JPS62502235A - 組換えdna技術によってdna、rna、ペプタイド、ポリペプタイド、または蛋白質を取得するための方法 - Google Patents
組換えdna技術によってdna、rna、ペプタイド、ポリペプタイド、または蛋白質を取得するための方法Info
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- JPS62502235A JPS62502235A JP60502625A JP50262585A JPS62502235A JP S62502235 A JPS62502235 A JP S62502235A JP 60502625 A JP60502625 A JP 60502625A JP 50262585 A JP50262585 A JP 50262585A JP S62502235 A JPS62502235 A JP S62502235A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
組換えDNA技術によってDNA、RNA、ペプタイド。
ポリペブタイド、または蛋白質を取得するための方法本発明は、RNA、ペプチ
ド、ポリペプチドまたは蛋白質を発現することのできる遺伝子を含有する形質転
換された宿主細胞を用いて、つまり組換えDNA技術を利用して、DNA、RN
A、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を取得するための方法を、その目的対
象とするものである。
この発明は、特に、一応(in a fashion)次のことができるストキ
ャスティック遺伝子(stochastic gene)またはストキャスティ
ック遺伝子のフラグメントを製造することを目途とするものである:該遺伝子ま
たはその断片は、これらの遺伝子の転写または翻訳の後に、 (およそ少なくと
も10,000の)非常に数多くの全く新規な蛋白質を、これらの蛋白質を発現
(expressing) L/うるこれらの遺伝子をそれぞれ含有す存バクテ
リアまたは真核細胞からなる)宿主細胞の存在下で、同時に得ることができるも
のであり、しかる後に、該クローンの内どれが希望する性質を有する蛋白質を生
産するのかを決定する目的で、選択又はクリーニングを行うものである。該希望
する性質としては5例えば、構造的、酵素的、触媒的、抗原的、薬学的性質、ま
たはリガンドとしての性質(proper−ties of ligandin
g)があり、そして更に一般的には、化学的。
生化学的、生物学的その他の性質があるのである。
この発明は、また、利用できる性質、特に化学的、生化学的、または生物学的性
質、を有するDNAまたはRNA配列(gequence)を得る手法を、その
目的とするものである。
したがって、この発明が、科学、工学、及び医学の非常に数多くの分野において
、非常に数多くの応用に受け入れられることは、明白なことである。
この発明にしたがってペプタイドまたはポリペブタイドを製造するための方法は
、次の特徴を有するものである:少なくとも一部分は合成ストキャスティック
ポリヌクレオチドからなる遺伝子を、同じ培地中で同時に製造し;このようにし
て得られた遺伝子を宿主細胞内に導入し;ストキャスティック遺伝子をクローニ
ングしくalone)そしてこれらのストキャスティック遺伝子の各々によって
発現される蛋白質の製造が行われるよう、これらの遺伝子を含有する形質転換さ
れた宿主細胞の独立クローン(independent C1one)を同時に
培養し;希望する活性を少なくとも1つは有するペプタイドまたはポリペブタイ
ドを生産するこれらのクローンを確認する(identify)よう、形質転換
された宿主細胞のクローンの選択及び/又はスクリーニングを行い;しかる後に
、このようにして確認したクローンを単離し;そして、これらを培養して、該性
質を有する少なくとも1つのベプタイドまたはポリペブタイドを生産させるので
ある。
この方法を実施する第1の態様においては、ストキャスティック遺伝子は次のよ
うにして製造する。すなわち、はじめに直線状となした発現ベクターの2つの端
部からの4種類のデオキシホスホヌクレオチドA、 C,G、 Tのストキャス
ティック共重合によって;次いで、それらの3′末端が相補的であるところの2
つのストキャスティック配列(stochasticsequence)を有す
る発現ベクター1分子によって構成された、ストキャスティック第1DNA鎖(
stochastic first 5trandofDNA)を形成するよう
、コヘッシブーエンド(eohesiveend)を形成せしめ;ひき続いてス
トキャスティック第2DNA鎖を合成することによって、製造するのである。
この方法を実施するための第2の態様によれば、ストキャスティ°ツクDNA断
片を形成するよう、コヘツシブーエンドを有しないオリゴヌクレオチドの共重合
によって、続いて。
予じめ直線化した発現ベクターに該断片を連結することによって、ストキャステ
ィック遺伝子を製造するのである。
発現ベクター(expression vector)としては、プラスミド、
特に細菌プラスミドが使用できる。発現ベクターとしてPUC8プラスミドを使
用すると卓越した結果が得られる。
また発現ベクターとしては、ウィルスDNA、または、ウィルスDNAとプラス
ミドとのハイブリッドも使用することができる。
宿主細胞としては、)18101及びC600といった原核生物細胞。
または真核生物細胞が使用できる。
上述した第2の態様による方法を利用する場合には、1群の回帰性オクタマー(
palindromic octamer)を形成するオリゴヌクレオチドを利
用することができる。
次のグループからなる回帰性オクタマーを利用すれば、特に、良い結果が得られ
る:
5’ GGAATTCC3’
5’ GGTCGACC3’
5’ CAAGCTTG 3’
5’ CCATATGG 3’
5’ CATCGATG 3’
1群の回帰性ヘプタマー(heptamer)を形成するオリゴヌクレオチドを
使用することも可能である。
次のグループからなる回帰性ヘプタマーを利用すれば、非常に良い結果が得られ
る:
5’ XTCGCGA 3’
5’ XCTGCAG 3’
5’ RGGTACC3’
式中、X=A、 G、 C又はT
R=A又はT
これらの手法を利用する方法の内で特に有利な方法によれば、上述した手法によ
って得た形質転換された宿主細胞の独立クローンのカルチャーから、プラスミド
の形質転換性DNA (transfora+ing D N A )を分離、
精製し;次いで、この精製されたDNAは、少なくとも1つの制限酵素(res
trictionenzyme)で切断するが、この酵素は、回帰性オクタマー
またはヘプタマー中には存在するけれども使用した発現ベクター中には存在しな
い特異的酵素切断部位に、対応するものである;この切断処理の後に、制限酵素
を失活させ;このようにして得た直線化されたストキャスティックDNA断片の
総体(ensemble)を、T4DNA リガーゼを用いて同時に処理して、
新しいストキャスティック配列を含む新しいDNA総体を創製し、その結果、こ
の新しい総体は、当初の総体における遺伝子の数よりもより多い沢山のストキャ
スティック遺伝子を。
含むことができることになるのである。そこで、この新しい形質転換性DNAの
総体を、宿主細胞を形質転換しそしてこれらの遺伝子をクローニング(clon
e)するために、利用し;そして最後に、スクリーニング及び/又は選択処理を
利用して、形質転換された宿主細胞の新しいクローンを分離し、そして、これら
を培養して、少なくとも1つのベプタイドまたはポリペブタイド、例えば新しい
蛋白質を製造するのである。
宿主細胞のクローンを選択するときの基準として利用できる性質としては、与え
られたクローンから生産されたベプタイドまたはポリペブタイドが有するところ
の、与えられた化学反応を触媒する能力を挙げることができる。
例えば、いくつかのベプタイド及び/又はポリペブタイドの製造にあっては、上
記した性質としては、化学的化合物からなる最初のグループから目的とする最終
の1つの化合物にいたる一連の反応を触媒する能力(capacity)を、利
用することができる。
多数のベプタイド及びポリペブタイドから構成される総体を再帰的自触反応によ
って(reflexively autocataLytic)製造する目的の
場合は、該性質としては、適宜な培地中で上記総体をアミノ酸及び/又はオリゴ
ペプタイドから合成する際、それを触媒する能力を挙げることができる。
また、該性質としては、与えられた化合物の生物学的又は化学的諸性質を選択的
に修飾する(modify)能力、例えばポリペブタイドの触媒活性を選択的に
修飾する能力、を利用することもできる。
また、該性質としては1例えばホルモン、神経伝播体、ゆ着因子、成長因子、及
