGAGGCCAGCAAAATTCTGGCCCGCCTGGAACCGCAGGCAGATCCTAACCTGACAATTCAGAAAATTAAGGCCGGCTTCGACAAAGCCATGGATAAGAGCAGCGCCGGCTTATTTGCCTTCGGCATTACCGTTGTTTTTGCAGGCGTGAGCGTTGCCGCCTTTCAGCAGCTGGTGGGTATTAACGCCGTGCTGTATTATGCCCCGCAGATGTTTCAAAACCTGGGTTTTGGCGCCGATACCGCCCTGCTGCAGACCATTAGCATCGGCGTGGTGAACTTTATCTTCACCATGATCGCCAGCCGTGTGGTGGATCGCTTTGGTCGCAAACCGCTGCTGATCTGGGGTGCACTGGGTATGGCCGCAATGATGGCCGTGCTGGGCTGCTGTTTCTGGTTCAAGGTGGGCGGTGTGTTACCGTTAGCAAGCGTGCTGCTGTACATTGCCGTGTTTGGCATGAGCTGGGGCCCGGTTTGCTGGGTTGTGCTGAGCGAGATGTTCCCTAGCAGCATTAAAGGCGCAGCCATGCCGATCGCAGTTACCGGCCAGTGGCTGGCCAACATTCTGGTGAACTTTTTATTTAAGGTTGCCGACGGCAGCCCGGCCTTAAACCAGACCTTCAACCACGGCTTCAGCTACCTGGTTTTCGCAGCACTGAGCATCCTGGGTGGTCTGATTGTGGCCCGTTTTGTTCCGGAGACAAAGGGCCGCAGCCTGGATGAAATCGAAGAAATGTGGCGCAGCCAGAAATAATTTCCCGGGTTCTTTTAAAAATCAGTCACAAGTAAGGTAGGGTTATGGAGATTGTGGCCATTGATATCGGTGGCACCCACGCCCGTTTTAGCATCGCCGAAGTTAGCAATGGCCGCGTTCTGAGCCTGGGTGAGGAAACCACCTTCAAAACAGCCGAGCATGCAAGCCTGCAGCTGGCATGGGAACGTTTTGGCGAGAAACTGGGTCGCCCTTTACCGCGTGCAGCAGCAATTGCCTGGGCAGGCCCGGTTCATGGTGAGGTTCTGAAGCTGACCAACAACCCTTGGGTTCTGCGCCCGGCCACCCTGAATGAGAAGCTGGATATCGACACCCACGTGCTGATCAATGACTTTGGCGCCGTGGCACATGCCGTGGCACACATGGATAGCAGCTATCTGGACCACATCTGTGGTCCGGATGAAGCCCTGCCGAGCGATGGTGTGATCACCATTCTGGGCCCTGGTACAGGCCTGGGTGTGGCACATCTGCTGCGCACCGAAGGCCGCTATTTCGTGATTGAAACCGAGGGCGGCCATATCGATTTCGCCCCTCTGGATCGCCTGGAAGATAAGATTCTGGCCCGTCTGCGTGAACGCTTCCGCCGTGTGAGCATCGAGCGCATTATTAGCGGCCCTGGCCTGGGCAATATCTACGAGGCCCTGGCCGCAATTGAAGGCGTGCCGTTTAGTCTGCTGGACGACATCAAACTGTGGCAGATGGCACTGGAAGGCAAGGATAATCTGGCAGAAGCCGCCCTGGACCGTTTTTGCCTGAGCCTGGGTGCCATTGCCGGTGATCTGGCCCTGGCACAGGGTCGTACCAGCGTGGTGATTGGTGGCGGTGTGGGCCTGCGCATCGCAAGTCATCTGCCGGAAAGCGGCTTCCGCCAGCGTTTCGTGAGCAAAGGCCGTTTTGAGCGCGTGATGAGCAAAATTCCGGTGAAACTGATTACCTATCCGCAGCCGGGTCTGTTAGGCGCACAGCTGCCGATGCCGACCAATATTCTGAAACTGAATAATATCTTTTAA(SEQ ID NO.4)

以Takara高保真酶PrimeSTAR Max DNAPolymerase产品进行PCR扩增，按照上表及引物制备ptsHIcrr-T7-glf-glk-Donor，图5显示了ptsHIcrr-T7-glf-glk-Donor的结构示意图。

制备ptsHIcrr-T7-iolT1-Donor

根据大肠杆菌BL21(DE3)ptsHIcrr基因上下游序列和谷氨酸棒杆菌ATCC13032iolT1序列(SEQ ID NO.11)设计引物如下：

SEQ ID NO.5：AAAGGCACCAAAGGCAAGAC

SEQ ID NO.6：CCTATAGTGAGTCGTATTATGTATTTCCCCAACTTATA

SEQ ID NO.12：

TAATACGACTCACTATAGGGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCTAGTACCTTCATTCAG

SEQ ID NO.13：CCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTAGTGCACCTTTCCTTTTCGG

