KR20190005944A - 척수성 근위축 치료용 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 대상체에 보체 경로의 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 척수 근 위축증을 예방하거나, 이것으로 진행되는 위험을 감소시키거나, 이것을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

척수성 근위축 치료용 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2016년 5월 9일자로 출원된, 미국 가특허원 제62/333,348호의 이익을 청구하며, 이의 전문은 본원에 참고로 포함된다.
신경변성 질환(neurodegenerative disease)은 전 세계적으로 대략 3천만 명의 개인에게 영향을 미치는 신경계를 쇠약하게 만드는 장애이다. 신경변성 질환은 사망률 및 고통을 받는 사람들에 대한 관리 비용의 측면 둘 다에서, 치료가 어렵고 건강 관심도가 증가하고 있다. 신경계는 신체의 취약한 요소이며 뇌졸중 및 척수 손상과 같은 급성 손상, 또는 변성 질환 둘 다로부터 재생할 수 있는 능력이 제한된 능력을 갖는다. 신경변성 질환은 뇌 및 척수에서 뉴런의 아류형(neuronal subtype)의 점진적인 손실을 특징으로 할 수 있으며 산발적이거나 가족성일 수 있다. 신경변성 질환의 증상의 발병은 어느 때에서도 나타날 수 있으며, 보다 일반적으로는 중년 또는 노년 동안에 발생한다. 인구의 기대 수명이 증가하면서, 이러한 질환의 발생이 증가할 것이다. 새로운 치료요법이 신경변성 질환을 치료하는데 요구된다.
척수 근 위축증(SMA)은 척수에서 알파 운동 뉴런의 변성에 의해 특징화되는 임상적으로 이종성의, 상염색체 열성 신경근육 질환이며, 진행성 근위 근육 약화 및 마비를 초래한다. SMA는 주로 영아에서 진단되며 성인에게서는 흔하지 않다. 추정된 발생율은 신생아에서 6,000명 당 1명 내지 10,000명당 1명이고 보유자(carrier) 빈도는 1명/40명 내지 1명/60명이다. SMA는 가장 치명적인 소아 병리를 나타낸다. SMA 환자는 일반적으로 주로 근위 사지 근육에서 근 약화 및 위축을 갖는다. SMA 표현형은 전형적으로 2개의 유전자인, 운동 뉴런 생존1(SMN1) 및 SMN2의 발현 수준과 관련되어 있으며, 표현형은 SMN1에서 동형접합성 돌연변이로부터 생성된다. 표현형은 발생 연령 및 달성된 운동 기능을 기준으로 하는, 4개 등급의 중증도로 분류된다.
현재, SMA에 대해 유일하게 승인된 치료는 생물학적 약물인 스핀라자(Spinraza; 누시네르센(nusinersen))이다. 스핀라자는 인트론성 스플라이싱 사일런서(intronic splicing silencer) N1(ISS-N1) 표적을 기반으로 하는 안티센스 약물이다. 스핀라자는 척수 주변의 유체 내에 주사함으로써 투여된다.
그러나, 스핀자라의 대부분의 임상 시험은 증상을 보이는 영아 및 SMA로 이미 진단된 어린이의 치료에 촛점이 맞추어져 있으며, 이때 이미 많은 변화가 운동 뉴런에서 발생한 상태이다. 또한, 신경계내 독성(신경독성)이 동물 연구에서 관찰되었다. 따라서, SMA로 진행될 위험을 예방하고 감소시키며, SMA를 치료하기 위한 새로운 치료요법에 대한 필요성이 존재한다.
요약
본 개시내용은 일반적으로 보체 경로(complement pathway)의 억제제를 대상체(subject)에게 투여함을 포함하여, 척수 근 위축증(SMA)을 예방하거나, 이로 진행될 위험을 감소시키거나, 이를 치료하는 방법에 관한 것이다.
신경변성 질환은 다양한 병인이 있지만, 모든 뉴런 중에 존재하는 한가지 세포 공통성은 시냅스이다. 기능적 시냅스의 변성은 전체적인 신경변성의 1차적인 메카니즘을 이해하는데 매우 중요하다. 증거는 신경근육 시냅스내 결함이 SMA 질환의 최초 병리학적 지표 중 하나임을 시사한다. 다른 예는 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease:AD)이며, 여기서 시냅스 손실은 뉴런 손실에 우선함이 밝혀졌다. 시냅스 손실은 뉴런을 보체 경로의 억제제 또는 길항제와 접촉시킴으로써 억제된다. 예를 들면, 억제제는 보체 캐스캐이드(complement cascade)의 활성화를 차단할 수 있거나, 뉴런에서 특이적인 보체 단백질의 발현을 차단할 수 있거나, 보체 활성화를 유도하는 시그널링 분자(signaling molecule)를 방해할 수 있거나, 뉴런에서 보체 억제제의 발현을 상향조절할 수 있거나, 그렇지 않으면 시냅스 손실에 있어서 보체의 역활을 방해할 수 있다. 예컨대, 성인 뇌에서 시냅스 손실을 방지하는 능력은 다양한 신경변성 상태에서 정상적인 뉴런 기능을 유지하는데 중요한 결과를 갖는다.
따라서, 보체 활성화 경로의 억제는 예컨대, 보체 활성화 경로를 포함하는, 보체 활성화의 조기 단계를 억제하는 항체를 사용하여, 척수 근 위축증을 예방하거나, 이로 진행할 위험을 감소시키거나, 이를 치료하기 위한 촉망되는 치료학적 전략일 수 있다. 구체적으로, 항-C1q, 항-C1r, 및 항-C1s 항체는 자가항체가 보체 활성화의 전통적인 경로를 트리거하는(triggering) 것을 방지할 수 있고 보체 인자의 뉴런 발현으로부터 야기되는 시냅스 손실을 방지할 수 있다.
본 개시내용은 하나 이상의 보체 인자에 결합하는, 예컨대, 모노클로날, 키메라, 인간화된 항체, 항체 단편 등과 같은 항체의 투여를 통해, 보체 활성화를 억제함으로써, 예컨대, 보체 인자 C1q, C1r, 또는 C1s를 억제함으로써, 척수 근 위축증을 예방하거나, 이로 진행할 위험을 감소시키거나, 또는 이를(척수 근 위축증을) 치료하는 방법에 관한 것이다.
인간 보체는 원래는 체액계 및 세균의 보조된 항체-의존성 사멸을 "보충"하는 혈장의 열-불안정성 성분으로서 정의되었다. 현재는 보체는 특히 염증 및 침입하는 유기체에 대한 신체의 방어와 관련되므로, 포유동물의 선천적인 면역성에 있어서의 중요한 역할을 조정화는 막 표면에 부착되거나 혈액 속에서 순환하는 30개 이상의 단백질의 엄격하게 조절되는 단백질분해 네트워크인 것으로 알려져 있다. 보체 단백질은 많은 세포타입에 의해 생산되며 다양한 협력 기능을 갖는다. 예를 들면, 보체는 자가-항원 및 세포사멸성 세포의 제거(clearance)에 관여하며, 적응성 면역력에 대한 브릿지(bridge)를 형성하고, 또한 조직 재생 및 종양 성장에 있어서 중요한 역할을 한다. 이러한 기능을 발휘하기 위해서, 보체 시스템은 병원체 세포 표면과 상호작용하는 가용성 및 세포-표면-결합된 단백질의 상호작용에 의존하여 포식세포에 의한 파괴를 위해 이들을 표시한다. 보체 시스템은 주로 간에 의해 생산된, 다수의 별개의 혈장 단백질로 구성된다. 다수의 이러한 단백질은 자이모겐으로 알려진 프로테아제의 부류이며, 이는 단백질분해성 절단에 의해 자체적으로 활성화된다. 이러한 자이모겐은 침입 병원체가 검출될 때까지 불활성 형태로 광범위하게 분포될 수 있다. 따라서, 보체 시스템은 트리거된 효소 캐스캐이드(triggered enzyme cascade)를 통해 활성화된다.
보체 활성화는 3가지 경로를 통해 개시된다: 전통적, 대안적 및 렉틴 경로. 3개 경로 모두 패턴 인식 단백질에 의한 표면 구조의 검출에 의해 개시된다. 또한, 3개 경로 모두는 공통적인 교차점인 보체 C3를 통해 합쳐진다. C3는 급성 단계 반응제이다. 비록 소량이 활성화된 단핵세포 및 대식세포에 의해서도 또한 생산되지만, 간(liver)이 합성의 주요 부위이다. 대략 200 kD의 단일 쇄 전구체(pro-C3)가 세포내에서 발견되며; cDNA는 이것이 1,663개의 아미노산을 포함함을 나타낸다. 이는 단백질분해성 절단에 의해 알파 및 베타 소단위로 프로세싱되며, 이는 성숙한 단백질 내에서 이황화물 결합에 의해 연결된다. Pro-C3는 22개의 아미노산 잔기의 단일 펩타이드, 베타 쇄(645개의 잔기) 및 알파 쇄(992개의 잔기)를 함유한다. 2개의 쇄는 성숙한 단백질 내에 존재하지 않는 4개의 아르기닌 잔기에 의해 결합된다.
전통적인 경로는 표면-결합된 항체(IgM 및 IgG)의 패치, 및 또한 C-반응성 단백질인 혈청 아밀로이드 P, 펜트락신 3, 및 세포, 시냅스, 및 미생물의 표면상의 다른 공지된 및 공지되지 않은 결합 부위에 대해 직접적인 보체 단백질 C1q의 결합에 의해 활성화된다.
렉틴 경로는 MASP-1 및 MASP-2로 지정된 2개의 혈청 세린 프로테아제와 함께 만노즈-결합 렉틴(MBL)의 결합에 의해 활성화된다. MBL은 급성 단계 단백질이며 보체 경로에서 이의 기능은 C1q와 유사하고, 이는 구조에 있어서도 유사하다. MBL이 세포 또는 병원체의 탄수화물 표면에 결합한 후, MASP-1 및 MASP-2가 MBL에 결합하며, 이러한 회합은 C4 및 C2의 절단 및 활성화를 유발한다. MASP-1 및 MASP-2 단백질은 C1r 및 C1s와 구조적으로 유사하며, 이들의 활동을 모사(mimic)한다. 전통적인 보체 경로와 유사하게, 렉틴 보체 경로는 또한 C3의 활성화를 위해 C4 및 C2 및, 캐스캐이드에 있어서 또한 하부로 다른 말단 성분을 필요로 한다.
보체 경로의 활성화는 보체 단백질의 생물학적으로 활성인 단편, 예컨대, C3a, C4a 및 C5a 아나필라톡신(anaphylatoxin) 및 백혈구 주화성, 대식세포, 호중구, 혈소판, 비만 세포 및 내피 세포의 활성화, 증가된 혈관 침투능, 세포용해, 및 조직 손상을 포함하는 염증 활성을 매개하는, sC5b-9 막 공격 복합체(MAC)를 생성한다. 세포 표면 항원에 결합된 항체는 또한 보체 시스템을 활성화시켜, 외부 세포의 막 내에 구멍을 생성하거나, 이는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC)에 의한 세포 파괴를 매개할 수 있다. 이러한 과정에서, Fc 수용체를 지닌 세포독성 세포는 표적 세포에서 항체의 Fc 영역에 결합하여 세포의 사멸을 촉진한다. 외부 세포에 결합된 항체는 또한 옵소닌(opsonin)으로서 제공되어, 포식 세포가 Fc 또는 C3b 수용체와 함께 항체-코팅된 세포에 결합하고 식균 작용할 수 있도록 한다.
C1q는 18개의 폴리펩타이드 쇄(6개의 C1q A 쇄, 6개의 C1q B 쇄, 및 6개의 C1q C 쇄)로 이루어진 460 kDa의 큰 다량체성 단백질이다. C1r 및 C1s 보체 단백질은 C1q 테일 영역(tail region)에 결합하여 C1 복합체(C1qr2S2)를 형성한다. 세포의 표면 또는 항체 Fc 영역의 보체 결합 도메인에 대한 C1q 복합체의 결합은 C1r에 있어서 자가촉매적 효소 활성의 활성화를 초래하는 C1q에 있어서의 구조적 변화를 유도하며, 이는 이후 C1s를 절단하여 활성인 세린 프로테아제를 생성한다. 일단 활성화되면, C1s는 C4를 절단하여 C4b를 생성하며, 이는 궁극적으로 C2에 결합한다. C2는 C1s에 의해 절단되어, C4b에 결합된 활성화된 형태인, C2a를 생성하고 전통적인 경로의 C3 컨버타제(C4b2a)를 형성한다. 궁극적으로, 이러한 경로는 막 공격 복합체(membrane attack complex)의 형성을 야기하며, 이러한 복합체는 영향받은 세포를 용해하여 사멸시킨다.
C3는 각각의 보체 경로의 중심 성분이며 선천성 및 적응성 면역 반응 둘 다에서 보체 시스템에 중요하다. C3b는 보체 시스템의 주요 효과기 분자 중 하나이며 아미노산 Cys(988)과 Glu(991) 사이의 C3b의 절단은 고도로 반응성인 티오에스테르의 방출을 야기하고, 이러한 티오에스테르는 C3b가 트랜스아세틸화를 통해 세포 표면에 결합할 수 있도록 한다(시그널 펩타이드가 없는 성숙한 단백질 서열에 따른 번호매김). 또한, 추가의 결합 부위의 절단은 C3b가 둘 다 프로테아제 인자 I에 의한 절단에 대해 보조-인자인, CR1(CD35) 또는 인자 H에 대한 결합 부위를 포함하는 몇개의 조절성 및/또는 상보성 단백질과 상호작용하도록 한다. 인자 I은 Arg(1281)과 Ser(1282) 및 Arg(1298)과 Ser(1299) 사이의 C3b를 절단함으로써, 단편 C3f 및 C3bi가 생성된다. C3bi는 병원체의 표면에 부착하여 잔존할 수 있으며, 여기서 이는 CR3(CD11b/CD18)에 의해 인식되고, 이는 대식세포 및 킬러 세포에서 발현된다. 후속적으로, CR3은 병원체의 식세포작용 및 파괴를 매개한다. CR1과 함께, 인자 I는 또한 아미노산 Arg(932)과 Glu(933) 사이를 추가로 절단함으로써 C3dg 및 C3c를 형성할 수 있다. C3dg는 또한 CR2(CD21)에 의한 인식을 위해 표면에 잔존할 수 있으며, 이는 B-림프세포 및 수지 세포(DC)에 의해 발현된다.
C4는 대략 350 μg/ml의 농도로 혈장 속에 존재하는 ~200 kDa의 3개-쇄 당단백질이다. C4는 전통적인 보체 경로 활성화 서열에서 제2의 보체 단백질로서 기능한다. 기질에 대한 적절한 항체의 결합은 C1 복합체의 결합 및 활성화를 초래한다. 활성화된 C1은 결국 C4 알파 쇄의 N-말단으로부터 C4a를 절단한다. 이러한 절단은 내부 티오에스테르를 노출시키며, 이는 C4 알파 소단위의 C4d 영역내 991 및 994번 위치에서 아미노산을 연결하는, 내부 티오에스테르를 노출시킨다. 노출 시, 이러한 고도로 반응성인 그룹은 친핵성 공격을 받아 표적 기질과 공유 결합을 형성한다. C4의 주요 단편인, C4b는 표적 기질에 공유결합으로 결합한 후 절단되어 C4a를 방출하며, 전통적인 경로의 C2에 대한 수용체로서 작용한다. C2는 C4b에 결합하며 이는 궁극적으로 활성 C1에 의해 절단되어 보체 캐스캐이드를 지속한다.
보체는 외부 침입체와 숙주 세포 둘 다를 공격할 수 있다는 점에서 비특이적이다. 정상 상태하에서, 뉴런을 포함하는 숙주 세포는 C1 억제제(C1-Inh)와 같은, 다양한 유체-상 및 막-결합된 보체 조절성 단백질에 의한 잠재적인 보체-매개된 손상으로부터 보호된다. C1-INH는 활성 C1 복합체로부터 C1r 및 C1s를 해리시키며, 이는 숙주 세포를 막 공격 복합체로부터의 용해 또는 손상으로부터 보호한다. 잠재적인 보체-매개된 손상으로부터 보호하는 다른 단백질은 C4b-결합 단백질(C4BP), 인자 H(FH), 보체 수용체 1(CR1; CD35), 보체 수용체 Ig(CRIg), 붕괴 촉진 인자(decay accelerating factor: DAF; CD55), 막 보조인자 단백질(membrane cofactor 단백질: MCP; CD46), 및 CD59를 포함한다. 그러나, 이들 성분의 결핍 또는 특정의 병리학적 상태에 대한 반응시 보체의 과도한 활성화는 이러한 보호 메카니즘을 압도할 수 있다. 이러한 불균형화된 활성화는 증가하는 수의 질환 및 병리학적 장애와 관련되어 왔다.
예를 들면, 다양한 보체 성분이 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 뉴런 및 교질 세포에 의해 발현된다. 뇌에서의 이들의 기능은 알려져 있지 않지만, 많은 이들 보체 단백질의 발현은 뇌 손상 후 또는 신경변성 질환 병리학의 과정 동안에 혈청 또는 염증성 사이토킨에 의해 상향조절된다. 배양물 속에서 성상세포는 C1q, C1r, C1s, C4, C2, 및 C3, 및 또한 보다 말단인 보체 단백질을 발현하는 것으로 보고되었다. 뉴런은 C4 및 C3를 발현하는 것으로 보고되었다. C1q는 뉴런 시냅스에서 발현되어 제거를 위해 이들 시냅스를 표시하는 것으로 밝혀졌다. 미국 특허원 제2012/0195880호 및 제2012/328601호를 참고한다. 선택적인 시냅스 손실이 정상의 뇌 발달("시냅스 프루닝(synaptic pruning)")에 필수적인 국면이지만, 특히 성숙하거나 노화되는 뇌에서 과도한 시냅스 손실은 신경변성 및 인지력 감퇴를 야기한다. 상승된 시냅스 보체 축적은 정상적인 노화 및 신경변성 질환 진행시 시냅스 손실에 기여한다. 역으로, 보체 발현을 낮추는 것은 신경보호 효과가 있었다. 시냅스 손실에 의해 영향받은 뉴런은 중추 신경계 뉴런, 또는 말초 신경계 뉴런일 수 있다.
C1q, C1r, 또는 C1s와 같은 보체 인자의 활성의 중화는 보체 활성화를 차단하고, 시냅스 손실을 방지하며, 척수 근 위축증(SMA)과 같은 장애에서 신경변성 질환 진행을 지연시킨다. SMA에서 C1q, C1r, 또는 C1s와 같은 중화 보체 인자와 관련된 방법이 본원에 개시되어 있다.
본 개시내용에 언급된 모든 서열은 제WO 2015/006504호, 미국 가특허원 제62/075793호, 미국 가특허원 제62/261376호, 제WO 2014/186599호, 미국 특허 제8,877,197호를 참고로 포함되어 있으며, 이들 각각은 항체 및 이를 개시하는 관련된 조성물에 대해 본원에 참고로 포함된다.
특정의 국면에서, 대상체에게 보체 경로의 억제제를 투여함을 포함하여, SMA을 예방하거나 이로 진행될 위험을 감소시키거나, 이를 치료하는 방법이 본원에 개시되어 있다.
부정적인 시냅스 손실로 고통받는 환자에게 항-C1q 항체, 항-C1r 항체, 또는 항-C1s 항체와 같은 항체를 투여함을 포함하여, SMA에서 시냅스 손실을 억제하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 이러한 방법은 뉴런 선조체(neural progenitor), 또는 신경발생 증진제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 특정의 바람직한 구현예에서, 항체는 C1q, C1r, 또는 C1s에 결합하여 보체 활성화를 억제한다.
완전한 길이의 항체는 재조합 DNA 가공 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 가공된 버전은 예를 들면 천연 항체의 아미노산 서열의 삽입, 결실 또는 변경에 의해 천연 항체 가변 영역으로부터 생성된 것을 포함한다. 이러한 유형의 특수한 예로 하나의 항체로부터의 적어도 하나의 CDR 및 임의로 하나 이상의 골격(framework) 아미노산 및 제2 항체로부터의 가변 영역 도메인의 나머지를 함유하는 가공된 가변 영역 도메인을 포함한다. 항체를 암호화하는 DNA는 완전한 길이의 항체를 암호화하는 DNA의 바람직한 부위를 제외하고 모두를 결실시켜 제조할 수 있다. 키메라 항체를 암호화하는 DNA는 인간 불변 영역을 실질적으로 또는 배타적으로 암호화하는 DNA 및 인간 이외의 포유동물의 가변 영역의 서열로부터 실질적으로 또는 배타적으로 기원한 가변 영역을 암호화하는 DNA를 조합시켜 제조할 수 있다. 인간화된 항체를 암호화하는 DNA는 불변 영역 및 상응하는 인간 항체 영역으로부터 실질적으로 또는 배타적으로 기원한 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 가변 영역을 암호화하는 DNA와 인간 이외의 포유동물로부터 실질적으로 또는 배타적으로 기원한 CDR을 암호화하는 DNA를 조합함으로써 제조할 수 있다.
항체를 암호화하는 DNA 분자의 적합한 공급원은 완전한 길이의 항체를 발현하는, 하이브리도마와 같은 세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 발현 벡터를 발현하는 숙주 세포로부터 분리될 수 있다.
항체 단편은 또한 항체 가변 및 불변 영역을 암호화하는 DN의 조작 및 재-발현을 포함하는 재조합 DNA 가공 기술을 사용함으로써 제조할 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 요구되는 추가의 아미노산 또는 도메인을 변형시키거나, 첨가하거나 결실시킬 수 있다. 가변 또는 불변 영역에 대한 어떠한 변경도 본원에 사용된 바와 같은 용어 '가변' 및 '불변' 영역에 여전히 포함된다. 일부 예에서, PCR을 사용하여 CH1의 쇄간 시스테인을 암호화하는 코돈 바로 다음에 정지 코돈을 도입시킴으로써, CH1 도메인의 해독이 쇄간 시스테인에서 정지하도록 항체 단편을 생성한다. 적합한 PCR 프라이머를 설계하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 항체 CH1 도메인의 서열은 용이하게 이용가능하다. 일부 구현예에서, 정지 코돈은 부위-지시된 돌연변이유발 기술을 사용하여 도입할 수 있다.
본 개시내용의 항체는 예를 들면, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 포함하는 어떠한 항체 동형("부류") 및 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는, 및 이의 서브부류(subclass)로부터 기원할 수 있다. 특정의 바람직한 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 쥐과의 IgG1으로부터 기원한다.
일부 구현예에서, 억제제는 항-C1q 항체, 항-C1r 항체, 또는 항-C1s 항체와 같은 항체이다. 항-C1q 항체는 C1q와 자가항체 사이, 또는 C1q와 C1r 사이, 또는 C1q와 C1s 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 항-C1r 항체는 C1r과 C1q 사이, 또는 C1r과 C1s 사이의 상호작용을 억제할 수 있다. 항-C1r 항체는 C1r의 촉매 활성을 억제할 수 있거나, 항-C1r 항체는 프로(pro)-C1r의 활성 프로테아제로의 프로세싱을 억제할 수 있다. 항-C1s 항체는 C1s와 C1q 사이, 또는 C1s와 C1r 사이, 또는 C1s와 C2 또는 C4 사이의 상호작용을 억제할 수 있거나, 항-C1s 항체는 C1s의 촉매 활성을 억제할 수 있거나, 이는 프로-C1s의 활성 프로테아제로의 프로세싱을 억제할 수 있다. 일부 예에서, 항-C1q, 항-C1r, 또는 항-C1s 항체는 순환계 또는 조직으로부터 C1q, C1r 또는 C1s의 제거를 유발한다.