び、DNAの複製の特異的レギュレータ及び/又はRNAの転写及び/又は翻訳
の特異的レギーユレータの中から選ばれる少なくとも1つの生物学的活性化合物
が有する少なくとも1つの生物学的機能を、刺激し、阻害し。
または修飾する能力、を利用することもできる。
また、該性質としては、ペプタイドまたはポリペブタイドが与えられたリガンド
(ligand)と結合する能力、を利用することもできる。
この発明は、また、上記した方法で得たベプタイドまたはポリペブタイドを、リ
ガンドの検出及び/又は滴定のために使用することも、その目的対象とするもの
である。
この発明を実施するための特に有利な態様によれば、形質転換された宿主細胞(
host cell)のクローンを選ぶ基準(criterion)は、これら
のベブタイドまたはポリペブタイドが有するところの1例えば蛋白質といった生
物学的活性分子の効果をシミュレートしたり修飾したりする能力であり、そして
、この性質を有するペプタイドまたはポリペブタイドの少なくとも1つを生産す
る形質転換された宿主細胞のクローンを、次のようにして、スクリーニングし及
び/又は選択する。:すなわち、この活性分子に対する抗体を調製し;次に。
これらの抗体を精製した後、このペプタイドまたはポリペブタイドを含有するク
ローンを確認する(identify)するのにこれらの抗体を利用し;次いで
、このようにして確認したクローンを培養し、これらのクローンによって生成さ
れたベプタイドまたはポリペブタイドを分離、精製し:そして最後に、ベプタイ
ドまたはポリペブタイドをin vitroアッセイにかけて、それが該分子の
効果をシミュレートしたり(simulate)または修飾したりする能力(c
apacity)を有することを確かめるのである。
この発明に係る方法を実施するための他の態様によれば、選択の基準にして役立
つ性質としては、与えられた抗原のエピトープ(apitopes)の内の1つ
に類似したエピトープを少なくとも1つ有するか否かという点である。
利用される。
特に、該抗原がEGFの場合には、この発明によれば、上皮腫の化学療法的処置
に有用なポリペプチドを得ることができる。
この方法の変形によれば、DNAハイブリッドの天然の部分によって発現される
蛋白質に対応する抗体に対する親和クロマトグラフィによって、希望する性質を
有するペプタイドまたはポリペブタイドを生成する形質転換宿主細胞のクローン
を、確認しそして単離する。
例えば、ハイブリッドDNAの天然の部分がβ−ガラクトシダーゼ発現遺伝子を
含んでいる場合には、抗−β−ガラクトシダーゼ抗体に対する親和クロマトグラ
フィによって、形質転換された宿主細胞の該クローンを、有利に確認しそしてこ
れを単離することができるのである。ハイブリッド ペプタイドまたはポリペブ
タイドの発現及び精製の後に、それらの新規な部分を分離しそして単離すればよ
いのである。
この発明は、また、ワクチンを調製するのに上述した方法を利用するのにも応用
される;その応用は次の特徴を有するものである。すなわち、病原剤(path
ogenic agent)に対する抗体を単離する1例えば、この病原剤に対
する抗体産生能を有する動物体内にこの病原剤を注入し、しかる後に生成される
抗体を単離し;そして、病原剤のエピトープの1つに類似した少なくとも1つの
エピトープを有する蛋白質を少なくとも1つ生成しうるクローンを確認するのに
、これら上記した抗体を使用し;これらのクローンに対応する形質転換宿主細胞
を培養して、これらの蛋白質を製造し;この蛋白質を細胞のクローンから単離、
精製し;そして、この蛋白質を、該病原剤に対するワクチンの製造のために、使
用するのである。
例えば、抗−)IVBワクチンを調製するためには、HVBウィルスのカプシド
蛋白質(capside protein)を少なくとも1つ抽出、精製し;H
VBウィルスのエピトープの1つに類似したエピトープを少なくとも1つ有する
この蛋白質に対する抗体を産生する能力を有する動物に、この蛋白質を注入し;
そして、この蛋白質を製造するよう、これらのクローンに対応する形質転換され
た宿主細胞のクローンを培養し;これらの細胞のクローンのカルチャー(cul
ture)から、該蛋白質を単離、精製し:そして、抗−)IVBワクチン製造
のために、この蛋白質を利用すればよいのである。
この発明に係る方法を実施する有利な態様によれば、宿主細胞は、バクテリアか
らなり、例えば、そのゲノムがβ−ガラクトシダーゼを発現する天然の遺伝子も
含まずまたEBG遺伝子も含まないようなエシェリヒア・コリ(Escheri
chiacoli)、すなわちZ−、E B G−E、coliから成る。形質
転換細胞は、培地中において、 Xgal及びインディケータ−IPTGの存在
下で、培養し、そしてβ−ガラクトシダーゼ機能が陽性の細胞を検出する;しか
る後に、大規模培養のために、形質転換DNAを宿主細胞の適宜なりローン内に
移入して(betransplanted) 、少なくとも1つのベプタイドま
たはポリペブタイドを製造するのである。
また、形質転換された宿主細胞を選択する基準として利用される性質としては、
これらのクローンの培養によって製造されたポリペブタイドまたは蛋白質が有す
るところの、与えられた化合物への結合能を、挙げることもできる。
この化合物は、特に、ペプタイド、ポリペブタイド及び蛋白質の中から、とりわ
け、DNAの転写活性(transcriptionactivity)を調節
する蛋白質の中から、有利に選ぶことができる。
他方、該化合物は、DNA及びRNA配列の中からも選ぶことができる。
またこの発明は1次のような蛋白質もその目的とするものである。すなわち、こ
れらの蛋白質とは、形質転換された宿主細胞のクローンを選択する判断基準とし
て利用される性質が、DNAの転写活性をコントロールする調整蛋白質(reg
ulatory protein)とこれらの蛋白質とが結合するμカ、さもな
くば(or else) D N A及びRNA配列とこれらの蛋白質が結合す
る能力、から構成される場合に得られる蛋白質をいうのである。
更にまた、この発明は、上述した第1番目の特定ケースにおいて得た蛋白質を、
隣接DNA配列の複製又は転写をコントロールするcis調整配列として利用す
ることも、その目的としている。
他方、また、この発明の目途としては、既述した第2番目のケースにおいて得た
蛋白質の利用も包含されるものであるが、該利用とは、DNAのある配列を、こ
のDNA配列を含有しこの蛋白質を発現する細胞内で、転写し又は複製する性質
を修飾するために、該蛋白質を利用することをいうのである。
また、この発明は、DNAの製造方法もその目的対象とするものであって、この
方法は、少なくとも1部分はストキャスティック合成ポリヌクレオチドから成る
遺伝子を、同−培地内で同時に生産することによって特徴づけられるものであり
、次の点を特徴とするものである。すなわち、このようにして得られた遺伝子を
宿主細胞内に導入して、形質転換された宿主細胞の総体(ensemble)を
生成せしめ;この総体にスクリーニング及び/又は選択処理を行って、少なくと
も1つの希望する性質を有するストキャスティックDNA配列(stochas
tic 5equence of D N A)をそれらのゲノム中に含有する
宿主細胞を、確認し:そして最後に、このようにして確認した宿主細胞のクロー
ンからDNAを単離するのである。
更にまた。この発明は、RNAを製造するための手法もその目的対象とするもの
であって、この手法(procedure)は、少なくともその1部分はストキ
ャスティック合成ポリヌクレオチドから成る遺伝子を、同−培地内で同時に生産
することによって特徴づけられるものであり、次の点を特徴とするものである。
すなわち、このようにして得た遺伝子を宿主細胞内に導入して、形質転換された
宿主細胞の総体を生成せしめ;このようにして製造した宿主細胞を同時に培養し
、そして、希望する性質を少なくとも1つ有するストキャスティックRNA配列
を含有する宿主細胞を確認するように、この総体のスクリーニング及び/又は選
別を行い;そして、このようにして確認した宿主細胞から、RNAを単離するの
である。該性質としては1例えばペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質であって
もよいところの、与えられた化合物に対する結合能であってもよいし、また、与
えられた化学反応の触媒能であってもよいし、また、転移RNAとなり得る能力
であってもよい。
さて次に、実施例を挙げながら、本発明に係る方法を更に詳細に、そしてまたそ
の応用についても記述するが、本発明はこれらの実施例のみに飯定されるもので
はない。
先ず最初に、ストキャスティック遺伝子(stochastic gens)の
合成を行い、そして、形質転換されたバクテリアのクローンを製造するために、
バクテリア内にこれらの遺伝子を導入するのに特に有用な手法について、記述す
