KR20160127042A - 바이러스성 폐렴의 치료를 위한 c5a의 억제제 - Google Patents

바이러스성 폐렴의 치료를 위한 c5a의 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐렴, 특히 바이러스성 폐렴의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폐렴, 특히 바이러스성 폐렴의 치료를 위한 약학 조성물의 제조에서 C5a의 억제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 폐렴, 특히 바이러스성 폐렴의 치료가 필요한 피험자에게 치료량의 C5a의 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 폐렴, 특히 바이러스성 폐렴의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

바이러스성 폐렴의 치료를 위한 C5A의 억제제{INHIBITORS OF C5A FOR THE TREATMENT OF VIRAL PNEUMONIA}
본 발명은 폐렴, 특히 바이러스성 폐렴의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폐렴, 특히 바이러스성 폐렴의 치료를 위한 약학 조성물의 제조에서 C5a의 억제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 폐렴, 특히 바이러스성 폐렴의 치료가 필요한 피험자에게 치료량의 C5a의 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 폐렴, 특히 바이러스성 폐렴의 치료 방법에 관한 것이다.
C5a
C5a은 보체 활성화시 C5로부터 절단된다. 상기 보체 활성화 산물 중에서, C5a는 광범위한 기능과 함께, 가장 효력 있는 염증성 펩티드 중 하나이다(Guo RF, and Ward PA. 2005. Annu. Rev. Immunol. 23:821-852). C5a는 11.2 kDa의 분자량을 갖는, 건강한 인간의 혈액 중에 존재하는 당단백질이다. C5a의 폴리펩티드 부분은 8.2 kDa의 분자량을 차지하는 74개 아미노산을 함유하는 반면, 탄수화물 부분은 대략 3 kDa을 차지한다. C5a는 고-친화성 C5a 수용체들(C5aR 및 C5L2)을 통해 그의 효과를 발휘한다(Ward PA. 2009. J. Mol. Med. 87(4):375-378). C5aR은 7개의 막관통 분절과 함께 G-단백질-커플링된 수용체의 로돕신-유형 과에 속하고; C5L2는 유사하지만 G-단백질-커플링되지 않는다. 현재, C5a는 C5a-C5L2 상호작용에 대해 몇 가지 생물학적 반응들이 발견되었기 때문에, 주로 C5a-C5aR 상호작용을 통해 그의 생물학적 기능들을 발휘하는 것으로 여겨지고 있다. C5aR은 다수의 기관, 특히 폐 및 간 중의 호중구, 호산구, 호염기구 및 단핵구를 포함한 골수 세포, 및 비-골수 세포상에서 광범위하게 발현되며, 이는 C5a/C5aR 신호전달의 중요성을 암시한다. C5a는 다양한 생물학적 기능들을 갖는다(Guo and Ward, 2005, 상기). C5a는 호중구에 대한 강한 화학유인물질이며 또한 단핵세포 및 대식세포에 대해 화학 주성 활성을 갖는다. C5a는 호중구에서 산화적 폭발(O2 소비)을 일으키며 식작용 및 과립 효소의 방출을 증대시킨다. C5a는 또한 혈관확장제인 것으로 밝혀졌다. C5a는 다양한 세포 유형들로부터의 사이토킨 발현의 조절에 관련되어, 호중구상의 부착 분자의 발현을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. C5a는 염증 반응 쇄의 상류에서 염증 반응 기능화에 강한 유도제 및 촉진제이므로, 질병 환경에서 과도하게 생성될 때 매우 유해하게 되는 것으로 밝혀졌다. 고용량의 C5a는 호중구에 대해 비특이적인 화학주성 "탈감작"을 유도할 수 있고, 이에 의해 광범위한 기능장애를 일으킨다(Huber-Lang M et al. 2001. J. Immunol. 166(2):1193-1199).
C5a는 다수의 염증전 반응을 발휘하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, C5a는 염증전 사이토킨, 예를 들어 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, 및 대식세포 이동 억제 인자(MIF)의 인간 백혈구로부터의 합성 및 방출을 자극한다(Hopken U et al. 1996. Eur J Immunol 26(5):1103-1109; Riedemann NC et al. 2004. J Immunol 173(2):1355-1359; Strieter RM et al. 1992. Am J Pathol 141(2):397-407). Ca5는 폐포상피세포에서 TNF-α, 대식세포 염증성 단백질(MIP)-2, 사이토킨-유도된 호중구 화학유인물질(CINC)-1, 및 IL-1β의 생산에서 LPS와 강한 상승작용적 효과를 생성시킨다(Riedemann NC et al. 2002. J. Immunol. 168(4):1919-1925; Rittirsch D et al. 2008. Nat Rev Immunol 8(10):776-787).
C5a의 봉쇄는 또한 문헌[Klos A. et al. 2009. Mol Immunol 46(14):2753-2766] 및 문헌[Allegretti M. et al (Allegretti M et al. 2005. Curr Med Chem 12(2):217-236]에 부분적으로 고찰된 바와 같이, 패혈증 실험 모델 및 다수의 다른 염증, 예를 들어 허혈/재관류 손상, 신장병, 이식 거부, 말라리아, 류마티스성 관절염, 감염성 장 질병, 염증성 폐 질병, 루푸스-유사 자가-면역 질병, 신경퇴행성 질병 등의 모델에서 보호성인 것으로 입증되었다. 더욱이, 최근에, C5a의 봉쇄는 마우스의 종양 모델에서 강한 치료학적 이점을 보인 것으로 밝혀졌다(Markiewski MM et al. 2008. Nat Immunol 9(11):1225-1235).
조류 인플루엔자
새로운 조류 인플루엔자 H7N9 바이러스가 2013년 2월 중국에서 나타났으며 45건의 치명적인 사례와 함께 총 139명의 환자가 2013년 11월까지 확인되었다(WHO. Human infection with avian influenza A(H7N9) virus - update. http://www.who.int/csr/don/2013_11_06/en/ index.html(2013년 11월 16일에 접근되었다)). H7N9 바이러스 감염으로 감염된 대부분의 중증 사례들은 급성 폐 손상(ALI)을 갖는 바이러스성 폐렴의 징후가 있었으며 이어서 중증 호흡부전 및 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)으로 진행되었고 이는 HPAI(고병원성 조류 인플루엔자) H5N1 바이러스 또는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스로 감염된 환자에서의 병인과 유사하였다(Beigel JH et al. 2005. N Engl J Med 353:1374-1385; Ip WK, et al. 2005. J Infect Dis 191:1697-1704). 지금까지, 이러한 질병을 유효하게 치료하는 것으로 밝혀진 치료 전략은 발견되지 않았다. 축적 중인 연구들은 보체 활성화가 인플루엔자 바이러스로 감염된 중증 환자에서 발생하였고 염증전 매개체의 수준 및 폐 손상과 밀접하게 관련됨을 시사하였다. 중증 pdmH1NI(유행성 인플루엔자 H1N1) 바이러스 감염된 환자는 염증전 매개체의 증가된 생성과 함께 강한 전신 보체 활성화를 갖는 것으로 보고되었다(Berdal JE et al. 2011. J. Infect. 63(4):308-16; Ohta R et al. 2011. Microbiol. Immunol. 55(3):191-8). 또한, 우리의 선행 연구는 폐 조직 섹션 및 혈장 샘플 중의 보체 활성화 산물이 주로 H5N1 감염의 마우스 모델에서 증가하였고, ALI의 병인은 적어도 부분적으로 상기 보체 활성화 및 C3a 및 C5a와 같은 관련된 활성화 산물에 기인할 수 있음을 입증하였다(Sun, S. et al. 2013. Am J Respir Cell Mol Biol 49: 221-230).
보체 시스템은 병원체 침입에 대한 숙주 방어 및 잠재적으로 손상성인 세포 찌꺼기의 청소에 있어서 면역계의 중심적인 부분이다. 그러나, 과도한 보체 활성화는 해로울 수 있는데, 그 이유는 상기 활성화가 조절되지 않는 염증 반응에 기여하여 세포 손상에 이르게할 수 있기 때문이다(Daniel Ricklin & John D Lambris. 2013 J Immunol 190(8):3831-8). 보체는 다양한 임상적 질병들, 예를 들어 허혈/재관류(I/R) 손상, 이식 및 자가면역 질환의 치료에 흥미롭고 유망한 표적이 되고 있다(Lu F. et al. 2013. Cardiovasc. Pathol. 22:75-80; Tillou, X. et al. 2010. Kidney Int. 78:152-159; Manderson AP, et al. 2004. Annu Rev Immunol 22:431-456). 병원체-유발된 질병의 결과에서 보체 활성화의 역할은 상기 병원체-구동된 면역 반응에서 보체 활성화의 잠재적인 "이중 역할"뿐만 아니라 번식 및 병원성을 포함한 병원체 생물학적 특징의 다양성으로 인해 보다 복잡할 수 있기 때문에, 병원체-관련된 염증 질환의 치료를 위한 보체 억제제의 개발을 위해 염증 및 조직 손상을 억제하면서 병원체 청소 기능을 보존하는 것을 고려하는 것이 중요하다.
보체 활성화 산물 C5a는 우세한 염증전 활성을 발휘하며 다수의 질병 모델에서 강한 염증전 및 조절 신호를 매개한다((Klos A. et al. 2009, 상기). 지금까지, C5a 또는 C5aR을 표적화하는 다수의 치료학적 화합물들, 예를 들어 C5a 억제제 C5aIP, C5aR 길항물질 PMX53 및 CCX168이 이식, 패혈증, 관절염, 신장 맥관염 및 암에 유망한 치료학적 이점과 함께 임상전 모델에서 시험되었다(Woodruff, T.M. et al. 2011. Mol. Immunol. 48:1631-1642; Okada, N. et al. 2012. Clin. Exp. Pharmacol. 2:114; Tokodai, K. et al. 2010. Transplantation 90:1358-1365; Kohl, J. 2006. Curr. Opin. Mol. Ther. 8: 529-538). C5a 또는 C5a 수용체의 항체 봉쇄가 플라스모디움 베르게이(Plasmodium berghei) ANKA(PbA) 감염의 마우스 모델에서 과도한 면역 반응을 없애는 것이 또한 입증되었다(Patel, S.N. et al. 2008. J. Exp. Med. 205:1133-1143). 유사하게, HPAI H5N1 바이러스성 폐렴의 마우스 모델을 사용하는 우리의 선행 연구는 항-C5a 처리가 폐 손상을 현저하게 약독화하고 생존률을 개선시킴을 밝혔다(Sun, S. et al. 2013, 상기). 막 공격 복합체(MAC)는 다시 병원체를 침범하는 선천성 숙주 방어에 필수적인 역할을 하기 때문에, MAC 형성의 가지를 본래대로 두면서 병원체 감염으로부터 유래된 염증 반응을 억제하는 C5a 봉쇄 전략을 적용하는 것이 유리한 것으로 보인다.
본 발명에 근원적인 기술적 문제
본 발명에 근원적인 문제들 중 하나는 바이러스성 폐렴의 치료, 특히 새로운 조류 인플루엔자 H7N9 바이러스에 의해 야기된 바이러스성 폐렴의 치료를 위한 치료학적 접근법의 제공이었다.
지금까지는 항-C5a 치료가 새로운 조류 인플루엔자 바이러스 H7N9에 의해 야기된 바이러스성 폐렴의 치료에 유효할 것인지가 연구되지 않았다. 선행의 연구들은 다른 조류 인플루엔자 바이러스들(H5N1; 상기 문헌[Sun, S. et al. 2013] 참조)에 집중하였으며 단지 상기 조류 인플루엔자 바이러스에 의해 야기된 바이러스성 폐렴을 연구하기 위해 마우스 모델을 사용했을 뿐이다. 마우스 모델로부터의 긍정적인 결과가 인간 환자의 실제적인 치료로 항상 이행될 수 있는 것은 아니다.
본 출원의 발명자들은 H7N9 바이러스-유발된 중증 폐렴의 치료에서 보체 억제의 치료학적 가능성을 탐구하기 위해서 H7N9 바이러스 감염의 원숭이 모델에서 인간 C5a에 대해 매우 효력 있는 중화 mAb인 IFX-1(현재 임상 개발 중에 있다)을 적용하였다. 우리가 알고 있는 바로는, 이는 바이러스성 폐렴의 항-C5a 치료가 원숭이 모델에서 연구된 최초이다.
하기에 나타낸 실험 섹션의 데이터는 과도한 보체 활성화가 H7N9 감염에서 발생하며 이는 ALI(급성 폐 손상) 및 전신 염증의 발생에 기여할 수 있음을 입증한다.
본 발명자들은 H7N9 감염된 원숭이에서 항-C5a 처리가, 처리되지 않은 감염된 아프리카 녹색 원숭이에 비해 ALI를 실질적으로 약독화시켜 폐 조직병리학적 손상 점수를 강하게 감소시킬 뿐만 아니라 대식세포 및 호중구의 폐 침윤을 감소시킴을 발견하였다. 또한, H7N9에 의해 야기된 감염성 SIRS(전신 염증 반응 증후군)의 강도가, 체온 증가 및 염증 매개체의 혈장 수준 모두의 현저한 감소에 의해 입증되는 바와 같이 IFX-1 처리에 의해 현저하게 감소되었다. AGM의 감염된 폐에서 바이러스 역가는 IFX-1 처리에 의해 뜻밖에도 감소되었다. 이는 바이러스 복제에서 C5a의 관련을 암시하는 기전이 알려지지 않았기 때문에 매우 놀라운 것이다.
상기 결과는 보체 억제가 중증 바이러스성 폐렴의 보조 치료에 매우 유망한 전략임을 암시한다. C5a 억제제의 투여와 관련된 치료학적 효과는 매우 탁월하여 C5a 억제제에 기반한 바이러스성 폐렴의 단독요법조차도 실행가능한 것으로 보인다.
상기 개관은 본 발명과 관련된 이점들 및 본 발명에 의해 해결되는 문제들을 반드시 모두 개시하는 것은 아니다.
발명의 요약
첫 번째 태양에서 본 발명은 바이러스성 폐렴을 앓고 있는 피험자에서 바이러스 부하의 감소 및/또는 급성 폐 손상(ALI)의 감소에 사용하기 위한 C5a의 억제제에 관한 것이다.
두 번째 태양에서 본 발명은 피험자에서 폐렴(바람직하게는 바이러스성 폐렴)의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제에 관한 것이며, 여기에서 상기 억제제는 단독요법으로서 사용하기 위한 것이다.
세 번째 태양에서 본 발명은 피험자에서 바이러스성 폐렴의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제에 관한 것이며, 여기에서 상기 피험자에서 바이러스성 폐렴은 H7N9 바이러스에 의해 야기된다.
네 번째 태양에서 본 발명은 피험자에서 폐렴(바람직하게는 바이러스성 폐렴)의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제에 관한 것이며, 여기에서 상기 피험자는 영장류, 바람직하게는 유인원, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 상기 요약은 본 발명의 특징들을 반드시 모두 개시하는 것은 아니다.