본원에 개시된 항체는 예컨대, 포유동물 C1q, C1r, 또는 C1s, 바람직하게는 인간 C1q, C1r, 또는 C1s에 결합하는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 또는 항체 단편일 수 있다. 본원에 개시된 항체는 또한 혈액 뇌 장벽(BBB)을 교차할 수 있다. 항체는 인슐린 수용체, 트랜스페린 수용체, 렙틴 수용체, LDL 수용체, 또는 IGF 수용체를 이용하는 시스템과 같은 BBB 수용체-매개된 수송 시스템을 활성화시킬 수 있다. 항체는 인간에게 투여하기에 적합한 충분한 인간 서열을 지닌 키메라 항체일 수 있다. 항체는 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있으며; 일부 구현예에서, 항체는 예컨대, CHO 세포내에서 해독 후 변형에 의해 생산된 글리코실화 패턴으로 글리코실화된다.
본 개시내용의 항체는 소염성 단백질, 신경치료제, 항-바이러스, 항-기생충, 항-세균, 내분비 약물, 대사 약물, 미토독소(mitotoxin), 화학치료요법 약물, 또는 siRNA와 같은, 치료제에 공유결합으로 연결될 수 있으며, 이를 위해 BBB 또는 태반을 횡단하는 수송이 요구된다. 항체와, 예를 들면 신경치료제 사이의 공유결합성 연결은 항체-제제 융합이 혈액 뇌 장벽을 교차하도록 하고 치료제가 중추 신경계 내에서 치료학적으로 유용한 이의 활성의 일부를 보유하는 한, 항체의 어떠한 적합한 부위와 치료제 사이의 연결일 수 있다. 예를 들면, 공유결합성 연결은 항체의 하나 이상의 경쇄 및 치료제 사이에 존재할 수 있다. 펩타이드 신경 치료제(예컨대, 뇌 기원한 신경영향성 인자, BDNF와 같은 뉴로트로핀)의 경우에, 이의 카복시 또는 아미노 말단에 의해 펩타이드는 항체의 경쇄(LC) 또는 중쇄(HC)의 카복시 또는 아미노 말단에 공유결합으로 연결될 수 있다.
본 개시내용의 항체에 연결될 수 있는 다른 신경치료제는 뇌 기원 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴트로핀-4/5, 섬유아세포 성장 인자(FGF)-2 및 다른 FGF, 뉴로트로핀(NT)-3, 에리트로포이에틴(EPO), 간세포 성장 인자(HGF), 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자(TGF)-α, TGF-β, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1ra), 섬모 향신경성 인자(CNTF), 신경교-기원한 신경영양 인자(GDNF), 뉴르투린(neurturin), 혈소판-기원 성장 인자(PDGF), 헤레굴린, 뉴레굴린, 아르테민, 페르세핀, 인터루킨, 과립구-콜로니 자극 인자(CSF), 과립구-대식세포-CSF, 네트린, 카디오트로핀-1, 헤지호그(hedgehogs), 백혈병 억제 인자(LIF), 미드킨, 플레이오트로핀, 골 형성 단백질(BMPs), 네트린, 사포신, 세마포린, 또는 줄기 세포 인자(SCF)로부터 선택된 뉴로트로핀을 포함한다.
항체는 제1 및 제2 항원을 인식하는 이중특이적(bispecific) 항체일 수 있으며, 예컨대, 제1 항원은 C1q, C1r, 및 C1s로부터 선택되고/되거나 제2 항원은 항체가 트랜스페린 수용체(TR), 인슐린 수용체(HIR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFR), 저-밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 1 및 2(LPR-1 및 2), 디프테리아 독소 수용체, CRM197, 라마 단일 도메인 항체, TMEM 30(A), 단백질 형질도입 도메인, TAT, Syn-B, 페네트라틴, 폴리-아르기닌 펩타이드, 안지오펩 펩타이드, 또는 ANG1005로부터 선택된 항원과 같은 혈액-뇌-장벽을 교차하도록 하는 항원이다.
본 개시내용의 항체는 C1q, C1r, 또는 C1에 결합하여 이의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. 예를 들면, (1) C1q는 자가항체에 결합하거나, (2) C1q는 C1r에 결합하거나, (3) C1q는 C1s에 결합하거나, (4) C1q는 포스파티딜세린에 결합하거나, (5) C1q는 펜트락신-3에 결합하거나,(6) C1q는 C-반응성 단백질(CRP)에 결합하거나, (7) C1q는 구형의 C1q 수용체(gC1qR)에 결합하거나, (8) C1q는 보체 수용체 1(CR1)에 결합하거나, (9) C1q은 B-아밀로이드에 결합하거나,(10) C1q는 칼레티쿨린에 결합한다. 다른 구현예에서, C1q의 생물학적 활성은 (1) 전통적인 보체 활성화 경로의 활성화, (2) 항체 및 보체 의존성 세포독성의 활성화, (3) CH50 용혈, (4) 시냅스 손실, (5) B-세포 항체 생산, (6) 수지 세포 성숙,(7) T-세포 증식,(8) 사이토킨 생산, (9) 미세아교세포 활성화, (10) 아더스 반응(Arthus reaction), (11) 시냅스 또는 신경 말단의 식세포작용 또는 (12) 보체 수용체 3(CR3/C3) 발현 세포의 활성화이다.
일부 구현예에서, CH50 용혈작용은 인간, 마우스, 및/또는 랫트 CH50 용혈작용을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 CH50 용혈작용의 적어도 약 50%, 내지 적어도 약 95%를 중화할 수 있다. 항체는 또한 150 ng 미만, 100 ng 미만, 50 ng 미만, 또는 20 ng 미만의 용량에서 CH50 용혈작용의 적어도 50%를 중화할 수 있다.
보체 활성을 측정하기 위한 다른 시험관내 검정은 보체 활성화 동안 형성되는 보체 성분이나 복합체의 분할 생성물의 측정을 위한 ELISA 검정을 포함한다. 전통적인 경로를 통한 보체 활성화는 혈청 속에서 C4d 및 C4의 수준을 추적하여 측정할 수 있다. 대안적인 경로의 활성화는 순환계에서 Bb 또는 C3bBbP 복합체의 수준을 평가함으로써 ELISA에서 측정할 수 있다. 시험관내 항체-매개된 보체 활성화 검정을 또한 사용하여 C1q, C1r, 또는 C1s 생산의 억제를 평가할 수 있다.
본 개시내용의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 이의 항체 단편일 수 있다.
본 개시내용의 항체는 또한 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아보디(diabody), 또는 단일 쇄(single chain) 항체 분자와 같은 항체 단편일 수 있다.
제2 항체 또는 제2 억제제와 같은 제2 제제를 대상체에게 투여하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 항체는 항-C1q 항체, 항-C1r 항체, 또는 항-C1s 항체일 수 있다. 억제제는 항체-의존성 세포 세포독성, 대안적인 보체 활성화 경로의 억제제; 및/또는 자가항체와 자가항원 사이의 상호작용의 억제제일 수 있다. 대안적인 구현예에서, 제2 제제는 뉴시네르센과 같은 안티센스 약물일 수 있다. 제2 제제는 바람직하게는 항체와 함께 공동으로 투여된다.
일부 구현예에서,(a) 대상체에게 항체(즉, 항-C1q, 항-C1r, 또는 항-C1s 항체)(여기서, 항체는 검출가능한 표지에 커플링된다)를 투여하는 단계; (b) 검출가능한 표지를 검출하여 대상체 내에서 C1q, C1r, 또는 C1s의 양 또는 위치를 측정하는 단계; 및 (c) 하나 이상의 C1q, C1r, 또는 C1s의 양 또는 위치를 레퍼런스와 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 척수 근 위축증의 진행 위험이 레퍼런스에 대한 하나 이상의 C1q, C1r, 또는 C1s의 양 또는 위치의 비교를 기반으로 함을 특징으로 하는, 척수 근 위축증으로 진행될 대상체의 위험을 측정하는 방법이 제공된다. 검출가능한 표지는 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 효소, 방사활성 동위원소, 바이오틴 또는 형광성 표지를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항체는 바이오티닐화 과정을 사용하여 바이오틴과 같은 보조효소로 표지할 수 있다. 바이오틴이 표지로서 사용되는 경우, 항체의 검출은 아비딘 또는 이의 세균 대응물인 스트렙타비딘과 같은 단백질의 첨가에 의해 달성되며, 이들 중 어느 것도 전술한 염료, 플루오레세인과 같은 형광성 마커, 방사활성 동위원소 또는 퍼옥시다제와 같은 효소와 같은 검출가능한 마커에 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 단편(예컨대, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 F(ab')2 단편)이다.
본원에 개시된 항체는 또한 표지 그룹(labeling group), 예컨대, 방사선동위원소, 방사성핵종, 효소 그룹, 바이오티닐 그룹, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 효소 또는 형광성 표지에 커플링될 수 있다. 표지 그룹은 어떠한 적합한 길이의 스페이서 아암(spacer arm)을 통해 항체에 커플링되어 잠재적인 입체 장애를 감소시킬 수 있다. 단백질을 표지하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있으며 이러한 표지된 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.
다양한 투여 경로가 고려된다. 이러한 투여 방법은 국소, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 척추강내, 비강내, 및 병변내 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 중추 신경계 상태의 치료를 위해, 항체를 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 또는 심지어 경구 투여와 같은 비-침입성 말초 투여 경로 후 혈액-뇌 장벽을 지나가도록 개조시킬 수 있다.
본 개시내용은 또한 a) 구현예 중 어느 것으로부터의 항체를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서, 항체는 검출가능한 표지에 커플링되는 단계; (b) 검출가능한 표지를 검출하여 대상체 내에서 항체의 양 또는 위치를 측정하는 단계; 및 (c) 항체의 양 또는 위치를 레퍼런스와 비교하는 단계에 의해 개인에서 시냅스를 검출하는 방법을 제공하며, 여기서 보체 활성화와 관련된 질환으로 진행될 위험은 레퍼런스와 비교된 바와 같은 항체의 양의 비교를 기반으로하여 특징화된다. 예를 들면, 검출가능한 표지는 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 효소, 방사활성 동위원소, 바이오틴, 또는 형광성 표지(예컨대, 플루오레세인, 로다민, 시아닌 염료 또는 BODIPY)를 포함할 수 있다. 검출가능한 표지는 x-선, CT, MRI, 초음파, PET 및 SPECT용 영상화제를 사용하여 검출할 수 있다.
본원에 기술된 다양한 구현예의 특징들 중 하나, 일부 또는 모두는 합해져서 본원에 제공된 조성물 및 방법의 다른 구현예를 형성할 수 있다. 본 발명에 관한 구현예의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 수용되며 각각의 및 모든 조합이 개별적으로 및 명확하게 개시된 경우와 같이 본원에 개시되어 있다. 또한, 다양한 구현예 및 이의 요소의 모든 하위-조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되며 각각의 및 모든 이러한 하위-조합이 개별적으로 및 명확하게 본원에 개시된 바와 같이 본원에 개시되어 있다. 본원에 제공된 조성물 및 방법의 이들 및 다른 국면은 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다.
본원에 논의된 공보는 본원의 출원일 전에 이들이 개시되었다는 것만을 위해서만 제공된다. 본원의 어느 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 공보를 선행하는 자격을 획득하지 않는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 제공된 공보의 날짜는 실제 공개일과는 상이할 수 있으며, 이는 별도의 확인을 필요로 할 수 있다.
도 1은 항-C1q를 시냅스 손실에 대해 보호성인 것으로서 묘사한다. 항체는 말초 투여를 통해 제공되었다.
도 2는 항-C1q가 투여된 경우 증진된 근육 활성, 운동, 및 연장된 생존을 묘사한다.
도 3은 출생 후 0일 내지 12일까지 격일마다 M1 항체를, 100 mg/Kg으로 복강내 투여로 치료한 SMNdelta7 마우스를 묘사하며, 수명에 있어서의 증진 및 체중 증가량을 나타낸다.
도 4는 SMN에 결함이 있는 SMNdelta7 마우스를 묘사하며, C1q가 운동 뉴런에서의 시냅스 및 보다 적은 정도로 발달하는 정상(WT) 시냅스를 태그하는 방법을 나타낸다. 요추 L4 수준의 운동 뉴런이 출생 후 4일째에 나타내고, C1q(적색)으로 표지되며 시냅스는 시냅토파이신(녹색)으로 표지된다.
도 5는 항체 M1으로 치료한 SMNdelta7 마우스를 묘사하며, 운동 뉴런에 있어서 고유 시냅스(proprioceptive synapse)를 구조(rescue)함을 나타낸다. 척수내 운동 뉴런(적색) 및 vGlut1으로 표지된 시냅스(백색). M1은 SMA 마우스에서 고유 시냅스의 구조를 이끌었다.
도 6은 2개의 패널,(A) 및(B)로 이루어져 있다. 도 6은 척수 근 위축증(SMA)의 개관을 나타낸다. 환자는 생존 운동 뉴런 1 겐(survival motor neuron 1 gen)(SMN1)내 상염색체 열성(recessive) 돌연변이를 가져서, 완전한 길이의 SMN 단백질의 불충분한 수준을 초래한다(도 6의 A). SMN-△7 마우스 모델은 가장 심각한 SMA 환자의 임상 사진을 근접하게 개괄한다(도 6의 B). 돌연변이체 마우스는 인간 SMN2(SMN-△7)의 2개의 이식유전자 카피를 발현한다. SMA 마우스는 출생 후 ~2주 동안 생존하며 심각한 운동 장애 및 자세 및 또한 척추 반사 결함을 나타낸다(도 6의 B).
도 7은 2개의 패널,(A) 및(B)로 이루어져 있다. 도 7은 SMA에서 운동 회로 기능장애를 나타낸다. 도 7의 A는 SMA 운동 뉴런에서 감각 자기수용 시냅스의 유의적인 손실이 어떻게 운동 뉴런의 선택적인 손실 전에 발생하는 지 보여준다. 두 이벤트 모두 척추반사 작용의 장애로 이어진다. 도 7의 B는 운동 뉴런 시냅스(청색) 및 감각 뉴런 시냅스(녹색)를 나타낸다.
도 8은 C1q가 SMA에서 흥분성 시냅스를 우선적으로 태그함을 묘사한다. SMA에서, C1q는 체세포 및 근접한 수지세포 둘 다에서, SMN 결함이 있는 운동 뉴런 상의 VgluT1 시냅스를 흔하게 태그한다. 그러나, 억제성 시냅스는 거의 태그되지 않는다. 면역활성 실험은 WT 및 SMA 척수(L1) 둘 다에서 C1q의 존재를 나타내었다. WT에서, C1q는 감각 시냅스를 거의 태그하지 않는다.
도 9는 C3이 또한 SMA에서 흥분 시냅스를 태그함을 나타낸다. C3는 SMA 운동 뉴런에서 VgluT1 시냅스를 흔히 태그한다. 이러한 결과는 C1q 및 C3 둘 다에 의한 SMN 결합이 있는 흥분성 시냅스의 태그화를 입증하며, 이는 보체 캐스캐이드(cascade) 활성화를 제시한다.
도 10은 소교세포가 SMA에서 시냅스 제거를 매개함을 나타낸다. 소교세포 면역반응성에 대한 형태학적 실험은 소교세포 내부의 VGluT1 시냅스를 나타낸다. 이러한 결과는 소교세포가 SMA 운동 뉴런에서 시냅스 제거를 매개함을 제시한다.
도 11은 소교세포가 C1q의 주요 공급원임을 시사한다. 당해 도에서, 모든 IBA1+ 세포는 C1q 양성이고 TMEM119 양성이다. 이러한 결과는 소교세포가 척수 내 C1q의 주요 공급원임을 보여준다. 또한, IBA1+TMEM119-세포의 결여는 SMA의 마우스 모델에서 대식세포의 침윤의 부재를 시사한다.
도 12는 5개의 패널,(A),(B),(C),(D) 및(E)로 이루어져 있다. 도 12는 C1q의 생체내(in vivo) 차단이 SMA 표현형을 증진시키고 VGluT1 시냅스를 구조함을 나타낸다. 항-C1q 항체를 사용한 치료는 SMA로 치료하지 않은 새끼들과 비교하여 중등도(moderate)의 그러나 유의적으로 증진된 수명 및 체중 증가량을 초래했다. SMA 치료된 새끼들은 이들의 직립 반사가 유의적으로 증진되었다. 중요하게도, 이들 거동 증진은 시냅스 구조와 관련되어 있다. VGluT1 시냅스는 근위 수지(proximal dendrites) 및 SMA 운동 뉴런의 체세포 둘 다에서 구조된다.
도 13은 3개의 패널,(A),(B) 및(C)로 이루어진다. 도 13은 구조된 VGluT1 시냅스가 기능성 시냅스임을 나타낸다. 구조된 자기수용 시냅스의 기능을 시험하기 위해, 생체외(ex vivo) 척수 제제로 배근(dorsal root)을 자극하고 척추 반사를 기록하기 위해 제조한다. WT 마우스는 풍부한 모노시냅스 반응을 나타낸다(도 13의 B)(회색으로 강조함). 반사는 SMA 마우스에서 현저히 감소된다. C1q 중화 Ab를 사용한 치료는 단일 자극 후 반사의 진폭을 유의적으로 증진시켰다. 살아있는 운동 뉴런의 수와는 독립적인 시냅스 기능을 챌린지(challenge)하기 위하여, 배근 뉴런을 보다 높은 빈도로 자극했다. 20Hz에서의 자극은 WT 마우스에서 ~60% 기능저하(depression)을 초래하였고 SMA 마우스에서 거의 완전히 저하되었다(도 13의 B). 항-C1q 항체를 사용한 치료는 WT 마우스에서 관찰된 것과 거의 동일한 기능저하를 초래하였으며, 이는 구조된 시냅스가 기능적이라는 추가의 증거를 제공한다.
상세한 설명
본 개시내용은 일반적으로 대상체에게 보체 경로의 억제제를 투여함을 포함하여, 척수 근 위축증으로 진행될 위험을 예방하거나, 감소시키거나, 이를 치료하는 방법에 관한 것이다.
적합한 항체는 보체 성분 C1q, C1r, 또는 C1s에 결합하는 항체를 포함한다. 이러한 항체는 모노클로날 항체 및 동족체, 유사체, 및 Fab, F(ab')2, Fv 및 단일 쇄 항체를 포함하는, 이의 변형되거나 유도된 형태를 포함한다.
바람직한 항체는 모노클로날 항체이며, 이는 설치류(예컨대, 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아 피그)를 (1) 인간 혈장 또는 혈청으로부터의 정제된 보체 성분의 효소적 분해로부터 기원한 천연의 보체 성분(예컨대, C1q, C1r, 또는 C1s), 또는(2) 진핵세포 또는 원핵세포 시스템에 의해 발현된, 재조합 보체 성분, 또는 이의 유도된 단편으로 면역화시켜 생성시킬 수 있다. 다른 동물, 예를 들면, 비-인간 영장류, 인간 면역글로불린을 발현하는 이식유전자 마우스, 및 인간 B-림프구로 이식된 심각한 조합된 면역결핍성(SCID) 마우스를 면역화를 위해 사용할 수 있다.
폴리클로날 및 모노클로날 항체는 병원체에 대한 면역계의 반응에서 면역글로불린(Ig) 분자로서 천연적으로 생성된다. 인간 혈청 속에서 농도가 8 mg/ml인 우성 양식인, ~150-kDa의 IgG1 분자는 2개의 동일한 ~50-kDa의 중쇄와 2개의 동일한 ~25-kDa의 경쇄로 구성된다.
하이브리도마는 골수 세포를 지닌 면역화된 동물로부터의 B-림프세포를 융합시킴으로써 통상의 공정으로 생성할 수 있다. 또한, 항-C1q, -C1r, 또는 -C1s 항체는 파아지-디스플레이 시스템에서 인간 B-림프구로부터 재조합 단일 쇄 Fv 또는 Fab 라이브러리를 스크리닝(screening)함으로써 생성시킬 수 있다. 인간 C1q, C1r, 또는 C1s에 대한 MAb의 특이성은 효소 연결된 면역흡착성 검정(ELISA), 웨스턴 면역블롯팅, 또는 다른 면역화학적 기술로 시험할 수 있다.
스크리닝 과정에서 확인된 항체의 보체 활성화에 있어서의 억제 활성은 대안적 보체 경로의 경우 비감작화된 토끼 또는 기니아 피그 RBC를 사용하거나 전통적인 보체 경로의 경우 감작화된 닭 또는 양 RBC를 사용한 용혈 검정에 의해 평가할 수 있다. 전통적인 보체 경로에 대해 특이적인 억제 활성을 나타내는 하이브리도마는 제한된 희석으로 클로닝된다. 항체는 상술한 검정에 의해 인간 C1q, C1r, 또는 C1s에 대한 특이성에 대해 특성화용으로 정제된다.
항-C1q, -C1r, 또는 -C1s 항체의 가변 영역의 분자 구조를 기반으로 하여, 분자 모델링 및 합리적 분자 설계(rational molecular design)를 사용하여 항체의 결합 영역의 분자 구조를 모사하고 C1q, C1r, 또는 C1s의 활성을 억제하는 소 분자를 생성하고 스트리닝할 수 있다. 이들 소 분자는 펩타이드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 올리고뉴클레오타이드, 또는 유기 화합물일 수 있다. 모사하는 분자는 신경성, 염증성, 또는 자가면역 질환에서 보체 활성화의 억제제로서 사용할 수 있다. 대안적으로, 조합 화합물의 라이브러리(library)로부터 적합한 소 분자를 분리하기 위한 분야에서 일반적으로 사용된 대규모 스크리닝 과정을 사용할 수 있다.
본원에 개시된 항체의 적합한 노출은 10 내지 500 μg/ml의 혈청일 수 있다. 실제 혈청 노출은 임상 시험에서 결정되며, 최적의 투여량을 측정하기 위해, 즉, 다양한 투여량을 투여하고 어느 투여량이 바람직하지 않은 부작용없이 적합한 효능을 제공하는지를 측정하기 위한 통상의 방법으로 결정될 수 있다.
재조합 DNA 기술의 출현 이전에는, 폴리펩타이드 서열을 절단하는 단백질분해 효소(프로테아제)를 사용하여 항체 분자의 구조를 해부하고 이의 다양한 기능에 관여할 수 있는 분자의 부분을 측정하였다. 프로테아제 파파인을 사용한 제한된 분해는 항체 분자를 3개의 단편으로 절단한다. Fab 단편으로 공지된 2개의 단편은 동일하며 항원-결합 활성을 함유한다. Fab 단편은 항체 분자의 2개의 동일한 아암(arm)에 상응하며, 이들 각각은 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이루는 완전한 경쇄로 이루어져 있다. 다른 단편은 항원 결합 활성을 함유하지 않지만 용이하게 결정화하는 것으로 원래 관찰되었으며 이러한 이유로 Fc 단편(결정화가능한 단편)으로 명명된다.
Fab 분자는 불변 도메인 CH2 및 CH3를 결여한 중쇄를 지닌 Ig 분자의 인공의 ~50-kDa의 단편이다. 2개의 이호성(heterophilic)(VL-VH 및 C1-CH1) 도메인 상호작용은 Fab 분자의 2개-쇄 구조의 기저를 이루며, 이는 또한 CL과 CH1 사이의 이황화물 브릿지에 의해 추가로 안정화된다. Fab 및 IgG는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 형성된 동일한 항원 결합 부위를 가지며, 상기 상보성 결정 영역은 3개 각각이 VL 및 VH로부터 기원한다(LCDR1, LCDR2, LCDR3 및 HCDR1, HCDR2, HCDR3). CDR은 항체의 초가변 항원 결합 부위를 정의한다. 최고의 서열 변이는 LCDR3 및 HCDR3에서 발견되며, 이는 천연 면역계내에서 VL 및 JL 유전자 또는 VH, DH 및 JH 유전자 각각의 재배열에 의해 생성된다. LCDR3 및 HCDR3은 전형적으로 항원 결합 부위의 코어를 형성한다. 6개의 CDR을 연결하여 나타내는 보존된 영역은 골격 영역으로 지칭된다. 가변 도메인의 3차원 구조에서, 골격 영역은 외부에서 초가변 CDR 루프(loop)에 의해 및 내부에서 보존된 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 대치하는 역평행 β-시이트(sheet)의 샌드위치를 형성한다.