ることにする。
■) 現ベクター上の直接合成
a)ベクターの直線化
pUc8発現ベクター 30マイクログラム、すなわち約1013分子について
、適宜な標準バッファー 300Q中でPst I制限酵素100ユニットを用
いて37℃で2時間これをインキニーベートして、該ベクターを直線化する。こ
の直線化されたベクター(linearized vector)は、フェノー
ル−クロロホルムで処理し、次いでエタノール中に沈澱せしめ、30Qの容積中
に取り上げ、そして、標準TEBバッファー中0.8%アガロースゲル上に負荷
する(loaded) 、 3 V/■の場で3時間移動せしめた後、直線化さ
れたベクターを電気的に溶出しくelectro−eluted)、エタノール
中で沈澱させ、そして水30Q中にとり上げる。
b)酵素ターミナル トランスフェラーゼ(TdT)を用いるストキャスティッ
ク合成
dGTP 1mM、dCTP 1mM、dTTP 0.3mM及びdATP 1
mMの存在下、適宜なバッファー300Q中で、直線化されたベクター30ug
をTdT30ユニットと37℃で2時間反応させる。対応するメツセンジャーR
NA中における“終止″コドンの頻度を減少せしめるために、低濃度のdTTP
を選択する。他のデスオキシヌクレオチド トリホスフェートよりもより低い濃
度のdATPを使用すれば、いく分好ましくはないけれども、これと同様の結果
を得ることができる。続いて、この反応工程中にアリフォート(aliquot
es)を採取してそのゲルについて分析を行いつつ、pst1部位の3′末端上
での重合を進行させる。
3′末端当り添加したヌクレオチドの平均値が300に達するか又はそれをこえ
たときに9反応を終止し、そして、示差沈澱によってまたはBiogel P2
Oといった分子篩を有するカラムを通過させることによって、遊離のヌクレオチ
ドをポリマーから分離する。エタノール中で沈澱させて濃縮した後、ポリマーを
更にTdTを用いて重合させるが、その場合、最初はdATPの存在下、次にd
TTPの存在下で重合を行う。これら最後の2つの反応は、ゲル上で濾過するこ
とによって分離しそして短時間(30秒〜3分)行うが、それは、ポリマーの3
′末端に順次1O−3OAを加え次いで1O−30Tを加えるためであC)第2
のストキャスティックDNA鎖の合成上記した操作終了時には、ベクターの各分
子は、それぞれ、2つのストキャスティック配列を持っているが、該配列の3′
末端は相補的になっている。このポリマー混合物は、しかる後に、相補的末端が
ハイブリッド化(hybridization)するのに都合の良い条件で、イ
ンキニーベートする(150mM NaCQ。
10mM Tris−1(Cf1. pH7,6,1mM EDTA、65℃で
10分間、ひき続き1時間当り3〜4℃の割合で温度を下げながら22℃にまで
もっていく。そこで、ハイブリッド化したポリマーは、4つのヌクレオチド ト
リホスフェートの存在下(200mM)、40℃で2時間の間、ポリメラーゼ1
の大きなフラグメント(Klenov)60ユニツトと反応させる。この工程で
、ハイブリッド ポリマーの3′端部からの第2鎖の合成が完了する。しかる後
に、線状化されたベクターから出発したこの直接合成の結果得られる分子は、適
格細胞(co+npetent cell)を形質転換するのに用いるのである
。
d)適格クローンの形質転換
CaCQx6mM、Tris−HCQ 6+sM、 pH81MgCQ、6+a
Mの存在下、濃度1010cells/ml)のC600の適格HBIOI 1
00〜200mQを、 (上記で得た)ストキャスティックDNA調製物ととも
に、0℃で30分間インキニーベートする。この混合物に対して、37℃。
3分間の温度ショックを与えた後、抗生物質を含まないNZY培地を400〜8
00i添加する。形質転換されたカルチャーは、37℃で60分間インキニーベ
ートした後、アンピシリンを40μg/mQ含有するNZY培地を添加して10
12に希釈する。37℃で3−5時間インキニーベートした後、増殖した(am
plified)カルチャーを遠心分離し、そして、形質転換細胞のペレットを
ライオファイルし、−70℃で貯蔵する。このようなカルチャーは独立形質転換
株(independent transformant)を3×10’〜10
″含有しており、またこれらの独立形質転換株は、発現ベクター内に挿入された
ユニーク(unique)ストキャスティック遺伝子を、それぞれ1個含有して
いる。
この手法は次の事実に基礎をおくものである。その事実とは、慎重に選んだ回帰
性オリゴヌクレオチドを重合することにより、ストキャスティック遺伝子の構築
ができることであり、該遺伝子は、6個の可能な解読フレーム(reading
flame)のいずれにおいても“終止”コドンを含むものではなく、声た一
方、すべてのアミノ酸を特定化するトリプレットのバランスのとれた表現を確実
にするものである。更にまた、結果として得られる蛋白質において、シーケンス
モチーフ(sequence motif)の反復を避けるために、オリゴヌ
クレオチドは、3の倍数ではない数の塩基を含むことができる。以下に述べる実
施例は、これらの基準を満たすところの可能性のある結合の内の1つの使用を、
記述したものである:a)オクタマーグループの選定
該オリゴヌクレオチドのグループは次式で示され:5’ GGAATTCC3’
5’ GGTCGACC3’
5’ CAAGCTTG 3’
5’ CCATATGG 3’
5’ CATCGATG 3’
5つの回帰体(palindrome) (このように自己相補性配列)からな
るものであって、これは、ストキャスティック重合が、“終止″コドンを全く発
生させないこと、そしてまたすべてのアミノ酸を特定すること、を容易に確認さ
せるものである。
どのような″終始(stop)”コドンも発生させることがなく且つポリペブタ
イド中に発見されるアミノ酸をすべて特定化するような1回帰性オクタマーのグ
ループであれば上記以外のものも使用できることは明白である。また、2本鎖D
NAを形成する相補体(complement)が同じく使用されるという条件
の下であれば、オクタマーの非回帰性グループであってもまたその他のオリゴマ
ーであっても、これらのものも使用できることは明らかである。
b) オクタマーのグループからストキャスティック遺伝子のアセンブリー
ATPlmM、ポリエチレングリコール10%、及びT4DNAリガーゼ100
ユニットを含有する適宜なバッファー100uQ中で、上述したオリゴヌクレオ
チド(常法にしたがって予じめ5′の位置でリン酸化しておく)の各々5μgを
含有する混合物を、13℃で6時間反応させる。この工程は、2本鎖状態でしか
もコヘツシブーエンドを有しないオリゴマーのストキャスティック重合を行うも
のである。その結果得られたポリマーは、モレキュラーシーブ(Biogel
P2O)を通して単離し、20〜lOOオリゴマーを有するものを回収する。濃
縮した後、このフラクションを、上述した条件のもとで、再度T4DNAリガー
竹1モロH62−502235(8)
ゼによる触媒及び重合処理にかける。しかる後に、上述したようにして、少なく
とも100オリゴマーがアセンブルした(assembled)ポリマーを単離
する。
C)宿主プラスミドの調整
上述したようにして、適宜なバッファー中で、Sma I酵素によってpUc8
発現ベクターを線状化する。このSMalによって線状化されたベクターは、コ
ヘッシブーエンドを有してはいない。したがって、この直線化ベクターは、仔牛
の腸がら得たアルカリホスファターゼ(CIP)を用いて、つまり適宜なバッフ
ァー中においてベクター1マイクログラム当り該酵素1ユニツトのレベルで、3
7℃で30分間処理する。しかる後に。
このCIP酵素は、フェノール−クロロホルムを用いて連続2回の抽出を行って
、これを失活させる。直線化され脱リン酸された(dephosphoryla
ted)ベクターは、エタノール中で沈澱させ、次いで1 mg/mQでり水中
で再溶解させる。
d) ストキャスティック遺伝子のベクターへの連結ベクターとポリマーとを等
モル量ずつ混合し、これを、T4 DNA リガーゼ1000ユニツト、ATP
1mM%ポリエチレングリコール10%の存在下、適宜なバッファー中におい
て13℃で12時間インキニーベートする。この工程によって、ストキャスティ
ック ポリマーが発現ベクター内に連結されて。
2本鎖の環状分子が形成される。したがって、この分子は形質転換することが可
能である。
格クローンの形 転
適格クローンの形質転換は、先述した方法にしたがって実施する。
■)ヘプタマーのグループを ・と るストキャスティック′ −のアセンブリ
ー
る、つまりこの手法は、同一のモチーフをより少ない数だけ有するストキャステ
ィック配列の代りに、可変性(variable)コヘッシブーエンドを有する