정의
본 발명을 하기에 상세히 개시하기 전에, 본 발명은 본 발명에 개시된 특정 방법, 프로토콜 및 시약들(이들은 변할 수 있으므로)로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명에 사용된 용어는 단지 특정 실시태양들을 개시하기 위한 것이며 오직 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 과학기술 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게, 본 발명에 사용된 용어들은 "다중언어 생물공학 용어 사전:(IUPAC 추천)"(Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)에 개시된 바와 같이 정의된다.
본 명세서 및 하기의 특허청구범위 전체를 통해서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다"란 단어 및 "포함하는" 및 "포함하고 있는"과 같은 어미변화는 서술된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹도 제외하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
여러 문헌들(예를 들어 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 명세서, 설명서, 진뱅크(GenBank) 수납 번호 서열 제출물 등)은 본 명세서의 본문 전체에 걸쳐 인용된다. 본 발명의 어디에도 본 발명이 선행 발명에 의한 상기와 같은 명세에 앞서는 자격이 없음을 인정하는 것으로서 해석되는 것은 없다. 본 발명에 인용된 상기 문헌들 중 일부는 "참고로 인용되는" 것으로서 묘사된다. 상기와 같이 인용된 참고문헌의 정의 또는 교시와 본 명세서에 인용된 정의 또는 교시가 불일치하는 경우, 본 명세서의 본문이 우선한다.
서열: 본 발명에서 언급된 모든 서열들은, 그의 전체 내용 및 개시와 함께 본 명세서의 일부인 첨부된 서열 목록에 개시된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "인간 C5a"는 하기 74개 아미노산 펩티드를 지칭한다:
TLQKKIEEIA AKYKHSVVKK CCYDGACVNN DETCEQRAAR ISLGPRCIKA FTECCVVASQ LRANISHKDM QLGR (서열번호 1).
본 발명에 사용되는 바와 같이, "인간 C5a"란 용어는 상기 74개 아미노산 펩티드의 글리코실화된 형태 및 탈글리코실화된 형태를 지칭한다. "인간 C5a" 및 "hC5a"란 용어는 본 발명에서 호환적으로 사용된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "C5a의 억제제"란 용어는 C5a의 생물학적 활성을 억제하는 화합물을 지칭한다. "C5a의 억제제"란 용어는 특히 C5a의 C5a 수용체, C5aR 및 C5L2에의 결합을 방해하는 화합물; 특히 C5a의 C5aR에의 결합을 방해하는 화합물을 지칭한다. 상응하게, "C5a의 억제제"란 용어는 C5a에 특이적으로 결합하고 C5a의 C5aR에의 결합을 억제하는 화합물뿐만 아니라 C5aR에 특이적으로 결합하고 C5a의 C5aR에의 결합을 억제하는 화합물을 포함한다. C5a의 예시적인 억제제는 C5a 억제성 펩티드(C5aIP), 선택성 C5a 수용체 길항물질 PMX53 및 CCX168, 및 WO 2011/063980 A1(또한 US 2012/0231008 A1으로서 공개됨)에 개시된 항-C5a 항체를 포함한다. "C5a의 억제제" 및 "C5a 억제제"란 용어는 본 발명에서 호환적으로 사용된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "결합 모이어티"란 용어는 표적 분자 또는 표적 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 또는 분자의 부분을 지칭한다. 본 출원과 관련하여 바람직한 결합 모이어티는 (a) 항체 또는 그의 항원-결합 단편; (b) 올리고뉴클레오티드; (c) 항체-유사 단백질; 또는 (d) 펩티드유사물질이다. 본 발명의 실시에 특히 매우-적합한 예시적인 "결합 모이어티"는 2개의 아미노산 서열 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)에 의해 형성되는 인간 C5a의 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 실시에 특히 매우-적합한 추가의 예시적인 "결합 모이어티"는 2개의 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 및 HKDMQ(서열번호 5)에 의해 형성되는 인간 C5a의 입체형태적 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 제1 화합물(예를 들어 항체)은, 상기 화합물이 제2 화합물에 대해, 1 mM 이하, 바람직하게는 100　μM 이하, 바람직하게는 50　μM 이하, 바람직하게는 30　μM 이하, 바람직하게는 20　μM 이하, 바람직하게는　10 μM 이하, 바람직하게는 5　μM 이하, 보다 바람직하게는 1　μM 이하, 보다 바람직하게는 900　nM 이하, 보다 바람직하게는 800　nM 이하, 보다 바람직하게는 700　nM 이하, 보다 바람직하게는 600　nM 이하, 보다 바람직하게는 500　nM 이하, 보다 바람직하게는 400　nM 이하, 보다 바람직하게는 300　nM 이하, 보다 바람직하게는 200　nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 100　nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 90　nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 80　nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 70　nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 60　nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 50　nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 40　nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 30　nM 이하, 훨씬 더 바람직하게는 20　nM 이하, 및 훨씬 더 바람직하게는 10　nM 이하의 해리 상수 Kd를 갖는 경우, 상기 제2 화합물(예를 들어 항원, 예를 들어 표적 단백질)에 "결합하는" 것으로 간주된다.
본 발명에 따른 "결합하는"이란 용어는 바람직하게는 특이적인 결합에 관한 것이다. "특이적인 결합"은 결합 모이어티(예를 들어 항체)가 또 다른 표적에의 결합에 비해 특이적인 표적, 예를 들어 에피토프에 더 강하게 결합함을 의미한다. 결합 모이어티는, 상기 부분이 제2 표적에 대한 해리 상수(Kd)보다 낮은 해리 상수로 제1 표적에 결합하는 경우, 상기 제2 표적에 비해 상기 제1 표적에 더 강하게 결합한다. 바람직하게 상기 결합 모이어티가 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리 상수(Kd)는 상기 결합 모이어티가 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리 상수(Kd)보다 10배초과, 바람직하게 20배 초과, 보다 바람직하게 50배 초과, 훨씬 더 바람직하게 100배, 200배, 500배 또는 1000배 초과하여 더 낮다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "Kd"(대개는 "mol/L"로 측정됨, 때때로 "M"으로서 약기됨)란 용어는 결합 모이어티(예를 들어 항체 또는 그의 단편)와 표적 분자(예를 들어 항원 또는 그의 에피토프)간의 특정한 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭하고자 한다. 본 출원과 관련하여, 상기 "Kd" 값을 실온(25 ℃)에서 표면 플라스몬 공명 분광학[비아코어(Biacore™)]에 의해 측정한다.
"에피토프"(또한 항원 결정인자로서 공지됨)는 면역계, 구체적으로 항체, B 세포, 또는 T 세포에 의해 인식되는 거대분자의 부분이다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 본 발명에 개시되는 바와 같은 결합 모이어티(예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편)에 결합할 수 있는 거대분자의 부분이다. 이와 관련하여, "결합"이란 용어는 바람직하게는 특이적인 결합에 관한 것이다. 에피토프는 대개 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹들로 이루어지며 대개는 특정한 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비-입체형태적 에피토프는 상기 입체형태적 에피토프에 대한 결합이 변성 용매의 존재하에서 상실되지만 비-입체형태적 에피토프는 그렇지 않다는 점에서 구분될 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "입체형태적 에피토프"는 상기 거대분자의 3차원 구조에 의해 형성되는 선형 거대분자(예를 들어 폴리펩티드)의 에피토프를 지칭한다. 본 출원과 관련하여, "입체형태적 에피토프"는 "불연속적인 에피토프", 즉 상기 거대분자의 1차 서열(예를 들어 폴리펩티드의 아미노산 서열) 중의 적어도 2개의 별도의 영역으로부터 형성되는 거대분자(즉 폴리펩티드)상의 입체형태적 에피토프이다. 즉, 에피토프는, 상기 에피토프가 본 발명의 결합 모이어티(예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편)가 동시에 결합하는 1차 서열 중의 적어도 2개의 별도의 영역들로 이루어지는 경우, 본 발명과 관련하여 "입체형태적 에피토프"인 것으로 간주되며, 여기에서 이들 적어도 2개의 별도의 영역들은 본 발명의 결합 모이어티가 결합하지 않는 상기 1차 서열 중의 하나 이상의 영역들에 의해 중단된다. 바람직하게, 상기와 같은 "입체형태적 에피토프"는 폴리펩티드상에 존재하고, 상기 1차 서열 중 2개의 별도의 영역들은 본 발명의 결합 모이어티(예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편)가 결합하는 2개의 별도의 영역들이며, 여기에서 이들 적어도 2개의 별도의 영역들은 본 발명의 결합 모이어티가 결합하지 않는 상기 1차 서열 중의 하나 이상의 영역들에 의해 중단된다. 바람직하게, 상기 중단시키는 아미노산 서열은 상기 결합 모이어티가 결합하지 않는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 연속적인 아미노산 서열이다. 본 발명의 결합 모이어티가 결합하는 상기 적어도 2개의 별도의 아미노산 서열은 그의 길이에 관하여 특별히 제한되지 않는다. 상기와 같은 별도의 아미노산 서열은 상기 적어도 2개의 별도의 아미노산 서열내의 아미노산의 총수가 상기 결합 모이어티와 상기 입체형태적 에피토프간의 특이적인 결합을 수행하기에 충분히 긴한은 단지 하나의 아미노산으로 이루어질 수도 있다.
"파라토프"는 상기 에피토프에 결합하는 항체의 부분이다. 본 발명과 관련하여, "파라토프"는 상기 에피토프에 결합하는 본 발명에 개시된 바와 같은 결합 모이어티(예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편)의 부분이다.
"항체"란 용어는 전형적으로 디설파이드 결합에 의해 상호-연결되는 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 당단백질, 또는 그의 항원-결합 모이어티를 지칭한다. "항체"란 용어는 또한 항체, 특히 본 발명에 개시된 항체의 모든 재조합 형태들, 예를 들어 원핵생물에서 발현된 항체, 글리코실화되지 않은 항체, 진핵생물(예를 들어 CHO 세포)에서 발현된 항체, 글리코실화된 항체, 및 하기에 개시하는 바와 같은 임의의 항원-결합 항체 단편 및 유도체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 발명에서 VH 또는 VH로서 약기됨) 및 중쇄 불변 영역(본 발명에서 CH 또는 CH로서 약기됨)으로 구성된다. 상기 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3(또는 CH1, CH2 및 CH3)로서 지칭되는, 3개의 부분으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 발명에서 VL 또는 VL로서 약기됨) 및 경쇄 불변 영역(본 발명에서 CL 또는 CL로서 약기됨)으로 구성된다. 상기 VH 및 VL 영역을, 보다 보존된 영역(프레임워크 영역(FR)이라 지칭됨)과 산재된, 고가변성 영역(상보성 결정 영역(CDR)이라 지칭됨)으로 추가로 세분할 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 상기 항체의 불변 영역들은 면역글로불린의 숙주 조직 또는 인자, 예를 들어 면역계의 다양한 세포들(예를 들어 효과기 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)에의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 항체의 "항원-결합 단편"(또는 간단히 "결합 모이어티")란 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 완전-길이 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원-결합 모이어티"란 용어내에 포함된 결합 단편들의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어지는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 가지의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 결합될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합을 포함한다. 더욱 또한, 상기 Fv 단편의 2개 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들을 재조합 방법을 사용하여, 상기 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단쇄 Fv(scFv)로서 공지됨; Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883을 참조하시오)를 형성하는 단일 단백질쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 결합시킬 수 있다. 상기와 같은 단쇄 항체를 또한 항체의 "항원-결합 단편"이란 용어내에 포함시키고자 한다. 추가의 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되는 결합 도메인 폴리펩티드, (ii) 상기 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, 및 (iii) 상기 CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 상기 결합 도메인 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 상기 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질들은 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 추가로 개시된다. 이들 항체 단편을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수득하며, 상기 단편들을 완전한 항체의 경우와 동일한 방식으로 유용성에 대해 선별한다. "항원-결합 단편"의 추가적인 예는 소위 마이크로항체이며, 이는 단일 CDR로부터 유래된다. 예를 들어 문헌[Heap et al., 2005]은 HIV-1의 gp120 외피 당단백질에 대한 항체의 중쇄 CDR3으로부터 유래된 17 아미노산 잔기 마이크로항체를 개시한다(Heap C.J. et al. (2005) Analysis of a 17- amino acid residue, virus - neutralizing microantibody . J. Gen. Virol. 86:1791-1800). 다른 예는 바람직하게는 동족 프레임워크 영역에 의해 서로 융합되는 2개 이상의 CDR 영역을 포함하는 작은 항체 유사물질을 포함한다. 동족 VH FR2에 의해 연결된 VH CDR1 및 VL CDR3을 포함하는 상기와 같은 작은 항체 유사물질은 문헌[Qiu X.-Q. et al. (2007) Small antibody mimetics comprising two complementary - determining regions and a framework region for tumor targeting . Nature biotechnology 25(8):921-929]에 개시되었다.
따라서, 본 발명에 사용되는 바와 같은 "항체 또는 그의 항원-결합 단편"이란 용어는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역 활성 부분, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 또한, 예를 들어 표적 분자 또는 표적 에피토프, 예를 들어 서열번호 2 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 인간 C5a의 입체형태적 에피토프; 또는 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 및 HKDMQ(서열번호 5)에 의해 형성된 인간 C5a의 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하는 파지 디스플레이를 포함하는 기법들을 통해 선택된 면역글로불린-유사 단백질이 포함된다. 본 발명의 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어 IgG1, IgG2, 바람직하게는 IgG2a 및 IgG2b, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
본 발명에 유용한 항체 및 그의 항원-결합 단편은 조류 및 포유동물을 포함한 임의의 동물 기원의 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 항체 또는 단편은 인간, 침팬지, 설치류(예를 들어 마우스, 래트, 기니피그, 또는 토끼), 닭, 칠면조, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개 기원의 것이다. 상기 항체는 인간 또는 뮤린 기원의 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 항체는 또한 하나의 종, 바람직하게는 인간으로부터 유래된 항체 불변 영역이 또 다른 종, 예를 들어 마우스로부터 유래된 항원 결합 부위와 병용되는 키메릭 분자를 포함한다. 더욱이, 본 발명의 항체는 비-인간 종(예를 들어 마우스)으로부터 유래된 항체의 항원 결합 부위가 인간 기원의 불변 및 프레임워크 영역과 병용되는 인간화된 분자를 포함한다.
본 발명에 예시된 바와 같이, 본 발명의 항체를 상기 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 획득하거나, 또는 클로닝하여 숙주 세포(예를 들어 CHO 세포, 또는 림프구 세포)에서 재조합적으로 발현시킬 수 있다. 숙주 세포의 추가의 예는 미생물, 예를 들어 이 콜라이, 및 진균, 예를 들어 효모이다. 한편으로, 상기 세포는 트랜스제닉 비-인간 동물 또는 식물에서 재조합적으로 생산된다.