척수 근 위축증에서와 같이, 시냅스 손실의 부작용으로 고생하는 개인을 보호하거나 치료하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 정상적인 발달시 미성숙 성상세포는 뉴런을 유도하여 특이적인 보체 단백질을 발현하는 시그날을 생성하여, 발달 윈도우(developmental window)가 가능하도록 하며 이 동안 시냅스 제거가 일어난다. 발달시 이러한 단백질의 발현은 발달 시냅스생성의 기간을 보여주며, 시냅스 프루닝(synaptic pruning) 및 제거가 일어나는 경우 배아 뇌 및 성인 뇌에서는 사라지지만 출산 후 태아에서는 고 수준으로 존재한다.
이러한 발견은 다양한 임상 상태, 특히 척수 근 위축증과 같이, 시냅스 손실이 관여하는 신경변성 상태와 광범위하게 연루되어 있다. 시냅스 손실은 뉴런을 보체 경로의 억제제 또는 길항제와 접촉시킴으로써 억제된다. 예를 들면, 억제제는 보체 캐스캐이드의 활성화를 차단할 수 있고, 뉴런에서 특이적인 보체 단백질의 발현을 차단할 수 있으며 보체 활성화를 유도하는 시그널링 분자를 방해할 수 있고, 뉴런에서 보체 억제제의 발현을 상향조절할 수 있으며, 그렇지 않으면 시냅스 손실에서 보체의 역활을 방해할 수 있다. 예컨대, 성체 뇌에서 시냅스 손실을 방지하는 능력은 다양한 신경변성 상태에서 정상의 뉴런 기능을 유지하기 위한 중요한 영향을 갖는다.
항-보체 C1q 항체
적합한 억제제는 보체 C1q 단백질(즉, 본원에서 또한 항-C1q 항체 및 C1q 항체로 지칭된, 항-보체 C1q 항체)에 결합하는 항체 및, 척수 근 위축증으로 진행될 위험을 예방하거나, 감소시키거나, 이를 치료하는 방법을 위한 이러한 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
다음의 14번째 절에서 언급된 모든 서열은 이것이 개시하고 있는 항체 및 관련 조성물에 대해 참고로 본원에 포함된 제WO 2015/006504호로부터 참고로 포함된다.
경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항-C1q 항체를 투여하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 항체는 적어도 인간 C1q, 마우스 C1q, 또는 랫트 C1q에 결합할 수 있다. 항체는 인간화된 항체, 키메라 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 경쇄 가변 도메인은 수탁 번호 제PTA-120399호로 기탁된 하이브리도마 세포주(hybridoma cell line)에 의해 생산된 모노클로날 항체 M1의 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3를 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 ATCC 수탁번호 제PTA-120399호로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체 M1의 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3를 포함한다.
일부 구현예에서, 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 하나 이상의 서열 번호: 5의 HVR-L1, 서열 번호: 6의 HVR-L2, 서열 번호:7의 HVR-L3, 서열 번호:9의 HVR-H1, 서열 번호:10의 HVR-H2, 및 서열 번호:11의 HVR-H3을 포함한다.
항체는 서열 번호: 4에 대해 적어도 85% 동일한 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열 번호: 8에 대해 적어도 85% 동일한 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
C1q와 자가항체 사이의 상호작용을 억제하는 항-C1q 항체를 투여하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q와 시냅스 사이의 상호작용을 억제한다. 바람직한 구현예에서, 항-C1q 항체는 순환계 또는 조직으로부터 C1q를 제거하도록 한다.
항-C1q 항체는 C1q 단백질에 결합하여, (a) 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 196 내지 226번(서열 번호: 16), 또는 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 196 내지 226번(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHI)(서열 번호: 16)에 상응하는 C1q 단백질 쇄 A(C1qA)의 아미노산 잔기; (b) 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 196 내지 221번(서열 번호: 17), 또는 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 196 내지 221번(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(서열 번호: 17)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; (c) 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 202 내지 221번(서열 번호: 18), 또는 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 202 내지 221번(SGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(서열 번호: 18)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; (d) 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 202 내지 219번(서열 번호: 19), 또는 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 202 내지 219번(SGGMVLQLQQGDQVWVEK)(서열 번호: 19)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; 및 (e) 서열 번호: 1의 아미노산 잔기 Lys 219 및/또는 Ser 202, 또는 서열 번호: 1의 Lys 219 및/또는 Ser 202에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산 잔기내 C1q 단백질의 하나 이상의 아미노산에 결합한다.
일부 구현예에서, 항체는 (a) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 218 내지 240번(서열 번호: 20) 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 218 내지 240번(WLAVNDYYDMVGI QGSDSVFSGF)(서열 번호: 20)에 상응하는 C1q 단백질 쇄 C(C1qC)의 아미노산 잔기; (b) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 225 내지 240번(서열 번호: 21) 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 225 내지 240번(YDMVGI QGSDSVFSGF)(서열 번호: 21)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (c) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 225 내지 232번(서열 번호: 22) 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 225 내지 232번(YDMVGIQG)(서열 번호: 22)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (d) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 Tyr 225번 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 Tyr 225번에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (e) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 174 내지 196번(서열 번호: 23) 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 174 내지 196번(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(서열 번호: 23)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (f) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 184 내지 192번(서열 번호: 24) 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 184 내지 192번(RSGVKVVTF)(서열 번호: 24)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (g) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 185 내지 187번 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 185 내지 187번(SGV)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (h) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 Ser 185번 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 Ser 185번에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산 잔기내 C1q 단백질의 하나 이상의 아미노산에 추가로 결합한다.
특정의 구현예에서, 항-C1q 항체는 서열 번호: 1에 나타낸 바와 같은 인간 C1qA의 아미노산 잔기 Lys 219번 및 Ser 202번 또는 서열 번호: 1에 나타낸 바와 같은 Lys 219 및 Ser 202에 상응하는 인간 C1qA의 아미노산, 및 서열 번호: 3에 나타낸 바와 같은 인간 C1qC의 아미노산 잔기 Tyr 225번 또는 서열 번호: 3에 나타낸 바와 같은 Tyr 225에 상응하는 인간 C1qC의 아미노산 잔기에 결합한다. 특정의 구현예에서, 항-C1q 항체는 서열 번호: 1에 나타낸 바와 같은 인간 C1qA의 아미노산 잔기 Lys 219번 또는 서열 번호: 1에 나타낸 바와 같은 Lys 219번에 상응하는 인간 C1qA의 아미노산 잔기, 및 서열 번호: 3에 나타낸 바와 같은 인간 C1qC의 아미노산 잔기 Ser 185번 또는 서열 번호: 3에 나타낸 바와 같은 Ser 185번에 상응하는 인간 C1qC의 아미노산 잔기에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q 단백질에 결합하며 (a) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 218 내지 240번(서열 번호: 20) 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 218 내지 240번(WLAVNDYYDMVGI QGSDSVFSGF)(서열 번호: 20)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (b) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 225 내지 240번(서열 번호: 21) 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 225 내지 240번(YDMVGI QGSDSVFSGF)(서열 번호: 21)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (c) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 225 내지 232번(서열 번호: 22) 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 225 내지 232번(YDMVGIQG)(서열 번호: 22)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (d) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 Tyr 225번 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 Tyr 225번에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (e) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 174 내지 196번(서열 번호: 23) 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 174 내지 196번(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(서열 번호: 23)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (f) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 184 내지 192번(서열 번호: 24) 또는 서열 번호: 3(서열 번호: 24)의 아미노산 잔기 184 내지 192번(RSGVKVVTF)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (g) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 185 내지 187번 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 185 내지 187번(SGV)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (h) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 Ser 185번 또는 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 Ser 185번에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산 잔기내 C1q 단백질의 하나 이상의 아미노산에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항-C1q 항체는 C1q와 C1s 사이의 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q와 C1r 사이의 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q와 C1s 및 C1q와 C1r 사이의 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q와 자가항체와 같은 다른 항체 사이의 상호작용을 억제한다. 바람직한 구현예에서, 항-C1q 항체는 순환계 또는 조직으로부터 C1q의 제거를 유발한다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 2.5:1; 2.0:1; 1.5:1; 또는 1.0:1 미만의 화학량론에서, 각각의 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, C1q 항체는 C1q 및 항-C1q 항체의 대략적인 등몰 농도에서 C1q-C1s 상호작용과 같은 상호작용을 억제한다. 다른 구현예에서, 항-C1q 항체는 20:1 미만; 19.5:1 미만; 19:1 미만; 18.5:1 미만; 18:1 미만; 17.5:1 미만; 17:1 미만; 16.5:1 미만; 16:1 미만; 15.5:1 미만; 15:1 미만; 14.5:1 미만; 14:1 미만; 13.5:1 미만; 13 :1 미만; 12.5:1 미만; 12:1 미만; 11.5:1 미만; 11 :1 미만; 10.5:1 미만; 10:1 미만; 9.5:1 미만; 9:1 미만; 8.5:1 미만; 8:1 미만; 7.5:1 미만; 7:1 미만; 6.5:1 미만; 6:1 미만; 5.5:1 미만; 5:1 미만; 4.5:1 미만; 4:1 미만; 3.5:1 미만; 3:1 미만; 2.5:1 미만; 2.0:1 미만; 1.5:1 미만; 또는 1.0:1 미만의 화학량론으로 C1q에 결합한다. 특정의 구현예에서, 항-C1q 항체는 20:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위의 결합 화학량론으로 C1q에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 6:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론으로 C1q와 결합한다. 특정의 구현예에서, 항-C1q 항체는 2.5:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론으로 C1q에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q과 C1r 사이, 또는 C1q와 C1s 사이, 또는 C1q와 C1r 및 C1s 둘 다의 사이의 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q와 C1r, C1q와 C1s, 및/또는 C1q와 C1r 및 C1s 둘 다의 사이의 상호작용을 억제한다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q A-쇄에 결합한다. 다른 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q B-쇄에 결합한다. 다른 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q C-쇄와 결합한다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q A-쇄, C1q B-쇄 및/또는 C1q C-쇄에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q A-쇄, B-쇄, 및/또는 C-쇄의 구형 도메인(globular domain)에 결합한다. 다른 구현예에서, 항-C1q 항체는 C1q A-쇄, C1q B-쇄, 및/또는 C1q C-쇄의 콜라겐-유사 도메인에 결합한다.
본 개시내용의 항체가 C1q 및 C1s의 상호작용, 또는 C1q와 C1r 사이의 상호작용과 같은 2개 이상의 보체 인자 사이의 상호작용을 억제하는 경우, 항체의 존재하에 일어나는 상호작용은 본 개시내용의 항체가 부재하는 대조군에 대해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%), 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 까지 감소될 수 있다. 특정의 구현예에서, 항체의 존재하에서 일어나는 상호작용은 본 개시내용의 항체가 부재하는 대조군에 대해 적어도 30% 내지 적어도 99% 범위의 양까지 감소한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 본 개시내용의 항체가 부재하는 대조군에 대해 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 30% 내지 적어도 99%의 양까지 C2 또는 C4-절단을 억제한다. C2 또는 C4-절단을 측정하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. C2 또는 C4-절단과 관련하여 본 개시내용의 항체에 대한 EC50 값은 3 μg/ml 미만; 2.5 μg/ml 미만; 2.0 μg/ml; 1.5 μg/ml; 1.0 μg/ml; 0.5 μg/ml; 0.25 μg/ml; 0.1 μg/ml; 0.05 μg/ml일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 C1q 및 각각의 항-C1q 항체의 대략 등몰 농도에서 C2 또는 C4-절단을 억제한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 본 개시내용의 항체가 부재하는 대조군에 대해 자가항체-의존성 및 보체-의존성 세포독성(CDC)을 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%까지, 또는 적어도 30% 내지 적어도 99% 범위의 양까지 억제한다. 자가항체-의존성 및 보체-의존선 세포독성과 관련하여 본 개시내용의 항체에 대한 EC50 값은 3 μg/ml 미만; 2.5 μg/ml; 2.0 μg/ml; 1.5 μg/ml; 1.0 μg/ml; 0.5 μg/ml; 0.25 μg/ml; 0.1 μg/ml; 0.05 μg/ml일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 본 개시내용의 항체가 부재하는 대조군에 대해 보체-의존성 세포-매개된 세포독성(CDCC)을 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 30% 내지 적어도 99%까지 억제한다. CDCC를 측정하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. CDCC 억제와 관련하여 본 개시내용의 항체에 대한 EC50 값은 3 μg/ml 미만; 2.5 μg/ml; 2.0 μg/ml; 1.5 μg/ml; 1.0 μg/ml; 0.5 μg/ml; 0.25 μg/ml; 0.1 μg/ml; 0.05 μg/ml일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 CDCC를 억제하지만 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 억제하지 않는다.
인간화된 항-보체 C1q 항체
본 개시내용의 인간화된 항체는 전통적인 보체 경로의 C1 복합체 내의 보체 인자 C1q 및/또는 C1q 단백질에 특이적으로 결합한다. 인간화된 항-C1q 항체는 인간 C1q, 인간 및 마우스 C1q, 랫트 C1q, 또는 인간 C1q, 마우스 C1q, 및 랫트 C1q에 특이적으로 결합할 수 있다.
다음의 16번째 단락에서 언급된 모든 서열은 미국 가특허원 제62/075793호로부터 참고로 포함되며, 이는 이것이 개시하고 있는 항체 및 관련된 조성물에 대해 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 인간 중쇄 불변 영역은 서열 번호: 47의 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 37에 대해 적어도 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG4 중쇄 불변 영역이다. 인간 IgG4 중쇄 불변 영역은 카밧 번호매김(Kabat numbering)에 따라 하나 이상의 변형 및/또는 아미노산 치환을 지닌 Fc 영역을 포함할 수 있다. 이러한 경우에서, Fc 영역은 248번 위치에서 루이신의 글루타메이트로의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 이러한 치환은 Fc 수용체와의 상호작용으로부터 Fc 영역을 억제한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 241번 위치에서 세린의 프롤린으로의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 이러한 치환은 항체내 아암 스위칭(arm switching)을 방지한다.
인간 IgG4(S241P L248E) 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열은:
Figure pct00001
이다.
항체는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 중쇄 가변 도메인은 서열 번호: 31 내지 34 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 31 내지 34 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 특정의 이러한 구현예에서, 경쇄 가변 도메인은 서열 번호: 35 내지 38 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호:35 내지 38 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 상동성인 아미노산 서열을 포함한다.
중쇄 가변 도메인 변이체 1(VH1)의 아미노산 서열은:
Figure pct00002
(서열 번호:31)이다. VH1의 초 가변 영역(HVR)은 굵은 글씨체로 묘사되고 밑줄쳐져 있다.
중쇄 가변 도메인 변이체 2(VH2)의 아미노산 서열은:
Figure pct00003
(서열 번호:32)이다. VH2의 초 가변 영역(HVR)은 굵은 글씨체로 묘사되고 밑줄쳐져 있다.
중쇄 가변 도메인 변이체 3(VH3)의 아미노산 서열은:
Figure pct00004
(서열 번호:33)이다. VH3의 초가변 영역(HVR)은 굵은 글씨체로 묘사되고 밑줄쳐져 있다.
중쇄 가변 도메인 변이체 4(VH4)의 아미노산 서열은:
Figure pct00005
(서열 번호:34). VH4의 초 가변 영역(HVR)은 굵은 글씨체로 묘사되고 밑줄쳐져 있다.
카파 경쇄 가변 도메인 변이체 1(Vκ1)의 아미노산 서열은:
Figure pct00006
(서열 번호: 35)이다. Vκ1의 초 가변 영역(HVR)은 굵은 글씨체로 묘사되고 밑줄쳐져 있다.
카파 경쇄 가변 도메인 변이체 2(Vκ2)의 아미노산 서열은:
Figure pct00007
(서열 번호: 36)이다. Vκ2의 초 가변 영역(HVR)은 굵은 글씨체로 묘사되고 밑줄쳐져 있다.
카파 경쇄 가변 도메인 변이체 3(Vκ3)의 아미노산 서열은:
Figure pct00008
(서열 번호:37)이다. Vκ3의 초 가변 영역(HVR)은 굵은 글씨체로 묘사되고 밑줄쳐져 있다.
카파 경쇄 가변 도메인 변이체 4(Vκ4)의 아미노산 서열은:
Figure pct00009
(서열 번호:38)이다. Vκ4의 초 가변 영역(HVR)은 굵은 글씨체로 묘사되고 밑줄쳐져 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 인간화된 항-C1q 항체는 Fab 영역을 함유하는 중쇄 가변 영역 및 Fc 영역을 함유하는 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기서 Fab 영역은 본 개시내용의 C1q 단백질에 특이적으로 결합하지만, Fc 영역은 C1q 단백질에 결합할 수 없다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 동형으로부터 기원한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 보체 활성을 유도할 수 없고/없거나 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 유도할 수 없다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 아미노산 치환을 포함하며, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 변형을 포함한다. 특정의 구현예에서, 본 개시내용의 인간화된 항-C1q 항체의 Fc 영역은 카밧 번호매김 관례에 따라 248번 위치 또는 카밧 번호매김 관례에 따라 248번에 상응하는 위치, 및/또는 카밧 번호매김 관례에 따라 241번 위치 또는 카밧 번호매김 관례에 따라 241번에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 248번 위치 또는 248번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환은 Fc 수용체와의 상호작용으로부터 Fc 영역을 억제한다. 일부 구현예에서, 248번 위치 또는 248번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환은 루이신의 글루타메이트로의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 241번 위치에서 또는 241번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환은 항체내 아암 스위칭(arm switching)을 방지한다. 일부 구현예에서, 241번 위치에서 또는 241번 위치에 상응하는 위치에서 아미노산 치환은 세린에서 프롤린으로의 아미노산 치환이다. 특정의 구현예에서, 본 개시내용의 인간화된 항-C1q 항체의 Fc 영역은 서열 번호:37의 아미노산 서열, 또는 서열 번호:47의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 상동성을 지닌 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 인간화된 항-C1q 항체는 C1q 단백질에 결합할 수 있으며 (a) 서열 번호:39의 아미노산 잔기 196 내지 226번(서열 번호:42), 또는 서열 번호:39의 아미노산 잔기 196 내지 226번(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDPKKGHI)(서열 번호:42)에 상응하는 C1q 단백질 쇄 A(C1qA)의 아미노산 잔기; (b) 서열 번호:39의 아미노산 잔기 196 내지 221번(서열 번호:43), 또는 서열 번호:39의 아미노산 잔기 196 내지 221번(GLFQVVSGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(서열 번호:43)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; (c) 서열 번호:39의 아미노산 잔기 202 내지 221번(서열 번호:44), 또는 서열 번호:39의 아미노산 잔기 202 내지 221번(SGGMVLQLQQGDQVWVEKDP)(서열 번호:44)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; (d) 서열 번호:39의 아미노산 잔기 202 내지 219번(서열 번호: 45), 또는 서열 번호:39의 아미노산 잔기 202 내지 219번(SGGMVLQLQQGDQVWVEK)(서열 번호:45)에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기; 및 (e) 서열 번호:39의 아미노산 잔기 Lys 219 및/또는 Ser 202, 또는 서열 번호:39의 Lys 219번 및/또는 Ser 202번에 상응하는 C1qA의 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산 잔기내 C1q 단백질의 하나 이상의 아미노산에 결합한다.
일부 구현예에서, 인간화된 항-C1q 항체는: (a) 서열 번호:41의 아미노산 잔기 218 내지 240번(서열 번호: 46) 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 218 내지 240번(WLAVNDYYDMVGI QGSDSVFSGF)(서열 번호: 46)에 상응하는 C1q 단백질 쇄 C(C1qC)의 아미노산 잔기; (b) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 225 내지 240번(서열 번호: 48) 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 225 내지 240번(YDMVGI QGSDSVFSGF)(서열 번호: 48)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (c) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 225 내지 232번(서열 번호: 49) 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 225 내지 232번(YDMVGIQG)(서열 번호: 49)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 Tyr 225번 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 Tyr 225번에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (e) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 174 내지 196번(서열 번호: 50) 또는 서열 번호:41의 아미노산 잔기 174 내지 196(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(서열 번호: 50)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (f) 서열 번호: 41(서열 번호: 30)의 아미노산 잔기 184 내지 192번 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 184 내지 192번(RSGVKVVTF)(서열 번호: 30)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (g) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 185 내지 187번 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 185 내지 187번(SGV)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (h) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 Ser 185번 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 Ser 185번에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기로부터 선택된 아미노산 잔기를 갖는 C1q 단백질의 하나 이상의 아미노산에 추가로 결합할 수 있다.
특정의 구현예에서, 본 개시내용의 인간화된 항-C1q 항체는 서열 번호: 39에 나타낸 바와 같은 인간 C1qA의 아미노산 잔기 Lys 219번 및 Ser 202번 또는 서열 번호: 39에 나타낸 바와 같은 Lys 219번 및 Ser 202번에 상응하는 인간 C1qA의 아미노산, 및 서열 번호: 41에 나타낸 바와 같이 인간 C1qC의 아미노산 잔기 Tyr 225번 또는 서열 번호: 41에 나타낸 바와 같은 Tyr 225번에 상응하는 인간 C1qC의 아미노산 잔기에 결합할 수 있다. 특정의 구현예에서, 항-C1q 항체는 서열 번호: 39에 나타낸 바와 같은 인간 C1qA의 아미노산 잔기 Lys 219번 또는 서열 번호: 39에 나타낸 바와 같은 Lys 219번에 상응하는 인간 C1qA의 아미노산 잔기, 및 서열 번호: 41에 나타낸 바와 같은 인간 C1qC의 아미노산 잔기 Ser 185번 또는 서열 번호: 41에 나타낸 바와 같은 Ser 185번에 상응하는 인간 C1qC의 아미노산 잔기에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 인간화된 항-C1q 항체는 C1q 단백질에 결합할 수 있으며 다음으로부터 선택된 아미노산 잔기내 C1q 단백질의 하나 이상의 아미노산에 결합할 수 있다: (a) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 218 내지 240번(서열 번호: 46) 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 218 내지 240번(WLAVNDYYDMVGI QGSDSVFSGF)(서열 번호: 46)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (b) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 225 내지 240번(서열 번호: 48) 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 225 내지 240번(YDMVGIQGSDSVFSGF)(서열 번호: 48)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (c) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 225 내지 232번(서열 번호: 49) 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 225 내지 232번(YDMVGIQG)(서열 번호: 49)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 Tyr 225번 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 Tyr 225번에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (e) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 174 내지 196번(서열 번호: 50) 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 174 내지 196번(HTANLCVLLYRSGVKVVTFCGHT)(서열 번호: 50)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (f) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 184 내지 192번(서열 번호: 50) 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 184 내지 192번(RSGVKVVTF)(서열 번호: 50)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (g) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 185 내지 187번 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 185 내지 187번(SGV)에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기; (h) 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 Ser 185번 또는 서열 번호: 41의 아미노산 잔기 Ser 185번에 상응하는 C1qC의 아미노산 잔기.
항-보체 C1s 항체
적합한 억제제는 보체 C1s 단백질에 결합하는 항체(즉, 본원에서 항-C1s 항체 및 C1s 항체로 또한 지칭된 항-보체 C1s 항체) 및 이러한 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 보체 C1s는 보체 캐스캐이드의 상부에 있으므로 매력적인 표적이며 협소한 범위의 기질 특이성을 갖는다. 또한, C1s의 활성화된 형태에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들면, 모노클로날 항체이며 이로 한정되지 않는다)를 수득하는 것이 가능하다.