回帰性ヘプタマー(palindromicheptamer)を利用するもの
である。
a)ヘプタマーのグループの選定
例えば、次に示す3つの回帰性ヘプタマーを利用することができる:
5’ XTCGCGA 3’
5’ XCTGCAG 3’
5’ RGGTACC3’
式中、 X=A、 G、 C又はT
R=A又はT
ここにおいて、重合化の際に“終止″コドンを発生することは全くなく、そして
、すべてのアミノ酸を特定するトリプレットは生成するものである。これらと同
一の条件を満たすものであれば、上記以外のヘプタマーグループを用いることが
できるのは明白なことである。
b)ヘプタマーのグループの重合
この重合処理は、オクタマーについて上述したのと全く同じ方法で実施する。
C) コヘッシブ端部の除去
このようにして得たポリマーは、その2つの5′末端に1つの対になっていない
塩基を有している。したがって、対応する3′末端に相補的な塩基を加えてやる
必要がでてくる。これは次のようにして行う:2重鎖ポリマー(double
5trandedpoly+wer) 10マイクログラムを、4つのデオキシ
ヌクレオチド−ホスフェート(200mM) 100 it flの存在下、K
lenow酵素 10ユニツトと、4℃で60分間反応させる。フェノールクロ
ロホルム抽出によって酵素を失活せしめ、示差沈澱によって、ポリマーから遊離
のヌクレオチド残渣を洗い落す。次いで、上述した手法によって、このポリマー
を(予じめ直線化し脱リン酸しておいた)宿主プラスミドに連結するのである。
次の点に注目すべきである。すなわち、既述したこれら最後の2つの手法は回帰
性オクタマーまたはヘプタマーを利用するものであるが、これらはある制限酵素
の特異的部位を構成するものである。大低の場合、pUc8発現ベクターからは
これらの部位は消失している。したがって、次のような処理をすることによって
、ストキャスティック遺伝子の最初の調製物の複雑性を相当高くすることができ
る:上述した最後の2つの手法の内の1つによって得た107の独立形質転換株
のカルチャーから誘導したプラスミドDNAを、単離する。このDNAを精製し
た後、これをCQa I制限酵素(手法■)又はPst■制限酵素(手法■)を
用いて、部分的に消化する。酵素失活後1部分消化されたDNAはT4 DNA
リガーゼで処理するが、これは、最初の配列の基本的な性質は保持する一方で
、非常に数多くの新規配列を創造する効果を有するものである。そこで、この新
規なストキャスティック配列の総体は。
コンピテント細胞を形質転換するのに使用できるのである。
また1手法■及び■によってクローン化された(cloned)ストキャスティ
ック遺伝子は、クローニングベクターに属しそしてストキャスティックDNA配
列内には表現されない制限部位を利用することによって、pUc8発現ベクター
から無傷のまま切り出すことができるのである。
丁度述べたばかりの2つの手法によって発生するストキャスティック遺伝子内で
の組換えは、反復的分子モチーフ(recurrent molecular
motif)による内部相同(internalho+nology)の結果生
じるものであるが、この組換えは、in叶二でコード連鎖(coding 5e
quence)の突然変異生成を達成するためのもう1つの重要な方法である。
その結果、新しい遺伝子の数を増加させることとなり、これらの遺伝子は検査す
ることができるものである。
最後に、新しい合成遺伝子を発生させるためのすべての手法について、in v
ivo又はin vitroで遺伝子を修飾するための共通の技術を利用するこ
とができる。この共通の技術は。
数多く存在し、例えば、解読フレームの変更、プロモータに対する配列の逆転、
点突然変異、1又はいくつかのサプレッサ転移RNAを発現する宿主細胞の利用
が挙げられる。
上述したことを考慮すると、次のことが明白になる。つまり、ヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドを酵素重合すれば、極めて多数の(例えば10億以上の)
各種遺伝子をin vitr。
で構築することができるのである。この重合化は、確率的に(in a 5to
chastic +mannar)実施され、それは1反応混合物中に存在する
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのそれぞれの濃度によって決定されるも
のである。
上で指示したように、2つの方法は、このような遺伝子(又はコード化配列)を
クローニングするのに利用することができる:重合は、予じめ直線化したクロー
ニング発現ベクターに対して直接行うか;または、遂次重合をすすめ2次いでポ
リマーを発現ベクターに連結することもできる。
これら2つのケースにおいて、次の工程は、適格バクテリア細胞(又はカルチャ
ー内の細胞)−の形質転換又はトランスフェクション(transfectio
n)である、この工程は、生細胞内でストキャスティック遺伝子をクローニング
することから成り、生細胞中で遺伝子が不定的に増殖し発現するのである。
上述した手法のほかに、ストキャスティック配列の合成に適当な方法であれば他
の方法をすべて使用することが、明らかにうまくいくものである。特に、化学合
成によって得たDNA又はRNAの1本鎖オリゴマーを、生化学的手段によって
重合し1次いで、このような遺伝子をクローニングするために、2本鎖DNA(
cDNA)を発生せしめるのに確立された手法によって、これらのDNA又はR
NAセグメントを処理することができる。
ノ 転換された 土納 のクローンのスクリーニングまたは選択
本発明に係る手法における次なる工程は、選択又はスクリーニングによって、形
質転換又はトランスフェクションを受けた細胞を調査することから成るものであ
り、この調査の目的は、細胞が有する形質転換又はトランスフェクションDNA
が、希望する性質を有する転写製品(RN A)又は翻訳製品(蛋白質)の合成
につながっていく、そのような細胞を1個又は数個単離すること、である、これ
らの性質としては、例えば、酵素的、機能的、又は構造的なものを挙げることが
できる。
本発明に係る方法において、最も重要な面の1つは、この方法によって、有用な
生産物(RNA又は蛋白質)を同時にスクリーニングまたは選択できることであ
り、そしてまた、該生産物を生産する遺伝子が得られることである。また、既述
したようにして合成されクローン化されたDNAは、それ自体が生産物となり有
用な生化学的性質を有するところのDNA配列を単離するために、選択又はスク
リーニングすることができる。
さて次に、工業的又は医学的応用の見地からして、新規な蛋白質が重大な関心事
となるような形質転換細胞にあって。
目的とするクローンをスクリーニングまたは選択するための好適な手法を以下に
述べることにするが、本発明はこの例に限定されるものではない。
これらの手法の内の1つは次のような思想によるものである:すなわち、ある蛋
白質、又は、生化学的若しくは医学的に興味のある他のタイプの分子であって、
ただし、該分子は免疫原性を有しているか(immunogenic)あるいは
既に免疫原性化されているものであるが、この蛋白又は分子に対するポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体を、確立された技術によって製造又は取得し;し
かる後に、ストキャスティック遺伝子によって形質転換された非常に多数のクロ
ーンの中から、その蛋白質が上記した抗体と反応するクローンを確認するため、
これらの抗体をプローブ(probe)として使用するものである。この反応は
、ストキャスティック遺伝子によって合成されたポリペブタイドと最初の分子と
の間に存する構造的相同(straetural ho+mology)、の結
果である。このようにして、最初の分子上で抗原決定基(antigenic
determinant)又はエピトープとして行動する新規蛋白質を数多く単
離することができる。このような新規蛋白質は、最初の分子の効果を容易にシミ
ュレートし、刺激し、炭調し、又はブロックしうるものである。この選択又はス
クリーニング手段が、それ自体、非常に多くの薬学的及び生化学的手段を有し得
ることは、明らかである。具体的な例において、この操作の第1の態様を以下に
説明することとするが、この例のみに限定されるものではない:EGF(表皮成
長因子)は、血液中に存在する小さな蛋白質であって、その役割は、上皮細胞を
刺激することにある。その効果は、上皮細胞の膜内に位置する特異的レセプタと
EGFとの間の相互作用によって、得られるものである。EGFの免疫原性を高
めるためにKLH(カギアナ カサガイのヘモシアニン)に結合したEGFを動
物に注入することによって、EGFに対する抗体を調製する0例えば、EGF又
はEGF断片に相当する合成ペプタイドをリガンドとしたアフィニティカラムを