SEQ ID NO.14：

CTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGAAAATCTTTGAAACCAACCA

SEQ ID NO.10：CCAGCAGCATGAGAGCGATG

以Takara高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase产品进行PCR扩增，按照上表及引物制备ptsHIcrr-T7-iolT1-Donor，图6显示了ptsHIcrr-T7-iolT1-Donor的结构示意图。

ATGGCTAGTACCTTCATTCAGGCCGACAGCCCTGAAAAAAGTAAGAAGCTGCCCCCACTCACAGAAGGTCCGTATAGAAAGCGGCTATTCTACGTTGCACTAGTTGCGACGTTTGGTGGGCTGCTCTTCGGATATGACACCGGAGTAATCAACGGTGCACTCAACCCAATGACACGTGAGCTCGGACTAACCGCGTTCACCGAGGGTGTTGTAACTTCTTCCCTGCTGTTTGGTGCAGCAGCTGGTGCGATGTTTTTCGGTCGCATTTCCGACAACTGGGGTCGCCGGAAAACAATCATCTCACTTGCAGTAGCTTTCTTTGTCGGCACCATGATCTGCGTGTTTGCTCCATCTTTTGCAGTAATGGTTGTCGGACGTGTGCTTCTTGGACTCGCAGTTGGTGGCGCTTCCACTGTTGTCCCTGTCTACCTGGCTGAACTTGCTCCTTTTGAAATCCGTGGCTCACTGGCTGGCCGTAATGAGTTGATGATTGTTGTTGGTCAGCTCGCAGCTTTTGTCATCAATGCGATTATTGGAAATGTTTTTGGACACCACGATGGTGTGTGGCGCTACATGCTGGCAATTGCCGCAATCCCAGCAATTGCCCTCTTCTTTGGAATGCTCCGAGTTCCAGAATCCCCACGCTGGCTTGTTGAGCGAGGACGCATTGATGAGGCTCGCGCAGTTCTTGAAACCATTCGCCCTCTAGAACGTGCCCATGCAGAAGTTGCTGATGTTGAACACCTAGCAAGAGAAGAGCACGCCGTTTCCGAGAAGTCCATGGGCTTAAGGGAAATTTTGTCCAGCAAGTGGCTTGTGCGCATCCTCCTGGTAGGTATCGGATTGGGTGTCGCACAGCAGCTGACCGGCATCAACTCCATCATGTACTACGGCCAGGTTGTTCTCATTGAGGCTGGTTTCTCCGAGAATGCAGCTCTGATCGCCAACGTGGCGCCAGGAGTGATCGCAGTTGTCGGTGCATTCATCGCACTGTGGATGATGGATCGTATCAACCGCCGTACCACCCTCATTACCGGTTATTCTCTCACCACCATTAGCCACGTATTGATCGGTATCGCATCCGTAGCATTCCCAGTCGGCGATCCTCTTCGCCCCTACGTTATCTTGACTCTGGTTGTGGTCTTCGTGGGATCCATGCAGACCTTCCTCAACGTAGCTACCTGGGTTATGCTCTCTGAGCTCTTCCCGCTGGCAATGCGCGGTTTCGCAATCGGTATCTCAGTGTTCTTCCTCTGGATCGCAAACGCGTTCCTCGGATTGTTCTTCCCAACCATCATGGAAGCAGTAGGACTAACCGGAACCTTCTTCATGTTCGCCGGAATCGGTGTGGTTGCCTTGATCTTCATCTACACCCAGGTTCCTGAAACTCGTGGACGTACCTTGGAGGAGATTGATGAGGATGTTACTTCCGGTGTCATTTTCAACAAGGACATCCGAAAAGGAAAGGTGCACTAA(SEQ ID NO.11)

制备ptsHIcrr-T7-iolT2-Donor

根据大肠杆菌BL21(DE3)ptsHIcrr基因上下游序列和谷氨酸棒杆菌ATCC13032iolT2序列(SEQ ID NO.15)设计引物如下：

SEQ ID NO.5：AAAGGCACCAAAGGCAAGAC

SEQ ID NO.16：AAGGAGATCCACACCTATAGTGAGTCGTATTAACATTGTATTTCCCCAACTTAT

SEQ ID NO.17：

TATAGGTGTGGATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATGACGGACATCAAGGCCAC

SEQ ID NO.18：GTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTAAGCCTTCTTGAAGATCTGG

SEQ ID NO.19：

TTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGGTCGCGCCAGTAGACGGCACC

SEQ ID NO.10：CCAGCAGCATGAGAGCGATG

以Takara高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase产品进行PCR扩增，按照上表及引物制备ptsHIcrr-T7-iolT2-Donor，图7显示了ptsHIcrr-T7-iolT2-Donor的结构示意图。