"키메릭 항체"란 용어는 중쇄 및 경쇄의 각각의 아미노산 서열의 한 부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열에 상동성이면서 상기 쇄의 나머지 분절은 또 다른 종 또는 부류의 상응하는 서열에 상동성인 항체를 지칭한다. 전형적으로 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 포유동물의 한 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 영역은 또 다른 종으로부터 유래된 항체의 서열에 상동성이다. 상기와 같은 키메릭 형태에 대한 한 가지 분명한 이점은 상기 가변 영역을, 예를 들어 인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 함께 비-인간 숙주 유기체로부터 쉽게 입수할 수 있는 B-세포 또는 하이브리도마를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 편리하게 획득할 수 있다는 것이다. 상기 가변 영역은 제조 용이성의 이점을 갖고 특이성은 상기 공급원에 의해 영향을 받지 않지만, 인간인 불변 영역은 상기 항체 주입시 인간 피험자에서 면역 반응을 이끌어내기가 비-인간 공급원으로부터의 불변 영역에서보다 덜한 듯하다. 그러나, 상기 정의는 상기 특정한 예로 제한되지 않는다.
"인간화된 항체"란 용어는 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 실질적으로 유래된 항원-결합 부위를 갖는 분자를 지칭하며, 여기에서 상기 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열을 기본으로 한다. 상기 항원-결합 부위는 불변 도메인상에 융합된 완전한 가변 도메인을 포함하거나 또는 오직 상기 가변 도메인 중의 적합한 프레임워크 영역상에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형이거나 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다, 예를 들어 인간 면역글로불린을 보다 가깝게 닮도록 변형될 수 있다. 인간화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열(예를 들어 마우스 항체로부터의 6개 CDR을 전부 함유하는 인간화된 마우스 항체)을 보존한다. 다른 형태들은 원래 항체에 대해 변경된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
여러 가지의 항체 인간화 방법들이 문헌[Almagro & Fransson, 2008, Frontiers in Bioscience, 13:1619-1633](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 고찰된 바와 같이, 숙련가에게 공지되어 있다. 상기 알마그로와 프랜슨의 고찰 논문은 US 2012/0231008 A1(국제 특허 출원 WO 2011/063980 A1의 국내 단계 진입이다)에 간단히 요약되어 있다. 상기 US 2012/0231008 A1 및 WO 2011/063980 A1의 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "인간 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 본 발명의 인간 항체는 예를 들어 미국특허 제 5,939,598 호(Kucherlapati & Jakobovits)에 개시된 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 트랜스제닉인 동물로부터 단리되었고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 항체들을 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일의 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 불멸화된 세포에 융합된 비-인간 동물, 예를 들어 마우스로부터 획득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "재조합 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리되는 모든 항체, 예를 들어 (a) 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마에 대해 트랜스제닉이거나 트랜스염색체성인 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 예를 들어 형질감염종으로부터의 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열에의 이어맞추기를 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 항체를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "형질감염종"이란 용어는 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 포함한 진균과 같은, 항체를 발현하는 재조합 진핵생물 숙주 세포를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "이종 항체"는 상기와 같은 항체를 생산하는 트랜스제닉 유기체에 관하여 정의된다. 상기 용어는 트랜스제닉 유기체로 이루어지지 않고 상기 트랜스제닉 유기체 이외의 종으로부터 일반적으로 유래되는 유기체에서 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 암호화 핵산 서열을 갖는 항체를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "헤테로하이브리드 항체"는 상이한 유기체 기원의 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 뮤린 경쇄와 결합된 인간 중쇄를 갖는 항체가 헤테로하이브리드 항체이다.
따라서, 본 발명에 사용하기에 적합한 "항체 및 그의 항원-결합 단편"은 비제한적으로 다클론, 단클론, 1가, 이중특이성, 이종접합체, 다중특이성, 재조합성, 이종, 헤테로하이브리드, 키메릭, 인간화된(특히 CDR-이식된), 탈면역된, 또는 인간 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, Fd, Fv, 디설파이드-연결된 Fv(dsFv), 단쇄 항체(예를 들어 scFv), 디아바디 또는 테트라바디(Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14), 6444-6448), 나노바디(또한 단일 도메인 항체로서 공지됨), 항-유전물질형(항-Id) 항체(예를 들어 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함한다.
본 발명에 개시된 항체를 바람직하게는 단리시킨다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하고자 한다(예를 들어 C5a에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 C5a 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, 인간 C5a의 에피토프, 동형 또는 변체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 예를 들어 다른 종들(예를 들어 C5a 종 동족체, 예를 들어 래트 C5a)로부터의 다른 관련 항원에 교차-특이성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수도 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, "단리된" 단클론 항체들의 조합은 상이한 특이성을 갖고 충분히 한정된 조성으로 병용되는 항체들에 관한 것이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "천연"이란 용어는 사물에 적용될 때 사물이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함) 중에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 천연이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "핵산 앱타머"란 용어는 시험관내 선택 또는 SELEX(급격한 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)의 반복된 라운드를 통해 표적 분자에 결합하도록 조작된 핵산 분자를 지칭한다(고찰을 위해 문헌[Brody E.N. and Gold L. (2000), Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J. Biotechnol. 74(1):5-13]을 참조하시오). 상기 핵산 엡타머는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 상기 앱타머는 변형, 예를 들어 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 2'-불소-치환된 피리미딘을 함유할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "항체-유사 단백질"이란 용어는 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 조작된(예를 들어 고리의 돌연변이유발에 의해) 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 상기와 같은 항체-유사 단백질은 단백질 스캐폴드에 양쪽 단부에서 부착된 적어도 하나의 가변 펩티드 고리를 포함한다. 이러한 이중 구조 구속은 상기 항체-유사 단백질의 결합 친화성을 항체의 경우에 필적하는 수준으로 크게 증가시킨다. 상기 가변 펩티드 고리의 길이는 전형적으로 10 내지 20개 아미노산이다. 상기 스캐폴드 단백질은 양호한 용해성 성질을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게, 상기 스캐폴드 단백질은 작은 구상 단백질이다. 항체-유사 단백질은 비제한적으로 애피바디, 안티칼린, 및 설계된 안키린 반복 단백질을 포함한다(고찰을 위해서 문헌[Binz H.K. et al. (2005) Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol. 23(10):1257-1268]을 참조하시오). 항체-유사 단백질은 큰 돌연변이체 라이브러리로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어 큰 파지 디스플레이 라이브러리로부터 골라낼 수 있고, 규칙 항체와 유사하게 단리시킬 수 있다. 또한, 항체-유사 결합 단백질을 구상 단백질 중의 표면-노출된 잔기의 조합적 돌연변이유발에 의해 수득할 수 있다. 항체-유사 단백질을 때때로 "펩티드 앱타머"라 칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "펩티드유사물질"은 펩티드를 모방하도록 설계된 작은 단백질-유사 쇄이다. 펩티드유사물질은 전형적으로 상기 분자의 성질을 변경시키기 위한 기존 펩티드의 변형으로부터 발생한다. 예를 들어, 상기 물질은 상기 분자의 안정성 또는 생물학적 활성을 변화시키기 위한 변형으로부터 발생한다. 상기는 기존의 펩티드로부터 약물-유사 화합물의 개발에 한 역할을 가질 수 있다. 이러한 변형은 자연에서 발생하지 않을 상기 펩티드에 대한 변화(예를 들어 변경된 주쇄 및 비천연 아미노산의 통합)를 수반한다.
"보존적인 치환"은 예를 들어 관련된 아미노산 잔기의 극성, 전하, 크기, 용해성, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질의 유사성을 근거로 수행될 수 있다. 아미노산들을 하기 6개의 표준 아미노산 그룹들로 분류할 수 있다:
(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "보존적인 치환"은 상기에 나타낸 6개 표준 아미노산 그룹의 동일 그룹내에 나열된 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로서 정의된다. 예를 들어, Glu에 의한 Asp의 교환은 그렇게 변형된 폴리펩티드 중에 하나의 음전하를 유지한다. 또한, 글리신 및 프롤린을 α-나선을 붕괴시키는 그들의 능력을 근거로 서로 치환시킬 수 있다. 상기 6개 그룹내의 일부 바람직한 보존적인 치환은 하기 하위-그룹들내에서 교환된다: (i) Ala, Val, Leu 및 Ile; (ii) Ser 및 Thr; (iii) Asn 및 Gln; (iv) Lys 및 Arg; 및 (v) Tyr 및 Phe. 공지된 유전자 암호, 및 재조합 및 합성 DNA 기법이 제공되는 경우, 숙련된 과학자는 상기 보존적 아미노산 변체를 암호화하는 DNA를 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "비-보존적인 치환" 또는 "비-보존적인 아미노산 교환"은 상기에 나타낸 6개 표준 아미노산 그룹 (1) 내지 (6)의 상이한 그룹에 나열된 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로서 정의된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 포함하는"이란 표현은 상기와 같이 변형된 아미노산 서열이 3개 이하의 아미노산 교환(바람직하게는 보존적인 아미노산 교환), 3개 이하의 아미노산 결실, 및 3개 이하의 아미노산 부가를 함유하는 것으로 이해해야 한다. 결과적으로, 상기와 같이 특성화된 아미노산 서열은 최대 9개의 아미노산 변형(3개의 교환 + 3개의 결실 + 3개의 부가)을 갖는다. 상응하게, 상기-언급된 표현은, 비록 "포함하는"이란 용어가 다른 상황에서는 개방적인 표현으로서 이해되지만, 폐쇄된 표현이다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "생물학적 활성"은 폴리펩티드가 나타낼 수 있는 임의의 활성, 예를 들어 비제한적으로 효소 활성; 또 다른 화합물에의 결합 활성(예를 들어 또 다른 폴리펩티드에의 결합, 특히 수용체에의 결합, 또는 핵산에의 결합); 억제 활성(예를 들어 효소 억제 활성); 활성화 활성(예를 들어 효소-활성화 활성); 또는 독성 효과를 지칭한다. 폴리펩티드의 변체 및 유도체에 관하여, 상기 변체 또는 유도체는 모 폴리펩티드와 같은 정도로 상기와 같은 활성을 나타낼 필요는 없다. 변체는, 상기 변체가 모 폴리펩티드 활성의 적어도 10%(예를 들어 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%) 정도로 관련된 활성을 나타내는 경우, 본 출원의 상황내에서 변체로서 간주된다. 마찬가지로, 유도체는, 상기 유도체가 모 폴리펩티드 활성의 적어도 10% 정도로 관련된 생물학적 활성을 나타내는 경우 본 출원의 상황내에서 유도체로서 간주된다. 본 발명의 상황에서 특별히 관련된 "생물학적 활성"은 서열번호 2 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 인간 C5a의 입체형태적 에피토프에 대한 결합 활성이다. 바람직하게, 본 발명의 상황에서 상기 관련된 "생물학적 활성"은 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 및 KDM에 의해 형성된 인간 C5a의 입체형태적 에피토프에 대한 결합 활성이다. 결합 활성의 측정을 위한 분석은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지되어 있으며 ELISA 및 표면 플라스몬 공명 분석을 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "환자"는 본 발명에 개시된 C5a의 억제제에 의한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 포유동물 또는 조류를 의미한다. 바람직하게, "환자"는 실험 동물(예를 들어 마우스 또는 래트), 가축(예를 들어 기니 피그, 토끼, 닭, 칠면조, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개 포함), 또는 원숭이를 포함한 영장류(예를 들어 아프리카 녹색 원숭이, 챔팬지, 난쟁이 침팬지, 고릴라) 및 인간으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 상기 "환자"는 인간이 특히 바람직하다. "환자" 및 "치료되는 피험자"(또는 단순히 "피험자")란 용어는 본 발명에서 호환적으로 사용된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "원숭이"란 용어는 문맥상 달리 말하지 않는 한 임의의 비-인간 영장류 동물을 지칭한다. 예를 들어, 하기 "실시예" 섹션에서, "원숭이"란 용어는 전형적으로 "아프리카 녹색 원숭이"에 대한 약기로서 사용된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "유인원"이란 용어는 유인원 생물학적 상과에 속하는 구세계 유인원 포유동물을 지칭하며, 상응하게 긴팔원숭이(힐로바티다에(Hilobatidae)과), 오랑우탄(퐁고(Pongo) 속), 고릴라(고릴라(Gorilla) 속, 챔팬지(판(Pan) 속) 및 인간(호모(Homo) 속)을 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 질병 또는 질환을 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 하기 중 하나 이상을 수행함을 의미한다: (a) 상기 질환의 중증도 및/또는 지속기간을 감소시킴; (b) 치료되는 질환(들)의 특징적인 증상의 발생을 제한하거나 예방함; (c) 치료되는 질환(들)의 특징적인 증상의 악화를 억제함; (d) 앞서 질환(들)이 있었던 환자에서 상기 질환(들)의 재발을 제한하거나 예방함; 및 (e) 앞서 상기 질환(들)의 징후를 나타내었던 환자에서 증상의 재발을 제한하거나 예방함.
본 발명에 사용되는 바와 같이, 질병 또는 질환을 "예방하다", "예방하는", "예방" 또는 "예방학"은 일정량의 시간 동안 피험자에서 질환이 발생하는 것을 방지함을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 C5a의 억제제(예를 들어 항-C5a 항체 또는 그의 항원-결합 단편)를 질병 또는 질환의 예방을 목적으로 피험자에게 투여하는 경우, 상기 질병 또는 질환이 적어도 투여일 및 바람직하게는 또한 상기 투여일 다음의 하루 이상의 날(예를 들어 1 내지 30일; 또는 2 내지 28일; 또는 3 내지 21일; 또는 4 내지 14일; 또는 5 내지 10일)에 발생하는 것이 예방된다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "투여하는"은 생체내 투여뿐만 아니라 생체외 조직, 예를 들어 정맥 이식편에의 직접적인 투여를 포함한다.
본 발명에 따른 "약학 조성물"은 조성물의 형태로 존재할 수 있으며, 여기에서 여러 가지 활성 성분 및 희석제 및/또는 담체가 서로 혼합되거나, 또는 복합 제제의 형태를 취할 수 있으며, 이때 상기 활성 성분들은 부분적으로 또는 전적으로 별개의 형태로 존재한다. 상기와 같은 조합 또는 복합 제제의 예는 부분들의 키트(kit-of-parts) 이다.