通すことによって、免疫化した動物の抗−EGF抗体を精製する。そして、この
精製された抗−EGF抗体は、クロロホルムで融解せしめた(lysed)多数
の細菌クローンを固体支持体上でスクリーニングするたストキャスティック ペ
プタイドまたは蛋白質と結合するのであるが、該ペプタイドまたは蛋白質が有す
るエピトープは、最初の抗原のそれに類似のものである。該固体支持体を放射活
性を有するプロティンA又は放射活性を有する抗−抗体とインキニーベートした
後、オートラジオグラフィ処理することによって、上記したようなペプタイドま
たは蛋白質を含有するクローンが明らかにされる。
これらの工程は、このようなりローン、すなわちその各々が、スクリーニング抗
体と反応する蛋白質(及びその遺伝子)を1つ含有しているようなりローンを、
確認するものである。
非常に数多くのバクテリア細胞のコロニーまたはウィルスのプラーク(例えば約
1,000,000)内でのスクリーニングを、うま〈実施することができるし
、また、例えば約1ナノグラムといった極微量の蛋白製品をうまく検出すること
ができる。
しかる後に、これら確認したクローンを培養し、そして検出した蛋白質を常法に
よって精製する。これらの蛋白質は、上皮細胞カルチャー中in vitroで
テストを行い、これらの蛋白質が該カルチャー内でEGFの効果を阻害し、シミ
ュレートし、又は変調する(modulate)か否かを決定する。このように
して得た蛋白質の内のいくつかのものは、上皮腫の化学療法的処置のために用い
ることができる。このようにして得た蛋白質の活性は、既述したのと類似の方法
にしたがい、蛋白質をコード化するDNAを突然変異することによって、これを
改良することができる。この手法の変形の1つとしては、ワクチンとして使用す
ることができるこれらのストキャスティック ペプタイド、ポリペブタイド、ま
たは蛋白質を精製することが挙げられるが、その目的は、一般的には、病原剤に
対する免疫性を付与したり、または、免疫システムに対して別の効果を与えたり
すること、例えば、与えられた抗原に関して、この抗原に対する抗体とこれらの
ベプタイド、ポリペブタイドまたは蛋白質を結合させることによって、この抗原
に対する耐性を付与したりあるいは過感作性を軽減したりすること、である、こ
のようなペプタイド、ポリペブタイドまたは蛋白質は、in vivoのみでな
く in vitroでも使用できることは明らかである。
更に正確には、与えられた抗原Xに対する抗体と反応する新規な蛋白質からなる
総体(ensemble)において、その各々は、Xに共通したエピトープを少
なくとも1つ有するものであり。
したがって、この総体は、Xに共通したエピトープの総体を有することになる。
このため、総体又は亜−総体(sub−ensemble)を、Xに対する抗原
性を付与するためのワクチンとして使用することができるのである6例えば、B
型肝炎ウィルスの1つ又はいくつかのカプシド蛋白質の精製を容易に行うことが
できる。そこで、これらの蛋白質は、例えばラビットといった動物内に注入する
ことができるようになり、そして、最初の抗原に対応する抗体を、親和カラム精
製によって回収することができる。これらの抗体は、上述したように。
最初の抗原のエピトープの少なくとも1つに類似したエピトープを1つ有する蛋
白質を少なくとも1つ産生ずるクローンを、確認する(indantify)の
に使用してもよい、精製した後、B型肝炎に対する防御の目的で、これらの蛋白
質を(単独又は併用して)抗原として使用する。ワクチンの最終製品は、更に、
最初の病原剤にアクセスする必要がないのである。
上記手法の記述において、選択(selection)又はスクリーニングを行
うための手段を数多く述べてきた点に注目されたい、これらの手法は、すべて、
形質転換クローンからの特定蛋白質を精製することを必要としているようである
。これら蛋白質の精製は、確立された手法で行うことができ、特に、ゲルクロマ
トグラフィー、イオン交換によるもの、及び親和クロマトグラフィーによる技術
を利用することができる。また、ストキャスティック遺伝子によって産生された
蛋白質は、例えばβ−ガラクトシダーゼ酵素配列を有するハイブリッド蛋白質の
形でクローニングされ得るものである。この酵素は。
抗−β−ガラクトシダーゼ抗体に対する親和クロマトグラフィーにかけることが
でき、続いてハイブリッド部分を切断(cleavage) して、(つまり、
ハイブリッド蛋白質のバクテリアの部分と新規な部分とを分離するものである。
ペプタイドまたはポリペブタイドが有する特異的反応に対する触媒能を検出する
ことに基礎をおくところの、第2のスクリーニングまたは選択方法にしたがって
、ベプタイドまたはポリペブタイド及び対応する遺伝子を選択するための原理と
手法とを、以下に記述することにする。
通常の場合、これは酵素β−ガラクトシダーゼ(β−gaQ)によって果される
機能であるが、ラクトースの切断を触媒することができるところの、蛋白質とい
う特定のケースにおけるスクリーニングまたは選択について、これを具体的に以
下に記述するが、この例に限定されるものではない。
上述したように2本法の第1工程は発現ベクターの非常に大きな総体を生成せし
めることにあり、その各々はそれぞれ異なった新規蛋白質を発現するものである
。具体的には1例えば、Pst I制限部位にDNAのストキャスティック配列
をクローニングしたpUc8発現ベクターを1選んでもよいのである1次に、こ
のようにして得たプラスミドをE、coliのクローン(clone)内に導入
するが、ただしそのクローンは、β−ガラクトシダーゼ、Zに対する天然の遺伝
子及び第1の遺伝子とは関係がないけれどもβ−ga12機能に対して突然変異
をひき起す可能性がある第2の遺伝子EBGの双方を、既知の遺伝子技術によっ
て、ゲノムから既に除去しておいたものである。
このような宿主細胞(Z−、EBGつは、それ自体では、ラクトースの加水分解
を触媒することができず、その結果、生長用炭素源としてラクトースを使用する
ことはできない、このため、β−gaQ機能をスクリーニングまたは選択するの
に、このような宿主クローンを利用することができることになるのである。
新規なβ−gaQ機能発現遺伝子を有する、形質転換されたEcoliクローン
を分析するための便利な生物学的アッセイは。
先に述べた形質転換バクテリアを、培地中にX −gaQを含有するペトリ皿の
中で培養することから成る。この場合、β−gaQ機能を発現する細菌コロニー
は、すべて、青いコロニーとなって可視化される。このような生物学的アッセイ
を用いると、弱い触媒活性でさえも検知することができる。この特徴的酵素の特
異的活性は、1秒当り10〜io、ooo生産物分子に亘っている。
ストキャスティック遺伝子によって合成された蛋白質は、100秒当り約1分子
というように特異的活性(Specificactivity)が弱いことを考
慮に入れると、このような触媒活性の検知を可能にするという課題が依然として
残っている。
培地中にX −ga12を含有したペトリ皿内で、そして非代謝性インデューサ
であるIPIG (イソプロピル−D−チオガラクトシド)の存在下において、
青い領域を可視化するに当っては、1平方ミリ当り約to”〜101i分子のX
−gaαを切断する必要がある。
弱い酵素を発現しそして表面積1圓2を占める細菌コロニーは、その細胞数が1
07〜101である。もしも各細胞が弱い酵素をわずか1コピーしか有しないの
であれば、各細胞は、検地すべきX−gaQの10,000〜100の切断を触
媒することが必要となるであろうし、それには2.7〜270時間を要すること
になるであろう1選択された条件の下では、細胞当りの各プラスミドのコピー数
を5〜20コピー/細胞にまで増幅でき(amplify)更には100又は1
000にまでも増幅することができるようになるし。
また、細胞の蛋白質の10%までは新規遺伝子によって特定することができるの
で、活性の弱い酵素が細胞当り100分子の場合には、青いコロニーを検知する
のに必要な時間は、約0.27〜2.7時間となる。
これらの事実の結果として、各コロニーがそれぞれ異なった新規遺伝子を発現し
そしてその選択基準としてβ−gaff機能発現能を利用するような、非常に数
多くの独立細菌コロニーのスクリーニングが、充分にうまく行われることになる
のである。直径10国のペトリ皿1個中に約2000コロニーが存在しても、こ
れらのスクリーニングが可能なのである。このようにして、X−gaQ寒天シー
ト1平方メートル上で、約2000万コロニーをスクリーニングすることができ
るのである。
X gaQベトリ皿上で青色を呈するバクテリアコロニーがあっても、これが偽
陽性である場合があるので、その点に留意すべきである。その原因は、バクテリ
アゲノム中に突然変異が起ってラクトース代謝能が付与されたり、または、該コ
ロニーの細胞によって発現される新規蛋白質の触媒活性の結果として生じる理由