다음의 2개의 단락에서 언급된 모든 서열이 제WO 2014/186599호로부터의 참고에 의해 포함되며, 이는 여기서 이것이 개시하고 았는 항체 및 관련된 조성물에 대한 참고로 본원에 포함된다.
특정 국면에서, 항-C1s 항체를 투여하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 항체는 쥐과의, 인간화된, 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 가변 도메인은 2013년 5월 15일자로 ATCC에 기탁된 하이브리드마 세포주 또는 이의 자손(ATCC 수탁 번호 제PTA-120351호)에 의해 생산된 쥐과의 항-인간 C1s 모노클로날 항체 5A1의 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함하고, 중쇄는 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3를 포함한다. 다른 구현예에서, 경쇄 가변 도메인은 2013년 5월 15일자로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주, 또는 이의 자손(ATCC 수탁 번호 제PTA-120352호)에 의해 생산된 쥐 항-인간 C1s 모노클로날 항체 5C12의 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3을 포함하고 중쇄 가변 도메인은 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 C1q에 결합하는 C1s, C1r에 결합하는 C1s, 또는 C2 또는 C4에 결합하는 C1s와 같이 C1s 또는 C1s 전구효소(proenzyme)에 특이적으로 결합하여 이의 생물학적 활성을 억제한다. 생물학적 활성은 C1s의 단백질분해 효소 활성, C1s 전구효소의 활성 프로테아제로의 전환, 또는 C2 또는 C4의 단백질분해성 절단일 수 있다. 특정의 구현예에서, 생물학적 활성은 전통적인 보체 활성화 경로의 활성화, 항체 및 보체 의존성 세포독성의 활성화, 또는 C1F 용혈작용이다.
다음의 62번째 단락에서 모든 서열은 반 블라쎄라에르(Van Vlasselaer)의, 미국 특허 제8,877,197호로부터 참고로 포함되며, 이는 이것이 개시하고 있는 항체 및 관련된 조성물에 대해 참고로 본원에 포함된다.
보체 성분 C1s의 도메인 IV 및 V를 포함하는 영역내 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화된 모노클로날 항체를 투여하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 일부 경우에, 항체는 보체 성분 4(C4)에 대한 C1s의 결합을 억제하고/하거나 C1s의 프로테아제 활성을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, 방법은 C1 복합체 속에서 보체 성분 C1s에 높은 항체결합능(avidity)으로 결합하는 인간화된 모노클로날 항체를 투여함을 포함한다.
아미노산 서열 서열 번호: 57을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역 및/또는 아미노산 서열 서열 번호: 58을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 지닌 항-C1s 항체를 투여하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 항-C1s 항체는 인간 또는 랫트 보체 C1s 단백질에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 보체 C1s 단백질에 의해 절단된 적어도 하나의 기질의 절단을 억제한다.
특정의 구현예에서, 항체는: a) 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 및 서열 번호: 56으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR); 및/또는 b) 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 53, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 및 서열 번호: 66으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
항체는 아미노산 서열 서열 번호: 51을 갖는 CDR-L1, 아미노산 서열 서열 번호: 52를 갖는 CDR-L2, 아미노산 서열 서열 번호: 53을 갖는 CDR-L3, 아미노산 서열 서열 번호: 54를 갖는 CDR-H1, 아미노산 서열 서열 번호: 55를 갖는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 서열 번호: 56을 갖는 CDR-H3을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 항체는 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 갖는 가변 영역의 경쇄 CDR, 및/또는 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 갖는 가변 영역의 중쇄 CDR을 포함할 수 있다.
항체는 보체 성분 C1s에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체일 수 있으며, 여기서 항체는 에피토프에 대한 결합에 대해 아미노산 서열 서열 번호: 57 또는 서열 번호: 67을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역의 CDR 중 하나 이상, 및/또는 아미노산 서열 서열 번호: 58 또는 서열 번호: 68을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 CDR 중 하나 이상을 포함하는 항체와 경쟁한다.
다른 예에서, 항체는 보체 C1s에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체일 수 있으며, 여기서 항체는: a) 보체 C1s 단백질 내에서 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체(여기서, 항체는 에피토프에 대한 결합에 대해 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 및 서열 번호: 56으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다); 및 b) 보체 C1s 단백질 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체(여기서, 항체는 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 53, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 및 서열 번호: 66으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다)로부터 선택된다. 일부 경우에, 항체는 에피토프에 대한 결합에 대해 a) 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 69, 서열 번호: 55, 및 서열 번호: 56; 또는 b) 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 53, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 및 서열 번호: 66을 포함하는 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다.
항체는 별도의 폴리펩타이드 내에 존재하는 경쇄 영역 및 중쇄 영역을 포함할 수 있다. 항체는 Fc 영역을 포함할 수 있다.
아미노산 서열 서열 번호: 57에 대해 90% 동일한 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역, 및 아미노산 서열 서열 번호: 58에 대해 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-C1s 항체가 본원에 개시되어 있다.
항-C1s 항체는 항원 결합 단편, Ig 단량체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, scFv, scAb, dAb, Fv, 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체, 일-특이적인 항체, 이-특이적인 항체, 또는 다중-특이적인 항체로부터 선택될 수 있다.
항체 IPN003(또한 본원에서 "IPN-M34" 또는 "M34" 또는 "TNT003"로서 지칭됨), 예컨대, 항체 IPN003과 같은 항체 IPN003의 가변 도메인을 포함하는 항체에 의해 결합된 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체를 투여하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 방법은 보체 C1s 단백질 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 투여함을 포함한다. 일부 구현예에서, 분리된 항-C1s 항체는 활성화된 C1s 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 분리된 항-C1s 항체는 C1s의 불활성 형태에 결합한다. 다른 예에서, 분리된 항-C1s 항체는 활성화된 C1s 단백질 및 C1s의 불활성 형태 둘 다에 결합한다.
일부 구현예에서, 방법은 C4의 절단을 억제하는 모노클로날 항체를 투여함을 포함하며, 여기서 분리된 모노클로날 항체는 C2의 절단을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, 방법은 C2의 절단을 억제하는 모노클로날 항체를 투여함을 포함하며, 여기서 분리된 모노클로날 항체는 C4의 절단을 억제하지 않는다. 일부 경우에, 분리된 모노클로날 항체는 인간화된다. 일부 경우에, 항체는 전통적인 보체 경로의 성분을 억제한다. 일부 경우에, 항체에 의해 억제된 전통적인 보체 경로의 성분은 C1s이다. 본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 개인에게 C4의 절단을 억제하는 분리된 모노클로날 항체, 또는 분리된 모노클로날 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여함으로써, 보체-매개된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 분리된 모노클로날 항체는 C2의 절단을 억제하지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 C1s에 의한 C2 또는 C4의 절단을 억제하는, 즉, C2 또는 C4의 C1s-매개된 단백질분해성 절단을 억제하는 모노클로날 항체를 투여함을 포함한다. 일부 경우에, 모노클로날 항체는 인간화된다. 일부 경우에, 항체는 C1s에 대한 C2 또는 C4의 결합을 억제함으로써 C2 또는 C4의 절단을 억제하는데; 예를 들면, 일부 경우에, 항체는 C1s의 C2 또는 C4 결합 부위에 대한 C2 또는 C4의 결합을 억제함으로써 C2 또는 C4의 C1s-매개된 절단을 억제한다. 따라서, 일부 경우에, 항체는 경쟁적 억제제로서 기능한다. 본 개시내용은 또한 이를 필요로 하는 개인에게 C1s에 의한 C2 또는 C4의 절단을 억제하는, 즉, C2 또는 C4의 C1s-매개된 단백질분해성 절단을 억제하는 분리된 모노클로날 항체를 투여함으로써 척수 근 위축증을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 방법은 C1s에 의한 C4의 절단을 억제하는 모노클로날 항체를 투여함을 포함하며, 여기서 항체는 C1s에 의한 보체 성분 C2의 절단을 억제하지 않는데; 즉, 항체는 C4의 C1s-매개된 절단을 억제하지만, C2의 C1s-매개된 절단을 억제하지 않는다. 일부 경우에, 모노클로날 항체는 인간화된다. 일부 경우에, 모노클로날 항체는 C1s에 대한 C4의 결합을 억제하지만, C1s에 대한 C2의 결합을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, 방법은 이를 필요로 하는 개인에게 C1s에 의한 C4의 절단을 억제하는 분리된 모노클로날 항체를 투여함으로써, 보체-매개된 질환 또는 장애를 치료함을 포함하며, 여기서 항체는 C1s에 의한 보체 성분 C2의 절단을 억제하지 않는데; 즉, 항체는 C4의 C1s-매개된 절단을 억제하지만, C2의 C1s-매개된 절단을 억제하지 않는다. 방법의 일부 구현예에서, 항체는 인간화된다.
일부 구현예에서, 방법은 C1s의 도메인 IV 및 V를 포함하는 영역내 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화된 모노클로날 항체를 투여함을 포함한다. 예를 들면, 인간화된 모노클로날 항체는 도 1에 묘사되고 서열 번호: 70에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 272 내지 422번내 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에, 인간화된 모노클로날 항체는 도 1에 묘사되고 서열 번호: 70으로 제시된 아미노산 서열의 아미노산 272 내지 422번 내의 에피토프에 특이적으로 결합하고 C1s에 대한 C4의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, 방법은 이를 필요로 하는 개인에게 도 1에 묘사되고 서열 번호: 70에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 272 내지 422번 내의 에피토프에 특이적으로 결합하고, C1s에 대한 C4의 결합을 억제하는 인간화된 모노클로날 항체를 투여함으로써, 보체-매개된 질환 또는 장애를 치료함을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 C1s의 도메인 IV 및 V를 포함하는 영역내 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화된 모노클로날 항체를 투여함을 포함한다. 예를 들면, 인간화된 모노클로날 항체는 도 1에 묘사되고 서열 번호: 70에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 272 내지 422번 내의 구조적 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에, 인간화된 모노클로날 항체는 도 1에 묘사되고 서열 번호: 70에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 272 내지 422번 내의 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하여 C1s에 대한 C4의 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, 방법은 척수 근 위축증을 포함하며, 이러한 방법은 이를 필요로 하는 개인에게 도 1에 묘사되고 서열 번호: 70에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 272 내지 422번 내의 구조적 에피토프에 특이적으로 결합하고 C1s에 대한 C4의 결합을 억제하는 인간화된 모노클로날 항체를 투여함을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 C1 복합체 내 보체 성분 C1s에 결합하는 모노클로날 항체를 투여함을 포함한다. C1 복합체는 C1q 6개 분자, C1r 2개 분자, 및 C1s 2개 분자로 구성된다. 일부 경우에, 모노클로날 항체는 인간화된다. 따라서, 일부 경우에, 인간화된 모노클로날 항체는 C1 복합체내 보체 성분에 결합한다. 일부 경우에, 항체는 C1 복합체내에 존재하는 C1s에 고 항체 결합능으로 결합한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체(예컨대, 보체 C1s 단백질내 에피토프에 특이적으로 결합하는 대상체 항체)는: a) IPN003 항체의 1개, 2개 또는 3개의 VL CDR를 포함하는 경쇄 영역; 및 b) IPN003 항체의 1개, 2개 또는 3개의 VH CDR를 포함하는 중쇄 영역을 포함하며; 여기서 VH 및 VL CDR은 카밧에 의해 정의된 바와 같다(참고: 예컨대, 표 1; 및 Kabat 1991).
다른 구현예에서, 항-C1s 항체(예컨대, 보체 C1s 단백질내 에피토프에 특이적으로 결합하는 대상체 항체)는: a) IPN003 항체의 1개, 2개, 또는 3개의 VL CDR을 포함하는 경쇄 영역; 및 b) IPN003 항체의 1개, 2개, 또는 3개의 VH CDR을 포함하는 중쇄 영역을 포함하고; 여기서 VH 및 VL CDR은 초티아(Chothia)에 의해 정의된 바와 같다(참고: 예컨대, 표 1, 및 Chothia 1987).
IPN003 항체의 CDR 아미노산 서열, 및 VL 및 VH 아미노산 서열은 표 2에 제공된다. 표 2는 또한 아미노산 서열 각각에 지정된 서열 번호를 제공한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체(예컨대, 보체 Cls 단백질내 에피토프에 특이적으로 결합하는 대상체 항체)는: a) 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 및 서열 번호: 53으로부터 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 및 서열 번호: 56으로부터 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 영역을 포함한다. 이들 구현예들 중 일부에서, 항-C1s 항체는 인간화된 VH 및/또는 VL 골격 영역을 포함한다.
Figure pct00010
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 및 서열 번호: 56으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 및 서열 번호: 53을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 54, 서열 번호: 55, 및 서열 번호: 56을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 51을 갖는 CDR-L1, 아미노산 서열 서열 번호: 52를 갖는 CDR-L2, 아미노산 서열 서열 번호: 53을 갖는 CDR-L3, 아미노산 서열 서열 번호: 54를 갖는 CDR-H1, 아미노산 서열 서열 번호: 55를 갖는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 서열 번호: 56을 갖는 CDR-H3를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 서열 번호: 57에 제시된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
서열 번호: 57:
Figure pct00011
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 서열 번호: 58에 설정된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
서열 번호: 58:
Figure pct00012
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 57에 대해 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 58에 대해 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 57을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 58을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 57에 대해 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열 번호: 58에 대해 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 57을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열 번호: 58을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 보체 C1s 단백질내 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 에피토프에 대한 결합에 대해 아미노산 서열 서열 번호: 57을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역의 경쇄 CDR 및 아미노산 서열 서열 번호: 58을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 중쇄 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 57을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역의 경쇄 CDR 및 아미노산 서열 서열 번호: 58을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 중쇄 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체(예컨대, 보체 C1s 단백질내 에피토프에 특이적으로 결합하는 대상체 항체)는: a) 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 및 서열 번호: 53으로부터 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 영역; 및 b) 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 및 서열 번호: 66으로부터 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 영역을 포함한다.
Figure pct00013
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 서열 번호: 53, 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 및 서열 번호: 66으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 62, 서열 번호: 63, 및 서열 번호: 53을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 64, 서열 번호: 65, 및 서열 번호: 66을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 62를 갖는 CDR-L1, 아미노산 서열 서열 번호: 63을 갖는 CDR-L2, 아미노산 서열 서열 번호: 53을 갖는 CDR-L3, 아미노산 서열 서열 번호: 64를 갖는 CDR-H1, 아미노산 서열 서열 번호: 65를 갖는 CDR-H2, 및 아미노산 서열 서열 번호: 66을 갖는 CDR-H3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 서열 번호: 67에 제시된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
서열 번호: 67:
Figure pct00014
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 서열 번호: 68에 제시된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
서열 번호: 68:
Figure pct00015
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 67에 대해 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 68에 대해 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 67을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 68을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 67에 대해 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열 번호: 68에 대해 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 67에 대해 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열 번호: 68에 대해 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 67을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 아미노산 서열 서열 번호: 68을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 보체 C1s 단백질내 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 에피토프에 대한 결합에 대해 아미노산 서열 서열 번호: 67을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역의 경쇄 CDR 및 아미노산 서열 서열 번호: 68을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 중쇄 CDR을 포함하는 항체와 경쟁한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 아미노산 서열 서열 번호: 67을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역의 경쇄 CDR 및 아미노산 서열 서열 번호: 68을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역의 중쇄 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 서열 번호: 67에 제시된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-C1s 항체는 서열 번호: 68에 제시된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
항-C1s 항체는 서열 번호: 79에 제시되고 도 2(VH 변이체 1)에 묘사된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
항-C1s 항체는 서열 번호: 80에 제시되고 도 3(VH 변이체 2)에 묘사된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
항-C1s 항체는 서열 번호: 81에 제시되고 도 4(VH 변이체 3)에 묘사된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
항-C1s 항체는 서열 번호: 82에 제시되고 도 5(VH 변이체 4)에 묘사된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
항-C1s 항체는 서열 번호: 83에 제시되고 도 6(VK 변이체 1)에 묘사된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
항-C1s 항체는 서열 번호: 84에 제시되고 도 7(VK 변이체 2)에 묘사된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
항-C1s 항체는 서열 번호: 85에 제시되고 도 8(VK 변이체 3)에 묘사된 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
항-C1s 항체는 표 3(도 9)에 묘사된, IPN003 모 항체 FR 아미노산 서열과 관련하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 골격(FR) 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
정의
본원 명세서에 사용된 바와 같은 하나("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 청구항(들)에서 사용된 바와 같은, 단어 "포함하는"과 함께 사용된 경우, 단어 하나("a" 또는 "an")는 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다. 예를 들면, "항체"에 대한 언급은 1개 내지 많은 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, "다른"은 적어도 2개 이상을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 다른 화합물 또는 조성물과 "공동으로" 투여는 동시 투여 및/또는 상이한 시간에서의 투여를 포함한다. 공동 투여는 또한 공-제형(co-formulation)으로서 투여 또는 상이한 용량 빈도 또는 간격을 포함하고, 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 사용하는 별도의 조성물로서의 투여를 포함한다. 따라서, 공동 치료를 제공받는 대상체는 상이한 치료제의 조합된 효과로 유리할 수 있다.
용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 "항체"와 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 용어 "항체"는 최광의의 의미로 사용되며 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 완전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 이들이 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편을 구체적으로 포함한다.
기본적인 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경(L) 쇄 및 2개의 동일한 중(H) 쇄로 구성된 헤테로사량체성 당단백질이다. VH 및 VL의 쌍화(pairing)는 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 상이한 부류의 항체의 구조 및 특성의 경우, 예컨대, Basic and C1inical Immunology, 8th Ed., Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6을 참고한다.
특정 척추동물 종으로부터의 L 쇄는 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하여, 카파("κ") 및 람다("λ")로 불리는 2개의 명확하게 별개인 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 이들의 중쇄(CH)의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 면역글로불린은 상이한 부류 또는 동형으로 할당될 수 있다. 5개 부류의 면역글로불린이 존재한다: 각각 알파("α"), 델타("δ"), 엡실론("ε"), 감마("γ") 및 뮤("μ")로 지정된 중쇄를 갖는, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM. γ 및 α 부류는 CH 서열 및 기능에 있어서 비교적 작은 차이를 기준으로 서브부류(동형)으로 추가로 나뉘는데, 예컨대, 인간은 다음의 서브부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2. 면역글로불린의 상이한 부류의 소단위 구조 및 3차원 구조는 예를 들면, Abbas et al, Cellular and Molecular Immunology, 4th ed.(W.B. Saunders Co., 2000)에 일반적으로 잘 공지되어 있고 기술되어 있다.
"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경(L) 쇄 및 2개의 동일한 중(H) 쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로사량체성 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유결합성 이황화물 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 이황화물 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아형의 중쇄 중에서 변한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄 내(intrachain) 이황화물 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽의 말단에 가변 도메인(VH)을 갖고 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽의 말단(VL)에 가변 도메인 및 이의 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1의 불변 도메인과 정렬되어 있고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있다. 특정한 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
"분리된" 분자 또는 세포는 이것이 생산된 환경 속에서 이와 원래 연합된 적어도 하나의 오염원 분자 또는 세포로부터 확인되고 분리된 분자 또는 세포이다. 바람직하게는, 분리된 분자 또는 세포는 생산 환경과 관련된 모든 성분과의 회합되지 않는다. 분리된 분자 또는 세포는 천연에서 발견된 형태 또는 셋팅(setting)이외의 형태로 존재한다. 따라서, 분리된 분자는 세포내에서 천연적으로 존재하는 분자와는 구별되며; 분리된 세포는 조직, 기관, 또는 개인에서 천연적으로 존재하는 세포와는 구별된다. 일부 구현예에서, 분리된 분자는 본 개시내용의 항-C1s, 항-C1q, 또는 항-C1r 항체이다. 다른 구현예에서, 분리된 세포는 본 개시내용의 항-C1s, 항-C1q, 또는 항-C1r 항체를 생산하는 숙주 세포 또는 하이브리도마 세포이다.
"분리된" 항체는 이의 생산 환경(예컨대, 천연적으로 또는 재조합적으로)의 성분으로부터 확인되고/되거나 분리되고/되거나 회수된 것이다. 바람직하게는, 분리된 폴리펩타이드는 이의 생산 환경으로부터 모든 다른 오염 성분과 회합되지 않는다. 재조합 형질감염된 세포로부터의 생성되는 것과 같은, 이의 생산 환경으로부터의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료학적 용도를 전형적으로 방해할 수 있는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 특정의 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드는: (1) 예를 들면, 로우리 방법(Lowry method)에 의해 측정된 바와 같이 항체의 95 중량% 이상, 및 일부 구현예에서, 99% 중량%까지; (2) 스피닝 컵 배열결정장치(spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 꼬마지에 블루(Coomassie blue)를 사용한 비-환원 또는 환원 조건 하에서 또는, 은 염색(silver stain) 하에서 SDS-PAGE에 의한 동질성 까지 정제될 것이다. 분리된 항체는 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이므로 재조합 T-세포내에 제자리내(in situ) 항체를 포함한다. 그러나, 일반적으로, 분리된 폴리펩타이드 또는 항체는 적어도 하나의 정제 단계를 포함하는 과정에 의해 분리될 것이다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL"로 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체(동일한 부류의 다른 항체에 대해)의 가장 가변성인 부분이며 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "가변성"은 가변 도메인의 특정 분절이 항체 중에서 서열에 있어서 매우 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항체 결합을 매개하며 이의 특정한 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 정의한다. 그러나, 가변성은 가변 도메인의 전체 스판(span)을 가로질러 균일하제 분포하지 않는다. 대신에, 이는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역(HVR)으로 불리는 3개의 분절 내에 농축되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부위는 골격 영역(FR)으로 불린다. 천연의 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 3개의 HVR에 의해 연결된 베타-시이트(sheet) 구조를 주로 채택하고 있는 4개의 FR 영역을 포함하며, 이는 베타-시이트 구조를 연결하고, 일부 경우에 이의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각각의 쇄 내에서 HVR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되어 있으며, 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(참고: Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD(1991)). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성-세포 독성에 있어서 항체의 참여와 같은, 다양한 기능을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 가변 영역 내에서 발견된 비-연속적인 항원 결합 부위를 의미하기 위해 의도된다. CDR은 다음에 기술되어 있으며: Kabat et al., J. Biol. Chem. 252: 6609-6616(1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest"(1991)(또한 본원에서 Kabat 1991로 지칭됨); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)(또한 본원에서 Chothia 1987로 지칭됨); 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745(1996), 여기서 정의는 서로에 대해 비교하는 경우 아미노산 잔기의 오버랩핑(overlapping) 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 접목된 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 정의의 적용도 본원에 정의되고 사용된 바와 같은 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 인용된 참고 문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은, CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 비교로서 표 1에 하기 설정되어 있다. 표 2에 나열된 CDR은 Kabat 1991에 따라 정의되었다.
Figure pct00016
1잔기 번호매김은 카밧 등(상기 참고)의 명명법에 따른다.
2잔기 번호매김은 초티아 등(상기 참고)의 명명법에 따른다.
3잔기 번호매김은 맥칼럼(MacCallum) 등(상기 참고)의 명명법에 따른다.