"유효량"은 의도한 목적을 성취하기에 충분한 치료제의 양이다. 제공되는 치료제의 유효량은 인자들, 예를 들어 상기 치료제의 성질, 투여 경로, 상기 치료제를 수용하는 피험자의 크기 및 종, 및 투여 목적에 따라 변할 것이다. 각각의 개별적인 경우에 유효량은 당해 분야에 확립된 방법에 따라 숙련가에 의해 실험적으로 측정될 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "보조요법"이란 용어는 적어도 2개의 상이한 약물이 환자에게 투여되는 복합 요법을 지칭한다. 이들 적어도 2개의 상이한 약물을 상기 두 약물을 모두 함유하는 하나의 단일 약학 조성물로 제형화할 수 있다. 한편으로, 각각의 약물을 별도의 약학 조성물로 제형화할 수 있으며 상기 약학 조성물을 환자에게 별도로 투여한다(예를 들어 상이한 시점에서 및/또는 상이한 투여 경로에 의해서). 상기 후자의 대안에서, 상기 (적어도) 2개의 상이한 약물들은 부분들의 키트 중에 존재할 수 있다. 본 명세는 특히 항바이러스제에 의한 항바이러스 치료에 대한 보조 요법으로서 C5a 억제제에 의한 치료법을 특징으로 한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "항바이러스제"란 용어는 비제한적으로 뉴라미니다제 억제제(예를 들어 경구 흡입되는 자나미비어 또는 경구 오셀타미비어) 및 바이러스-특이성 항체를 포함한다.
"약학적으로 허용 가능한"은 동물 및 보다 특히 인간에의 사용에 대해 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나 또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열됨을 의마한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "담체"란 용어는 상기 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 상기와 같은 약학 담체는 멸균 액체, 예를 들어 물 및 오일, 예를 들어 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 대두 오일, 무기 오일, 참깨 오일 등 중의 염수 용액일 수 있다. 상기 약학 조성물을 정맥내로 투여하는 경우 염수 용액이 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액을 또한, 특히 주사성 용액에 대한 액체 담체로서 사용할 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀가루, 백악, 실리카젤, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화 나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 상기 조성물은 또한 목적하는 경우 소량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유화액, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 상기 조성물을 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들어 트리글리세라이드와 함께 좌약으로서 제형화할 수 있다. 본 발명의 화합물을 중성 또는 염 형태로서 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 유리 아미노기와 형성된 염, 예를 들어 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 염, 및 유리 카복실기와 형성된 염, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 약학적 담체의 예는 이 더블유 마틴(E.W. Martin)의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences"]에 개시되어 있다. 상기와 같은 조성물은 환자에게 적합한 투여를 위한 형태를 제공하기에 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태의 치료 유효량의 상기 화합물을 함유할 것이다. 상기 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
분자 생물학, 세포 생물학, 단백질 화학 및 항체 기법의 분야에 일반적으로 공지되고 실행되는 방법들은 연속적으로 갱신되는 하기의 발행물들에 충분히 개시되어 있다: "분자 클로닝: 실험 매뉴얼", (Sambrook et al., Cold Spring Harbor); 분자 생물학의 현행 프로토콜 (F. M. Ausubel et al. Eds., Wiley & Sons); 단백질 과학의 현행 프로토콜 (J. E. Colligan et al. Eds., Wiley & Sons); 세포 생물학의 현행 프로토콜 (J. S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) 및 면역학의 현행 프로토콜 (J. E. Colligan et al., Eds., Wiley & Sons). 세포 배양 및 배지와 관련된 공지된 기법들은 하기 문헌들에 개시되어 있다: "대규모 포유동물 세포 배양" (D. Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:148-153, 1997); "무혈청 배지" (K. Kitano, Biotechnol. 17:73-106, 1991); 및 "포유동물 세포의 현탁 배양" (J.R. Birch et al. Bioprocess Technol. 10:251-270, 1990).
발명의 실시태양
본 발명을 이제 추가로 개시할 것이다. 하기에서 본 발명의 상이한 태양들을 보다 상세히 정의한다. 하기에 정의된 각각의 태양을 달리 명백히 지시되지 않는 한 임의의 다른 태양 또는 태양들과 병행할 수 있다. 특히, 바람직하거나 이로운 것으로서 나타낸 임의의 특징을 바람직하거나 이로운 것으로서 나타낸 임의의 다른 특징 또는 특징들과 병행할 수 있다.
첫 번째 태양에서 본 발명은 바이러스성 폐렴, 특히 HxNx-매개된 바이러스성 폐렴을 앓고 있는 피험자에서 바이러스 부하의 감소 및/또는 급성 폐 손상(ALI)의 감소에 사용하기 위한 C5a의 억제제에 관한 것이다.
또 다른 말로, 본 발명의 첫 번째 태양은 바이러스성 폐렴, 특히 HxNx-매개된 바이러스성 폐렴을 앓고 있는 피험자에서 바이러스 부하의 감소 및/또는 급성 폐 손상(ALI)의 감소를 위한 약학 조성물의 제조에서 C5a의 억제제의 용도에 관한 것이다.
또 다른 말로, 본 발명의 첫 번째 태양은 바이러스성 폐렴, 특히 HxNx-매개된 바이러스성 폐렴을 앓고 있는 피험자에서 바이러스 부하의 감소 및/또는 급성 폐 손상(ALI)의 감소를 위한 방법에 관한 것으로 상기 방법은 상기 피험자에게 치료량의 C5a의 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
두 번째 태양에서 본 발명은 피험자에서 폐렴(바람직하게는 바이러스성 폐렴, 특히 HxNx-매개된 바이러스성 폐렴)의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제에 관한 것이며, 여기에서 상기 억제제는 단독요법으로서 사용하기 위한 것이다.
또 다른 말로, 본 발명의 두 번째 태양은 피험자에서 폐렴(바람직하게는 바이러스성 폐렴, 특히 HxNx-매개된 바이러스성 폐렴)의 치료를 위한 약학 조성물의 제조에서 C5a의 억제제의 용도에 관한 것이며, 여기에서 상기 약학 조성물은 단독요법으로서 사용된다.
또 다른 말로, 본 발명의 두 번째 태양은 폐렴(바람직하게는 바이러스성 폐렴, 특히 HxNx-매개된 바이러스성 폐렴)의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 치료가 필요한 피험자에게 치료량의 C5a의 억제제를 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 억제제는 단독요법으로서 투여된다.
세 번째 태양에서 본 발명은 피험자에서 바이러스성 폐렴의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제에 관한 것이며, 여기에서 상기 피험자의 바이러스성 폐렴은 H7N9 바이러스에 의해 야기된다.
또 다른 말로, 본 발명의 세 번째 태양은 피험자에서 바이러스성 폐렴의 치료를 위한 약학 조성물의 제조에서 C5a의 억제제의 용도에 관한 것이며, 여기에서 상기 피험자의 바이러스성 폐렴은 H7N9 바이러스에 의해 야기된다.
또 다른 말로, 본 발명의 세 번째 태양은 바이러스성 폐렴의 치료를 위한 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 치료가 필요한 피험자에게 치료량의 C5a의 억제제를 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 피험자의 바이러스성 폐렴은 H7N9 바이러스에 의해 야기된다.
네 번째 태양에서 본 발명은 피험자에서 폐렴(바람직하게는 바이러스성 폐렴, 특히 HxNx-매개된 바이러스성 폐렴)의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제에 관한 것이며, 여기에서 상기 피험자는 영장류, 바람직하게는 유인원, 보다 바람직하게는 인간이다.
또 다른 말로, 본 발명의 네 번째 태양은 피험자에서 폐렴(바람직하게는 바이러스성 폐렴, 특히 HxNx-매개된 바이러스성 폐렴)의 치료를 위한 약학 조성물의 제조에서 C5a의 억제제의 용도에 관한 것이며, 여기에서 상기 피험자는 영장류, 바람직하게는 유인원, 보다 바람직하게는 인간이다.
또 다른 말로, 본 발명의 네 번째 태양은 폐렴(바람직하게는 바이러스성 폐렴, 특히 HxNx-매개된 바이러스성 폐렴)의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 치료가 필요한 피험자에게 치료량의 C5a의 억제제를 투여하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 피험자는 영장류, 바람직하게는 유인원, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 상기 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 C5a의 억제제는 바이러스성 폐렴을 앓고 있는 피험자에서 바이러스 부하 및/또는 급성 폐 손상(ALI)의 감소에 사용하기 위한 것이거나, 또는 또 다른 말로, 상기 약학 조성물은 바이러스성 폐렴을 앓고 있는 피험자에서 바이러스 부하의 감소 및/또는 급성 폐 손상(ALI)의 감소를 위한 것이거나, 또는 또 다른 말로, 상기 방법은 바이러스성 폐렴을 앓고 있는 피험자에서 바이러스 부하 및/또는 급성 폐 손상(ALI)의 감소를 위한 것이다.
본 발명의 상기 첫 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 C5a의 억제제는 단독요법으로서 사용하기 위한 것이거나, 또는 또 다른 말로, 상기 약학 조성물은 단독요법으로서 사용되는 것이거나, 또는 또 다른 말로 상기 C5a의 억제제는 단독요법으로서 투여된다.
본 발명의 상기 첫 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 또 다른 실시태양에서, 상기 C5a의 억제제는 항바이러스제와 함께 보조요법에 사용하기 위한 것이거나, 또는 또 다른 말로 상기 약학 조성물은 항바이러스제와 함께 보조요법에 사용되는 것이거나, 또는 또 다른 말로, 상기 방법은 상기 피험자에게 치료량의 항바이러스제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기와 같은 보조요법에 사용하기에 적합한 항바이러스제는 비제한적으로 뉴라미니다제 억제제(예를 들어 경구 흡입되는 자나미비어 또는 경구 오셀타미비어) 및 바이러스-특이성 항체를 포함한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째 또는 네 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 피험자에서 폐렴은 HxNx 바이러스에 의해 야기된다. 일부 실시태양에서, 상기 HxNx 바이러스는 H1N1, H1N3, H2N2, H3N2, H5N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, 및 H10N8로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째 또는 네 번째 태양의 특정 실시태양에서, 상기 HxNx 바이러스는 H7N9이다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째 또는 세 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 피험자는 영장류, 바람직하게는 유인원, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명은 또한 상기 정의된 4개 태양들의 조합을 제공한다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 태양의 특징들을 병용할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째 및 네 번째 태양의 특징들을 병용할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 상기 첫 번째, 세 번째 및 네 번째 태양의 특징들을 병용할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 상기 두 번째, 세 번째 및 네 번째 태양의 특징들을 병용할 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 태양의 특징들을 병용할 수 있다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 C5a의 억제제는 (i) C5a에 특이적으로 결합하고 C5a의 C5aR에의 결합을 억제하는 화합물(결합 모이어티); 및 (ii) C5aR에 특이적으로 결합하고 C5a의 C5aR에의 결합을 억제하는 화합물(결합 모이어티)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. C5a에 특이적으로 결합하는 예시적인 화합물은 C5a 억제성 펩티드(C5aIP) 및 항-C5a 항체, 예를 들어 WO 2011/063980 A1(또한 US 2012/0231008 A1으로서 공개됨)에 개시된 항-C5a 항체를 포함한다. C5aR에 특이적으로 결합하는 예시적인 화합물은 선택성 C5a 수용체 길항물질 PMX53 및 CCX168을 포함한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 C5a의 억제제는 인간 C5a에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티이다. 추가의 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는
(a) 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
(b) 올리고뉴클레오티드;
(c) 항체-유사 단백질; 및
(d) 펩티드유사물질
로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 인간 C5a의 아미노산 서열 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합한다. 서열번호 2 및 3에 따른 아미노산 서열에 의해 형성된 입체형태에의 결합은 상기 결합 모이어티가 서열번호 2에 따른 아미노산 서열내의 적어도 하나의 아미노산 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열내의 적어도 하나의 아미노산에 결합함을 의미한다. 서열번호 2는 인간 C5a의 아미노산 30-38에 상응한다. 서열번호 3은 인간 C5a의 아미노산 66-72에 상응한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 DETCEQR(서열번호 4)에 상응하는 아미노산 서열내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다. 서열번호 4는 인간 C5a의 아미노산 31-37에 상응한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 더욱 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 HKDMQ(서열번호 5)에 따른 아미노산 서열내의 적어도 하나의 아미노산, 보다 바람직하게는 아미노산 서열 KDM내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다. 서열번호 5는 인간 C5a의 아미노산 67-71에 상응하고; 서열 KDM은 인간 C5a의 아미노산 68-70에 상응한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 내의 적어도 하나의 아미노산 및 아미노산 서열 HKDMQ(서열번호 5) 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 아미노산 서열 DETCEQR(서열번호 4) 내의 적어도 하나의 아미노산 및 아미노산 서열 KDM 내의 적어도 하나의 아미노산에 결합한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 입체형태적 에피토프를 형성하는 2개의 서열(예를 들어 서열번호 2 및 3; 서열번호 4 및 5; 또는 서열번호 4 및 서열 KDM에 상응하는 서열 쌍)은 본 발명의 결합 모이어티에의 결합에 참여하지 않는 1 내지 50개의 연속적인 아미노산에 의해 분리된다. 하기에서, 본 발명의 결합 모이어티에의 결합에 참여하지 않는 상기와 같은 아미노산을 "비-결합 아미노산"으로서 지칭할 것이다. 상기 입체형태적 에피토프를 형성하는 2개의 서열은 바람직하게는 6 내지 45개의 연속적인 비-결합 아미노산, 보다 바람직하게는 12 내지 40개의 연속적인 비-결합 아미노산, 보다 바람직하게는 18 내지 35개의 연속적인 비-결합 아미노산, 보다 바람직하게는 24 내지 30개의 연속적인 비-결합 아미노산, 보다 바람직하게는 25 내지 29개의 연속적인 비-결합 아미노산, 보다 바람직하게는 26 내지 28개의 연속적인 비-결합 아미노산, 및 가장 바람직하게는 27개의 연속적인 비-결합 아미노산에 의해 분리된다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 10 nM 이하, 바람직하게는 9 nM 이하, 보다 바람직하게는 8 nM 이하, 보다 바람직하게는 7 nM 이하, 보다 바람직하게는 6 nM 이하, 보다 바람직하게는 5 nM 이하, 보다 바람직하게는 4 nM 이하, 보다 바람직하게는 3 nM 이하, 보다 바람직하게는 2 nM 이하, 및 훨씬 더 바람직하게는 1 nM 이하의 Kd 값의, 인간 C5a에 대한 결합 상수를 갖는다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티와 인간 C5a 간의 해리 상수 Kd는 1 pM(피코몰) 내지 5 nM(나노몰), 보다 바람직하게는 2 pM 내지 4 nM, 보다 바람직하게는 5 pM 내지 3 nM, 보다 바람직하게는 10 pM 내지 2 nM, 보다 바람직하게는 50 pM 내지 1 nM, 보다 바람직하게는 100 pM 내지 900 pM, 보다 바람직하게는 200 pM 내지 800 pM, 보다 바람직하게는 300 pM 내지 700 pM, 및 훨씬 더 바람직하게는 400 pM 내지 600 pM이다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 하나의 결합 모이어티는 하나의 분자 C5a, 특히 인간 C5a에 의해 유도된 생물학적 효과에 대해 적어도 75%의 차단 활성, 바람직하게는 적어도 80%의 차단 활성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 차단 활성, 보다 바람직하게는 적어도 90%의 차단 활성, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 차단 활성을 나타낸다. 이들 바람직한 차단 활성은 상기 결합 모이어티가 C5a, 바람직하게는 인간 C5a에 대해 단일의 파라토프 결합을 포함하는 실시태양들을 지칭한다. 상기 결합 모이어티가 2개 이상의 C5a-특이성 파라토프를 포함하는 실시태양들에서, 하나의 결합-부분 분자가 상기 결합 모이어티 중에 존재하는 C5a-특이성 파라토프의 수와 동등한 수의 C5a 분자와 접촉할 때 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85% 등의 상기 차단 활성이 성취된다. 즉, 본 발명에 개시된 결합 모이어티의 파라토프 및 C5a가 동몰 농도로 존재할 때, 상기 결합 모이어티는 C5a에 의해 유도된 생물학적 효과에 대해 적어도 75%의 차단 활성, 바람직하게는 적어도 80%의 차단 활성, 보다 바람직하게는 적어도 85%의 차단 활성, 보다 바람직하게는 적어도 90%의 차단 활성, 및 보다 바람직하게는 적어도 95%의 차단 활성을 나타낸다. 차단되는 바람직한 생물학적 효과는 인간 전혈 세포로부터 C5a-유도된 리소자임 방출이다. 상기 C5a-유도된 리소자임 방출 및 그의 차단을 측정하기 위한 분석은 예를 들어 WO 2011/063980 A1에 개시되어 있다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 인간 혈장에서 CH50 활성을 억제하지 않는다. CH50 활성을 측정하기 위한 분석은 숙련가에게 공지되어 있으며 예를 들어 WO 2011/063980 A1에 개시되어 있다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 적어도 하나의 C5b-유도된 생물학적 효과에 대한 차단 활성을 나타내지 않는다; 바람직하게 상기 결합 모이어티는 어떠한 C5b-유도된 생물학적 효과에 대해서도 차단 활성을 나타내지 않는다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 인간 전혈에서 이 콜라이 유도된 IL-8 생산을 감소시킬 수 있다. 전혈 중 IL-8 생산의 측정을 위한 분석은 숙련가에게 공지되어 있으며 예를 들어 WO 2011/063980 A1에 개시되어 있다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 항체이며, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 1가 항체, 이중특이성 항체, 이종접합 항체, 다중특이성 항체, 탈면역된 항체, 키메릭 항체, 인간화된(특히 CDR-이식된) 항체, 및 인간 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 항체의 항원-결합 단편이며, 상기 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 디설파이드-연결된 Fv(dsFv), 단일 도메인 항체(또한 나노바디로서 공지됨), 및 단쇄 Fv(scFv) 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기에서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
(i) 서열번호 6에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR3 서열; 또는
(ii) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR3 서열
을 포함하며, 여기에서 상기 중쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기에서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
(i) 서열번호 8에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR3 서열; 또는
(ii) 서열번호 9에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR3 서열
을 포함하며, 여기에서 상기 경쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 일부 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기에서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
(i) 서열번호 6에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR3 서열 및 서열번호 8에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR3 서열; 또는
(ii) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR3 서열 및 서열번호 9에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR3 서열
을 포함하며, 여기에서 상기 중쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
상기 경쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 하나의 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이며, 여기에서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기의 서열들 중 적어도 하나를 포함하고:
(v) 서열번호 10에 따른 중쇄 CDR2 서열;
(vi) 서열번호 11에 따른 중쇄 CDR2 서열;
(vii) 서열번호 12에 따른 경쇄 CDR2 서열;
(viii) 서열번호 13에 따른 경쇄 CDR2 서열;
(ix) 서열번호 14에 따른 중쇄 CDR1 서열;
(x) 서열번호 15에 따른 중쇄 CDR1 서열;
(xi) 서열번호 16에 따른 경쇄 CDR1 서열; 또는
(xii) 서열번호 17에 따른 경쇄 CDR1 서열;
여기에서 상기 중쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
상기 경쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
상기 중쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
상기 경쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함한다.