以外の理由によるものである。陽性コロニーからの発現ベクターのDNAを精製
しそしてZ−、EBG−Ecoli宿主細胞を再度形質転換すれば、このような
偽陽性を直接除去することができる。もしもβ−gaQ活性が発現ベクター内で
新規遺伝子によってコード化された新規蛋白質によるものであれば、該ベクター
によって形質転換されたこれらの細胞はすべてβ−gaρ機能を示すことになろ
う、これとは逆に。
最初の青いコロニーが宿主細胞のゲノム内での突従変異によるものであれば、こ
のような現象はめったに起るものではないし形質転換とは別のものであり、した
がって、gaΩ機能発現性を有する形質転換E coliの新規クローンの細胞
数は。
ゼロまたは小さいものとなろう。
ナイーブな(naive)バクテリアを再度形質転換した後の陽性クローン(青
色)のすべてからの全発現ベクターであれば。
これを大量に同時に精製する力は強調されるはずである。この目的が、触媒機能
を有する蛋白質を選択するためのスクリーニングを実施することであることを考
慮に入れ、そしてまた、新規なペプタイドまたはポリペブタイドがこの機能を実
行する可能性が、弱くてもせいぜい10−6であり、一方、Ecoli細菌宿主
の1つのクローンが、これと同じ機能を実行できるような突然変異を受ける可能
性が、 10−’であることを考慮に入れると、スクリーニングした2000万
の形質転換細菌について次のような計算をすることができる:すなわち、20の
陽性クローンが、その各々が担持している発現ベクター内の新規遺伝子に由来す
るものといい得るであろうし、一方、200の陽性クローンがゲノム突然変異の
結果得られたものといい得るであろう、ナイーブなバクテリアを発現ベクター混
合物で再度形質転換(retransformation) L/た後に得た2
20の陽性の細菌クローン全部について、これから得た発現ベクターを大量精製
(mass purification)すれば、多数の陽性クローンと非常に
少数の細菌クローンを製造することができることになろう:該陽性クローンは、
希望する機能を有する新規な蛋白質をコード化する(code)20の発現ベク
ターを用いて形質転換したこれらすべてのバクテリアから成るものであり。
一方、該細菌クローンは、ゲノムの突然変異の結果生じたものであり、関心の的
とはならない発現ベクターを200有するものである。このような再度の形質転
換の後に、陽性の細菌コロニーからの発現ベクターの精製サイクルを少し行うと
、同一機能に対して、宿主細胞内でのバックグラウンド突然変異の率が高いにも
かかわらず、希望する触媒活性に対して本当に陽性を示すところの極めてまれな
発現ベクターを検知することができる。
このタイプのスクリーニング操作にひき続き、確立された技術によって新規蛋白
質を精製することができる。このような蛋白質の大量生産は、有用な蛋白質の確
認がそれをコード化する遺伝子の同時確認(simultaneous 1de
ntification)と共に行われることによって、可能となるものである
。その結果、その合成と単離とを大規模に行うためには、同一の発現ベクターも
使用可能であるし、また、新規遺伝子を更に適当な発現ベクター内に移入(tr
ansplant)させることもできるのである。
このスクリーニング方法は、適当な生物学的アッセイが存在するのであればすべ
ての酵素機能に対して適用しても、うまくいくものである。このようなスクリー
ニングにあっては。
探しめている該酵素機能が宿主細胞にとって有用である必要はない、酵素機能に
ついてスクリーニングを行うことができるだけでなく、他のすべての希望する性
質についてもスクリーニングを行うことができるが、このような性質に対しては
適当な生物学アッセイが確立できることが必要である。したがって、触媒活性又
は他のすべての希望する性質について。
X −gaQベトリブレート上で可視化されるβ−gaQ機能という簡単なケー
スにおいてすらも、約1億、場合によっては10億もの新しい遺伝子のスクリー
ニングをうまく行うことができるのである。
多 転換された宿主細胞の択
他方、新しい遺伝子をコードする発現ベクターを含有する宿主細胞の生存に対し
てその性質の存否が基本的な役割をなしたり、または、その存否が、希望する新
しい遺伝子をコ−ディングしそして発現するこれらのウィルスを選択するのに使
用できたりする場合には、触媒的又はその他いかなる性質をも選択する技術が使
用可能である。非限定的な具体的実施例として、β−ガラクトシダーゼ機能の選
択(selection)について記述することにする。Z−EBG−E、co
liの適宜のクローンは、ラクトースを唯一の炭素源とした場合には生育するこ
とができない、したがって、上述した第1工程を行った後に、他の炭素源を少し
ずつ無くしていったり又はスタート時からラクトースのみを使用したりするとい
う条件を選び、新しい遺伝子をコード化する発現ベクターによって形質転換され
た非常に多数の宿主細胞を、このような選定された条件のもとで培養することが
できるのである。このような選択工程中に、下記によってin vivoでの突
然変異の生成が生じ、そのために希望する触媒機能を満たす能力(capaci
ty)を適応できるように改良することができるのである。上記突然変異の生成
は、組換えによって;または、発現ベクターを回収しそしてそれらの新規遺伝子
を各種の突然変異誘発物質によりin vitroで突然変異を生成させるエク
スプリシティ(explicity)により;または、その他すべての既知の技
術によって;行われるものである。このケースのように、選択技術と便利なバイ
オアッセイ技術とが同時に存在する場合には、はじめに、次のような選択技術を
用いることができる。すなわち、β−gaff機能を発現する宿主細菌の表現(
representation)を富化し、そして、陽性細胞を効率よく確立す
るためにX −gaQ培地を用いるペトリ皿上でスクリーニングを行う、という
選択技術を用いることができるのである。使いやすいバイオアッセイが存在しな
い場合には、それぞれ異なった1個又は少数の宿主細胞であって、その発現ベク
ターが希望する反応を触媒する蛋白質をコード化するような該宿主細胞を精製す
るためには、順次きびしくしていく選択方法を適用するのが最も容易なルートで
ある。
特定の反応を触媒する能力の外に、数多くの種類の構造的特徴と機能的特徴とを
有する新しい蛋白質を見出すために。
これらの技術を利用することができる。例えi1次のような新しい蛋白質のスク
リーニングまたは選択を行うことができる。該新規蛋白質とは、DNAのシス−
調節部位(。is−regulatory 5ite)に結合し、それによって
宿主細胞の機能の内の1つの発現をブロックし、または、DNAの転写をブロッ
クしたり、転写その他を刺激したりする蛋白質をいうのである。
例えば、 E、 coliの場合、ラクトースオペロンのリプレッサ(repr
essor)に突然変異を起した(i−)クローン ミュータント(clone
mutant in)は、ラクトースオペレータが抑制されないという事実故
に、構造的にβ−ga11機能を発現する。
このタイプの細胞は、すべて、X−gaf2培地を含有するベトリブレート上で
青いクローンを産生ずる。このような宿主細胞を、新規蛋白質を合成する発現ベ
クターを用いて形質転換し、そして、青色でないこれらのクローンを検出するた
めにX−1<aQベトリブレート上でふるい分けを行うことができる。
これらの中には、該新規蛋白質がラクトース オペレータ(lactose o
perator)に結合してβ−gaAの合成を抑制する(repress)場
合を示すものがある。そのようなときには、このようなプラスミドを単離して再
度形質転換を行い、β−gaffを生産しないこれらのクローンを単離し、そし
てしかる後に詳細な確認を行えばうまくいくのである。
上述したように、有用な蛋白質のみでなく、有用な性質を有する生産物としての
RNAとDNAとをそれ自体の中で創製した後にこれを分離するために、この方
法を利用することができる。これは、次の事実の結果である。すなわち、一方で
は、この手法は、他の細胞又は生化学的構成4分と直接相互反応することができ
るDNAのストキャスティック配列を創製することに存するものであり、他方、
発現ベクター内でクローニングされたこれらの配列は、それ自体多種類の生化学
的相互反応を行うことのできるRNAに転写される。という事実の結果なのであ
る。
それ 体 用なりNAを創製しそして゛ するために。
法を 用する 施例
この実施例は、有用なり N Aの選択、及びそのDNAに結合する調節蛋白質
(regulatory protein)の精製と該蛋白質の作用のメカニズ
ムの研究について、説明するものである。標準的技術によって得られる蛋白質で
あるエストラジオールリセプタ(oestradiol receptor)の
調製について検討する。