Figure pct00017
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CDR-L1", "CDR-L2", 및 "CDR-L3"은 각각 경쇄 가변 영역 내 제1, 제2, 및 제3의 CDR을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CDR-H1", "CDR-H2", 및 "CDR-H3"는 각각 중쇄 가변 영역내 제1, 제2, 및 제3의 CDR을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CDR-1", "CDR-2", 및 "CDR-3"은 각각의 쇄의 가변 영역의 각각 제1, 제2, 및 제3의 CDR을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉, 집단의 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이 및/또는 해독후 돌연변이(예컨대, 이성체화, 아미드화)를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원부위에 대해 지시된다. 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이들의 특이성 외에, 모노클로날 항체는 전형적으로 하이브리도마 배양에 의해 합성되며, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않으므로, 유리하다. "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체의 집단으로 수득되는 것으로서 항체의 특징을 나타내며, 어떠한 특수한 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 개시내용에 따라 사용될 모노클로날 항체는 예를 들면, 하이브리도마 방법(예컨대, Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97(1975); Hongo et al., Hybridoma, 14(3):253-260(1995), Harlow et al., Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2d ed. 1988); Hammerling et al., in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법(참고: 예컨대, 미국 특허 제4,816,567호), 파아지-디스플레이 기술(참고: 예컨대, Clackson et al., Nature, 352: 624-628(1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1992); Sidhu et al, J. Mol. Biol. 338(2):299-310(2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093(2004); Fellouse, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 101(34):12467-472(2004); 및 Lee et al, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132(2004), 및 인간 면역글로불린 유전자자리(loci) 또는 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 유전자 중 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술(참고: 예컨대, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:2551(1993); Jakobovits et al, Nature 362:255-258(1993); Bruggemann et al, Year in Immunol. 7:33(1993); 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625, 126; 5,633,425; 및 5,661,016; Marks et al, Bio/Technology 10:779-783(1992); Lonberg et al, Nature 368:856-859(1994); Morrison, Nature 368:812-813(1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851(1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826(1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 : 65-93(1995)을 포함하는, 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "전체 길이의 항체", "완전한 항체" 및 "전체 항체"는 항체 단편과는 대치되는 것으로서, 실질적으로 완전한 형태인 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 구체적으로, 전체 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 지닌 것을 포함한다. 불변 도메인은 천연의 서열 불변 도메인(예컨대, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 완전한 항체는 하나 이상의 효과기 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편"은 완전한 항체의 일부, 바람직하게는 완전한 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아보디(diabody); 선형 항체(참고: 미국 특허 5,641,870, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)); 단일 쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하다.
항체의 파파인 소화는 2개의 동일한 항원-결합 단편인 "Fab" 단편, 및 용이하게 결정화되는 능력을 반응하는 명칭인, 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. Fab 단편은 H 쇄(VH)의 가변 영역 도메인 및 하나의 중쇄(CH1)의 제1의 불변 도메인을 따라 전체 L 쇄로 이루어진다. 각각의 Fab 단편은 항원 결합과 관련하여 1가인데, 즉, 이는 단일 항원-결합 부위를 갖는다. 항체의 펩신 처리는 상이한 항원-결합 활성을 가진 2개의 이황화물 연결된 Fab 단편에 거의 상응하고 여전히 항원과 가교-결합하는 단일의 큰 F(ab')2 단편을 수득한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시 말단에서 약간의 추가의 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 Fab'에 대해 지정되며, 여기서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)은 유리 티올 그룹을 지닌다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 지닌 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 알려져 있다.
Fc 단편은 이황화물에 의해 함께 유지된 H 쇄 둘 다의 카복시-말단 부위를 포함한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 영역내 서열에 의해 결정되며, 이러한 영역은 또한 특정한 유형의 세포에서 발견된 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식된다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 천연-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계부가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중-쇄 Fc 영역은 일반적으로 Cys226번 위치에서 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230번으로부터 이의 카복시-말단까지 신장시키기위해 정의된다. Fc 영역의 C-말단 라이신(EU 번호매김 시스템에 따른 잔기 447번)은 예를 들면, 항체의 생산 또는 정제 동안에, 또는 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산을 재조합적으로 가공함으로서 제거될 수 있다. 따라서, 완전한 항체의 조성은 모든 K447번 잔기가 제거된 항체 집단, K447번 잔기가 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447번 잔기가 있는 항체 및 없는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 항체에서 사용하기에 적합한 천연-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 동종이인자형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 및 또는 천연적으로 존재하는 이의 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)로 인해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예컨대, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역내 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 및 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역과 및/또는 모 폴리펩타이드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 상동성, 및 가장 바람직하게는 이와 적어도 약 90% 상동성, 보다 바람직하게는 이와 적어도 약 95% 상동성을 보유할 것이다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것이며 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태(spliced form)를 포함하는, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브부류의 수용체를 포함하며, FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하고, 이는 이의 세포질성 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질성 도메인내에서 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프("ITAM")를 함유한다. 억제성 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질성 도메인내에서 면역수용체 타이로신-계 억제 모티프("ITIM")를 함유한다(참고: 예컨대, M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)). FcR은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92(1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34(1994); 및 de Haas et al., J. Lab. C1in. Med. 126:330-41(1995)에서 검토된다. 미래에 확인될 것을 포함하는 다른 FcR은 본원에서 용어 "FcR"에 의해 포함된다. FcR은 또한 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.
생체내(in vivo) FcRn에 대한 결합 및 인간 FcRn 고-친화성 결합 폴리펩타이드의 혈청 반감기는 예컨대, 인간 FcRn을 발현하는 유전자삽입 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주, 또는 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩타이드가 투여되는 영장류에서 검정할 수 있다. WO 2004/42072(Presta)는 FcRs에 대해 증진되거나 약화된 결합을 지닌 항체 변이체를 기술한다. 또한, 예컨대, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001)을 참고한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소의 항체 단편이며, 이는 강력한, 비-공유결합성 회합으로 하나의 중쇄- 및 하나의 경-쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2개의 도메인의 폴딩(folding)으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항원 결합 특이성을 항체에 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)를 발산시킨다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3개의 HVR 만을 포함하는 Fv의 1/2)일지라도 전체 결합 부위보다는 더 작은 친화성에서이지만, 항원을 인식하여 이에 결합하는 능력을 갖는다.
또한 "sFv" 또는 "scFv"로 약술된 "단일-쇄 Fv"는 단일의 폴리펩타이드 쇄내로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩타이드는 또한 sFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록 하는 VH과 VL 사이에 폴리펩타이드 링커를 포함한다. sFv의 고찰을 위해서는, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315(1994)를 참고한다.
항체의 "기능성 단편"은 일반적으로 완전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역 또는 변형된 FcR 결합능을 보유하거나 갖는 항체의 F 영역을 포함하는, 완전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
용어 "디아보디"는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 짧은 링커(약 5 내지 10개) 잔기를 지닌 sFv 단편(선행 단락 참고)을 작제하여 V 도메인의 쇄-간(inter-chain) 쌍화가 달성되지만 쇄 내(intra-chain) 쌍화는 달성되지 않도록 함으로써, 2가 단편, 즉, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 생성하도록 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아보디는 2개의 "교차" sFv 단편의 헤테로이량체이며 여기서 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인은 상이한 폴리펩타이드 쇄 상에 존재한다. 디아보디는 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/011161; WO/2009/121948; WO/2014/191493; Hollinger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 6444-48(1993)에 보다 상세히 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특수한 종으로부터 기원하거나 특수한 항체 부류 또는 서브부류에 속하는 항체내 상응하는 서열과 동일하거나 이에 대해 상동성이지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 항체 부류 또는 서브부류, 및 또한 이들이 요구되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 이러한 항체의 단편으로부터 기원한 항체 또는 이에 속하는 항체내 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 항체(면역글로불린)을 지칭한다(미국 특허 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81 : 6851-55(1984)). 본원의 목적한 키메라 항체는 PRIMATIZED® 항체를 포함하며, 여기서 항체의 항원-결합 영역은 예컨대, 목적한 항원으로 짧은 꼬리 원숭이(macaque monkey)를 면역화시켜 생산한 항체로부터 기원한다. 본원에 사용된 바와 같은, "인간화된 항체"는 "키메라 항체"의 서브세트이다.
비-인간(예컨대, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 기원한 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용체 항체)이며, 여기서 수용체의 HVR로부터의 잔기는 요구되는 특이성, 친화성, 및/또는 능력을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여체 항체)의 HVR로부터의 잔기로 대체된다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 결합 친화성과 같은, 항체 성능을 추가로 개량하기 위해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인 모두를 실질적으로 포함할 것이며, 여기서 초가변 루프 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린 서열의 것에 상응하고, FR 영역이 결합 친화성, 이성체화, 면역원성 등과 같은 항체 성능을 증진시키는 하나 이상의 개별 FR 잔기 치환을 포함할 수 있지만, FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. FR내 이들 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 쇄 내에서 6개 이하이며, L 쇄 내에서, 3개 이하이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 예컨대, Jones et al., Nature 321: 522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596(1992)를 참고한다. 또한, 예를 들면, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115(1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 :1035-1038(1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433(1994); 및 미국 특허 6,982,321 및 7,087,409를 참고한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/되거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체의 제조 기술 중 어느 것을 사용하여 제조된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 지닌 것이다. 이러한 인간 항체의 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 배제한다. 인간 항체는 파아지-디스플레이 라이브러리를 포함하는, 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산할 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381(1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581(1991). 또한 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해서는 Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985); Boerner et al., J. Immunol, 147(l):86-95(1991)에 기술된 방법이 이용가능하다. 또한, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74(2001)을 참고한다. 인간 항체는 항원 챌린지에 대한 반응시 이러한 항체를 생산하도록 변형되었지만, 이의 내인성 유전자자리는 사용불가능하게된 형질도입 동물, 예컨대, 면역화된 크세노마우스(xenomouse)(참고: 예컨대, XENOMOUSE™ 기술에 관한 미국 특허 6,075,181 및 6,150,584)에게 항원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관해서는 또한 예를 들면, Li et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 103 :3557-3562(2006)을 참고한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "초가변 영역," "HVR," 또는 "HV"은 서열내에서 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체-가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH(H1, H2, H3)에서 3개, 및 VL(LI, L2, L3)에서 3개를 포함한다. 천연의 항체에서, H3 및 L3는 가장 다양한 6개의 HVR을 나타내며, 특히 H3은 항체에 미세한 특이성을 부여하는데 있어서 유일한 역활을 하는 것으로 여겨진다. 예컨대, Xu et al., Immunity 13 :37-45(2000); Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003))를 참고한다. 실제로, 중쇄 만으로 이루어진 천연적으로 존재하는 낙타과 항체는 경쇄의 부재하에서 기능성이고 안정하다. 예컨대, Hamers-Casterman et al., Nature 363 :446-448(1993) 및 Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736(1996)을 참고한다.
다수의 HVR 묘사가 사용되며 본원에 포함된다. 카밧 상보성-결정 영역(CDR)인 HVR은 서열 다양성을 기반으로 하며 가장 일반적으로 사용된다(Kabat et al., 상기 참고). 초티아는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)). AbM HVR은 카밧 CDR과 초티아 구조적 루프 사이의 절충을 나타내며, 옥스포드 몰리큘의 분자 AbM 항체-모델링 소프트웨어(Oxford Molecular's AbM antibody-modeling software)에 의해 사용된다. "접촉(contact)" HVR은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기반한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기는 하기 나타낸다.
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HVR는 다음과 같은 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL내 24-36번 또는 24-34번(L1), 46-56번 또는 50-56번(L2), 및 89-97번 또는 89-96번(L3), 및 VH내 26-35번(H1), 50-65번 또는 49-65번(바람직한 구현예)(H2), 및 93-102번, 94-102번, 또는 95-102번(H3). 가변-도메인 잔기는 이들 연장된-HVR 정의 각각에 대해 카밧 등(상기 참고)에 따라 번호매김된다.
"골격" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의한 바와 같이 HVR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기이다.
어구 "카밧에서와 같은 가변-도메인 잔기-번호매김" 또는 "카밧에서와 같은 아미노산 위치 번호매김" 및 이의 변이체는 카밧 등(상기 참고)에서 항체의 편집의 중-쇄 가변 도메인 또는 경-쇄 가변 도메인에 대해 사용된 번호매김 시스템을 지칭한다. 이러한 번호매김 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR 내로의 단축 또는 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들면, 중-쇄 가변 도메인은 H2의 52번 잔기 후 단일의 아미노산 삽입물(카밧에 따른 잔기 52a) 및 중-쇄 FR 잔기 82 후 삽입된 잔기(예컨대, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 번호매김은 "표준" 카밧 번호매김 서열을 지닌 항체 서열의 상동성 영역에서 정렬에 의해 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다.
카밧 번호매김 시스템은 일반적으로 가변 도메인(경쇄의 대략 잔기 1 내지 107번 쇄 및 중쇄의 잔기 1 내지 113번)내 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다(예컨대, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)). "EU 번호매김 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 면역글로불린 중쇄 불변 영역내 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다(예컨대, EU 지수는 Kabat et al, (상기 참고)에 보고되었다). "카밧에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호매김을 지칭한다. 본원에서 달리 지칭하지 않는 한, 항체의 가변 도메인내 잔기 번호에 대한 참고는 카밧 번호매김 시스템에 의한 잔기 번호매김을 의미한다. 본원에서 달리 기술하지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내 잔기 번호에 대한 참고는 EU 번호매김 시스템에 의한 잔기 번호매김을 의미한다(예컨대, 미국 특허 공보 2010-280227 참고).
본원에 사용된 바와 같은 "수용체 인간 골격"은 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격(consensus framework)으로부터 기원한 VL 또는 VH 골격의 아미노산 서열을 포함하는 골격이다. 인간 면역글로불린 골격 또는 인간 컨센서스 골격으로부터 기원한" 수용체 인간 골격은 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이는 기존의 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 기존의 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 기존의 아미노산 변화가 VH내에 존재하는 경우, 바람직하게는 이러한 변화는 71H, 73H 및 78H 위치 중 단지 3개, 2개, 또는 1개에서 일어나는데; 예를 들면, 이러한 위치에서 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A에 의할 수 있다. 일부 구현예에서, VL 수용체 인간 골격은 VL 인간 면역글로불린 골격 서열 또는 인간 컨센서스 골격 서열에 대한 서열에 있어서 동일하다.
"인간 컨센서스 골격"은 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격 서열의 선택시 가장 일반적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 골격이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터 기원한다. 일반적으로, 서열의 서브그룹은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)에서와 같은 서브그룹이다. 예는 VL에 대해 포함되며, 서브그룹은 Kabat et al, (상기 참고)에서와 같은 서브 그룹 카파 I, 카파 II, 카파 III 또는 카파 IV이다. 또한, VH의 경우, 서브그룹은 Kabat et al, (상기 참고)에서와 같은 서브그룹 I, 서브그룹 II, 또는 서브그룹 III일 수 있다.
규정된 위치에서 "아미노산 변형"은 규정된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 규정된 잔기에 근접한 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입을 지칭한다. 규정된 잔기에 "근접한" 삽입은 이의 1 내지 2개의 잔기 내 삽입을 의미한다. 삽입은 규정된 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다. 본원에서 바람직한 아미노산 변형은 치환이다.
"친화성-성숙된" 항체는 변경(들)을 소유하지 않은 모 항체와 비교하여, 항원에 대한 항체의 친화성에 있어서 증진을 야기하는 이의 하나 이상의 HVR내 하나 이상의 변경을 지닌 것이다. 일부 구현예에서, 친화성-성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화성을 갖는다. 친화성-성숙된 항체는 당해 분야에 공지된 공정에 의해 생산된다. 예를 들면, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783(1992)는 VH- 및 VL-도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화성 성숙을 기술하고 있다. HVR 및/또는 골격 잔기의 무작위 돌연변이는 예를 들면, Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809-3813(1994); Schier et al. Gene 169:147-155(1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004(1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9(1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896(1992)에 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "특이적으로 인식하다" 또는 "특이적으로 결합하다"는 표적과, 생물학적 분자를 포함하는 분자의 이종 집단의 존재하에서 표적의 존재를 결정하는 항체 사이의 이끌림(attraction) 또는 결합과 같은 측정가능하고 재생가능한 상호작용을 지칭한다. 예를 들면, 표적 또는 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 이러한 표적 또는 에피토프에 보다 큰 친화성으로, 항체 결합능으로, 보다 용이하게는, 및/또는 이것이 다른 표적 또는 표적의 다른 에피토프에 결합하는 것 보다 긴 기간으로 결합하는 항체이다. 이는 또한 예를 들면, 제1의 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 모이어티)가 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합할 수 없는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적인 결합" 또는 "우선적인 결합"은 독점적인 결합을 필수적으로 요구하지 않는다(이것이 포함할 수 있다고 해도). 표적에 특이적으로 결합하는 항체는 결합 상수가 적어도 약 103 M-1 또는 104 M-1, 때때로 약 105 M-1 또는 106 M-1, 다른 예에서 약 106 M-1 또는 107 M-1, 약 108 M-1 내지 109 M-1, 또는 약 1010 M-1 내지 1011 M-1 이상일 수 있다. 다양한 면역검정 양식을 사용하여 특정한 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체를 선택할 수 있다. 예를 들면, 고체-상 ELISA 면역검증을 통상적으로 사용하여 단백질과 특이적으로 면역반응성인 모노클로날 항체를 선택한다. 예컨대, 특이적인 면역활성을 측정하는데 사용될 수 있는 면역검정 양식 및 조건의 설명에 대해서는 Harlow and Lane(1988) Antibodies, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York을 참고한다.
본원에 사용된 바와 같은 "동일성"은 정렬된 서열내 어떠한 특수한 위치에서, 아미노산 잔기가 서열들 사이에서 동일함을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 "유사성"은 정렬된 서열내 어떠한 특수한 위치에서, 아미노산 잔기가 서열들 사이에서 유사함을 나타낸다. 예를 들면, 루이신은 이소루이신 또는 발린으로 치환될 수 있다. 서로에 대해 흔히 치환될 수 있는 다른 아미노산은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
- 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산);
- 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산);
- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산;
- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및
- 시스테인 및 메티오닌(황-함유 측쇄를 갖는 아미노산).
동일성 및 유사성의 정도는 용이하게 계산될 수 있다(참고: 예컨대, Computational Molecular Biology, Lesk,.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed.,cademic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin,.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,cademic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).
본원에 사용된 바와 같은, 보체 단백질과 제2 단백질 사이의 "상호작용"은 제한없이, 단백질-단백질 상호작용, 물리적 상호작용, 화학적 상호작용, 결합, 공유결합성 결합, 및 이온 결합을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은, 항체는 항체가 2개의 단백질 사이의 상호작용을 파괴하거나, 감소시키거나, 완전히 제거하는 경우, 2개의 단백질 사이의 "상호작용을 억제한다". 본 개시내용의 항체, 또는 이의 단편은 이의 항체 또는 단편이 2개의 단백질 중 하나에 결합하는 경우, 2개의 단백질 사이의 "상호작용을 억제한다".
"차단" 항체, "길항제" 항체, "억제성" 항체, 또는 "중화" 항체는 하나 이상의 단백질과의 상호작용과 같이, 이것이 결합하는 항원의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 일부 구현예에서, 차단 항체, 효능제 항체, 억제성 항체, 또는 "중화" 항체는 항원의 하나 이상의 생물학적 활성 또는 상호작용을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역(천연의 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 대해 기여할 수 있는 생물학적 활성을 지칭하며, 항체 동형으로 변한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "친화성"은 2개의 제제(예컨대, 항체 및 항원)의 가역성 결합에 대한 평형 상수를 지칭하며 해리 상수(KD)로 표현된다. 친화성은 관련되지 않은 아미노산 서열에 대한 항체의 친화성보다 적어도 1-배 이상, 적어도 2-배 이상, 적어도 3 -배 이상, 적어도 4-배 이상, 적어도 5-배 이상, 적어도 6-배 이상, 적어도 7-배 이상, 적어도 8-배 이상, 적어도 9-배 이상, 적어도 10-배 이상, 적어도 20-배 이상, 적어도 30-배 이상, 적어도 40-배 이상, 적어도 50-배 이상, 적어도 60-배 이상, 적어도 70-배 이상, 적어도 80-배 이상, 적어도 90-배 이상, 적어도 100-배 이상, 또는 적어도 1,000-배 이상일 수 있다. 표적 단백질에 대한 항체의 친화성은 예를 들면, 약 100 나노몰(nM) 내지 약 0.1 nM, 약 100 nM 내지 약 1 피코몰(pM), 또는 약 100 nM 내지 약 1 펜토몰(fM) 이상일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "항체 결합능"은 희석 후 해리에 대한 2개 이상의 제제의 복합체의 내성을 지칭한다. 용어 "면역반응성" 및 "우선적으로 결합한다"는 항체 및/또는 항원-결합 단편과 관련하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "결합하는"은 예를 들면, 공유결합, 정전기, 소수성, 및 염 브릿지 및 물 브릿지와 같은 상호작용을 포함하는, 이온성 및/또는 수소-결합 상호작용으로 인하여, 2개의 분자 사이에 직접적인 회합을 지칭한다. 예를 들면, 대상체 항-C1s 항체는 보체 C1s 단백질내 에피토프에 특이적으로 결합한다. "특이적인 결합"은 친화성이 적어도 약 10-7 M 이상, 예컨대, 5x 10-7 M, 10-8 M, 5x 10-8 M 이상인 결합을 지칭한다. "비-특이적인 결합"은 친화성이 약 10-7 M 미만인 결합, 예컨대, 친화성이 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M 등인 결합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "k0n"은 항원에 대한 항체의 회합에 대한 속도 상수를 지칭하기 위해 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "k0ff"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 속도 상수를 지칭하기 위해 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "KD"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하기 위해 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 항체 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)" 및 "상동성(homology)"은 서열을 정렬하여 필요에 따라 갭을 도입하여 최대의 서열 동일성 퍼센트를 달성하고 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않은 후에, 구체적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열내 아미노산 잔기와 동일한 후보물 서열내 아미노산 잔기의 퍼센트를 지칭한다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 측정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술내에 있는, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGN™(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공공 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 당해 분야에 공지된 어떠한 알고리즘도 포함하는, 정렬을 측정하기에 적절한 매개변수를 측정할 수 있다.
"생물학적 샘플"은 개인으로부터 수득된 다양한 샘플 유형을 포함하며 진단 또는 모니터링 검정에 사용할 수 있다. 이러한 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 다른 액체 샘플, 생검 표본 또는 조직 배양 또는 이로부터 기원한 세포 및 이의 후손과 같은 고형 조직 샘플을 포함한다. 이러한 정의는 또한 시약을 사용한 처리, 가용화, 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 특정 성분의 농축에 의해서와 같은, 이들의 조달 후 어떠한 방식으로도 조작된 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포함하며, 또한 배양물, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유액, 및 조직 샘플 속의 세포를 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 뇨, 타액, 뇌척수액, 간질액, 안구액, 활액, 혈장 및 혈청과 같은 혈액 분획 등을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 또한 고형 조직 샘플, 조직 배양 샘플, 및 세포 샘플을 포함한다.