바람직하게, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 및 서열번호 17에 따른 아미노산 서열 중 각 하나에서 상기 인용된 임의의 변화의 총수, 즉 각 서열 중 교환, 결실 및 부가의 총수는 1 또는 2이다.
바람직하게 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중에 존재하는 전체 CDR에 대해 더해지는 교환, 결실 및 부가의 총수는 1 내지 5이다(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5).
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 표 1에 나열된 바와 같은 중쇄 CDR3, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR1 서열의 세트 중 하나를 포함하며, 여기에서
각각의 중쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
각각의 중쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
각각의 중쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함한다:
본 발명의 항체 또는 그의 단편에 사용하기에 적합한 중쇄 CDR 서열들의 세트
중쇄 세트의
기호		 CDR3 서열 CDR2 서열 CDR1 서열
A 서열번호 6 서열번호 10 서열번호 14
B 서열번호 6 서열번호 10 서열번호 15
C 서열번호 6 서열번호 11 서열번호 14
D 서열번호 6 서열번호 11 서열번호 15
E 서열번호 7 서열번호 10 서열번호 14
F 서열번호 7 서열번호 10 서열번호 15
G 서열번호 7 서열번호 11 서열번호 14
H 서열번호 7 서열번호 11 서열번호 15
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 표 2에 나열된 바와 같은 경쇄 CDR3, 경쇄 CDR2, 및 경쇄 CDR1 서열의 세트 중 하나를 포함하며, 여기에서
각각의 경쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
각각의 경쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
각각의 경쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함한다:
본 발명의 항체 또는 그의 단편에 사용하기에 적합한 경쇄 CDR 서열들의 세트
항체 IFX-1의 CDR2 경쇄 서열(서열번호 12)은 항체 INab708의 CDR2 경쇄 서열(서열번호 13)과 동일하기 때문에, 서열번호 13을 포함한 세트는 서열번호 12를 포함하는 세트에 불필요할 것이다. 따라서, 상기 표는 단지 4개의 경쇄 CDR 서열 세트만을 나열한다.
경쇄 세트의 번호 CDR3 서열 CDR2 서열 CDR1 서열
I 서열번호 8 서열번호 12 서열번호 16
II 서열번호 8 서열번호 12 서열번호 17
III 서열번호 9 서열번호 12 서열번호 16
IV 서열번호 9 서열번호 12 서열번호 17
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 표 1에 나열된 중쇄 CDR 세트 A 내지 H 중 하나 및 상기 표 2에 나열된 경쇄 CDR 세트 I 내지 IV 중 하나, 즉 하기의 세트 조합 중 하나를 포함하며: A-I, A-II, A-III, A-IV, B-I, B-II, B-III, B-IV, C-I, C-II, C-III, C-IV, D-I, D-II, D-III, D-IV, E-I, E-II, E-III, E-IV, F-I, F-II, F-III, F-IV, G-I, G-II, G-III, G-IV, H-I, H-II, H-III, 또는 H-IV(여기에서 조합 A-I 및 H-IV가 특히 바람직하다), 여기에서
각각의 중쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
각각의 중쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
각각의 중쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
각각의 경쇄 CDR3 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
각각의 경쇄 CDR2 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
각각의 경쇄 CDR1 서열은 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) IFX-1의 VH 도메인 또는 (ii) INab708의 VH 도메인을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어지는 VH 도메인을 포함한다.
상기 IFX-1 및 INab708의 VH 도메인을 한정하는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열들을 하기 표 3에 나타낸다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) IFX-1의 VL 도메인 또는 (ii) INab708의 VL 도메인을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나 또는 이들로 이루어지는 VL 도메인을 포함한다.
상기 IFX-1 및 INab708의 VL 도메인을 한정하는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열들을 하기 표 3에 나타낸다.
항체 IFX-1 및 INab708의 CDR 및 FR 서열들(코티아(Chothia) 분류 모드)
IFX -1: INab708 :
중쇄:
FR1: QVQLQQSGPQLVRPGTSVKIS
(= 서열번호 18)
CDR1: CKASGYSFTTFWMD
(= 서열번호 14)
FR2: WVKQRPGQGLEWIGR
(서열번호 19)
CDR2: IDPSDSESRLDQ
(= 서열번호 10)
FR3: RFKDRATLTVDKSSSTVYMQLSSPTSEDSAVYY
(서열번호 20)
CDR3: CARGNDGYYGFAY
(= 서열번호 6)
FR4: WGQGTLVTVSS
(서열번호 21)		 중쇄:
FR1: VQLLESGAELMKPGASVKIS
(서열번호 26)
CDR1: CKATGNTFSGYWIE
(= 서열번호 15)
FR2: WVKQRPGHGLEWIGE
(서열번호 27)
CDR2: ILPGSGSTNYNE
(= 서열번호 11)
FR3: KFKGKATLTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYY
(서열번호 28)
CDR3: CTRRGLYDGSSYFAY
(= 서열번호 7)
FR4: WGQGTLVTVSA
(서열번호 29)
경쇄:
FR1: DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS
(서열번호 22)
CDR1: CKASQSVDYDGDSYMK
(= 서열번호 16)
FR2: WYQQKPGQPPKLL
(서열번호 23)
CDR2: IYAASNL
(= 서열번호 12)
FR3: QSGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYY
(서열번호 24)
CDR3: CQQSNEDPYT
(= 서열번호 8)
FR4: FGGGTKLEIK
(서열번호 25)		 경쇄:
FR1: DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS
(서열번호 30)
CDR1: CKASQSVDYDGDSYMN
(= 서열번호 17)
FR2: WYQQKPGQPPKLL
(서열번호 31)
CDR2: IYAASNL
(= 서열번호 13)
FR3: GSGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEVAATYY
(서열번호 32)
CDR3: CQQNNEDPLT
(= 서열번호 9)
FR4: FGAGTLLELK
(서열번호 33)
하기 "실시예" 섹션에서 추가로 설명하는 바와 같이, IFX-1은 InflaRx GmbH(독일 소재)에 의해 개발된 키메릭 인간/마우스 단클론 IgG4 항체이다. IFX-1은 WO 2011/063980 A1에 개시된 마우스 단클론 항체 INab308로부터 유래된다. IFX-1은 INab308과 동일한 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖는다. INab708은 INab308 및 IFX-1과 필수적으로 동일한 입체형태적 에피토프를 표적화하는 마우스 단클론 항체이며 또한 WO 2011/063980 A1에 개시되어 있다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하며, 여기에서
(i) 상기 VH 도메인은 IFX-1의 VH 도메인을 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어지고 상기 VL 도메인은 IFX-1의 VL 도메인을 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어지거나; 또는
(ii) 상기 VH 도메인은 INab708의 VH 도메인을 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어지고 상기 VL 도메인은 INab708의 VL 도메인을 포함하거나, 상기 도메인으로 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어진다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 하나 이상의 CDR, CDR들의 세트 또는 CDR들의 세트들의 조합을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 항체 프레임워크 중에 상기 CDR을 포함한다.
본 발명에서 중쇄에 관하여 특정한 쇄 또는 특정한 영역 또는 서열을 포함하는 항체에 대한 언급은 바람직하게는 상기 항체의 모든 중쇄가 상기 특정한 쇄, 영역 또는 서열을 포함하는 상황에 관한 것이다. 이를 항체의 경쇄에 상응하게 적용한다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 일부 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 올리고뉴클레오티드이다. 이들 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 핵산 앱타머, 예를 들어 DNA 앱타머 또는 RNA 앱타머 또는 DNA 및 RNA 뉴클레오티드를 포함하는 혼합 앱타머인 것이 추가로 바람직하다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 뉴클레오티드를 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 2'-불소-치환된 피리미딘에 의해 치환시킬 수도 있다. 핵산 앱타머를 또한 형광 리포터 분자, 친화성 태그 및/또는 거대분자와 접합시킬 수도 있다. 예를 들어, 상기 앱타머를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 필적하는 거대분자에 접합시키는 것은 상기 앱타머의 생물학적 반감기를 증가시킬 것이다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 일부 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 항체-유사 단백질, 예를 들어 상기 "정의" 섹션에 예시된 바와 같은 항체-유사 단백질이다.
본 발명의 상기 첫 번째, 두 번째, 세 번째 또는 네 번째 태양의 일부 실시태양에서, 상기 결합 모이어티는 펩티드유사물질이다. 본 발명의 실시에 적합한 펩티드유사물질은 바람직하게는 상술한 바와 같은 항체-유사 단백질에 근거한다.
특정한 핵산 및 아미노산 서열, 예를 들어 서열 목록에 나타낸 서열들에 관하여 본 발명에 제공된 교시는 또한 상기 특정한 서열, 예를 들어 상기 특정한 아미노산 서열의 경우와 동일하거나 유사한 성질들을 나타내는 아미노산 서열 및 상기 특정한 핵산 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열의 경우와 동일하거나 유사한 성질들을 나타내는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열과 기능적으로 동등한 서열들을 생성시키는 상기 특정한 서열의 변형에 관한 것으로 해석되어야 한다. 한 가지 중요한 성질은 항체의 그의 표적에의 결합을 유지하거나 항체의 효과기 기능을 지속시키는 것이다. 바람직하게, 특정한 서열에 관하여 변형된 서열은 상기 서열을 항체 중의 상기 특정한 서열로 치환시키는 경우, C5a, 특히 본 발명에서 확인된 C5a의 입체형태적 에피토프에의 상기 항체의 결합을 유지하며, 바람직하게는 본 발명에 개시된 바와 같은 상기 항체의 기능, 예를 들어 인간 전혈 세포로부터 C5a-유도된 리소자임 방출의 차단 및/또는 인간 전혈 중 이 콜라이 유도된 IL-8 생산의 감소를 유지한다.
당해 분야의 숙련가들은 특히 상기 CDR 고가변 및 가변 영역의 서열을 C5a에 결합하는 능력의 상실 없이 변형시킬 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, CDR 영역은 본 발명에 명시된 영역과 동일하거나 또는 고도로 상동성일 것이다. "고도로 상동성"에 의해 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 예를 들어 1 내지 3개 또는 1 또는 2개의 교환, 특히 보존적인 교환, 결실 및/또는 부가를 CDR에서 수행할 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 상기 고가변 및 가변 영역을 이들이 본 발명에 구체적으로 개시한 영역들과 실질적인 상동성을 나타내도록 변형시킬 수도 있다.
더욱 또한, 본 발명에 개시된 아미노산 서열, 특히 인간 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 상기 서열이 목적하는 알로타입 (allotype), 예를 들어 백인 집단 또는 중국인 집단에서 발견되는 알로타입에 순응하도록 변형시키는 것이 본 발명에 따라 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 항체의 기능 또는 약동학적 성질을 변화시키기 위해서 Fc 영역 중에 변경을 수행한 항체를 포함한다. 상기와 같은 변경은 Clq 결합 및 CDC 또는 FcγR 결합 및 ADCC(항체-의존성 세포 세포독성)의 감소 또는 증가를 생성시킬 수 있다. 치환을 예를 들어 중쇄 불변 영역의 아미노산 잔기 중 하나 이상에서 수행하여, 변형된 항체에 비해 항원에 결합하는 능력은 유지하면서 효과기 기능의 변경을 야기할 수 있다(미국특허 제 5,624,821 호 및 미국특허 제 5,648,260 호를 참조하시오).