TTAAGCCTTCTTGAAGATCTGGCCGGTGAATGCTGCGTGATCGAGTTCTTCAAGTGAGCGGCCACGGGTTTCAGGAACAAACTTGGTGACGAACGCCAGGGCAATGACTCCGACGACTGCGAAGATAAGGAAGGAGAAGGTGATACCCACGCCGGAGACCAGTGCTGGGAAGAACAACGCTAGGACGCCATTGATGCCCCAACCGCAGAATACCGAAATACCGGTGCCGATACCCTTCATTCGGACTGGGAAGATTTCCGCCAGCCACACCCACACTGCAACGTTGAGGAAAGTCTGCATGGAGAGCACGAACCCAACAACAAGGATCATGATGGCGAATGGTCGAATGGAGTTACCTTCTGGAAGGAGAGTGCCGGCAGCTGCGATCAAAAGGTGGAAGGTGGTGGTCAGTGACAGGCCGATGATGAAGGTGGTGCGGCGATCCAGGCGGTCCATGTTGCGCAGTGCGATCAGTCCACCGATGACGGCAACGGCACCGAAAGCAATGTTGGCAACCACAGCCATTTCTGCGCTCATGCCGGATTCCTCGAGGACGCGGGTTCCGTAGTACATGATGGCGTTGATGCCGGTGAGCTGCTGGGCAACTGCAACACCGATGCCGGCGATGAGCAGACGAACCAGCCATTTGTTGCTGAGGACTTCGCCGATGGACATGTGGGTGTGCTTGCTAGAAACCTGGCCTGAAGCCTGGCCCGAAGACTGCTTAACACCAGGAAGAGTGCCGCATTGTTTTCAGAGTGCACCGCGATGATTTCATCCATTTCGGCTTTCGCACGCTCAGGGGTACGGACGGTCTCCATGACGCGGCGGGCGTCGTCGTAACGCCCCTGGTTGACCAGCCAGCGTGGTGATTCCGGCATCCGCAGCATGCCGAGGAAGAGGGCGACGGCAGGGAGGGCACAGACGGCGAACATGATGCGCCAGATTCCATCAATAACTCCGTGTAGGGTGACGGCGATAAGCGCGTTGATCACGAAGGCAAGCAGCTGGCCGGTGACGATAGCAAGCTCGTTTCGGCCGGTCAGGGAGCCGCGGATTTCTAGTGGTGCGAGTTCAGCGAGGTACACCGGAACTACTGTGGAGGCGCCGCCAACCGCGAGACCCAACATGATGCGCCCGGTGACCAAGGTGGCAAATCCTGGTCCGTAGAACTGCCCCAGCTCACCGGCGGGGGAGAATACGACGAGGATTGATCCGAGGAAGAACAGCACGGACAAAGTGATAATTGCTTTTCGACGCCCGATTTCGTCCGAGATACGCCCAGCGAACAGCGCGCCAAAGGCTGCAGCGAAAACCAGTGAACTGATGACAACGCCGAGCTGCAGCACGTTGAGTCCGAGTTCTTGTGCCATGTGGCCTTCGGCGCCGTTGGCGACACCGGTGTCATAGCCGAAGAGAAGTCCGCCGAGACAGGCGACGAGGGAAATTTGTCCAAGTCGACGCGCTGGTCGGCCTGCTGTTGGTGCTGTAGTGGCCGATGTACTTGATGTGGCCTTGATGTCCGTCAT(SEQ ID NO.15)

制备ptsHIcrr-T7-iolT1-T7-glf-glk-Donor

根据大肠杆菌BL21(DE3)ptsHIcrr基因上下游序列、pUC57-glf-glk载体(glf-glk序列见序列SEQ ID NO.4)和谷氨酸棒杆菌ATCC13032 iolT1序列(SEQ ID NO.11)设计引物如下：

SEQ ID NO.5：AAAGGCACCAAAGGCAAGAC

SEQ ID NO.6：CCTATAGTGAGTCGTATTATGTATTTCCCCAACTTATA

SEQ ID NO.12：

TAATACGACTCACTATAGGGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCTAGTACCTTCATTCAG

SEQ ID NO.20：CCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTGCACCTTTCCTTTTCGG

SEQ ID NO.7：TAATACGACTCACTATAGGTGTGGATCTCCTTCTTAAAGT

SEQ ID NO.21：CCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTAAAAGATATTATTCAGTTTCA

SEQ ID NO.22：

TTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGAAAATCTTTGAAACCAACCA

SEQ ID NO.10：CCAGCAGCATGAGAGCGATG

以Takara高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase产品进行PCR扩增，按照上表及引物制备ptsHIcrr-T7-iolT1-T7-glf-glk-Donor，图8显示了ptsHIcrr-T7-iolT1-T7-glf-glk-Donor的结构示意图。