"분리된" 핵산 분자는 이와 함께 이것이 생산되는 환경 속에서 통상적으로 회합되는 적어도 하나의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 바람직하게는, 분리된 핵산은 생산 환경과 관련된 모든 성분과 회합되지 않는다. 본원의 폴리펩타이드 및 항체를 암호화하는 분리된 핵산은 이것이 천연에서 발견된 형태 또는 셋팅 이외의 다른 형태로 존재한다. 따라서, 분리된 핵산 분자는 세포내에 천연적으로 존재하는 본원의 어떠한 폴리펩타이드 및 항체를 암호화하는 것으로부터 구별된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "벡터"는 이것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 하나의 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 분절이 연결될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 파아지 벡터(phage vector)이다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가의 DNA 분절은 바이러스 게놈내로 연결될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예컨대, 세균의 복제 오리진(bacterial origin of replication) 및 에피소옴 포유동물 벡터를 갖는 세균 벡터). 다른 벡터(예컨대, 비-에피소옴 포유동물 벡터)는 숙주 세포내로 도입시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으며, 이에 의해 숙주 게놈을 따라 복제된다. 더욱이, 특정의 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발혁 벡터는 흔히 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용된 형태이므로 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 상호교환적으로 사용된 바와 같은 "폴리뉴클레오타이드", 또는 "핵산"은 어떠한 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 어떠한 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형을 중합체의 조립 전 또는 후에 부여할 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 표지에 대한 접합과 같이, 합성 후 제조된 변형(들)을 포함할 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들면, "캡(cap)", 하나 이상의 천연적으로 존재하는 뉴클레오타이드의 유사체로의 치환, 예를 들면, 하전되지 않은 연결(예컨대, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결(예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)을 지닌 것들, 예를 들면, 단백질(예컨대, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-라이신 등)와 같은 펜던트 모이어티(pendant moiety)를 함유하는 것들, 인터컬레이터(intercalator)(예컨대, 아크리딘, 소랄렌(psoralen) 등), 킬레이터(예컨대, 금속, 방사활성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것들, 알킬레이터를 함유하는 것들, 변형된 연결을 지닌 것들(예컨대, 알파 아노머성 핵산 등), 및 폴리뉴클레오타이드(들)의 변형되지 않은 형태를 포함한다. 또한, 당 속에 통상적으로 존재하는 어떠한 하이드록실 그룹도 예를 들면, 포스포네이트 그룹, 포스페이트 그룹에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호 그룹에 의해 보호될 수 있거나, 활성화되어 추가의 뉴클레오타이드에 대한 추가의 연결을 제조할 수 있거나, 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 포스포릴화되거나 탄소수가 1 내지 20인 아민 또는 유기 캡핑 그룹 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호 그룹으로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들면, 2'-0-메틸-, 2'-0-알릴-, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카보사이클릭 당 유사체를 포함하는 당해 분야에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사체 형태, α-아노머성 당, 아라비노즈, 크실로즈 또는 라익소즈(lyxose)와 같은 에피머성 당, 피라노즈 당, 푸라노즈 당, 세도헵툴로즈, 아사이클릭(acyclic) 유사체, 및 메틸 리보시드와 같은 염기성 뉴클레오시드 유사체를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결을 대안적 연결 그룹으로 대체할 수 있다. 이들 대안적 연결 그룹은 포스페이트가 P(0)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), (0)NR2("아미데이트"), P(0)R, P(0)OR', CO, 또는 CH2("포름아세탈")(여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나, 에테르(-0-) 연결을 임의로 함유하는 치환되거나 치환되지 않은 알킬(1-20C), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알킬이다)에 의해 대체된 구현예를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드내 모든 연결은 동일할 필요가 없다. 앞서의 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여, 본원에 지칭된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입체의 혼입을 위한 벡터에 대한 수용체일 수 있거나 수용체인 개개 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 후손을 포함하고, 후손은 천연의, 우연의, 또는 의도된 돌연변이로 인하여 원래의 모 세포에 대해 필수적으로 완전히 동일하지 않을 수 있다(형태학적으로 또는 게놈 DNA 보체에서). 숙주 세포는 이러한 개시내용의 폴리뉴클레오타이드(들)을 사용하여 생체내 형질감염된 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "담체"는 사용된 투여량 및 농도에서 이에 노출된 세포 또는 포유동물에게 무독성인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함한다. 흔히 생리학적으로 허용되는 담체는 수성의 pH 완충된 용액이다. 생리학적으로 허용되는 담체의 예는 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산과 같은 담체; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코즈, 만노즈, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제(chelating agent); 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 대이온(counterion); 및/또는 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLURONICS™와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
용어 "뉴로트로핀"은 뇌에서 신경보호성인 신경영양 인자를 지칭한다. 이들 인자는 본 개시내용의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합하며 뇌-기원한 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴로트로핀-4/5, 섬유아세포 성장 인자(FGF)-2 및 다른 FGF, 뉴로트로핀(NT)-3, 에리트로포이에틴(EPO), 간세포 성장 인자(HGF), 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자(TGF)-α, TGF-β, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-lra), 모세관 신경영양성 인자(CNTF), 신경아교-유도된 신경영양 인자(glial-derived neurotrophic factor: GDNF), 뉴투린(neurturin), 혈소판-기원한 성장 인자(PDGF), 헤레굴린, 뉴레굴린, 아르테민, 퍼세핀, 인터루킨, 과립세포-콜로니 자극 인자(CSF), 과립세포-대식세포-CSF, 네트린, 카르디오트로핀-1, 헤지호그(hedgehog), 백혈병 억제 인자(LIF), 미드킨, 플레이오트로핀, 골 형성 단백질(BMP), 사포신, 세마포린, 및 줄기 세포 인자(SCF)를 포함한다.
용어 "예방하는"은 당해 분야에 인지되어 있으며, SMA와 같은 조건과 관련하여 사용되는 경우, 당해 분야에 잘 이해되어 있고, 조성물을 제공받지 않은 대상체와 비교하여 대상체의 의학 상태의 하나 이상의 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키거나, 이의 발병을 지연시키는 조성물의 투여를 포함한다. 따라서, SMA 진행의 예방은 예컨대, 통계학적으로 및/또는 임상적으로 유의적인 양에 의해 예를 들면, 치료요법을 제공받지 않은 대조군 집단에 대해 치료요법을 제공받은 환자의 집단에서 신경변성의 평균 양을 감소시키는 것을 포함한다. 유사하게, 신경변성 질환 진행의 예방은 치료요법을 제공받은 환자가 치료요법을 제공받지 않은 환자와 비교하여, 인지력 감퇴 및/또는 기억 손실과 같은 불능으로 진행될 경향성을 감소시킴을 포함하거나, 불능의 발병을 지연시킴을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 살아있는 포유동물을 지칭하며, 용어 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 포유동물의 예는 어떠한 수의 포유동물 부류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 태아를 포함하는 인간, 침팬지, 및 다른 유인원 및 원숭이 종과 같은 비-인간 영장류; 소, 말, 양, 염소, 돼지와 같은 농장 동물; 토끼, 개, 및 고양이와 같은 가축 동물; 랫트, 마우스 및 기니아 피그 등과 같은 설치류를 포함하는 실험 동물. 이러한 용어는 특수한 연령 또는 성별을 나타내지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체의 상태를 안정화시키거나 증진시키거나 대상체가 치료를 제공받지 않는 경우와 같이 대상체의 상태가 악화되는 경향을 감소시키기 위한 상태의 증상, 임상 신호, 또는 근본적인 병리학을 감소시키거나, 저지하거나, 역전시킴을 포함한다.
대상체 치료 방법과 관련하여 용어 화합물의 "치료학적 유효량"은 바람직한 투여량 요법의 일부로서 (포유동물, 바람직하게는 인간)에게 투여되는 경우 치료될 장애 또는 상태 또는 화장 목적을 위한 임상적으로 허용되는 표준에 따른, 예컨대, 어떠한 의학적 치료에도 적용가능한 신뢰성있는 이점/위험비에서 질환 상태의 증상을 완화시키거나, 상태를 경감시키거나, 발병을 지연시키는 제제 속의 화합물(들)의 양을 지칭한다. 본원의 치료학적 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 개인에서 바람직한 반응을 유발하는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 특수한 질환, 장애 또는 상태를 진행시킬 "위험이 있는" 개인은 검출가능한 질환 또는 질환의 증상을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있고, 본원에 기술된 치료 방법 이전에 검출가능한 질환 또는 질환의 증상을 나타낼 수 있거나 나타내지 않을 수 있다. "위험이 있는"은 개인이 하나 이상의 위험 인자를 가짐을 나타내며, 이는 당해 분야에 공지된 특수한 질환, 장애, 또는 상태의 진행과 관련된 측정가능한 매개변수이다. 하나 이상의 이러한 위험 인자를 가진 개인은 하나 이상의 이러한 위험 인자가 없는 개인 보다 특수한 질환, 장애, 또는 상태로 진행될 더 높은 가능성을 갖는다.
"만성" 투여는 급성 방식과 대치되는 것으로서 연속된 의약(들)을 투여함으로써 연장된 기간 동안 초기의 치료학적 효과(활성)을 유지하는 것을 지칭한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 투여되지 않지만 오히려 기본적으로 순환/주기적인 치료를 지칭한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 어떠한 방법 및 물질도 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 기술되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)]에 기술된 광범위하게 이용된 방법론과 같은, 본원에 언급된 모든 공보는 이러한 공보가 인용하는 것과 관련하여, 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 참고로 본원에 포함된다.
핵산, 벡터 및 숙주 세포
본 개시내용의 방법에 사용하기에 적합한 항체는 예컨대, 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체 중 어느 것을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항-C1q, 항-C1r 또는 항-C1s 항체의 VH/CH1을 함유하는 아미노산 서열 및/또는 VL/CL을 함유하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 핵산을 함유하는 하나 이상의 벡터(예컨대, 발현 벡터)가 제공된다. 이러한 핵산을 함유하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 숙주 세포는: (1) 항체의 VL/CL을 함유하는 아미노산 서열 및 항체의 VH/CH1을 함유하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 함유하는 항체의 벡터, 또는 (2) 항체의 VL/CL을 함유하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 함유하는 제1 벡터 및 항체의 VH/CH1을 함유하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 함유하는 제2 벡터를 함유할 수 있다(예컨대, 이것으로 형질도입된다). 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예컨대, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프구 세포(예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
항-C1q, 항-C1r 또는 항-C1s 항체의 제조 방법이 본원에 개시되어 있다. 이러한 방법은 항-C1q, 항-C1r 또는 항-C1s 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 본 개시내용의 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양함을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 후속적으로 회수된다.
본 개시내용의 인간화된 항-C1q, 항-C1r 또는 항-C1s 항체의 재조합 생산을 위하여, 항체를 암호화하는 핵산을 분리하고 숙주 세포내에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내로 삽입한다. 이러한 핵산은 통상의 과정(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써)을 사용하여 용이하게 분리하고 서열분석할 수 있다.
본 개시내용의 항체 중 어느 것도 암호화하는 핵산 서열, 또는 본원에 기술된 폴리펩타이드(항체 포함)의 단편을 포함하는 적합한 벡터는 제한 없이, 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 작제할 수 있거나 당해 분야에서 이용가능한 큰 수의 클로닝 벡터로부터 선택할 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하는 것으로 의도된 숙주 세포에 따라 변할 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제하는 능력을 가지고/가지거나, 특수한 제한 엔도뉴클레아제에 대해 단일 표적을 지닐 수 있고/있거나, 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커를 위한 유전자를 수반할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 세균 바이러스, 예컨대, pUC18, pUC19, Bluescript(예컨대, pBS SK+) 및 이의 유도체, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파아지 DNA, 및 pSA3 및 pAT28와 같은 셔틀 벡터(shuttle vector)를 포함한다. 이들 및 많은 다른 클로닝 벡터는 BioRad, Stratagene, 및 Invitrogen과 같은 상업적 판매회사로부터 입수가능하다.
목적한 핵산을 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용하는 형질감염; 미세투사물 충격(microprojectile bombardment), 지질감염; 및 감염(예컨대, 벡터가 박시니아 바이러스와 같은 감염성 제제인 경우)를 포함하는, 다수의 적절한 수단 중 어느 것에 의해서도 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입되는 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드의 선택은 흔히 숙주 세포의 특징에 의존할 것이다. 일부 구현예에서, 벡터는 본 개시내용의 항-C1q, 항-C1r 또는 항-C1s 항체를 암호화하는 하나 이상의 아미노산 서열을 함유하는 핵산을 함유한다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 본 개시내용의 항-C1q, 항-C1r 또는 항-C1s 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 세균 속에서 생산될 수 있다. 세균내에서 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현의 경우(예컨대, 이. 콜라이(E. coli)내에서 항체 단편의 발현을 기술하는, 미국 특허 5,648,237, 5,789, 199, 및 5,840,523; 및 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254)를 참고할 수 있다. 발현 후, 항체를 가용성 분획에서 세균 세포 페이스트로부터 분리하고 추가로 정제할 수 있다.
항체 스크리닝
후보물 항체는 시냅스 손실을 조절하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 스크리닝은 시험관내(in vitro) 모델, 유전적으로 변경된 세포 또는 동물, 또는 정제된 단백질을 사용하여 수행할 수 있다. 시험관내 배양 시스템과 같은, 광범위한 검정을 이러한 목적을 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 시험관내 배양 시스템은 피질 뉴런의 배양물에 소교세포성 세포의 첨가에 이어서 뉴런으로부터 제거되고/되거나 소교세포성 세포에 의해 소화된 시냅수의 수를 계수함을 포함할 수 있다.
후보물 항체의 기능성 활성은 또한 예컨대, 아밀로이드-베타 올리고머의 뇌내 주사로 챌린지된 동물에서, 또는 SMA과 관련된 인간 가족성 돌연변이로 유전적으로 변형된 동물에서 또는 SMA의 유도된 형태를 지닌 동물에서 정상 발달 또는 노화 동안 시냅스 손실을 조절하는 항체의 능력을 평가함으로써 생체내(in vivo)에서 시험할 수 있다.
후보물 항체는 또한 컴퓨터-기반 모델링을 사용하여, 결합 검정 등에 의해 확인할 수 있다. 다양한 시험관내 모델을 사용하여 항체가 보체 활성에 결합하는지 또는 그렇지 않으면, 보체 활성에 영향을 미치는지를 측정할 수 있다. 이러한 후보물 항체는 시냅스 손실에 대해 승인된 환경 속에서 뉴런을 접촉시켜 시험할 수 있다. 이러한 항체는 시냅스 손실에 있어서의 효과에 대한 생체내 모델에서 추가로 시험할 수 있다.
시냅스 손실은 후보물 항체를 배양물 속에서 뉴런에 투여하고, 항체의 존재 또는 부재하에서 시냅스의 존재를 측정함으로써 정량화할 수 있다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, 뉴런은 망막 신경절 세포(RGC)의 원시 배양물이다. RGC의 정제된 집단은 순차적 면역패닝(sequential immunopanning)과 같은 통상의 방법에 의해 수득된다. 세포는 적합한 배지 속에서 배양되며, 이는 일반적으로 적절한 성장 인자, 예컨대, CNTF; BDNF; 등을 포함할 것이다. 신경 세포, 예컨대, RGC는 강력한 과정 결과를 허용하기에 충분한 기간 동안 배양된 후 후보물 항체와 함께 약 1일 내지 1주의 기간 동안 배양된다. 뉴런은 살아있는 성상세포 세포 공급기 상에서 배양되어 시냅스 손실에 대한 시그널링(signaling)을 유도한다. 성상세포 공급기 층을 배양하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 피질 신경교를 비-부착성 세포의 제거와 함께, 뉴런이 생존하지 못하도록 하는 배지 속에서 플레이팅(plating)할 수 있다.
시냅스 정량화를 위해, 배양물을 고정하고, 차단하고 세척한 후, 시냅스 단백질, 예컨대, 시냅토타그민 등에 대해 특이적인 항체로 염색하고 적절한 시약으로 가시화한다. 염색의 분석은 현미경적으로 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 형광성 방출의 디지탈 영상은 픽셀 값(pixel value) 범위의 사용되지 않은 부위 및 전체 픽셀 값 범위를 이용하도록 조절된 사용된 픽셀 값을 제거하도록 조절된, 카메라 및 영상 소프트웨어를 사용한다. 상응하는 채널 영상은 합하여 개개의 색상 채널로서 2개의 단일-채널 영상을 함유하는 색상(RGB) 영상을 생성할 수 있다. 동시-국재화된 점(puncta)은 롤링 볼 배경 공제 알고리즘(rolling ball background subtraction algorithm)을 사용하여 확인함으로써 각각의 영상 채널로부터 저-주파수 배경을 제거할 수 있다. 모든 시나프토타그민(synaptotagmin), PSD-95, 및 영상내 동시국재화된 점에 대한 수, 평균 부위, 평균 최소 및 최대 픽셀 강도, 및 평균 픽셀 강도를 분석을 위해 기록한다.
일반적으로, 다수의 검정 혼합물을 상이한 항체 농도와 동시에 작동시켜 다양한 농도에 대한 차등적인 반응을 수득한다. 전형적으로, 이들 농도 중 하나는 음성 대조군으로서, 즉 0의 농도 또는 검출 수준 이하에서 제공된다.
약제학적 조성물 및 투여
본 개시내용의 항체는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 항체의 치료학적 제형은 바람직한 정도의 순도를 가진 항체를 임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol,. Ed. [1980])와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로서, 저장용으로 제조될 수 있다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에 대해 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10개 잔기 미만)의 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신과 같은 아미노산; 글루코즈, 만니톨, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 슈크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 대-이온(counter-ion); 금속 복합체(예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
지질감염 또는 리포좀을 또한 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포로 전달할 수 있으며, 여기서 표적 단백질의 도메인에 특이적으로 결합하는 에피토프 또는 가장 작은 단편이 바람직하다.
항체는 또한 예를 들면, 코아세르베이션 기술(coacervation technique) 또는 계면 중합에 의해 제조된 미세캅셀, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-미세캅셀 및 폴리(메틸메타크릴레이트)미세캅셀 각각 속에 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 미세구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캅셀) 속에서 또는 미세유화액 속에서 가둘 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol,. Ed.(1980)에 개시되어 있다.
비경구 투여용으로 사용될 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방성 제제(sustained-release preparation)가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이러한 매트릭스는 성형 제품, 예컨대, 필름, 또는 미세캅셀의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 중합체와 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미세구)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일에 걸쳐 분자의 방출을 가능하도록 하지만, 특정의 하이드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다.
본 개시내용의 항체 및 조성물은 전형적으로 국소, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 비강내, 및 병변내 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 경로로 투여된다. 비경구 투여 경로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 척추강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 본 개시내용의 항체 및 조성물은 발달하는 태아에 대한 투여(예컨대, 혈관내 등)를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 바람직한 제형에 따라, 약제학적으로 허용되는, 희석제의 무-독성 담체를 포함할 수 있으며, 이는 동물 또는 인간 투여용의 약제학적 조성물을 제형화하는데 일반적으로 사용된 비히클로서 정의된다. 희석제는 조합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 완충된 물, 생리학적 염수, PBS, 링거액(Ringer's solution), 덱스트로즈 용액, 및 행크스 용액(Hank's solution)이다. 또한, 약제학적 조성물 또는 제형은 다른 담체, 보조제, 또는 무-독성의, 비치료학적, 비-면역학적 안정화제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 추가의 물질을 포함함으로써 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제, 습윤제 및 세제와 같은 생리학적 상태에 근접한다.
조성물은 또한 예를 들면, 항산화제와 같은 다양한 안정화제 중 어느 것도 포함할 수 있다. 약제학적 조성물이 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 생체내 안정성을 향상시키거나, 그렇지 않으면, 이의 약리학적 특성을 향상시키는(예컨대, 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키고/시키거나, 이의 독성을 감소시키고/시키거나, 다른 약동학 및/또는 약력학적 특성을 향상시키고/시키거나 용해도 또는 흡수를 향상시키는) 다양한 잘 공지된 화합물과 착체화될 수 있다. 이러한 변형 또는 착체화제의 예는 설페이트, 글루코네이트, 시트레이트 및 포스페이트를 포함한다. 조성물의 폴리펩타이드는 또한 이들의 생체내 기여를 향상시키는 분자와 착체화될 수 있다. 이러한 분자는 예를 들면, 탄수화물, 폴리아민, 아미노산, 다른 펩타이드, 이온(예컨대, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간), 및 지질을 포함한다. 다양한 투여 유형에 적합한 제형에 관한 추가의 안내는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed.(1985)에서 찾을 수 있다. 약물 전달 방법에 대한 간략한 고찰에 대해서는, Langer, Science 249:1527-1533(1990)을 참고한다.
활성 성분의 독성 및 치료학적 효능은 예를 들면, LD50(집단의 50%에 대해 치사량인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)을 측정함을 포함하는, 세포 배양물 및/또는 실험 동물에서 표준 약제학적 과정에 따라 측정할 수 있다. 독성과 치료학적 효과 사이의 투여량 비는 치료학적 지수이며 LD50/ED50 비로서 표시될 수 있다. 큰 치료학적 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양물 및/또는 동물 연구로부터 수득된 데이타를 인간용의 용량 범위를 제형화하는데 사용할 수 있다. 활성 성분의 투여량은 전형적으로 저 독성의 ED50을 포함하는 순환하는 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여형 및 이용된 투여 경로에 따라 이러한 범위내에서 변할 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 광범위한 상이한 방식으로 투여될 수 있다. 예는 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 조성물을 경구, 비강내, 직장, 국소, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 경피, 척추강내, 및 두개내 방법을 통해 투여함을 포함한다.
경구 투여를 위해, 활성 성분을 캅셀제, 정제, 및 산제와 같은 고체 투여형, 또는 엘릭서르(elixir), 시럽, 및 현탁액과 같은 액체 투여형으로 투여할 수 있다. 활성 성분(들)은 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 만니톨, 전분, 셀룰로즈 또는 셀룰로즈 유도체, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 나트륨 사카린, 활석, 탄산마그네슘과 같은, 불활성 성분 및 분말화된 담체와 함께 젤라틴 캅셀 내에 캅셀화될 수 있다. 첨가되어 바람직한 색상, 맛, 안정성, 완충능, 분산 또는 다른 공지된 바람직한 특징을 제공할 수 있는 추가의 불활성 성분의 예는 적색 산화철, 실리카 겔, 나트륨 라우릴 설페이트, 이산화티탄, 및 식용가능한 백색 잉크이다. 유사한 희석제를 사용하여 압착 정제를 제조할 수 있다. 정제 및 캅셀제는 수시간의 기간에 걸쳐 의약의 지속적인 방출을 제공하기 위해 서방성 생성물로 제작될 수 있다. 압착 정제는 당 코팅되거나 필름 코팅되어 불쾌한 맛을 차폐시키고 대기, 또는 위장관내에서 선택적인 붕해에 대해 장-코팅될 수 있다. 경구 투여용의 액체 투여형은 색상 및 풍미를 함유함으로써 환자의 용인(acceptance)을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여용으로 적합한 제형은 수성 및 비-수성의, 이온성 멸균 주사 용액을 포함하며, 이는 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제, 및 제형이 의도된 수용체의 혈액과 등장성이도록 하는 용질, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다.
약제학적 조성물을 제형화하는데 사용된 성분은 바람직하게는 고 순도이고 잠재적으로 유해한 오염물질을 포함하지 않는다(예컨대, 적어도 National Food(NF) 등급, 일반적으로 적어도 분석 등급, 및 보다 전형적으로 적어도 약제학적 등급). 더욱이, 비경구용으로 의도된 조성물은 일반적으로 멸균성이다. 제공된 화합물이 사용 전에 합성되어야만 하는 정도까지, 수득되는 생성물은 전형적으로 어떠한 잠재적으로 독성인 제제, 특히 어떠한 내독소도 포함하지 않으며, 이는 합성 또는 정제 공정 동안 존재할 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 또한 전형적으로 등장성이고 GMP 조건 하에 이루어진다.
본 개시내용의 조성물은 어떠한 의학적으로 적절한 과정, 예컨대, 혈관내(정맥내, 동맥내, 모세관내) 투여, 뇌척수액 내로 주사, 유리체내, 국소, 공동내 또는 뇌 속에 직접 주사를 사용하여 투여할 수 있다. 척추강내 투여는 옴마야 저장기(Ommaya reservoir)를 사용하여 공지된 기술(F. Balis et al.,m J. Pediatr. Hematol. Oncol. 11, 74, 76(1989)에 따라 수행할 수 있다.