ステロイド系性ホルモンであるエストラジオールの存在下では、該リセプタは、
その構造(conformation)が変化し、ゲノムDNA中のある特定の
配列と強固に結合し、その結果、性別に関係する遺伝子の転写が影響を受け、そ
して受精率のコントロールに影響が出てくるのである。エストラジオール、その
リセプタ、及びそれらのベクター中に挿入された数多くの各種DNA配列からな
る混合物をインキニーベートした後、この混合物をニトロセルロース メンプラ
ンで濾過することによって、エストロゲンーリセプタ複合体に結合するストキャ
スティック DNA配列を直接選択する。ここにおいて、蛋白質に結合したこれ
らのDNAのみがメンプランに保持されるのである。洗滌しそして溶出した後、
メンプランがら遊るのに使用する。形質転換されたバクテリアを培養した後。
これらが含んでいるベクターを再度形質転換し、そして、上述したようにして、
インキューベーション、濾過及び形質転換を1又は数サイクル実施する。これら
の手法を行うことによって、エストラジオールーリセプタ コンプレックスに対
して高い親和性を有するストキャスティックDNA配列を。
単離することができる。このような配列は、数多くの診断的応用及び薬学的応用
、特に、受精率のコントロールと不妊症の処理のための応用に、途を拓くもので
ある。
それ自 なRNAの1 と 択
既述したところにしたがって、多数のストキャスティックDNA配列(sequ
ence)を製造し発現ベクター内でクローニング(cloned)する。その
結果、形質転換細胞においてこれらの配列から転写されたRNAは、それ自体で
有用な生産物となり得るものである。以下に述べる手法によって、サプレッサ転
移RNA(tRNA)をコード化するストキャスティック遺伝子を選択すること
ができる: arg E、遺伝子内で1′ノンセンス(nonsense)”突
然変異を有する適格細菌細胞の中に、多数の(≧10°)ストキャスティック配
列を形質転換する。これら形質転換されたバクテリアは、最小培地上にプレート
する。
この最小培地は、アルギニンは含有しないが、該プラスミド用の選択性抗生物質
(ベクターがpUc8の場合にはアンピシリン)を含有するものである。アルギ
ニンを合成できるように形質転換されたバクテリアだけが、生育できるはずであ
る。
このフェノタイプ(phenotype)は、宿主ゲノムの復帰突然変異により
、または細胞内にサプレッサが存在することによって起り得るものである。この
ようにして形質転換された各コロニーがarg”表現型か否かを、そのベクター
内のストキャスティック遺伝子の存在によって試験することはたやすいことであ
る;それは、そのコロニーからのプラスミドを精製し。
そしてそれがそれによって形質転換されてarg E細胞のすべてに対してAr
g+フェノタイプを与えることを、確認すればそれで足りるからである。
連鎖を触媒することができる蛋白 の
他の選択手段を以下に記述するが、該手段は、独立した応用に途を拓くものであ
り、関連する反応連鎖(sequence ofreactions)を触媒で
きるいくつかの新規蛋白質を同時にそして平行的に選択するという原理をベース
とするものである。
この方法の基本的な考え方は次のとおりである:最初の化合物を建築用ブロック
または建設エレメントと考えると、これら当初化合物の総体から1またはいくつ
かの希望する化合物を触媒化された化学反応の連鎖によって合成したいという希
望が出てくるが、その際、非常に数多くの反応ルートが存在し、それらは、他の
ものに完全に又は一部置換することができ、すべて熱力学的に可能であり、そし
て、建築ブロックのセットから希望する1又はそれ以上のターゲット化合物へと
至るものである。もしも、建築ブロック化合物から標的とする化合物へと至る反
応径路の少なくとも1つの各工程が。
それぞれ、反応から構成されるものであってしかもその各反応が触媒されるもの
であれば、標的化合物を能率的に合成する方が都合が良い、他方、多数の独立し
た又は1部独立した反応径路の内で、どれが触媒されるものであるのかを決定す
ることは、比較的重要なことではない、既に述べてきたよう主細胞を非常に数多
く取得できるやり方について、説明してきたところである。
これら新規な蛋白質のそれぞれが、建築ブロック(building bloc
k)の総体から目的とする化合物へと導く可能性のある反応すべてからなるセッ
ト(set)における、1つの又はその他の可能性のある反応を触媒する候補者
、なのである、もしも、可能性のある反応が充分な数だけ触媒されるよう、スト
キャスティック蛋白質が、充分の数だけ、建築ブロック化合物を含む反応混合物
中に存在しておれば、建築ブロック化合物のセットからターゲット化合物へと導
く一連の関連する反応順序が、高い可能性をもって、新規蛋白質からなるサブセ
ット(subset)によって触媒されることになるであろう、この手法を、1
つのターゲット化合物の触媒現象だけでなくいくつかのターゲット化合物を同時
に触媒する触媒現象へと進展させることができることは、明白なことである。
この原理によれば、希望する化学反応連鎖を触媒する新規蛋白質のセットを平行
して選択するために1次のようにして処理を進めることができる:
1、希望するターゲット化合物へと導く可能性を有する共存する反応の数を増加
させる目的で、好ましくは適当な数の異なった化学種(chemical 5p
ecies)を利用することによって。
建築ブロックを構成する化合物の希望するセットを特定する。
2、適当量の反応媒体を用い、非常に数多くの新規なストキャスティック蛋白質
を添加する。ただし、これらの蛋白質は。
これらの蛋白質を合成する形質転換細胞又はトランスフェクト細胞(trans
fected cell)から単離したものである。ターゲット化合物が形成さ
れたか否かを決定するために、アッセイを行う、もしそうであれば、この形成に
は新規蛋白質の混合物の存在が必要であることを確認する。もしそうであれば。
そこで、該混合物は、建築ブロックセットからターゲット化合物へと至る1又は
いくつかの反応径路を触媒する蛋白質のサブセットを含んでいなければならない
、最初のクローンの総体を精製しそして分割するが、これらのクローンは、新規
なストキャスティック蛋白質のセットを合成し、ターゲット化合物に至る反応連
鎖を触媒するのに必要なサブセットを合成するものである。
更に正確に、新規蛋白質の選択について以下に述べることにするが、この実施例
のみに限定されるものではない、該新規蛋白質は、特定の小さな蛋白質の合成、
とりわけ、より小さなペプタイドとアミノ酸から構成される建築ブロックからの
ペンタベプタイドの合成を触媒できるものである。すべてのベプタイドは、アミ
ノ末端からカルボキシ末端へと配向されており、20の異なったタイプのアミノ
酸からなる直線配列から構成されるものである。2つのより小さなペプタイド(
又は2個のアミノ酸)の末端縮合により、またはより大きなペプタイドの加水分
解によって、1つの工程で、すべてのベプタイドを形成することができる。この
ようにして、M−1組合反応によって1M残基を有するペプタイドを生成せしめ
ることができる1反応、これによって、長さ1.2.3・・・N残基を有する1
セツトのベプタイドが相互転化され得る(can beinterconver
ted )のであるが、これらの反応数、Rは、可能な分子種(molecul
ar 5pecies)の数、Tよりも大きいものである。これは、R/T>M
−2と書き表わすことができる。このようにして、与えられたペプチド総体を出
発物質として、非常に多数の独立した又は一部独立した反応径路が、特定の標的
ペプタイドの合成へとつながっていくのである。ペンタペプタイドを選択するが
、その存在は、例えば、HPLC(液相高圧クロマトグラフィー)、ペーパーク
ロマトグラフィーその他といったいくつかの通常の分析技術によって、手軽に決
定することができる。稀釈した水性媒体中でペプチド結合を形成するには、エネ
ルギーが必要である。しかし、もしも縮合反応(condensation r
eaction)にあづかるベプタイドが適度に濃縮されていれば、ペプチド結
合の形成は、加水分解上熱力的に好都合であるし、例えばペプシンやトリプシン
といった適宜な酵素触媒の存在下、ATPや他の高エネルギー化合物の存在を必
要とすることなく、ペプチド結合が形成されるのである6小さなペプタイドであ
って、建築ブロックセットを構成するものであり、そしてそのアミノ酸は、トレ
ーサーとして作用するよう、3H114C,2′Sで放射活性的にマークしてな
る、小さなペプタイドのこのような反応混合物は、縮合反応に導くため、充分に
高い濃度で使用することができる。
例えば1次のように処理をすすめていけばうまくいくのである
:建築ブロックセットを構成するために選択した、各アミノ酸とアミノ酸を2〜
4個有する小さなベプタイド15■を、0.1M、pH7,6のホスフェートバ