实施例3大肠杆菌产莽草酸宿主的构建

首先，参考CN111057672A实施例1的方法，构建携带pcas-lac质粒的ESA-3(pcas-lac)电转感受态。

简言之，

a、将含pCas-lac质粒的大肠杆菌接种到液体LB(含卡那霉素终浓度为50μg/mL)培养基中，30℃、250rpm/min培养至对数期生长期。

b、以1％的接种量接种于装有100mLLB(含卡那霉素终浓度为50μg/mL)培养基的500mL三角瓶中，30℃、200rpm/min条件培养至OD600为0.2～0.3时，加入终浓度为10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导剂，诱导pCas-lac上的λ-Red重组酶充分表达，OD600为0.5～0.7时停止培养(1～1.5h)。

c、在超净台内将培养液转移到50mL无菌离心管中，在冰中放置10min。

d、将离心管中的菌液4℃、4000r/min离心10min。

e、弃上清，加入少量预冷的10％甘油温柔重悬菌体，继续添加10％甘油至离心管体积的三分之二处，4℃、4000r/min离心10min。重复一次操作。

f、将菌体悬浮于1mL预冷的10％甘油中，按每管80μL感受态细胞分装于1.5mL离心管中，冰上放置备用。

在获得ESA-3(pcas-lac)电转感受态后，按照下列步骤分别利用不同的供体制备不同的宿主，具体的，

构建ESA01宿主

每80ul ESA-3(pcas-lac)电转感受态加入100ng pTargetF2-ptsH质粒和500ngptsHIcrr-T7-glf-glk-Donor片段，冰上混匀10min，2.5KV恒压电击，立即加入1ml常温LB培养基，30℃250rpm复苏2h，涂布含50ug/ml Kana和50ug/ml spc的LB平板，30℃培养2天，挑取转化子进行基因型验证，得到符合预期的ESA01宿主。

ESA02宿主构建

每80ul ESA-3(pcas-lac)电转感受态加入100ng pTargetF2-ptsH质粒和500ngptsHIcrr-T7-iolT1-Donor片段，冰上混匀10min，2.5KV恒压电击，立即加入1ml常温LB培养基，30℃250rpm复苏2h，涂布含50ug/ml Kana和50ug/ml spc的LB平板，30℃培养2天，挑取转化子进行基因型验证，得到符合预期的ESA02宿主。

ESA03宿主构建

每80ul ESA-3(pcas-lac)电转感受态加入100ng pTargetF2-ptsH质粒和500ngptsHIcrr-T7-iolT2-Donor片段，冰上混匀10min，2.5KV恒压电击，立即加入1ml常温LB培养基，30℃250rpm复苏2h，涂布含50ug/ml Kana和50ug/ml spc的LB平板，30℃培养2天，挑取转化子进行基因型验证，得到符合预期的ESA03宿主。

ESA04宿主构建

每80ulESA-3(pcas-lac)电转感受态加入100ng pTargetF2-ptsH质粒和500ngptsHIcrr-T7-iolT1-T7-glf-glk-Donor片段，冰上混匀10min，2.5KV恒压电击，立即加入1ml常温LB培养基，30℃250rpm复苏2h，涂布含50ug/ml Kana和50ug/ml spc的LB平板，30℃培养2天，挑取转化子进行基因型验证，得到符合预期的ESA04宿主。

实施例4大肠杆菌产莽草酸工程菌(重组微生物)构建

首先，按照下列步骤分别制备ESA01、ESA02、ESA03和ESA04宿主的电转染感受态。

将大肠杆菌甘油菌按千分之一接种至液体LB中，37℃250rpm活化过夜；

按1％接种量接种至100ml/500mlLB培养基中，37℃250rpm培养至OD600为0.4-0.6时停止培养；

将培养好的菌液转移至无菌50ML离心管中，冰上放置30min；

4℃，5000rpm离心10min，去上清，加入少量预冷10％甘油轻柔混匀，定容至35ml；

4℃，5000rpm离心10min，重复d操作一次，加入1ml预冷10％甘油轻柔混匀，分装80ul/1.5ml保存于-80℃备用。

接下来利用pSA-14质粒(图9显示了其结构示意图，简言之，将大肠杆菌BL21(DE3)的3-脱氢奎宁酸(3-dehydroquinicacid，DHQ)合酶AroB、DHQ脱氢酶aroD、莽草酸脱氢酶aroE、DAHP合酶aroF、转酮醇酶tktA和PEP合成酶ppsA连接至表达载体pET-28a得到重组质粒pSA-14，详细内容可参见CN111057672A实施例5和6中关于pSA-14游离表达载体构建的描述，在此将CN111057672A全文引用并入本文)对上述电转染感受态进行转染，以便获得用于后续制备莽草酸的产莽草酸工程菌。

ESA01-pSA-14工程菌构建

每80ulESA01电转感受态加入100ng pSA-14质粒，冰上混匀10min，2.5KV恒压电击，立即加入1ml常温LB培养基，37℃250rpm复苏2h，涂板含50ug/ml Kana的LB平板，37℃培养15-18h，挑取转化子进行PCR和酶切验证，得到符合预期的ESA01-pSA-14工程菌。

ESA02-pSA-14工程菌构建

每80ulESA02电转感受态加入100ng pSA-14质粒，冰上混匀10min，2.5KV恒压电击，立即加入1ml常温LB培养基，37℃250rpm复苏2h，涂板含50ug/ml Kana的LB平板，37℃培养15-18h，挑取转化子进行PCR和酶切验证，得到符合预期的ESA02-pSA-14工程菌。