항체의 생체내 반감기를, 상기 분자가 완전한 CH2 도메인 또는 완전한 Ig Fc 영역을 포함하지 않도록 상기 Ig 불변 도메인 또는 Ig-유사 불변 도메인의 구제 수용체 에피토프를 변형시킴으로써 개선시킬 수 있다(미국특허 제 6,121,022 호 및 미국특허 제 6,194,551 호를 참조하시오). 상기 생체내 반감기를 더욱 또한 상기 Fc 영역 중에 돌연변이를 생성시킴으로써, 예를 들어 252번 위치에서 류신을 쓰레오닌으로 치환시킴으로써, 254번 위치에서 세린을 쓰레오닌으로 치환시킴으로써, 또는 256번 위치에서 페닐알라닌을 쓰레오닌으로 치환시킴으로써 증가시킬 수 있다(미국특허 제 6,277,375 호를 참조하시오).
더욱 또한, 항체의 글리코실화 패턴을 상기 항체의 효과기 기능을 변화시키기 위해서 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 항체를 Fc-수용체에 대한 상기 Fc 영역의 친화성을 증대시키기 위해서 상기 Fc 영역 중의 297번 위치에서 Asn에 통상적으로 부착된 퓨코스 단위를 가하지 않은 형질감염종에서 발현시킬 수 있으며, 이는 차례로 NK 세포의 존재하에서 상기 항체의 증가된 ADCC(항체-의존성 세포 세포독성)를 생성시킬 것이다(문헌[Shield et al. (2002) J. Biol. Chem., 277:26733-40]을 참조하시오). 더욱 또한, 갈락토실화의 변형을 CDC(보체-의존성 세포독성)의 변형을 위해 수행할 수 있다.
한편으로, 또 다른 실시태양에서, 돌연변이를, 예를 들어 포화 돌연변이유발에 의해 항-C5a 항체 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 도입시킬 수 있으며, 상기 생성되는 변형된 항-C5a 항체를 결합 활성에 대해 선별할 수 있다.
본 발명의 임의의 태양의 실시에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 약학 조성물 또는 C5a의 억제제(예를 들어 본 발명에 개시된 바와 같은 C5a, 특히 hC5a에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티)를 환자에게, 상기 환자에서 충분한 수준의 C5a의 억제제를 제공하는 당해 분야에 확립된 임의의 경로에 의해 투여할 수 있다. 상기를 전신적으로 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 상기와 같은 투여는 비경구, 점막흡수, 예를 들어 경구, 코, 직장, 질내, 설하, 점막하, 경피, 또는 흡입에 의할 수 있다. 바람직하게, 투여는 비경구, 예를 들어 정맥내 또는 복강내 주사를 통해서이며, 또한 비제한적으로 동맥내, 근육내, 피내 및 피하 투여를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물을 국소로 투여하는 경우 상기 조성물을 치료하려는 기관 또는 조직에 직접 주사할 수 있다.
경구 투여에 적합한 약학 조성물을 캡슐 또는 정제로서; 분말 또는 과립으로서; 용액, 시럽 또는 현탁액(수성 또는 비-수성 액체 중의)으로서; 식용 폼 또는 휘프로서; 또는 유화액으로서 제공할 수 있다. 정제 또는 경질 젤라틴 캡슐은 락토스, 전분 또는 그의 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트, 스테아르산 또는 그의 염을 포함할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 식물성 오일, 왁스, 지방, 반-고체, 또는 액체 폴리올 등을 포함할 수 있다. 용액 및 시럽은 물, 폴리올 및 당을 포함할 수 있다.
경구 투여용 활성제를 위장관에서의 상기 활성제의 붕해 및/또는 흡수를 지연시키는 물질로 코팅하거나 또는 상기 물질과 혼합할 수 있다(예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 사용할 수 있다). 따라서, 활성제의 서방성 (sustained release)을 수시간에 걸쳐 성취할 수 있으며, 필요한 경우 상기 활성제를 위내에서 분해되는 것으로부터 보호할 수 있다. 경구 투여용 약학 조성물을 특정한 pH 또는 효소 조건으로 인해 특정 위장관 위치에서 활성제의 방출을 촉진하도록 제형화할 수 있다.
경피 투여에 적합한 약학 조성물을 연장된 기간 동안 수용자의 표피와 긴밀하게 접촉한 채로 남아있도록 별도의 패치로서 제공할 수 있다. 국소 투여에 적합한 약학 조성물을 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 젤, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로서 제공할 수 있다. 피부, 입, 눈 또는 다른 외부 조직에의 국소 투여를 위해서 바람직하게는 국소 연고 또는 크림이 사용된다. 상기 활성 성분은 연고로 제형화시 파라핀 또는 수-혼화성 연고 베이스와 함께 사용될 수있다. 한편으로, 상기 활성 성분을 수중 유적형 베이스 또는 유중 수적형 베이스를 갖는 크림으로 제형화할 수 있다. 눈에 국소 투여하기에 적합한 약학 조성물은 점안제를 포함한다. 이들 조성물에서, 상기 활성 성분을 적합한 담체, 예를 들어 수성 용매 중에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다. 입안의 국소 투여에 적합한 약학 조성물은 로젠지, 알약 (pastille) 및 구강세정제를 포함한다.
코 투여에 적합한 약학 조성물은 고체 담체, 예를 들어 분말(바람직하게는 20 내지 500 마이크론 범위의 입자 크기를 갖는)을 포함할 수 있다. 분말을 코로 들이쉬는 방식으로, 즉 코에 가깝게 유지되는 분말의 용기로부터 코를 통한 신속한 흡입에 의해 투여할 수 있다. 한편으로, 코 투여에 적합한 조성물은 액체 담체, 예를 들어 코 스프레이 또는 코 점적제를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다. 흡입에 의한 투여를 위한 조성물을 소정의 활성 성분 투여량을 제공하도록 제작될 수 있는 특수 개조된 장치, 예를 들어 비제한적으로 가압 에어로졸, 분무기 또는 취입기로 공급할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 약학 조성물을 비강을 통해 폐에 투여한다.
비경구 투여에 적합한 약학 조성물은 수성 및 비-수성 멸균 주사성 용액 또는 현탁액을 포함하며, 이들은 산화방지제, 완충제, 세균발육저지제 및 상기 조성물을 의도하는 수용자의 혈액과 실질적으로 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있다. 상기와 같은 조성물 중에 존재할 수 있는 다른 성분은 예를 들어 물, 알콜, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함한다. 비경구 투여에 적합한 조성물을 단위-용량 또는 수회-용량 용기, 예를 들어 밀봉된 앰풀 및 바이알 중에서 제공할 수 있으며, 사용 직전에 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용 멸균 염수 용액의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조된(동결건조된) 상태로 보관할 수 있다. 즉시 주사 용액 및 현탁액을 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조할 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 상기 조성물을 인간에 정맥내 투여하기에 적합한 약학 조성물로서 통상적인 과정에 따라 제형화한다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 상기 조성물은 또한 용해제, 및 주사 부위의 통증을 완화시키기 위한 국소 마취제, 예를 들어 리도카인을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 상기 성분들을 단위 투여형으로, 예를 들어 용봉한 용기, 예를 들어 활성제의 양을 가리키는 앰풀 또는 사쉐 중의 무수 농축물 또는 건조한 동결건조된 분말로서 별도로 또는 함께 혼합하여 공급한다. 상기 조성물을 주입에 의해 투여해야 하는 경우, 상기를 멸균 약제 등급수 또는 염수를 함유하는 주입병으로 분배할 수 있다. 상기 조성물을 주사에 의해 투여하는 경우, 상기 성분들을 투여 전에 혼합할 수 있도록 멸균 염수의 앰풀을 제공할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 예를 들어 본 발명에 개시된 C5a 억제제와 같은 약물을 조절된 방출 시스템 중에서 전달할 수 있다. 예를 들어, 상기 억제제를 정맥내 주입, 이식성 삼투 펌프, 경피 패치, 리포솜, 또는 다른 투여 방식을 사용하여 투여할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 펌프를 사용할 수 있다(Sefton (1987) CRC Crit . Ref. Biomed . Eng. 14: 201-240; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:507-516; Saudek et al. (1989) N. Eng . J. Med . 321:574-579를 참조하시오). 또 다른 실시태양에서, 상기 화합물을 소낭, 특히 리포솜 중에서 전달할 수 있다(R. Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., 353-365; WO 91/04014; 미국특허 제 4,704,355 호를 참조하시오). 또 다른 실시태양에서, 중합체성 물질을 사용할 수 있다(Medical Applications of Controlled Release (1974) Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fla.; Controlled Drug Bioavailability , Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen and Ball (eds.), Wiley: N.Y.; Ranger and Peppas (1953) J. Macromol. Sci . Rev . Macromol . Chem . 23: 61을 참조하시오; 또한 Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. (1989) Ann . Neurol . 25: 351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105을 참조하시오).
더욱 또 다른 실시태양에서, 조절된 방출 시스템을 치료 표적, 즉 표적 세포, 조직 또는 기관의 근처에 놓을 수 있으며, 따라서 전신 용량의 단지 일부만이 필요하다(예를 들어 Goodson (1984) 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2를 참조하시오). 다른 조절된 방출 시스템은 문헌[Langer 1990, Science 249: 1527-1533]에 논의되어 있다.
특정한 실시태양에서, 상기 약학 조성물 또는 본 발명의 C5a 억제제를 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이를 예를 들어 비제한적으로 수술 중 국소 주입, 국소 적용, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해, 또는 이식물에 의해 성취할 수 있고, 상기 이식물은 멤브레인, 예를 들어 실라스틱 멤브레인, 또는 섬유를 포함한 다공성, 비-다공성, 젤라틴성 물질의 것이다.
바람직한 유효 용량의 선택은 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 공지되는 여러 인자들을 고려하여 숙련가에 의해 결정될 것이다. 상기와 같은 인자는 상기 약학 조성물의 특정 형태, 예를 들어 폴리펩티드 또는 벡터, 및 그의 약동학적 매개변수, 예를 들어 생물학적 이용효능, 대사, 반감기 등을 포함하며, 이들 인자는 약학 화합물의 규제 승인을 획득하는데 전형적으로 사용되는 통상적인 개발 과정 중에 확립되었을 것이다. 상기 용량의 고려에서 추가의 인자는 예방 및/또는 치료하고자 하는 상태 또는 질병 또는 통상적인 개인에서 성취되는 이점, 환자의 체질량, 환자의 연령, 투여 경로, 투여가 급성인지 만성인지의 여부, 동반 약물치료, 및 투여되는 약제의 효능에 영향을 미치는 것으로 주지된 다른 인자들을 포함한다. 따라서, 정확한 투여량은 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라, 예를 들어 개인 환자의 상태 및 면역 상태에 따라서 및 표준 임상 기법에 따라 결정되어야 한다.
하기의 도면 및 실시예들은 단지 본 발명의 예시일 뿐이며 첨부된 특허청구범위에 의해 지시되는 바와 같은 본 발명의 범위를 어떠한 식으로도 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다.
도면의 간단한 설명
도 1. IFX -1 생물학적 특징
도 1A 및 1B: 인간(도 1A) 및 원숭이(도 1B) eC5a에 대한 IFX-1의 차단 활성을 ZAP-CD11b 분석에서 시험하였다. 데이터는 상이한 공여체를 사용하는 3개의 별도의 실험을 나타낸다.
도 1C: IFX-1 농도를 감염 및 항체 투여 후 0, 1, 3, 5 및 7일째에 원숭이들(0, 1, 3일의 경우 n=4; 5, 7일의 경우 n=2)로부터의 혈장 샘플에서 측정하였다.
도 2. H7N9 바이러스 감염 후 AGM 폐에서 보체 활성화
도 2A, 2B 및 2C: C3aR(도 2A), C5aR(도 2B) 및 MASP2(도 2C)에 대한 정량적인 RT-PCR 분석을 감염후 3일째에 모든 폐엽으로부터 수집된 18개(A/H7N9 그룹) 및 6개(모의 그룹) 샘플상에서 수행하였다. 나타낸 데이터는 모의 그룹과 비교된 변화 배수(평균±SEM)이다.
도 2D, 2E 및 2F: A/H7N9-감염된 AGM 혈장 중 C3a(도 2D), C5a(도 2E) 및 C5b-9(도 2F)의 농도를 정량적인 ELISA에 의해 측정하였다. 데이터를 지시된 시점(0, 1 및 3일째에 n=6; 5일째에 n=3)에서 평균±SEM으로서 나타낸다. ***는 P<0.001 대 0일째를 의미한다.
도 3. 항- C5a 항체 처리에 의해 완화된 A/ H7N9 바이러스 감염 후의 ALI.
도 3A: 3일째의 반정량적인 조직병리학적 분석은 오직 A/H7N9 감염만을 수용한 AGM의 경우와 비교하여 IFX-1-처리된 AGM에서 완화된 폐 손상을 밝혀내었다(각 시점에서 IFX-1 처리된 그룹에서 2마리의 AGM 및 대조용 그룹의 경우 3마리의 AGM).
도 3B: A/H7N9 감염에 따른 지시된 시점들에서의 체온 변화(평균±SEM). 나타낸 데이터는 0일째에 측정된 체온을 공제함으로써 계산되었다(감염 후 0일째 및 3일째에 A/H7N9 그룹에서 6마리 AMG 및 A/H7N9 + IFN-1 그룹에서 4마리 AMG; 5일 및 7일째에 각 그룹에서 남은 3마리 및 2마리 AMG). *는 P<0.05 대 A/H7N9 그룹을 의미한다.
도 3C: 감염 후 3일째의 폐 바이러스 역가를 모든 폐엽으로부터 수집된 균질화된 샘플들에서 측정하였다(3마리의 AMG로부터 A/H7N9 그룹에서 n=18 및 2마리의 AMG로부터 A/H7N9+IFN-1 그룹에서 n=12). 데이터를 폐조직의 그램당 TCID50로서 나타내었으며(평균±SEM) 점선은 검출 한계를 가리켰다.
도 4. 항- C5a 항체 처리에 의한 H7N9 바이러스 감염 후의 AGM에서의 감소된 염증 반응
도 4A 내지 4F: AGM 혈청 샘플 중의 IL-1β(도 4A), IL-6(도 4B), IP-10(도 4C), IFN-γ(도 4D), TNF-α(도 4E) 및 MCP-1(도 4F)의 농도를 측정하기 위해서 정량적인 ELISA를 수행하였다. 제공된 데이터는 지시된 시점에서 사이토킨 및 케모킨의 농도(평균±SEM)이다(감염 후 0, 1 및 3일째에 A/H7N9 그룹(속이 찬 원)에서 n=6 및 A/H7N9 + IFX-1 그룹(빈 원)에서 n=4; 5일째에 각 그룹에서 남은 3 및 2마리 AMG). * 및 ***는 각각 A/H7N9 그룹에 대해 P<0.05 및 P<0.001을 의미한다.