치료제가 뇌 속에 국소 투여되는 경우, 본 개시내용의 치료학적 조성물의 하나의 투여 방법은 투여를 위해 직접 주사(필요에 따라, 주사용 주사기의 정위 위치조정(stereotaxic positioning)에 의해 보조됨)에 의해 또는 옴마야 저장기의 끝을 강(cavity), 또는 낭포(cyst) 내로 위치시킴에 의해서와 같은, 어떠한 적합한 기술에 의해서도 부위 내로 또는 부위 근처로 침착시킴에 의한다. 대안적으로, 대류-향상된 전달 카테터(convection-enhanced delivery catheter)를 부위내, 천연 또는 수술로 생성시킨 낭포내로, 또는 정상의 뇌 덩어리내로 이식시킬 수 있다. 이러한 대류-향상된 약제학적 조성물 전달 장치는 뇌 덩어리를 통해 조성물의 확산을 크게 개선시킨다. 이들 전달 장치의 이식된 카테터는 확산성 유동보다는, 고-유동 미세주입(약 0.5 내지 15.0 μl/분의 범위의 유동 속도로)을 이용하여, 치료학적 조성물을 뇌 및/또는 종양 덩어리로 전달한다. 이러한 장치는 본원에 참고로 전체가 포함된 미국 특허 제5,720,720호에 기술되어 있다.
특수한 환자에게 제공된 치료학적 조성물의 유효량은 다양한 요인에 의존할 수 있으며, 이들 중 일부는 환자마다 상이할 수 있다. 능숙한 임상의는 환자에게 투여하기 위한 치료제의 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 제제의 용량은 치료, 투여 경로, 치료제의 특성, 치료제에 대한 환자의 민감성 등에 의존할 것이다. LD50 동물 데이타, 및 다른 정보를 이용하여, 임상의는 투여 경로에 의존하여, 개인에 대한 최대로 안전한 용량을 결정할 수 있다. 통상의 기술을 이용하여, 능숙한 임상의는 일상의 임상 시험의 과정에서 특수한 치료학적 조성물의 투여량을 최적화할 수 있을 것이다. 조성물은 대상체에게 일련의 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 치료학적 조성물의 경우, 규칙적인 주기적 투여가 때때로 요구될 것이거나, 바람직할 수 있다. 치료 요법은 제제에 따라 변할 것이며; 예를 들어, 일부 제제는 매일 또는 1일 2회 기준의 연장된 기간 동안 취할 수 있지만, 보다 선택적인 제제는 보다 규정된 기간 동안, 예컨대, 매일, 1일 2회, 주당 2회, 매주 등으로 취하여, 1, 2, 3일 이상, 1주 이상, 1개월 이상 등의 기간 동안 투여될 수 있다.
제형은 뇌 속에서 보유 및 안정화를 위해 최적화할 수 있다. 제제를 두개 구획내로 투여하는 경우, 제제를 구획 내에 보유시키고, 혈액 뇌 장벽으로 확산하지 않거나 그렇지 않으면 교차하지 않도록 하는 것이 바람직하다. 안정화 기술은 분자량의 증가를 달성하기 위하여, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아미드, 중성 단백질 담체 등과 같은 그룹에 가교-결합, 다량체화, 또는 연결시키는 것을 포함한다.
보유를 증가시키기 위한 다른 전략은 생분해가능하거나 생부식가능한 임플란트 속에 제제를 포착(entrapment)시킴을 포함한다. 치료학적으로 활성인 제제의 방출 속도는 중합체 매트릭스를 통한 수송의 속도, 및 임플란트의 생분해에 의해 제어된다. 중합체 장벽을 통한 약물의 수송은 또한 화합물 용해도, 중합체 친수성, 중합체 가교-결합의 정도, 중합체 장벽이 약물에 대해 보다 투과성이 되도록 하기 위한 물 흡수시 중합체의 팽창, 임플란트의 기하학 등에 의해 영향받을 것이다. 임플란트는 이식 부위로서 선택된 영역의 크기 및 형상과 어울리는 치수이다. 임플란트는 입자, 시이트, 패치, 플라크(plaque), 섬유, 미세캅셀 등일 수 있으며 선택된 삽입 부위와 양립되는 어떠한 크기 또는 형상일 수 있다.
임플란트는 모놀리식(monolithic)일 수 있는데, 즉, 중합체 매트릭스를 통해 균질하게 분포되거나, 활성제의 저장기(reservoir)가 중합체 매트릭스에 의해 캡슐화된 경우, 캡슐화될 수 있다. 사용될 중합체 조성물의 선택은 투여 부위, 바람직한 투여 기간, 환자 내성, 치료될 질환의 특성 등에 따라 변할 것이다. 중합체의 특성은 이식 부위에서의 생분해능, 목적한 제제와의 상용성, 캅셀화 용이성, 생리학적 환경 속에서의 반감기를 포함할 것이다.
사용될 수 있는 생분해성 중합체 조성물은 유기 에스테르 또는 에테르일 수 있으며, 이는 분해된 경우, 단량체를 포함하는 생리학적으로 허용가능한 분해 생성물을 생성한다. 무수물, 아미드, 오르토에스테르 등은 자체적으로 또는 다른 단량체와 함께 사용될 수 있다. 중합체는 응축 중합체일 수 있다. 중합체는 가교-결합되거나 비-가교-결합될 수 있다. 특히 관심있는 것은 단독- 또는 공중합체인 하이드록시지방족 카복실산의 중합체, 및 다당류이다. 목적한 폴리에스테르 중에는 D-락트산, L-락트산, 라세미 락트산, 글리콜산, 폴리카프롤락톤, 및 이의 조합물이 포함된다. L-락테이트 또는 D-락테이트를 사용함으로써, 느린 생분해성 중합체가 달성되며, 분해는 라세메이트를 사용하여 실질적으로 향상된다. 생분해 속도가 글리콜산 대 락트산의 비에 의해 제어되는 경우, 글리콜산과 락트산의 공중합체가 특히 관심있다. 가장 신속하게 분해된 공중합체는 거의 동일한 양의 글리콜산과 락트산을 가지며, 여기서 어느 단독중합체도 분해에 대해 더욱 내성이다. 글리콜산 대 락트산의 비는 또한 임플란트 속에서의 취성에 영향을 미칠 것이며, 여기서 보다 굴곡성인 임플란트가 보다 큰 기하학에 바람직하다. 흥미있는 다당류 중에는 알긴산칼슘, 및 기능화된 셀룰로즈, 특히 수 불용성이고, 분자량이 약 5 kD 내지 500 kD 등임을 특징으로 하는 카복시메틸셀룰로즈 에스테르가 있다. 생분해성 하이드로겔은 또한 본 개시내용의 임플란트에서 사용될 수 있다. 하이드로겔은 전형적으로 액체를 흡수하는 능력에 의해 특징화되는, 공중합체 물질이다. 사용될 수 있는 예시적인 생분해가능한 하이드로겔은 Heller in:Hydrogels in Medicine and Pharmacy, N. A. Peppes ed., Vol. Ill, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1987, pp 137-149에 기술되어 있다.
키트(kit)
본 개시내용은 또한 약제학적 조성물의 성분 중 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩(pharmaceutical pack) 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)과 함께 약제 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 처방된 형태의 안내문이 존재할 수 있으며, 이러한 안내문은 기관에 의한 인간 투여용을 위한 제조, 사용 또는 판매의 승인을 반영한다.
본 개시내용의 키트는 정제된 항-C1q, 항-C1r 또는 항-C1s 항체 및 당해 분야에 공지된 방법에 따라 사용하기 위한 지시사항을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들 지시사항은 당해 분야의 공지된 어떠한 방법에 따라, 질환을 치료하거나 진단하기 위한 억제제의 투여 설명을 포함한다. 키트는 개인이 SMA 및 SMA의 단계를 가지고 있는지를 확인하는 것을 기반으로 치료에 적합한 개인을 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다.
지시사항은 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 용량 스케쥴, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 대량의 패키지(예컨대, 다중-용량 패키지) 또는 서브-단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 공급된 지시사항은 전형적으로 표지 또는 패키지 삽입물(예컨대, 키트내에 포함된 종이 시이트) 상의 서면 지시사항이지만, 기계-판독가능한 지시사항(예컨대, 자기 또는 광 저장 디스크에 수반된 지시사항)도 또한 허용가능하다.
표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 SMA 치료용으로 사용됨을 나타낸다. 지시사항은 본원에 기술된 방법 중 어느 것도 실시하기 위해 제공될 수 있다.
본 개시내용의 키트는 바람직하게는 적합한 패키징 속에 배치된다. 적합한 패키징은 바이알(vial), 병, 자(jar), 굴곡성 패키징(예컨대, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 흡입기, 비강 투여 장치(예컨대, 분무기)와 같은 특수한 장치 또는 미니펌프와 같은 주입 장치와 함께 사용하기 위한 패키지이다. 키트는 멸균 수용 포트(sterile access port)(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다)를 가질 수 있다. 용기는 또한 멸균 액서스 포트(예컨대, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다)를 가질 수 있다. 조성물 속의 적어도 하나의 활성제는 전통적인 보체 경로의 억제제이다. 용기는 제2의 약제학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 완충제 및 해석 정보와 같은 추가의 성분을 임의로 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기 및 표지 또는 용기 상의 또는 용기와 관련된 패키지 삽입물(들)을 포함한다.
보체의 억제
보체의 활성을 억제하는 다수의 분자가 알려져 있다. 공지된 화합물 외에, 적합한 억제제를 본원에 기술된 방법으로 스크리닝할 수 있다. 상술된 바와 같이, 정상의 세포는 보체 활성을 차단하는 단백질, 예컨대, CD59, C1 억제제 등을 생산할 수 있다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, 보체는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자의 발현을 상향조절함으로써 억제된다.
보체 활성화를 차단하는 분자의 변형이 또한 당해 분야에 알려져 있다. 예를 들면, 이러한 분자는 제한없이, 가용성 CR1과 같은 변형된 보체 수용체를 포함한다. CR1의 가장 일반적인 동종이인자형의 성숙한 단백질은 1998개의 아미노산 잔기: 1930개 잔기의 세포외 도메인, 25개 잔기의 막전이 영역, 및 43개 잔기의 세포질성 도메인을 포함한다. 전체 세포외 도메인은 짧은 컨센서스 반복체(SCR)는 짧은 컨센서스 반복체(SCR) 또는 보체 대조군 단백질 반복체(CCPR)로 언급된 30개의 반복 단위로 구성되며, 각각은 60 내지 70개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 최근의 데이타는 C1q가 인간 CR1에 특이적으로 결합함을 나타낸다. 따라서, CR1은 모든 3개의 보체 옵소닌(opsonin), 즉 C3b, C4b, 및 C1q를 인식한다. 전이막 및 세포질성 도메인을 결여한 재조합 인간 CR1(sCR1)의 가용성 버전이 생산되었으며 천연의 CR1의 공지된 기능 모두를 보유함이 밝혀졌다. 허혈/재관류 손상의 동물 모델에서 sCR1의 심장보호 역활은 확인되었다. 수개 유형의 인간 C1q 수용체(C1qR)가 기술되었다. 이들은 C1q의 콜라겐-유사 도메인에 결합하므로 cC1qR로 지칭된 편재하여 분포된 60- 내지 67-kDa 수용체를 포함한다. 이러한 C1qR 변이체는 칼레티쿨린; 단핵세포 식균작용을 조절하는 126-kDa 수용체인 것으로 밝혀졌다. gC1qR은 막-결합된 분자가 아니라, C1q의 구형 영역에 대해 친화성을 갖는 분비된 가용성 단백질이며, 보체 활성화의 유액-상 조절인자로서 작용할 수 있다.
부패 촉진 인자(decay accelerating factor: DAF)(CD55)는 4개의 SCR와 연장성 O-연결된 글리코실화가 가능한 세린/트레오닌이 풍부한 도메인으로 구성된다. DAF는 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI) 앵커(anchor)에 의해서 및, C4b 및 C3b에 결합하는 이의 능력을 통해 세포 막에 부착되며, 이는 C3 및 C5 컨버타제를 해리함으로써 작용한다. DAF의 가용성 버전(sDAF)은 보체 활성화를 억제하는 것으로 밝혀졌다.
세린 프로테아제 억제제의 "세르핀" 계열의 구성원인, C1 억제제는 유체-상 C1 활성화를 방지하는 크게 글리코실화된 혈장 단백질이다. C1 억제제는 C1r 및 C1s의 활성 부위를 차단하고 이를 C1q로부터 해리시킴으로써 보체 활성화의 전통적인 경로를 조절한다.
보체 활성화의 펩타이드 억제제는 C5a를 포함하며 다른 억제성 분자는 푸칸(Fucan)을 포함한다.
시냅스 손실
시냅스는 2개의 뉴런 사이에 형성된 비대칭 통신 연결부, 또는 뉴런과 근육 세포 사이의 신경근육 연결부(NMJ)이다. 화학적 시냅스는 신경전달인자의 분비를 통해 세포-대-세포 통신을 가능하도록 하지만, 전기적인 시냅스 시그널은 이온 전류 흐름을 허용하는 구체화된 세포내 채널인 갭 연결부를 통해 전송된다. 이온 외에, 시냅스 기능을 조율하는 다른 분자(예를 들면, ATP 및 제2의 전령 분자)가 갭 연결 공극을 통해 확산될 수 있다. 성숙된 NMJ에서, 시냅스 전(presynaptic)- 및 시냅스 후(postsynaptic) 막은 기저 라멜라를 형성하는 세포외 단백질을 함유하는 시냅스 간극에 의해 분리된다. 시냅스 소낭은 시냅스 전 방출 부위에서 무리를 형성하며, 전송인자 수용체는 시냅스 후 막에서 접합 주름에서 무리를 형성하고 신경교 프로세스는 신경 말단을 둘러싼다.
시냅스형성(Synaptogenesis)은 동적인 공정이다. 발달 동안, 궁극적으로 보유될 것보다도 보다 많은 시냅스가 전형적으로 제조된다. 따라서, 과도한 시냅스 도입(input)의 제거는 시냅스 회로 성숙에 있어서 중요한 단계이다. 시냅스 제거는 시냅스 전 파트너와 시냅스 후 파트너 사이의 상호작용을 포괄하는 경쟁적 과정이다. NMJ를 사용하는 것과 같이, CNS에서, 시냅스 회로의 개발, 활성-의존성 리모델링은 강제적인 도입 및 교정되지 않은 활성을 지닌 도입의 제거의 선택적인 안정화를 포함할 수 있는 공정에 의해 일어난다. 시냅스 회로의 해부학적 개선은 시냅스의 신속한 제거를 포함하는 동적 과정에 의해 개개의 엑손 및 수상돌기의 수준에서 일어난다. 엑손이 가지가 생겨 리모델링됨에 따라, 시냅스는 형성되어 신속하게 일어나는 시냅스 제거와 함께 해체된다.
정상적인 발달적 손실 외에, 시냅스 손실은 SMA를 포함하는 많은 신경변성 장애에 대해 일반적인 조기 병리학적 현상이며, 인지 손상에 대해 가장 관련성이 있다. 예를 들면, 전임상 알츠하이머 질환(AD)을 지닌 환자의 뇌, 및 형질전환 동물 모델에서의 연구는 시냅스 손상이 질환 진행에서 조기에 발생한다. 뇌에서 시냅스 연결의 이러한 조기 붕괴는 뉴런 기능장애를 야기하고, 이는 결국 치매의 특징적인 증상 및/또는 몇가지 신경변성 장애에서 관찰된 운동 손상을 초래한다는 것을 입증하였다.
AD 및 다른 신경변성 장애에 관여된 수개의 분자가 시냅스 기능에 있어서 중요한 역활을 한다. 예를 들면, ΑβΡΡ는 중추 및 말초 시냅스 부위에서 우선적인 국재화를 갖는다. 형질전환 마우스에서, ΑβΡΡ의 돌연변이체 형태의 비정상적인 발현은 아밀로이드 축적뿐만 아니라, 광범위한 시냅스 손상을 야기한다. 이러한 시냅스 병리학은 조기에 발생하며 플라크 형성보다는 가용성 Αβ1-42의 수준과 관련되어 있다. 유전자 생성물이 시냅스 복합체와 밀접하게 관련된 것으로 밝혀진 다른 신경변성 질환은 헌팅톤 질환(Huntington's disease: HD) 및 근육긴장 디스트로피(myotonic dystrophy: DM)를 포함한다. 헌팅틴(Huntingtin: HTT)은 시냅스 소낭 단백질 시냅토파이신의 분포와 매우 유사한 분포를 지닌 막-결합된 단백질이다. 인간 뇌에서의 연구는 일부 뉴런, 신경망, 정맥류성 종창의 세포체(perikarya)에서 및 신경 말단이 될 수 있는 점상 염색(punctate staining)으로서 HTT를 검출하였다. DM 유전자의 유전자 생성물인, 세린/트레오닌 키나제(DMK)는 골격근의 신경근육 연결부에서 및 심장 조직의 개재판(intercalated disc)에서 후-시냅스적으로 국재화함이 밝혀졌다. DMK는 또한 대뇌, 해마, 중뇌 및 수질내 시냅스 부위에서 발견되었다.
본원에 개시된 항체는 시냅스 손실 SMA를 억제하는데 사용될 수 있다. 시냅스 손실의 억제는 시냅스의 유지 또는 감소된 손실을 야기하며, 여기서 감소가 달리 발생할 수 있다.
혈액 뇌 장벽
본원에 사용된 바와 같은, "혈액-뇌 장벽"(BBB)은 말초 순환과 뇌 및 척수 사이의 장벽을 지칭한다. BBB는 뇌 모세관 내피 혈장 막내의 치밀 이음부(tight junction)에 의해 형성된다. 이러한 치밀 이음부의 형성은 분자, 심지어 분자량이 60 Da인 우레아와 같은 분자의 뇌 내로의 수송을 제한하는 극도로 치밀한 장벽을 생성한다. 뇌 내에서 혈액-뇌 장벽, 척수내 혈액-척수 장벽, 및 망막내 혈액-망막 장벽은 중추신경계(CNS) 내에서 연속적인 모세관 장벽이며, 총칭적으로 혈액-뇌 장벽 또는 BBB로 지칭된다. 본 개시내용은 이를 위해 BBB를 교차한 수송이 바람직한 제제, 예컨대, 신경치료제에 커플링된, BBB 수용체 매개된 수송 시스템에 결합하는 항체를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 개시내용의 조성물 및 방법은 선택된 내인성 BBB 수용체-매개된 수송 시스템에 의해 전송할 수 있고, 또한 요구되는 제제에 부착할 수 있는 어떠한 적합한 구조도 이용할 수 있다.
BBB는 혈액으로부터 수개의 거대분자의 뇌로 전송하도록 하는 특이적인 수용체를 가진 것으로 밝혀졌으며; 이들 전송인자는 본 개시내용의 조성물에 대한 전송인자로서 적합하다. 본 개시내용에 유용한 내인성 BBB 수용체-매개된 전송 시스템은 인슐린, 트랜스페린, 인슐린-유사 성장 인자 1 및 2((IGF1 및 IGF2), 렙틴, 및 지단백질을 전송하는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 내인성 인슐린 BBB 수용체-매개된 전송 시스템, 예컨대, 인간 내인성 인슐린 BBB 수용체-매개된 전송 시스템을 통해 BBB를 교차할 수 있는 구조를 이용한다.
혈액 뇌 장벽(BBB)을 통해 약물을 전달하기 위한 한가지 전략은 만니톨 또는 류코트리엔과 같은 삼투압 수단에 의한, 또는 브래디키닌과 같은 혈관활성 물질의 사용에 의해 생화학적으로, BBB의 붕괴를 내포한다. 특이적인 제제를 표적하기 위해 BBB 개방(opening)을 사용하기 위한 잠재능은 또한 선택사항이다. BBB 붕괴제(disrupting agent)는 조성물이 정맥내 주사에 의해 투여되는 경우 본 개시내용의 치료학적 조성물과 함께 통시투여될 수 있다. BBB를 통과시키는 다른 전략은 글루코즈 및 아미노산 담체와 같은 담체-매개된 전송인자, 인슐린 또는 트랜스페린용의 수용체-매개된 통과세포외배출(transcytosis), 및 p-당단백질과 같은 활성 유출물 전송인자를 포함하는 내인성 전송 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 활성인 전송 모이어티는 또한 본 개시내용의 항체에 접합되어 혈관의 내피 벽을 횡단하는 전송을 촉진할 수 있다. 대안적으로, BBB 뒤로의 약물 전달은 예컨대, 옴마야 저장기(Ommaya reservoir)를 통해서와 같이, 뇌척수 유액에 직접적으로 제제의 척추강내 전달에 의해 추구될 수 있다.
척수 근 위축증
본 개시내용의 항체는 보체 경로의 억제제(예컨대, 항-C1q, -C1r, 또는 -C1s 항체와 같은 억제제)를 투여함을 포함하여, SMA를 예방하거나, 이로 진행될 위험을 감소시키거나, 이를 치료하는 본 발명에 유용할 수 있다. 본 개시내용의 항체는 또한 SMA내 시냅스 손실을 억제하는데 유용할 수 있다.
시냅스 손실은 신경변성 질환의 중요한 특징으로서 제공되는 인지력 감퇴와 유의적으로 관련되어 있다. 예를 들면, 소교세포 프룬(prune) 발달은 시냅스를 형성하여 시냅스 가소성 및 기능을 조절한다. 소교세포-시냅스 상호작용에 있어서의 붕괴는 신경변성 질환에서 인지 장애를 포함하는 시냅스 손실 및 기능장애에 기여한다. 또한, 보체 단백질 또는 보체 및 프락탈킨(fractalkine) 수용체와 같은, 소교세포에서 발현된 면역-관련 분자 또는 수용체의 붕괴는 시냅스 연결성을 형성(sculpting)하는데 있어서 소교세포 연루된 출산 전 및 출산 후 뇌 발달 둘 다에서 시냅스 및 와이어링(wiring) 비정상을 야기한다.
척수 근 위축증(SMA)은 영아에서 주로 진단되고 성인에서는 거의 흔하지 않게 진단된 임상적으로 이종인, 상염색체 열성 신경변성 장애이다.
보체 경로 및 소교세포 식세포 활성의 비정상적인 활성화는 SMA에서 시냅스 손실을 매개할 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 바와 같은, C1q의 차단은 척수 근 위축증(SMA)을 예방하거나, 이의 진행 위험을 감소시키거나, 치료하는 방법에서 보체 억제제로서 제공될 수 있다. SMA의 마우스 모델에서 면역조직화학 검정은 C1q가 운동뉴런에서 흥분성-시냅스와 비정상적으로 관련되지만, 억제성-시냅스와는 관련되지 않음을 나타내었다. C1q 및 C3는 또한 취약한 운동 뉴런에서 자기수용성(VGluTl+) 시냅스를 태그한다. 시냅스 제거는 반응성 소교세포의 식세포 활성에 의해 매개되며, 이는 SMN 결핍성 척수에서 C1q의 주요 공급원이다. 모노클로날 항-C1q 항체를 사용한 C1q의 생체내 차단에 의한 면역치료요법은 제거될 예정의 시냅스를 구조하고 조기 시냅스 손실을 예방한다. 거동 및 형태학적 분석은 자기수용의 시냅스의 유의적인 구조, 증진된 적시(righting times), 자세 및 수명을 나타낸다. 척수 생체외(ex vivo) 제조를 사용한 기능성 검정은 제거로부터 구조된 시냅스가 기능성임을 입증하였으며, SMA가 운동 회로의 질환이라는 추가의 증거를 제공한다.
SMA는 생존 운동뉴런 유전자(SMN)의 결실/돌연변이에 의해 유발된다. 인간에서, 2개의 SMN 유전자, 편재하는 단백질(완전한 길이의 SMN 또는 FL-SMN)을 암호화하는 텔로머성 SMN1, 및 기능성이지 않은 엑손 7을 결여한 단백질(△7-SMN)을 주로 생성하는 이의 동원체성 동족체 SMN2가 존재하며: 실제로, SMN2 유전자는 SMA 중증도를 조율할 수 있는 제한된 양의 기능성 단백질을 생산한다. 이는 발병의 상이한 연령 및 질환 중증도에 의해 특징화되는, 5개의 주요 임상적 SMA 유형(0, 1, II, III, IV)의 존재를 설명한다. SMA의 특징은 운동 뉴런 및 비정상적인 자세 반사작용의 손실이다.