ESA03-pSA-14工程菌构建

每80ulESA03电转感受态加入100ng pSA-14质粒，冰上混匀10min，2.5KV恒压电击，立即加入1ml常温LB培养基，37℃250rpm复苏2h，涂板含50ug/ml Kana的LB平板，37℃培养15-18h，挑取转化子进行PCR和酶切验证，得到符合预期的ESA03-pSA-14工程菌。

ESA04-pSA-14工程菌构建

每80ulESA04电转感受态加入100ng pSA-14质粒，冰上混匀10min，2.5KV恒压电击，立即加入1ml常温LB培养基，37℃250rpm复苏2h，涂板含50ug/ml Kana的LB平板，37℃培养15-18h，挑取转化子进行PCR和酶切验证，得到符合预期的ESA04-pSA-14工程菌。

实施例5产莽草酸工程菌摇瓶发酵比较

在下面的实验中采用实施例4中制备的产莽草酸工程菌进行发酵生产莽草酸性能比较。

如无特殊说明，在后面的发酵中采用改良SOC发酵培养基，其含有：葡萄糖15.0g/L，酵母蛋白胨10.0g/L，酵母浸粉5.0g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钾2.0g/L，硫酸镁1.0g/L。

第一次摇瓶发酵比较

从-80℃冰箱取甘油种子ESA-pSA-14、ESA01-pSA-14、ESA02-pSA-14和ESA03-pSA-14，室温溶化后，以千分之一接种量各接种一瓶10ml含50ug/ml Kana的LB液体培养基，37℃250rpm活化15-18h，制得种子液。然后以1％接种量将种子液转接至2瓶50ml/250ml改良SOC发酵培养基中，其中一瓶加有终浓度50ug/ml Kana，一瓶不加，37℃250rpm发酵36h。发酵结束，离心取上清，采用HPLC方法检测莽草酸含量，结果如表1所示。

表1：

由上表可知，异源表达三种不同来源的糖转运蛋白对莽草酸产量和生物量均有不同程度的促进作用，其中谷棒来源的iolT1效果最优，其次为运动发酵单胞菌的glf+glk蛋白，而谷棒来源的iolT2效果最差。

第二次摇瓶发酵

从-80℃冰箱取甘油种子ESA-pSA-14、ESA01-pSA-14、ESA02-pSA-14和ESA04-pSA-14，室温溶化后，以千分之一接种量各接种一瓶10ml含50ug/ml Kana的LB液体培养基，37℃250rpm活化15-18h，制得种子液。然后以1％接种量将种子液转接至2瓶50ml/250ml改良SOC发酵培养基中，其中一瓶加有终浓度50ug/ml Kana，一瓶不加，37℃250rpm发酵36h。发酵结束，离心取上清，采用HPLC方法检测莽草酸含量，结果如表2所示。

表2：

由上表可知，共表达谷棒来源的iolT1和运动发酵单胞菌来源的glf+glk蛋白，莽草酸产量和生物量较单独表达有进一步的提升。

实施例6产莽草酸工程菌5L罐上发酵比较

发酵罐培养基

葡萄糖10.0g/L，酵母蛋白胨1.0g/L，酵母浸粉0.5g/L，玉米浆8.0g/L，磷酸氢二钠1.0g/L，氯化钠2.0g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化铵3.0g/L，氯化钙2.0g/L，磷酸二氢钾4.0g/L，微量元素溶液1ml/L

微量元素

五水硫酸铜0.3g/L，一水硫酸锰1.7g/L，七水硫酸锌0.3g/L，七水硫酸亚铁2.8g/L，二水钼酸钠2.0g/L，硼酸1.0g/L，六水氯化钴2.45g/L，无水氯化钙1.13g/L，浓硫酸27mL/L

5L罐上发酵

从-80℃冰箱取甘油种子ESA-pSA-14、ESA01-pSA-14、ESA02-pSA-14和ESA04-pSA-14，室温溶化后，以千分之一接种量各接种一瓶50ml含50ug/ml Kana的改良SOC液体培养基，37℃250rpm活化15-18h，制得一级种子。然后以1％接种量将一级种子转接至150ml/L含50ug/ml Kana的改良SOC种子培养基中，37℃250rpm培养8-12h，制得二级种子。接着以5％接种量将二级种子转接至5L发酵罐中发酵。发酵前期，待基础碳源消耗完毕，开始流加葡萄糖或其他碳源至发酵结束；发酵过程中，采用分阶段控温的方式，前期以37℃为主进行发酵促进菌体的快速生长，待中期即15-25h左右，降温至28-33℃开始合成莽草酸，63h发酵结束，离心取上清，采用HPLC方法检测莽草酸含量，结果如表3所示。

表3：

编号	菌株	OD600	SA含量g/l	DHS含量g/l	提高幅度
						1	ESA-pSA-14-63h	50.7	65.2	6.83	N/A
2	ESA01-pSA-14-63h	54.7	70.2	7.21	7％
						3	ESA02-pSA-14-63h	63.4	75.6	7.32	15％
4	ESA04-pSA-14-63h	66.4	84.2	7.85	25％