도 4G 및 4H: 감염 후 3일째에 폐 중의 대식세포(도 4G) 및 호중구(도 4H) 수의 반정량적인 분석(A/H7N9 그룹에서 n=3 및 A/H7N9+IFX-1 그룹에서 n=2).
실시예
1. 물질 및 방법
1.1 윤리규약
동물을 수반하는 모든 과정은 실험동물센터, 병원체 및 생물안보 국가중점연구소, 미생물 및 역학 IACUC의 베이징 연구소에 의해 승인되었다(허가 번호는 BIME 2013-15이다). 상기 동물 연구를 실험동물 보호 및 사용에 관한 지침의 권고에 따라 엄격하게 수행하였다.
1.2 H7N9 바이러스 감염의 아프리카 녹색 원숭이 모델
12마리의 2 내지 4년 된 다 자란 아프리카 녹색 원숭이(AGM)를 본 연구에 사용하였으며, 생 바이러스의 잠재적인 오염과 함께 생 바이러스 및 생물학적 샘플을 다루는 모든 실험을 생물안전 수준 3 실험실에서 수행하였다. 케타민(5 ㎎/㎏)의 복강내(i.p.) 주사에 의해 마취 후, 10마리의 AGM에게 A/안후이(Anhui)/1/2013(H7N9) 바이러스(106TCID50)를 기관내 접종하였으며 2마리의 AGM에게는 음성 대조용으로서 동일한 부피의 PBS를 기관내 접종하였다. 상기 바이러스 접종된 10마리 AGM 중 4마리를 바이러스 접종 후 30분째에 항-C5a 단클론 항체(IFX-1; 5 ㎎/㎏)로 정맥내 처리하였다(H7N9 + 항-C5a Ab 그룹). 상기 10마리 AGM 중 6마리는 대조용으로서 PBS로 처리하였다(H7N9 + PBS 그룹). 상기 H7N9 + PBS 그룹 중 3마리 원숭이 및 H7N9 + 항-C5a 항체 그룹 중 2마리 원숭이로부터의 샘플을 각각 감염 후 3일 및 7일째에 수집하였다. 정상 대조용의 샘플을 3일째에 수집하였다. 헤파린 혈장 및 혈청을 상기 모든 동물로부터 0, 1, 3, 5, 7일째에 수집하고 분석시까지 -70 ℃에서 보관하고, 보체 활성화 산물 또는 사이토킨의 수준을 평가하는데 사용하였다.
상기 동물들을 감염 후 3일째에 케타민 마취하에 사혈 (exsanguination)에 의해 안락사시켰다. 마취 후에, 상기 AGM의 체온을 모니터하고, 코 및 인두 면봉 표본을 채취하여, 100 IU 페니실린/㎖ 및 100 ㎍의 스트렙토마이신/㎖이 보충된 1 ㎖ 둘베코의 변형 이글 배지에 넣었다. 상기 면봉 표본을 상기 TCID50 분석 수행시까지 -70 ℃에서 보관하였다. 표준 프로토콜에 따라 부검을 수행하였다. 전반적인 병인의 반정량적인 평가를 위해서, 각 폐엽으로부터 부검시 감염된 폐조직의 비율을 각 폐엽 중의 경화 및 짙은 적색 변색 면적에 의해 계산하여 상기 전반적인 병리 점수를 측정하였다. 역전사 (RT)-PCR을 위해서, 샘플을 4 ℃에서 밤새 RNA 보관 액체(티안젠 바이오테크 캄파니 리미티드(Tiangen Biotech Co., Ltd))에 보관하고 이어서 RT-PCR 분석 수행시까지 -70 ℃에서 보관하였다. 조직병리학 연구를 위해서, 기관, 앞, 중간 및 뒤쪽 폐엽으로부터의 폐 조직, 간, 비장, 신장, 장, 뇌 및 림프절을 10% 중성-완충된 포르말린 중에 밤새 현탁시키고 파라핀 중에 묻고, 4 ㎛로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고 면역조직화학에 사용하였다.
1.3 폐 손상의 조직병리학적 분석
폐를 상기 폐의 앞, 중간 및 뒤쪽 폐엽으로부터 표준 과정으로 수집하고 샘플링하였다. 4 ㎛ 두께의 섹션을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고 광학 현미경검사에 의해 검사하였다. 기관 및 기관 병변을 변성된 상피 및 점막하 염증 세포 침윤 정도에 따라 평가하였다. 연조직의 손상을 상기 변성된 상피, 폐포 세포의 퇴화 및 괴사, 염증세포의 침윤 및 연조직벽 (parenchymal wall)의 확대, 출혈 및 간질 부종에 따라 평가하였다(Sun, S. et al. 2011, Am J Respir Cell Mol Biol;18:834-842). 퇴화 또는 염증의 크기 및 중증도의 누적 점수는 동물당 총점을 제공하였으며, 평균을 상기 그룹에 대한 총점으로서 간주하였다.
1.4 대식세포 및 호중구에 대한 면역조직화학 염색
포르말린-고정된, 파라핀-매몰된 폐 섹션을 자일렌으로 파라핀 제거하고 등급화된 알콜을 사용하여 수화시켰다. 대식세포, 호중구 및 T-림프구의 침윤을 하기의 항체들을 사용하여 평가하였다: CD68, 및 마이엘로퍼옥시다제(MPO)(베이징 종샨 바이오테크놀로지 캄파니 리미티드(Beijing Zhongshan Biotechnology Co., Ltd.), 중국 소재). 항체를 제조사의 설명에 따라 표준 스트렙트아비딘-비오틴 검출 시스템(베이징 종샨 바이오테크놀로지 캄파니 리미티드, 중국 베이징 소재)을 사용하여 검출하였다.
대식세포 및 호중구 침윤의 반-정량적인 평가를 위해서, 각 폐 섹션 중의 폐 연조직의 30 내지 50개의 임의로 선택된 40x 대물렌즈 시야를 맹검 방식으로 대식세포 또는 호중구의 존재에 대해 광학 현미경검사에 의해 검사하였다. 각 동물에 대한 누적 점수를 100개 시야당 양성 시야의 수(%)로서 나타내었다(상기 Sun, S. et al. 2013).
1.5 IFX -1 농도의 측정 및 CD11b 분석
원숭이 혈장 샘플 중 IFX-1 수준을 InflaRx GmbH(독일 소재)에 의해 제공된 표준 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA)에 의해 측정하였다. CD11b 분석을 사용하여 인간 및 원숭이에서 IFX-1의 차단 효율을 평가하였다. 간단히, 인간 또는 원숭이 혈액을 혈장 또는 지모산-활성화된 혈장(ZAP; 내인성 C5a-eC5a 함유)으로 자극하였다. 상이한 농도의 IFX-1 및 대조용 인간 IgG4 항체(시그마, 미국 위스콘신주 소재)를 항체 및 eC5a의 어떠한 사전 항온처리도 없이 상기 분석에 가하여 IFX-1 차단 활성을 측정하였으며 eC5a 수준을 InflaRx GmbH(독일 소재)에 의해 제공된 ELISA 키트에 의해 측정하였다. 자극 후에, 항-마우스 CD11b:FITC 또는 아이소타입 대조용 mAb(BD 바이오사이언스, 미국 뉴저지주 소재)를 가하고 항온처리하였다. 적혈구의 용해 단계 직후에, 관문(gated) 과립구상의 CD11b 발현을 BD FACSCanto™ II 유식 세포계에 의해 분석하였다. FITC-표지된 과립구의 평균 형광 강도(MFI)를 사용하여 CD11b 발현 수준을 검사하였다.
1.6 혈장 중 염증성 사이토킨 및 C3a , C5a , C5b -9의 측정
감염된 AGM의 혈청 또는 혈장 샘플을 지정된 시간에 수집하고 측정 전에 -70 ℃에서 보관하였다. IL-1β, IL-6, IFN-γ, TNF-α, MCP-1 및 IP-10의 사이토킨 수준을 U-CyTech 바이오사이언시즈 또는 Uscn 라이프 사이언스 인코포레이티드로부터의 원숭이 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. C3a 및 C5b-9 수준을 BD 바이오사이언시즈로부터의 인간 ELISA 키트를 사용하여 측정하였으며, C5a ELISA가 InflaRx GmbH(독일 예나 소재)에 의해 제공되었다. 간단히, 100 ㎕의 희석된 AGM 혈청 또는 혈장을 개별적인 AGM 사이토킨, MPO, C3a, C5a 및 C5b-9에 특이적인 항체로 사전-코팅한 플레이트에 가하고 4 ℃에서 밤새 항온처리하였다. 세척에 이어서, 효소-결합된 특이성 항체를 가하고 37 ℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 상기 플레이트의 세척 후에, 기질 용액을 가하고 30분 동안 37 ℃에서 항온처리하였다. 분석을 TMB를 사용하여 전개시키고, 반응을 1N H2SO4를 첨가하여 정지시켰다. 450 ㎚에서의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기(시너지(Synergy) 2, Bio Tek)에 의해 측정하고, AGM 사이토킨, 또는 C3a, C5a 및 C5b-9의 양을 상기 측정에서 획득한 표준 곡선에 의해 측정하였다.
1.7 C3aR mRNA , C5aR mRNA 및 MASP2 발현의 검출
전체 RNA를 AGM의 앞, 중간 및 뒤쪽 폐엽의 폐 조직으로부터 단리하고, 상대적인 정량적인 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 상대적인 C3aR, C5aR 및 만노스-결합 단백질-결합된 세린 프로테아제 2(MASP2) 발현 데이터를 2- ΔΔCT 방법을 사용하여 분석하였다(Livak, K.J. & Schmittgen T.D. 2001. Methods 25:402-408).
1.8 조직 중의 바이러스 역가
각각의 감염된 AGM 중의 기관지 및 각각의 우측 및 좌측 폐의 앞, 중간 및 뒤쪽 폐엽으로부터의 폐 조직 샘플의 6개 부분을 지정된 시간에 수확하고 최소 필수 배지(MEM) + 항생제 중의 OMNI BEAD RUPTOR 24 조직 분쇄기(OMNI 인터내셔널 인코포레이티드)를 사용하여 균질화시켜 10%(w/v) 현탁액을 성취하였다. 조직 중의 바이러스 역가를 개시된 바와 같이(Zhao, G. et al. 2010. Virology Journal, 7:151-156) 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50)에 의해 측정하였다. 간단히, MDCK 세포의 단층을 AGM 기관의 균질물의 10배 연속 희석물로 4회 중복하여 접종하였다. 접종 후 2시간째에, 상등액을 제거하고 MEM + 항생제 및 2 ㎍/㎖ TPCK-트립신(시그마)으로 대체하였다. 바이러스 세포변성 효과(CPE)의 3일 관찰에 이어서, 상기 세포의 감염을 0.5% 칠면조 적혈구를 사용하는 적혈구응집반응에 의해 나타내었다. 조직 바이러스 역가를 리드와 민츠(Reed and Muench) 방법에 의해 계산하고 Log10TCID50/조직 g으로서 나타내었다.
1.9 통계학적 분석
웰치 보정에 의한 스튜던츠 t-검정을 RT-PCR 분석, 반정량적인 조직병리학적 분석, 폐 바이러스 역가 검출 및 대식세포 및 호중구 수의 반정량적인 분석에서 데이터의 비교를 위해 사용하였다. C3a, C5a 및 C5b-9의 혈장 농도 및 IFX-1의 인간 eC5a에 대한 차단 활성에 대한 데이터를 듄네트의 사후검정과 함께 일원 ANOVA를 사용하여 비교하였다. 지정된 시점들에서의 그룹들간의 온도 변화 및 염증성 사이토킨 및 케모킨의 차이를 본페로니 사후검정과 함께 2원 ANOVA를 사용하여 비교하였다. 0.05 미만의 P 값을 통계학적 유의수준으로서 간주하였다. 상기 데이터를 평균±s.e.m.으로서 나타낸다. 모든 분석을 그래프패드 프리즘 버전 5.01에서 수행하였다.
2. 결과
2.1 IFX -1 및 그의 생물학적 활성
IFX-1은 InflaRx GmbH(독일 소재)에 의해 개발된 키메릭 인간/마우스 단클론 IgG4 항체이다. 상기 항체는 CHO(중국 햄스터 난소) 세포주에 의해 생산된 IgG4 카파 항체이며 뮤린 중쇄 및 카파 경쇄 가변(VH 및 VL) 영역 및 인간 감마 4 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. InflaRx GmbH에 의해 개시된 바와 같이, IFX-1은 원숭이 독성학 연구 및 인간 I기 시험에서 시험되었으며 추가의 임상 시험들에 대해 양호한 안전성 프로파일을 나타내었다.
IFX-1 차단 활성을 8명의 상이한 공여자로부터의 인간 ZAP 샘플로부터 생성된 내인성 C5a(eC5a)를 사용하여 CD11b 분석에 의해 시험하였다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, IFX-1은 인간 과립구상의 CD11b 발현을 0.5:1의 Ab:Ag 몰비에서 80% 이상까지 현저하게 감소시켰다. eC5a-유도된 CD11b 상향조절에 대한 IFX-1의 차단 활성은 1:1 및 2:1의 Ab:Ag 비가 적용되었을 때 98%까지 달성되었다.
원숭이 C5a에 대한 차단 활성을 또한 원숭이 ZAP 및 원숭이 전혈을 사용하여 ZAP-CD11 분석에 의해 시험하였다. IFX-1은 원숭이 과립구상의 ZAP-구동된 CD11b 상향조절을 100%까지 차단할 수 있으며(도 1B), 이는 IFX-1이 원숭이 eC5a에 대해 충분히 기능적인 차단 항체임을 암시한다.
상기 H7N9 바이러스 감염의 원숭이 모델에서, 5 ㎎/㎏ 용량의 IFX-1을 상기 4마리의 감염된 원숭이를 치료하기 위해 정맥내로 적용하였으며, 이어서 그의 수준을 약동학 분석에 의해 모니터하였다. 상기 처리 후 1일째에 상기 4마리의 처리된 원숭이에서 대략 40 ㎍/㎖의 IFX-1이 발견되었으며 상기 IFX-1의 수준은 7일째에 상기 2마리 원숭이에서 대략 10 ㎍/㎖까지 떨어졌다(도 1C). 이들 데이터는 IFX-1이 원숭이 eC5a를 차단하기에 충분히 기능성이며 상기 처리에 적용된 용량이 상기 모델에서 충분함을 암시한다.