제0 유형, 또는 출산 전 SMA는 SMA의 가장 심각한 형태에 대한 제안된 명칭이다. 영향받은 영아는 전형적으로 출생시 현저히 약하고 선천성 근형성부전을 나타낸다. 제0 유형의 SMA를 지닌 영아는 6개월 전에 죽는다.
앞서, 베르드니히-호프만병(Werdnig-Hoffmann)으로 불린 제I 유형은 사례의 60%에 해당한다. 증상은 출생시 또는 생애의 처음 수개월 내에 나타난다. 제I 형 영아는 매우 약하고, 긴장저하이며, 보조없이 일어설 수 없고, 연하 곤란성을 가지며, 힘줄 반사가 없고, 흡입 반사가 손상되어 있고 호흡 합병증을 갖는다. 대부분은 혀 섬유속연축(tongue fasciculation)을 갖는다. 호흡 부전으로부터의 사망이 전형적으로 만 2세의 영아까지 발생한다.
SMA 제II 형은 SMA의 중간 형태이다. 증상은 일반적으로 6개월 내지 12개월 연령에서 명백하며, 약하고, 낮은 근긴강도, 자세성 손가락 진전(postural finger tremor), 기거나 걷지 못함을 특징으로 한다. 제II 형 개인은 힘줄 반사가 없다. 제II 형으로 영향받은 개인은 전형적으로 일단 위치시키면 독립된 앉는 자세를 유지할 수 있고, 보조시 걷는 능력을 가질 수 있으며 및 청소년기 및 젊은 청년기까지 생존할 수 있다. 제I 형과 같이, 호흡 부전은 일반적으로 제II 형을 지닌 어린이의 주요 사망 원인이다.
제III 형은 SMA의 보다 약한 형태이며 2세 후 나타나는 증상을 지닌다. 척추측만증, 근육 힘줄의 단축, 및 호흡 합병증을 포함하는 합병증과 함께 하체가 가장 일반적으로 영향받는다. SMA 제III 형으로 영향받은 개인은 전형적으로 보조없이 걸을 수 있다. 제III 형을 지닌 개인은 성인까지 살 수 있다.
SMA 제IV 형은 제III 형과 유사한 표현형을 지닌 상태의 성인 발병이다. 이러한 유형의 SMA는 일반적이지 않다.
위장합병증은 SMA를 지닌 개인에게서 일반적이나, 이것이 무운동능 및 영향 결핍으로 인한 것인지 또는 주요 결함이 위장 운동능에 있는지의 여부는 명확하지 않다. 제I 형 SMA를 지닌 영아는 흔히 연장된 수유 시간을 가지며 빠르게 피곤해한다. 수유에 있어서 이러한 감소는 진행성 약화의 첫번째 신호일 수 있으며 성장(thrive) 및 호흡 부전을 일으킬 수 있다. 위장 기능장애는 수유 곤란성 및 구근 기능장애로 인한 연하 곤란성을 포함하며 혀 약화, 입을 벌리는 것의 곤란성, 및 불량한 머리 제어로 나타난다. 다른 관련된 문제는 위장 역류, 지연된 위 배출, 및 변비를 포함한다. 이러한 합병증은 또한 다른 이유로 앉거나 설 수 없는 개인에서 관찰될 수 있으며, SMA를 지닌 걸어다닐 수 없는 개인에서 덜 흔하게 관찰된다.
약화 및 손상된 운동능은 SMA 환자에서 많은 근골격적 문제로 취약하게 될 수 있다. 조기 인식 및 적절한 관리가 기능을 유지하고, 폐활량에 있어서의 악화를 예방하고, 삶의 질을 증진시키는데 도움이 된다. SMA를 지닌 걸어다닐 수 없는 개인에서, 경축(contractures)은 일반적이며 유연성을 보존하고 경축을 예방하기 위한 규칙적인 스트레칭 및 브래싱(bracing) 프로그램이 치료요법의 주요 목표이다. 수동 및 엔진이 달린 휠체어를 18 내지 24개월 정도로 조기에 개시할 수 있다. 일부 체중을 지탱할 수 있고 일부 몸통 제어(trunk control)하는 어린이는 발목-발 오르토(ankle-foot orthos)를 지닌 기립대(standing frame) 또는 이동식 스탠더(mobile stander)를 사용할 수 있다.
척추측만증이 SMA를 지닌 거의 모든 걸어다닐 수 없는 개인에서 발생한다. 치료받지 않는 경우, 척추측만증은 후속적인 호흡 제한이 있는 흉부 케이지 기형(chest cage deformity)을 유발한다. 척추 융합술 및 브래이싱(bracing)은 척추측만증에 대한 선택 치료이지만; 이들의 효능에 대해 명확한 합의가 없다.
치료 방법
보체 활성화를 억제하는 제제를 투여함으로써, 그렇지 않으면 손실될 수 있는 시냅스가 유지될 수 있다. 이러한 제제는 항-C1q, 항-C1r, 또는 항-C1s 항체 억제제를 포함한다. 다른 제제는 천연 보체의 발현을 상향조절하는 억제제, 또는 뉴런, 성상세포, 소교세포, 내피세포, 또는 희소돌기아교세포 세포에서 C1q, C1r 또는 C1s 합성을 하향-조절하는 제제, 보체 활성화를 차단하는 제제, 보체 활성화에 대한 시그널을 차단하는 제제 등을 포함할 수 있다. 이러한 제제는 단독으로 또는 척수 근 위축증을 치료하기 위한 안티센스 약물 치료요법과 같은 하나 이상의 다른 치료요법과 함께 사용될 수 있다(참고: 하기 "조합 치료" 단락 참고). 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 항체는 안티센스 약물 SPINRAZA™(누시네르센)과 공동으로 투여될 수 있다.
본원에 개시된 제제의 투여는, 단독으로 또는 본원에 개시된 다른 제제와 함께 사용하는 것과는 상관없이, 예컨대, 척수 근 위축증(SMA)으로 고통받는 환자에서, SMA를 예방하거나, 이로 진행될 위험을 감소시키거나, 이를 치료하는데 유용하다. 특정의 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 SMA로 고통받는 환자의 사망률을 감소시키고/시키거나 수명을 연장시킨다.
이러한 방법은 SMA과 같은 시냅스 손실과 관련된 상태에서 뉴런 기능의 증진된 유지를 촉진시킨다. 뉴런 연결의 유지는 치료되지 않은 환자와 관련하여 신경변성 질환에서 기능적 증진을 제공한다. 시냅스 손실의 예방은 1, 2, 3, 4, 5, 6일 또는 적어도 1주의 기간에 걸쳐 이러한 치료를 결여하는 대조군과 관련하여 적어도 측정가능한 증진, 예를 들면, 다수의 시냅스에서 적어도 10% 증진, 적어도 20% 증진, 적어도 50% 증진, 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 제제는 어떠한 부작용도 최소화시키면서 시냅스 손실을 감소시키는 투여량으로 투여될 수 있다. 조성물은 생체내 사용을 위해 주치의의 안내 하에서 수득되어 사용될 수 있음이 고려된다. 치료학적 제형의 투여량은 질환의 특성, 투여 빈도, 투여 방식, 숙주로부터의 제제의 제거 등에 의존하여, 광범위하게 변할 수 있다.
특정한 환자에게 제공된 치료학적 조성물의 유효량은 광범위한 인자에 의존할 수 있으며, 이중 수개는 환자마다 상이할 수 있다. 통상의 기술을 이용하여, 능숙한 임상의는 통상의 임상 시도 과정에서 특수한 치료학적 또는 영상 조성물의 투여량을 조절할 수 있을 것이다.
치료제, 예컨대, 보체 억제제, 유전자 발현의 활성인자 등은 적절한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합함으로써 치료학적 투여를 위한 광범위한 제형내에 혼입시킬 수 있으며, 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 연고, 액제, 좌제, 주사제, 흡입제, 겔제, 미소구, 및 에어로졸제와 같은 고체, 반-고체, 액체 또는 가스 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 따라서, 화합물의 투여는 경구, 볼내, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 경피, 비강, 척추강내 등의 투여를 포함하는 다양한 방식으로 달성할 수 있다. 활성제는 투여 후 전신계일 수 있거나 국부 투여, 벽내(intramural) 투여의 사용, 또는 이식 부위에서 활성 용량을 유지하기 위해 작용하는 임플란트의 사용에 의해 국재화할 수 있다.
조합 치료
본 개시내용의 보체 억제제는 제한 없이, 면역억제성 치료요법 또는 안티센스 약물 치료요법과 같은 어떠한 추가의 치료와 공동으로 척수 근 위축증을 치료하는데 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 보체 활성화의 대안적인 경로의 억제제와 함께 투여할 수 있다. 이러한 억제제는 제한 없이 인자 B 차단 항체, 인자 D 차단 항체, 가용성의, 막-결합된, 태그되거나 융합-단백질 형태의 CD59, DAF, CR1, CR2, Crry 또는 C3의 절단을 차단하는 콤프스타틴-유사 펩타이드, SB 290157과 같은 비-펩타이드 C3aR 길항제, 코브라 뱀독 인자(Cobra venom factor) 또는 나파모스타트 메실레이트(FUTHAN; FUT-175), 아프로티닌, K-76 모노카복실산(MX-1) 및 헤파린과 같은 비-특이적인 보체 억제제를 포함할 수 있다(참고: 예컨대, T.E. Mollnes & M. Kirschfink, Molecular Immunology 43 (2006) 107-121). 일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 자가항체와 이의 자가항원 사이의 상호작용의 억제제와 함께 투여된다. 이러한 억제제는 자가항원의 정제된 가용성 형태, 또는 AQP4 항원의 미모토프(mimotope)를 포함하는, 펩타이드 또는 RNA-기원한 미모토프(RNA-derived mimotope)와 같은 항원 모사체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이러한 억제제는 자가항원을 인식하고 전통적인 보체 경로를 트리거링(triggering)하지 않고 자가항체의 결합을 방지하는 차단제를 포함할 수 있다. 이러한 차단제는 예컨대, 자가항원-결합 RNA 아프타머 또는 이들의 Fc 도메인내 기능성 C1q, C1r, 또는 C1s 결합 부위를 결여하는 항체(예컨대, Fab 단편 또는 C1q, C1r, 또는 C1s에 결합하지 않도록 달리 가공된 항체)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 안티센스 약물과 공동으로 투여될 수 있다. 안티센스 약물은 스플라이싱 교정을 통해 완전한 기능성 단백질의 발현을 회복할 수 있다. 이러한 안티센스 약물은 인간 SMN1 또는 SMN2 프레-mRNA를 암호화하는 핵산에 대해 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다(예컨대, 안티센스 약물은 인간 SMN2 프레-mRNA를 암호화하는 핵산의 인트론 7에 대해 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다). 예를 들면, 본 개시내용의 항체는 안티센스 약물 SPINRAZA™(누시네르센)과 공동으로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 방법은 중추 신경계에 대한 세포 또는 조직 이식과 함께 사용할 수 있으며, 여기서 이러한 이식체는 태아 조직, 신경 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 신경 보수 또는 증강을 위해 고려된 다른 세포 및 조직에서 발견된 것들과 같은 신경 선조세포를 포함한다. 신경 줄기 및 선조 세포는 이미-확립된 이주 경로를 따라 산재성 CNS 영역으로의 이주, 미세환경 단서에 대한 반응시 다수 발달적으로- 및 부위-적절한 세포 유형으로의 분화, 및 숙주 선조세포 및 이들의 후대세포를 사용한 비-파열성, 비-종양원성 산재를 포함하는 정상적인 발달 국면에 관여할 수 있다. 인간 NSC는 이러한 산재된 위치에서 외부 이식유전자를 생체내 발현할 수 있다. 따라서, 이들 세포는 SMA의 치료시 사용된다.
참조문헌으로서 포함
본원에 인용된 특허, 발표된 특허원, 및 비-특허 참고문헌 각각은 이들의 전문이 참고로 포함된다.
등가물
당해 분야의 숙련가는 통상적인 실험 만을 사용하여, 본원에 기술된 발명의 특수한 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 다음의 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (71)

  1. 보체 경로의 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 척수 근 위축증(SMA)을 예방하거나, SMA로 진행되는 위험을 감소시키거나, SMA를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 억제제가 항체인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 항체가 항-C1q 항체인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 항-C1q 항체가 C1q와 자가항체 사이 또는 C1q와 C1r의 사이, 또는 C1q과 C1s 사이의 상호작용을 억제하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 항-C1q 항체가 순환계 또는 조직으로부터 C1q의 제거(clearance)를 촉진시키는 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 100 nM 내지 0.005 nM 또는 0.005 nM 미만의 범위인 해리 상수(dissociation constant, KD)를 갖는 항-C1q 항체인 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 20:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론(binding stoichiometry)으로 C1q와 결합하는 항-C1q 항체인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 항체가 6:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론으로 C1q에 결합하는 항-C1q 항체인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 항체가 2.5:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론으로 C1q에 결합하는 항-C1q 항체인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 항체가 항-C1r 항체인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 항-C1r 항체가 C1r과 C1q 사이, 또는 C1r과 C1s 사이의 상호작용을 억제하거나, 항-C1r 항체가 C1r의 촉매 활성을 억제하거나 활성 프로테아제에 대한 프로-C1r의 프로세싱을 억제하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 항체가 100 nM 내지 0.005 nM 또는 0.005 nM 미만의 범위인 해리 상수(KD)를 갖는 항-C1r 항체인 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 20:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론으로 C1r과 결합하는 항-C1r 항체인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 항체가 6:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론으로 C1r에 결합하는 항-C1r 항체인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항체가 2.5:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론으로 C1r에 결합하는 항-C1r 항체인 방법.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항-C1r 항체가 순환계 또는 조직으로부터 C1r의 제거를 촉진하는 방법.
  17. 제2항에 있어서, 항체가 항-Cls 항체인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 항-C1s 항체가 C1s과 C1q 사이 또는 C1s과 C1r 사이 또는 C1s와 C2 또는 C4 사이의 상호작용을 억제하거나, 항-C1s 항체가 C1s의 촉매 활성을 억제하거나 활성 프로테아제에 대한 프로-C1s의 프로세싱을 억제하는 방법.
  19. 제17항 또는 제19항에 있어서, 항체가 100 nM 내지 0.005 nM 또는 0.005 nM 미만의 범위인 해리 상수(KD)를 갖는 항-C1s 항체인 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 20:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론으로 C1s와 결합하는 항-C1s 항체인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 항체가 6:1 또는 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론으로 C1s에 결합하는 항-C1s 항체인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 항체가 2.5:1 내지 1.0:1 또는 1.0:1 미만의 범위인 결합 화학량론으로 C1s에 결합하는 항-C1s 항체인 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항-C1s 항체가 순환계 또는 조직으로부터 C1s의 제거를 촉진하는 방법.
  24. 항체가 C1q에 특이적으로 결합하여 이의 생물학적 활성을 중화시키는 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체.
  25. 제24항에 있어서, 생물학적 활성이 (1) 자가항체에 대한 C1q 결합, (2) C1r에 대한 C1q 결합, (3) C1s에 대한 C1q 결합, (4) 포스파티딜세린에 대한 C1q 결합, (5) 펜트락신-3에 대한 C1q 결합, (6) C-반응성 단백질(CRP)에 대한 C1q 결합, (7) 구형의 C1q 수용체(gC1qR)에 대한 C1q 결합, (8) 보체 수용체 1(CR1)에 대한 C1q 결합, (9) 베타-아밀로이드에 대한 C1q 결합, (10) 칼레티쿨린에 대한 C1q 결합, (11) 세포자멸사 세포에 대한 C1q 결합, 또는 (12) 신경 세포 막의 성분에 대한 C1q 결합인 항체.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 생물학적 활성이 (1) 전통적인 보체 활성화 경로의 활성화, (2) 항체 및 보체 의존성 세포독성의 활성화, (3) CH50 용혈, (4) 시냅스 손실, (5) B-세포 항체 생산, (6) 수지 세포 성숙, (7) T-세포 증식, (8) 사이토킨 생산, (9) 미세아교세포 활성화, (10) 아더스 반응(Arthus reaction), (11) 시냅스 또는 신경 말단의 식세포작용, 또는 (12) 보체 수용체 3(CR3/C3) 발현 세포의 활성화인 항체.
  27. 제26항에 있어서, CH50 용혈작용이 인간, 마우스, 랫트, 개, 붉은털 원숭이(rhesus) 및/또는 시노몰구스 원숭이 CH50 용혈작용을 포함하는 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 항체가 CH50 용혈작용의 적어도 약 50%, 내지 적어도 약 95%를 중화할 수 있는 방법.
  29. 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 150 ng 미만, 100 ng 미만, 50 ng 미만, 또는 20 ng 미만의 용량에서 CH50 용혈작용의 적어도 50%를 중화할 수 있는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 이의 항체 단편인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항체가 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 디아보디, 또는 단일 쇄 항체 분자인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 표지 그룹에 커플링되는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 표지 그룹이 광 표지, 방사선동위원소, 방사성핵종, 효소 그룹, 바이오티닐 그룹, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 효소 또는 형광성 표지인 방법.
  34. 제2항에 있어서, 항체가 항-C1 복합체 항체이고, 임의로 여기서 항-C1 복합체 항체가 C1r 또는 C1s 활성화를 억제하거나 C2 또는 C4에 작용하는 이들의 능력을 방지하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 항-C1 복합체 항체가 C1 복합체내 조합 에피토프에 결합하고, 여기서 상기 조합 에피토프가 C1q 및 C1s 둘 다; C1q 및 C1r 둘 다; C1r 및 C1s 둘 다; 또는 C1q, C1r, 및 C1s 각각의 아미노산을 포함하는 방법.
  36. 제2항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 C4의 절단을 억제하고 C2의 절단을 억제하지 않는 방법.
  37. 제2항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 C2의 절단을 억제하고 C4의 절단을 억제하지 않는 방법.
  38. 제2항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 포유동물 C1q, C1r, 또는 C1s에 결합하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 항체가 인간 C1q, C1r, 또는 C1s에 결합하는 방법.
  40. 제2항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 포유동물 C1 복합체에 결합하는 방법.
  41. 제2항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 혈액 뇌 장벽을 횡단하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 항체가 치료학적 제제에 공유결합으로 연결되는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 치료학적 제제가 소염성 단백질, 신경치료제, 항-바이러스, 항-기생충, 항-세균, 내분비 약물, 대사 약물, 미토독소(mitotoxin), 화학치료요법 약물, 또는 siRNA를 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 신경치료제가 뇌 기원 신경영양 인자(BDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뉴트로핀-4/5, 섬유아세포 성장 인자(FGF)-2 및 다른 FGF, 뉴로트로핀(NT)-3, 에리트로포이에틴(EPO), 간세포 성장 인자(HGF), 상피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자(TGF)-a, TGF-β, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-lra), 섬모 향신경성 인자(CNTF), 신경교-기원한 신경영양 인자(GDNF), 뉴르투린(neurturin), 혈소판-기원 성장 인자(PDGF), 헤레굴린, 뉴레굴린, 아르테민, 페르세핀, 인터루킨, 과립구-콜로니 자극 인자(CSF), 과립구-대식세포-CSF, 네트린, 카디오트로핀-1, 헤지호그(hedgehogs), 백혈병 억제 인자(LIF), 미드킨, 플레이오트로핀, 골 형성 단백질(BMP), 사포신, 세마포린, 또는 줄기 세포 인자(SCF)로부터 선택된 뉴로트로핀인 방법.
  45. 제2항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 제1 및 제2 항원을 인식하는 이중특이적 항체인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 제2 항원이 트랜스페린 수용체(TR), 인슐린 수용체(HIR), 인슐린 성장 인자 수용체(IGFR), 저-밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 1 및 2(LPR-1 및 2), 디프테리아 독소 수용체, CRM197, 라마 단일 도메인 항체, TMEM 30(A), 단백질 형질도입 도메인, TAT, Syn-B, 페네트라틴, 폴리-아르기닌 펩타이드, 안지오펩 펩타이드, 또는 ANG1005인 방법.
  47. 제2항 내지 제43항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 항체를 투여함을 포함하여, 척수 근 위축증을 앓는 환자에게서 시냅스 손실을 억제하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 척수 근 위축증이 시냅스 손실 또는 손실 신경 연결과 관련된 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 척수 근 위축증이 보체 수용체 3(CR3)/C3 또는 보체 수용체 CR1에 의존성인 시냅스 손실과 관련된 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 척수 근 위축증이 병리학적 활성-의존성 시냅스 프루닝(pathological activity-dependent synaptic pruning)과 관련된 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 척수 근 위축증이 소교세포에 의한 시냅스 식세포작용과 관련된 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 약물을 공동으로 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 안티센스 약물이 인간 SMN1 또는 SMN2 프레-mRNA를 암호화하는 핵산에 대해 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 인간 SMN2 프레-mRNA를 암호화하는 핵산의 인트론 7에 대해 상보성인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 안티센스 약물이 누시네르센(nusinersen)인 방법.
  56. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 전통적인 보체 활성화 경로를 적어도 30% 내지 적어도 99.9%의 범위의 양까지 억제하는 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 C1q 결합에 의해 개시된 대안적 보체 활성화 경로를 억제하는 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 대안적 보체 활성화 경로를 적어도 30% 내지 적어도 99.9%의 범위의 양까지 억제하는 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 보체-의존성 세포-매개된 세포독성(complement-dependent cell mediated cytotoxicity, CDCC)을 억제하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 항체가 보체-의존성 세포 매개된 세포독성(CDCC) 활성화 경로를 적어도 30% 내지 적어도 99.9%의 범위의 양까지 억제하는 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 항체가 자가항체 및 보체-의존성 세포-매개된 세포독성(CDCC)을 억제하는 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 항-C1q 항체, 항-C1r 항체, 및 항-C1s 항체로부터 선택된 제2 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료학적 유효량의 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)의 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료학적 유효량의 전통적인 보체 활성화 경로의 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료학적 유효량의 대안적 보체 활성화 경로의 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료학적 유효량의 자가항체와 이의 상응하는 자가항원 사이의 상호작용의 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  67. (a) 항-C1q, 항-C1r, 또는 항-C1s 항체를 대상체에게 투여하는 단계로서, 여기서 항-C1q, 항-C1r, 또는 항-C1s 항체는 검출가능한 표지에 커플링되는 단계;
    (b) 검출가능한 표지를 검출하여 대상체내에서 C1q, C1r, 또는 C1s의 양 또는 위치를 측정하는 단계; 및
    (c) 하나 이상의 C1q, C1r, 또는 C1s의 양 또는 위치를 레퍼런스와 비교하는 단계로서, 여기서 척수 근 위축증으로 진행되는 위험은 하나 이상의 C1q, C1r, 또는 C1s의 양 또는 위치를 레퍼런스와 비교함을 기반으로 하는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는, 척수 근 위축증으로 진행되는 대상체의 위험을 측정하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 검출가능한 표지가 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 효소, 방사활성 동위원소, 바이오틴 또는 형광성 표지를 포함하는 방법.
  69. 제77항에 있어서, 검출가능한 표지가 x-선, CT, MRI, 초음파, PET 및 SPECT에 대한 영상화제를 사용하여 검출되는 방법.
  70. 제67항에 있어서, 형광성 표지가 플루오레세인, 로다민, 시아닌 염료 또는 BODIPY로부터 선택되는 방법.
  71. 제3항, 제10항, 및 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체, 및 척수 근 위축증을 치료하거나 예방하기 위해 항체를 사용하기 위한 지시사항을 포함하는 패키지 삽입물을 포함하는 키트(kit).
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