由上可知，在ESA-pSA-14工程菌上，异源表达葡萄糖转运蛋白，提高碳源摄取能力，确实可以进一步提高莽草酸的产量，尤其是ESA04-pSA-14工程菌的效果最佳，最高提升幅度达到25％，并且在发酵过程中并不需要额外添加芳香族维生素或者芳香族氨基酸。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 宜昌东阳光生化制药有限公司

<120> 重组微生物及其用途、制备莽草酸和奥司他韦的方法

<130> PIDC4200128

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> N20序列

<400> 1

gcagaaagcg gttgaacatc 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

tagtgcagaa agcggttgaa catc 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

aaacgatgtt caaccgcttt ctgc 24

<210> 4

<211> 2450

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> glf-glk序列

<400> 4

atgagcagcg aaagcagtca gggtctggtg acccgtctgg ccctgattgc agccattggc 60

ggcctgctgt ttggctatga tagcgcagtg atcgccgcca ttggcacacc ggttgatatt 120

cacttcatcg ccccgcgcca tttaagcgca accgcagccg ccagcctgag tggtatggtg 180

gttgttgcag tgctggtggg ctgcgtgacc ggtagcttac tgagcggttg gatcggtatt 240

cgtttcggcc gccgtggtgg tctgctgatg agtagcatct gctttgtggc agccggtttt 300

ggcgcagccc tgaccgaaaa actgtttggc acaggtggta gcgccctgca gatcttctgc 360

ttctttcgtt tcctggccgg cctgggtatt ggtgttgtta gcacactgac accgacctac 420

attgccgaaa tccgccctcc ggataaacgc ggtcagatgg tgagcggcca gcagatggca 480

atcgtgaccg gtgcactgac cggctatatc tttacctggc tgctggccca ctttggtagc 540

attgactggg tgaacgcaag tggttggtgc tggagcccgg caagcgaggg tctgattggt 600

attgccttcc tgctgctgct gctgaccgca ccggacaccc cgcattggct ggtgatgaaa 660

ggtcgtcaca gcgaggccag caaaattctg gcccgcctgg aaccgcaggc agatcctaac 720

ctgacaattc agaaaattaa ggccggcttc gacaaagcca tggataagag cagcgccggc 780

ttatttgcct tcggcattac cgttgttttt gcaggcgtga gcgttgccgc ctttcagcag 840

ctggtgggta ttaacgccgt gctgtattat gccccgcaga tgtttcaaaa cctgggtttt 900

ggcgccgata ccgccctgct gcagaccatt agcatcggcg tggtgaactt tatcttcacc 960

atgatcgcca gccgtgtggt ggatcgcttt ggtcgcaaac cgctgctgat ctggggtgca 1020

ctgggtatgg ccgcaatgat ggccgtgctg ggctgctgtt tctggttcaa ggtgggcggt 1080

gtgttaccgt tagcaagcgt gctgctgtac attgccgtgt ttggcatgag ctggggcccg 1140

gtttgctggg ttgtgctgag cgagatgttc cctagcagca ttaaaggcgc agccatgccg 1200

atcgcagtta ccggccagtg gctggccaac attctggtga actttttatt taaggttgcc 1260

gacggcagcc cggccttaaa ccagaccttc aaccacggct tcagctacct ggttttcgca 1320

gcactgagca tcctgggtgg tctgattgtg gcccgttttg ttccggagac aaagggccgc 1380

agcctggatg aaatcgaaga aatgtggcgc agccagaaat aatttcccgg gttcttttaa 1440

aaatcagtca caagtaaggt agggttatgg agattgtggc cattgatatc ggtggcaccc 1500

acgcccgttt tagcatcgcc gaagttagca atggccgcgt tctgagcctg ggtgaggaaa 1560

ccaccttcaa aacagccgag catgcaagcc tgcagctggc atgggaacgt tttggcgaga 1620

aactgggtcg ccctttaccg cgtgcagcag caattgcctg ggcaggcccg gttcatggtg 1680

aggttctgaa gctgaccaac aacccttggg ttctgcgccc ggccaccctg aatgagaagc 1740

tggatatcga cacccacgtg ctgatcaatg actttggcgc cgtggcacat gccgtggcac 1800

acatggatag cagctatctg gaccacatct gtggtccgga tgaagccctg ccgagcgatg 1860

gtgtgatcac cattctgggc cctggtacag gcctgggtgt ggcacatctg ctgcgcaccg 1920

aaggccgcta tttcgtgatt gaaaccgagg gcggccatat cgatttcgcc cctctggatc 1980

gcctggaaga taagattctg gcccgtctgc gtgaacgctt ccgccgtgtg agcatcgagc 2040

gcattattag cggccctggc ctgggcaata tctacgaggc cctggccgca attgaaggcg 2100