2.2 H7N9 바이러스-감염된 아프리카 녹색 원숭이( AGM )의 발병학
H7N9 바이러스의 발병학 및 상기 바이러스 감염에 대한 숙주 면역 반응을 탐구하기 위해서, 8마리의 AGM을 H7N9 바이러스(AH1/H7N9)로 감염시키고 2마리의 AGM을 모의로 처리하였다. 3마리의 동물을 감염 후 3일째에 안락사시켰고, 3마리의 추가의 동물을 7일째에 안락사시켰으며, 나머지 2마리의 동물은 14일째에 안락사시켰다. H7N9 바이러스-감염된 AGM으로부터 폐, 기관, 심장, 간, 신장, 비장, 뇌 및 장을 채취하고 바이러스 단리를 위해 균질화하였다. 바이러스를 감염 후 3일째에 폐 및 기관으로부터 단리할 수 있으나 다른 조적 균질물로부터는 단리할 수 없다(표 4). 7일 및 14일째에, 상기 수집된 조직들 중 어느 것으로부터도 바이러스를 단리할 수 없었다. AGM 혈청 적혈구응집반응 억제(HI) 역가가 감염 후 7일째에 검출되었으며, 14일째의 HI 역가는 1:80 내지 1:160이었다(표 4). 바이러스학 및 혈청학적 검사는 AGM이 H7N9 바이러스에 의해 유효하게 감염됨을 입증하였다.
조직 바이러스 단리 및 혈청 HI 역가
그룹 A/H7N9 모의
감염 후 일수 3d 7d 14d 3d 7d
AGM 수 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2
바이러스 단리 폐 + + + - - - - - - -
기관 + + + - - - - - - -
심장 - - - - - - - - - -
간 - - - - - - - - - -
신장 - - - - - - - - - -
비장 - - - - - - - - - -
뇌 - - - - - - - - - -
장 - - - - - - - - - -
혈청 HI 역가 <1:10 <1:10 <1:10 1:10 1:20 1:20 1:80 1:160 <1:10 <1:10
추가의 현미경 관찰시(데이터 도시 안 됨), 폐의 피크 손상이 H7N9 바이러스 감염 후 3일째에 관찰되었으며 그 후에 점차적으로 회복되었다. 3일째에, PBS를 접종한 대조군과 비교시, 다병소 기관-기관지 선염이 상기 감염된 폐에서 관찰되었으며, 상기는 상기 기관의 변성된 상피 및 점막하의 림프구, 대식세포, 호중구 및 때때로 호산구의 보통의 침윤을 특징으로 하였다. 상기 H7N9 바이러스로 감염된 폐에서 발견된 병변들은 급성 삼출성 확산성 폐 손상이었으며 세기관지 및 말단 세기관지 중의 변성되고 붕괴된 상피, 림프구, 대식세포 및 호중구의 침윤과 함께 확산되고 두꺼워진 폐포 격벽, 변성되고 붕괴된 폐포세포, 및 폐 간질에서의 다병소 출혈, 삼출물 및 중증 부종을 특징으로 하였다. 내피는 다수의 염증세포 부착 및 손상된 기저막과 함께 변성되었다. 초미세구조 관찰은 미토콘드리아 팽창 및 변성된 소포체를 갖는 퇴화된 폐 상피세포, 폐포 공간내로 세포 찌꺼기가 떨어진 손상된 혈액-기체 장벽 및 간질성 부종 중 염증세포 침윤을 보였다(데이터 도시 안 됨).
뇌, 심장, 장, 비장 및 신장을 포함한 검사된 모든 다른 기관들 중에서, 비장만이, 비장의 적색 속질 및 동맥 근개 중 보통으로 상승된 식세포 수뿐만 아니라 적색 속질의 충혈 및 병소 출혈과 함께 H7N9 바이러스 감염 후 일정 수준의 조직병리학적 변화를 나타내는 유일한 기관이었다(데이터 도시 안 됨). 뇌, 장 및 신장과 같은 다른 기관에서는 손상이 발견되지 않았다.
2.3 H7N9 바이러스 감염 후 폐에서 보체 활성화
보체 활성화가 병원체 침입에 대한 방어에 중추적인 역할을 하지만, 축적된 연구는 과도한 보체 활성화는 다양한 자가면역 및 염증 질병과 관련됨을 입증하였다(상기 Klos, A. et al. 2009). 상기 연구에서, 실시간 RT-PCR 분석은 C3aR, C5aR 및 MASP2 발현의 전사 수준이 H7N9 바이러스 감염 1일째에 현저하게 상향조절됨을 밝혀내었다(도 2A, B 및 C). 또한, AGM으로부터의 혈장 샘플 중 주요 보체 활성화 산물 C3a, C5a 및 C5b-9 수준은 H7N9 바이러스 감염 후 현저하게 상승하였다. C3a 및 C5b-9는 1 내지 5일의 모든 시점에서 높은 수준으로 유지된 반면, C5a 수준은 1일 및 3일째에 현저하게 증가되었고 5일째에 배경 수준에 가깝게 회복되었다(도 2D, E 및 F). 더욱 또한, 폐 섹션, 특히 세기관지 상피 및 중증 염증이 있는 조직에서 C3aR 및 C5aR의 증대된 단백질 발현이 H7N9 바이러스 감염 후 면역조직화학 염색에 의해 입증되었다(데이터 도시 안 됨). 보체 활성화의 또 다른 지표인 C3c 염색이 또한 H7N9 바이러스 감염 후 3일째에 AGM 폐에서 증가된 침착을 보였다(데이터 도시 안 됨). 이들 데이터는 상기 보체 시스템이 H7N9 감염 후 폐에서뿐만 아니라 순환 중에 광범위하게 활성화됨을 암시하였다.
2.4 항- C5a 항체 치료는 H7N9 바이러스 감염에 의해 유발된 ALI의 임상 징후를 완화시켰다
H7N9 바이러스 감염 유발된-폐 손상의 발병학에서 보체 활성화의 역할을 조사하기 위해서, 항-C5a 항체 IFX-1(5 ㎎/㎏)을 바이러스 감염 직후 상기 감염된 AGM에 정맥내 주사하였다. 전반적인 병리는 AGM의 감염된 폐가 다병소 경화 및 짙은 적색 변색(이는 폐의 등쪽 표면상에서 가장 우세하였다)을 나타낸 반면, 항-C5a로 처리된 감염된 AGM은 매우 적은 짙은 적색 변색을 갖는 거의 정상적인 외관을 나타냄을 밝혀내었다(데이터 도시 안 됨). 조직병리학적 분석은 상기 감염된 AGM은 모두 순하거나 또는 다병소성인 기관지간질성 폐렴과 함께 어느 정도의 폐손상을 나타냄을 입증하였다. 그러나, 상기 폐 병리는 항-C5a 처리에 의해 감염된 AGM으로부터의 폐에서 명백히 개선된다. 감염 후 3일째에, 상기 처리되지 않은 AGM은 세기관지 상피세포의 낙설 (desquamation), 폐포 상피의 퇴화 및 괴사, 풍부한 간질성 부종, 다병소성 출혈 및 강한 염증 침윤을 갖는 크고 다병소성인 폐 병변을 나타낸 반면, 항-C5a 처리된 감염된 AGM은 적은 간질성 부종과 함께 연조직벽의 순하거나 보통의 팽창, 훨씬 더 낮은 수의 염증 세포 침윤물 및 명백하게 더 낮은 정도의 폐손상을 나타낸다(데이터 도시 안 됨). 상기 폐 손상은 상기 처리 및 비처리 그룹 모두에서 3일째의 경우보다 7일째의 경우에 더 가벼운 듯하였지만, 세기관지 상피세포 및 폐포세포의 퇴화, 특히 혈관 주변의 간질의 부종은 7일째에 처리된 AGM에서보다 처리되지 않은 AGM에서 더 심하였다(데이터 도시 안 됨). 감염 후 3일째에 수득된 AGM 폐에 대한 반정량적인 조직학적 분석은 상기 폐 조직병리학적 손상 점수가 IFX-1 처리에 의해 크게 저하됨을 지적하였다(도 3A).
IFX-1 항체로 처리된 AGM은 처리되지 않은 AGM에 비해 H7N9 바이러스 감염 후 보다 작은 체온 요동을 보였다(도 3B). 놀랍게도, 균질화된 폐 조직 중의 바이러스 역가의 결과는 처리된 AGM에서의 평균 폐 바이러스 역가가 처리되지 않은 AGM에서의 경우보다 대략 1.8 로그 더 낮았으며(p<0.01)(도 3C), 이는 상기 바이러스 복제가 어쨌든 항-C5a 항체 처리 후에 감소됨을 암시하였다.
2.5 항- C5a 항체는 AGM에서 H7N9 바이러스 감염에 의해 개시된 염증 반응을 감소시켰다
AGM에서 H7N9 바이러스 감염에 의해 개시된 염증 반응에 대한 보체 활성화의 역할을 추가로 측정하기 위해서, 상기 염증성 사이토킨 및 케모킨뿐만 아니라 대식세포 및 호중구의 침윤을 IFX-1 항체 처리의 존재 또는 부재하에서 H7N9 바이러스 감염된 AGM에서 평가하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 연구에서 조사된 모든 염증성 매개체들은 감염 후 현저하게 상승하였다. IL-1β, IP-10 및 MCP-1은 감염 후 1일정도로 일찍 피크 발현에 도달한 반면, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α는 3일째에 피크 발현을 보였으며, 상기 모든 매개체들의 수준은 5일째에 하락하였다. 이들 염증성 매개체의 전체적인 발현 수준은 항-C5a 처리된 원숭이에서 현저하게 방해를 받는 듯하다.
상기 대식세포 및 호중구의 침윤을 감염 후 3일째에 제조된 AGM의 폐 조직 섹션 중의 CD68의 면역조직화학 염색 및 MPO 발현에 의해 측정하였다(데이터 도시 안 됨). 상기 데이터는 상기 호중구 및 대식세포가 모두 감염된 폐에서 현저하게 증가하였고 침윤 정도는 폐의 병변과 양의 상관성을 가짐을 보였다. 그러나, 염증성 침윤물, 특히 호중구의 수는 비-처리된 AGM에 비해 IFX-1 처리된 원숭이의 폐에서 현저하게 감소하였다(도 4G, H). 집합적으로, 상기 데이터는 H7N9 바이러스성 감염에 의해 개시된 ALI 및 전신 염증에 대한 항-C5a 치료의 유효한 치료학적 효과를 입증하였다.
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Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 1 5 10 15 Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IFX-1 FR4 light chain <400> 25 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR1 heavy chain <400> 26 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser 20 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR2 heavy chain <400> 27 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu 1 5 10 15 <210> 28 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR3 heavy chain <400> 28 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr 1 5 10 15 Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 20 25 30 Tyr <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR4 heavy chain <400> 29 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR1 light chain <400> 30 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser 20 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR2 light chain <400> 31 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 1 5 10 <210> 32 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR3 light chain <400> 32 Gly Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 1 5 10 15 Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Val Ala Ala Thr Tyr 20 25 30 Tyr <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> INab708 FR4 light chain <400> 33 Phe Gly Ala Gly Thr Leu Leu Glu Leu Lys 1 5 10

Claims (13)

  1. 바이러스성 폐렴을 앓고 있는 피험자에서 바이러스 부하의 감소 및/또는 급성 폐 손상(ALI)의 감소에 사용하기 위한 C5a의 억제제로서,
    상기 C5a의 억제제는 인간 C5a에 특이적으로 결합하는 결합 모이어티이며,
    상기 결합 모이어티는
    (a) 항체 또는 그의 항원-결합 단편;
    (b) 올리고뉴클레오티드;
    (c) 항체-유사 단백질; 및
    (d) 펩티드유사물질
    로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 것인, C5a의 억제제.
  2. 피험자에서 폐렴(바람직하게는 바이러스성 폐렴)의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제로서, 단독요법으로서 사용하기 위한 것인, C5a의 억제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    피험자에서 폐렴이 HxNx 바이러스에 의해 야기되는 것인, C5a의 억제제.
  4. 제3항에 있어서,
    HxNx 바이러스가 H1N1, H1N3, H2N2, H3N2, H5N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, 및 H10N8로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 것인, C5a의 억제제.
  5. 피험자에서 바이러스성 폐렴의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제로서, 상기 피험자에서 바이러스성 폐렴이 H7N9 바이러스에 의해 야기되는 것인, C5a의 억제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자가 영장류, 바람직하게는 유인원, 보다 바람직하게는 인간인, C5a의 억제제.
  7. 피험자에서 폐렴(바람직하게는 바이러스성 폐렴)의 치료에 사용하기 위한 C5a의 억제제로서, 상기 피험자가 영장류, 바람직하게는 유인원, 보다 바람직하게는 인간인, C5a의 억제제.
  8. 제7항에 있어서,
    피험자에서 폐렴이 HxNx 바이러스에 의해 야기되는 것인, C5a의 억제제.
  9. 제8항에 있어서,
    HxNx 바이러스가 H1N1, H1N3, H2N2, H3N2, H5N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, 및 H10N8로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 것인, C5a의 억제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 모이어티가 인간 C5a의 아미노산 서열 NDETCEQRA(서열번호 2) 및 SHKDMQL(서열번호 3)에 의해 형성된 입체형태적 에피토프에 특이적으로 결합하고,
    상기 결합 모이어티가 서열번호 2에 따른 아미노산 서열내의 적어도 하나의 아미노산 및 서열번호 3에 따른 아미노산 서열내의 적어도 하나의 아미노산에 결합하는 것인, C5a의 억제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 모이어티가 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이
    (i) 서열번호 6에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR3 서열; 또는
    (ii) 서열번호 7에 제시된 바와 같은 중쇄 CDR3 서열
    을 포함하며,
    상기 중쇄 CDR3 서열이 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하는 것인, C5a의 억제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 모이어티가 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이
    (iii) 서열번호 8에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR3 서열; 또는
    (iv) 서열번호 9에 제시된 바와 같은 경쇄 CDR3 서열
    을 포함하며,
    상기 경쇄 CDR3 서열이 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하는 것인, C5a의 억제제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    결합 모이어티가 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고,
    상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 하기 서열 중 적어도 하나를 포함하며:
    (v) 서열번호 10에 따른 중쇄 CDR2 서열;
    (vi) 서열번호 11에 따른 중쇄 CDR2 서열;
    (vii) 서열번호 12에 따른 경쇄 CDR2 서열;
    (viii) 서열번호 13에 따른 경쇄 CDR2 서열;
    (ix) 서열번호 14에 따른 중쇄 CDR1 서열;
    (x) 서열번호 15에 따른 중쇄 CDR1 서열;
    (xi) 서열번호 16에 따른 경쇄 CDR1 서열; 또는
    (xii) 서열번호 17에 따른 경쇄 CDR1 서열;
    상기 중쇄 CDR2 서열이 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
    상기 경쇄 CDR2 서열이 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
    상기 중쇄 CDR1 서열이 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하고;
    상기 경쇄 CDR1 서열이 1, 2 또는 3개의 아미노산 교환, 바람직하게는 보존적인 아미노산 교환, 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 부가를 임의로 포함하는 것인, C5a의 억제제.
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