tgccgtttag tctgctggac gacatcaaac tgtggcagat ggcactggaa ggcaaggata 2160

atctggcaga agccgccctg gaccgttttt gcctgagcct gggtgccatt gccggtgatc 2220

tggccctggc acagggtcgt accagcgtgg tgattggtgg cggtgtgggc ctgcgcatcg 2280

caagtcatct gccggaaagc ggcttccgcc agcgtttcgt gagcaaaggc cgttttgagc 2340

gcgtgatgag caaaattccg gtgaaactga ttacctatcc gcagccgggt ctgttaggcg 2400

cacagctgcc gatgccgacc aatattctga aactgaataa tatcttttaa 2450

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

aaaggcacca aaggcaagac 20

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

cctatagtga gtcgtattat gtatttcccc aacttata 38

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 7

taatacgact cactataggt gtggatctcc ttcttaaagt 40

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 8

caaagatttt caaaaaaccc ctcaagaccc 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 9

gttttttgaa aatctttgaa accaaccacg 30

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 10

ccagcagcat gagagcgatg 20

<210> 11

<211> 1476

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 谷氨酸棒杆菌ATCC13032 iolT1序列

<400> 11

atggctagta ccttcattca ggccgacagc cctgaaaaaa gtaagaagct gcccccactc 60

acagaaggtc cgtatagaaa gcggctattc tacgttgcac tagttgcgac gtttggtggg 120

ctgctcttcg gatatgacac cggagtaatc aacggtgcac tcaacccaat gacacgtgag 180

ctcggactaa ccgcgttcac cgagggtgtt gtaacttctt ccctgctgtt tggtgcagca 240

gctggtgcga tgtttttcgg tcgcatttcc gacaactggg gtcgccggaa aacaatcatc 300

tcacttgcag tagctttctt tgtcggcacc atgatctgcg tgtttgctcc atcttttgca 360

gtaatggttg tcggacgtgt gcttcttgga ctcgcagttg gtggcgcttc cactgttgtc 420

cctgtctacc tggctgaact tgctcctttt gaaatccgtg gctcactggc tggccgtaat 480

gagttgatga ttgttgttgg tcagctcgca gcttttgtca tcaatgcgat tattggaaat 540

gtttttggac accacgatgg tgtgtggcgc tacatgctgg caattgccgc aatcccagca 600

attgccctct tctttggaat gctccgagtt ccagaatccc cacgctggct tgttgagcga 660

ggacgcattg atgaggctcg cgcagttctt gaaaccattc gccctctaga acgtgcccat 720

gcagaagttg ctgatgttga acacctagca agagaagagc acgccgtttc cgagaagtcc 780

atgggcttaa gggaaatttt gtccagcaag tggcttgtgc gcatcctcct ggtaggtatc 840

ggattgggtg tcgcacagca gctgaccggc atcaactcca tcatgtacta cggccaggtt 900

gttctcattg aggctggttt ctccgagaat gcagctctga tcgccaacgt ggcgccagga 960

gtgatcgcag ttgtcggtgc attcatcgca ctgtggatga tggatcgtat caaccgccgt 1020

accaccctca ttaccggtta ttctctcacc accattagcc acgtattgat cggtatcgca 1080

tccgtagcat tcccagtcgg cgatcctctt cgcccctacg ttatcttgac tctggttgtg 1140

gtcttcgtgg gatccatgca gaccttcctc aacgtagcta cctgggttat gctctctgag 1200

ctcttcccgc tggcaatgcg cggtttcgca atcggtatct cagtgttctt cctctggatc 1260

gcaaacgcgt tcctcggatt gttcttccca accatcatgg aagcagtagg actaaccgga 1320

accttcttca tgttcgccgg aatcggtgtg gttgccttga tcttcatcta cacccaggtt 1380

cctgaaactc gtggacgtac cttggaggag attgatgagg atgttacttc cggtgtcatt 1440

ttcaacaagg acatccgaaa aggaaaggtg cactaa 1476

<210> 12

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 12

taatacgact cactataggg tttaacttta agaaggagat ataccatggc tagtaccttc 60

attcag 66

<210> 13

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 13

cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta gttagtgcac ctttcctttt cgg 53

<210> 14

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 14

cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgaaaa tctttgaaac caacca 56

<210> 15

<211> 1529

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 谷氨酸棒杆菌ATCC13032 iolT2序列

<400> 15

ttaagccttc ttgaagatct ggccggtgaa tgctgcgtga tcgagttctt caagtgagcg 60

gccacgggtt tcaggaacaa acttggtgac gaacgccagg gcaatgactc cgacgactgc 120

gaagataagg aaggagaagg tgatacccac gccggagacc agtgctggga agaacaacgc 180

taggacgcca ttgatgcccc aaccgcagaa taccgaaata ccggtgccga tacccttcat 240

tcggactggg aagatttccg ccagccacac ccacactgca acgttgagga aagtctgcat 300

ggagagcacg aacccaacaa caaggatcat gatggcgaat ggtcgaatgg agttaccttc 360

tggaaggaga gtgccggcag ctgcgatcaa aaggtggaag gtggtggtca gtgacaggcc 420

gatgatgaag gtggtgcggc gatccaggcg gtccatgttg cgcagtgcga tcagtccacc 480

gatgacggca acggcaccga aagcaatgtt ggcaaccaca gccatttctg cgctcatgcc 540

ggattcctcg aggacgcggg ttccgtagta catgatggcg ttgatgccgg tgagctgctg 600

ggcaactgca acaccgatgc cggcgatgag cagacgaacc agccatttgt tgctgaggac 660

ttcgccgatg gacatgtggg tgtgcttgct agaaacctgg cctgaagcct ggcccgaaga 720

ctgcttaaca ccaggaagag tgccgcattg ttttcagagt gcaccgcgat gatttcatcc 780

atttcggctt tcgcacgctc aggggtacgg acggtctcca tgacgcggcg ggcgtcgtcg 840

taacgcccct ggttgaccag ccagcgtggt gattccggca tccgcagcat gccgaggaag 900

agggcgacgg cagggagggc acagacggcg aacatgatgc gccagattcc atcaataact 960

ccgtgtaggg tgacggcgat aagcgcgttg atcacgaagg caagcagctg gccggtgacg 1020

atagcaagct cgtttcggcc ggtcagggag ccgcggattt ctagtggtgc gagttcagcg 1080

aggtacaccg gaactactgt ggaggcgccg ccaaccgcga gacccaacat gatgcgcccg 1140

gtgaccaagg tggcaaatcc tggtccgtag aactgcccca gctcaccggc gggggagaat 1200

acgacgagga ttgatccgag gaagaacagc acggacaaag tgataattgc ttttcgacgc 1260

ccgatttcgt ccgagatacg cccagcgaac agcgcgccaa aggctgcagc gaaaaccagt 1320

gaactgatga caacgccgag ctgcagcacg ttgagtccga gttcttgtgc catgtggcct 1380

tcggcgccgt tggcgacacc ggtgtcatag ccgaagagaa gtccgccgag acaggcgacg 1440

agggaaattt gtccaagtcg acgcgctggt cggcctgctg ttggtgctgt agtggccgat 1500

gtacttgatg tggccttgat gtccgtcat 1529

<210> 16

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 16

aaggagatcc acacctatag tgagtcgtat taacattgta tttccccaac ttat 54

<210> 17

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 17

tataggtgtg gatctccttc ttaaagttaa acaaaatgac ggacatcaag gccac 55

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 18

gtttagaggc cccaaggggt tatgctagtt aagccttctt gaagatctgg 50

<210> 19

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 19

ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttggtcgc gccagtagac ggcacc 56

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 20

cctatagtga gtcgtattat tagtgcacct ttccttttcg g 41

<210> 21

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 21

ccgtttagag gccccaaggg gttatgctag ttaaaagata ttattcagtt tca 53

<210> 22

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 22

ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgaaaat ctttgaaacc aacca 55

Claims

1.一种用于生产莽草酸的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的PTS系统和莽草酸激酶被下调，并且所述重组微生物的3-脱氢奎尼酸合成酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶、莽草酸脱氢酶、转酮醇酶I、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶被上调，

其中，所述重组微生物进一步携带编码下列至少之一的外源核酸：

(A)外源肌醇转运蛋白或其功能类似物；和

(B)外源葡萄糖转运蛋白或其功能类似物，

编码所述外源肌醇转运蛋白的外源核酸为源自谷氨酸棒杆菌的iolT1；

编码所述葡萄糖转运蛋白的外源核酸为源自运动发酵单胞菌的glf和glk，

所述外源核酸分别独立地插入至所述莽草酸激酶和所述PTS系统至少之一对应的位点中，并且阻断所述莽草酸激酶和所述PTS系统至少之一的表达，

所述重组微生物为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，编码所述莽草酸激酶的基因包括aroL和aroK，所述PTS系统包括ptsHIcrr操纵子。

3.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述外源核酸可操作地与启动子相连，所述启动子包括选自大肠杆菌来源启动子、T7、tac、trc、lac和trp启动子的至少之一。

4.根据权利要求3所述的重组微生物，其特征在于，所述启动子为组成型T7启动子0。

5.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物的基因组中整合有依次串联的第一组成型T7启动子、iolT1、第二组成型T7启动子、glf和glk。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体整合有依次串联的第一组成型T7启动子、iolT1、第二组成型T7启动子、glf和glk。

7.权利要求1～5任一项所述的重组微生物或权利要求6所述的表达载体在制备莽草酸中的用途。

8.一种制备莽草酸的方法，其特征在于，包括：

对权利要求1～5任一项所述的重组微生物进行液体培养；和

从所述液体培养的培养产物中分离莽草酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液体培养包括：

菌体生长阶段，所述菌体生长阶段是在约37摄氏度下进行10～30小时；

莽草酸合成阶段，所述莽草酸合成阶段是在约28～33摄氏度下进行的。

10.一种制备奥司他韦的方法，其特征在于，包括：

按照权利要求8或9所述的方法，制备莽草酸；和

利用所述莽草酸作为中间体，合成奥司他韦。