ッファー0.25mQ−1,Omfl中に溶解する。上述したところにしたがっ
て発生せしめそして単離した多数の新規な蛋白質を、それらの細菌又は他の宿主
細胞から精製する。これらの新規蛋白混合物を、同じバッファー中で最終濃度が
0.8〜1.0■/sQとなるまで溶解する。0 、25+++fi〜0.5−
の蛋白質混合物を、建築ブロック混合物に添加する。
これを25℃〜40℃で1〜40時間インキニーベートする。規則正しい間隔で
、8μQのアリフォート(aliquots)を取り出し、最初のものは、“ブ
ランク”として使用し、新規蛋白混合物を添加する前に取り上げる。これらのア
リフォートは、溶剤としてn−ブタノール−酢酸−ピリジン−水(容積比で30
: 6 :20 : 24)を用いるクロマトグラフィーによって、これらを
分析する。クロマトグラムは、これを乾燥させ、そしてニンヒドリンまたは(増
感紙を用いて又は用いることなく)オートラジオグラフィーによって分析する。
建築ブロックセットを構成する化合物が放射活性的にマークされているので、タ
ーゲット化合物は、放射活性を有するであろうし、1−Longのレベルといっ
た検出可能な充分に高い特異的活性を有することになろう、標準的なりロマトグ
ラフィー分析の代りに、HPLC(高圧液体クロマトグラフィー)を用いること
ができ、これはより速くしかも実施するのがより簡単である。更に概説すれば、
通常の分析手法であればすべてのものが使用可能である。その結果、最初の建築
ブロックとして用いた化合物に比して、ターゲット化合物の収量がその重量の1
ppm以下であっても、これを検出できることになるのである。
もしもペンタペプチドが、上記した条件のもとで生成されたものであれば、ただ
し、抽出物として、ストキャスティック遺伝子を含まない発現ベクターによって
形質転換された宿主細胞から誘導されたもの、を利用しないで生成されたもので
あれば、このペンタペプチドの生成は細菌汚染物(contaminant)の
結果ではないということとなり、したがって、反応混合物中に新規な蛋白質のサ
ブセットを存在せしめる必要がでてくるのである。
次の工程は、細胞の特定のサブセットを分離することからなるものである。該細
胞は、新規な蛋白質を有する発現ベクターを含有するものであり、該蛋白質は、
ターゲットとしてのペンタペプタイドに導く反応の順序を触媒するものである。
実施例として、この連鎖を形成する反応の数が5とした場合。
必要な反応を触媒する新規な蛋白質は約5つ存在する。新規遺伝子をコード化す
る発現ベクターを含有するバクテリアのクローンバンク(clone bank
)が、約1,000,000という多数の異なる(distinct)新規遺伝
子を有している場合、これらすべての発現ベクターは、−団として(6n ma
sse)分離し、そして。
108の細菌からなる100の異なるセットの中に再度形質転換せしめるが、そ
の際、形質転換される各セット内の細菌数が平均して当初の遺伝子数の約半分、
すなわち約soo、oooとなるよう、ベクタ一対バクテリアの比率を充分に低
くしておく。
したがって、100セツトのバクテリアの内の与えられたどの1つをとっても、
それが5つの臨界的(critial)新規蛋白質の全体のセットを含む確率は
、(1/2)” = 1/32となるのである。
バクテリアの最初の100セツトの内、約3つのものが5つの臨界的形質転換体
を有することになろう、これらのセットの各々において、新しい遺伝子の全数は
、1,000,000というよりはむしろわずかにsoo、oooとなる。連続
的にこの処理を。
本件においてはトータルで約20回、くり返すことにより、5つの臨界的な新規
蛋白質を分離する。これにひき続いて、5つのストキャスティック遺伝子からな
るこのセットについて、突然変異を生成させそして選択処理を行うことによって
、必要な触媒機能を改良することができる。20の反応からなる1つの連鎖(s
equence)を触媒する必要があり、そしてまた新規蛋白質をコーディング
する20の遺伝子を併行して分離する必要がある場合には、10”のバクテリア
の各セットがそれぞれ10′のストキャスティック遺伝子の80%を受けとるよ
う、形質転換数を調節し、そしてこのようなバクテリアのセットを200使用す
れば、それで足りるのである。20の新規蛋白質すべてが1つのセット内に発見
される確率は、0.820::0.015である。したがって、200セツト内
の2つが、ターゲット化合になるのである。この20の新規遺伝子を単離するの
に必要なサイクル数は、およそ30である。
上記した原理及び手法は、ペプタイドの場合から、化学の多数の領域へと広げら
れるものである。該化学の領域とは、化学反応が、一般的な酵素機能が可能な、
水性媒質、温度、p)I、及び濃度の各条件のもとで行われるような、化学領域
である。いずれの場合においても、希望する1又はそれ以上のターゲット化合物
の生成を検知するために、分析方法を利用することが必要である。また、ターゲ
ット化合物に至る反応連鎖の数を増加させるのに充分な多数の建築ブロック化合
物を選択することも、必要なことである。
また、標的としてのペンタペプタイドの合成について行ってきた具体的な実施例
は5次のとおり他へも普及せしめることができる:
記述した手法は、他の生産物の内、ストキャスティックペブタイド及び蛋白質を
産み出すものである。これらのベブタイド又は蛋白質は、他の化合物に対して、
触媒的にあるいは他の方法で作用することができる。また、これらは、それらが
作用するところの基質を構成することもできる。したがって、このようなストキ
ャスティック ペプタイドまたは蛋白質が有するところの能力であって、それら
の間で相互作用を行いそしてそれによってそれらの間のコンホーメーション。
構造又は機能を修飾改変する能力を、選択(又はスクリーニング)することが可
能となるのである。同じ様にして、これらのベプタイド及び蛋白質が有する能力
であって、それらの間で、加水分解、縮合、トランスペプチド作用又はその他ペ
プタイドを修飾する反応を触媒する能力、を選択(又はスクリーニング)するこ
とも可能である。例えば、ひき続いて、ストキャスティック ペプタイド及び蛋
白質のセットの少なくとも1つのメンバーによって、ある与えられたストキャス
ティックペプタイドの加水分解をひき続き行うことができ、そして、与えられた
蛋白質の放射活性標識化を行い、続いてストキャスティック蛋白質混合物と共に
、 Mg、 Ca、 Zn、 Feといったイオン及びATP又はGTPの存在
下でインキュベートして、その測定を行うことができる。そこで、マークした蛋
白質の放射活性フラグメントの出現を、既述したようにして測定するのである。
この反応を触媒する1又はそれ以上のストキャスティック蛋白質は、上述したよ
うに、それらを生成する遺伝子にそって、形質転換クローンのライブラリー(l
ibrary)の逐次消失(sequential diminution)を
行うことによって、再度単離することができる。
この手法は、ストキャスティック ペプタイド及びポリペブタイドの総体の選定
にまで広げられるが、これらのベグタイド類は、最初の建築ブロック(アミノ酸
及び小さなペプチド)からセットのペプチドまたはポリペプチドへ至る1セツト
の反応を触媒しうるものである。したがって、それ自身を合成し得る総体を選択
することもできるのである;このような再帰的自己触媒反応のセットは、反応生
成物はコンスタントに希釈するが建築ブロックの濃度は一定に維持するケモスタ
ット(chemostat)において、確立することができる。二者択一的に、
標準法によりリポソーム内にペプタイドの複合セットを封入することによって、
上記のようなセットの合成が促進助長される。このようなリポソーム(lipo
some)の周囲の高張水雰囲気では、より大きな蛋白質を形成する縮合反応に
よれば、リポソーム内の滲透圧が低下して、この縮合反応によって生成した水分
子をリポソーム外へと追い出し、そのためにより大ぎなポリマーの合成がうまく
いくのである。このような自己触媒反応の総体の存在は、2次元ゲル電気泳動と
HPLCによって、ペプチドとポリペプチドとが安定な分布でもって合成される
のを見て、これを確認することができる。反応量の適量は、使用する分子種の数
とペプチド結合が加水分解される以上にペプチド結合をうまく形成するのに必要
な濃度と、によってきまってくる。自己触媒反応の総体(autocatal+
ytic ensemble)の分子種の分布は、異なった自己触媒反応の総体
の出現により、自由に変えたり変化させたりする。自己触媒反応のセットを構成
するペプタイド及びポリペブタイドは、(本発明に係る手法呻よって与えられた
ようにコード化されたペプチド及びポリペプチドからなる)大きな最初の総体と
共通するあるエレメントを有してもよいが、また、最初の総体をコーディングす
るストキャスティック遺伝子の総体によってコード化されるものではないところ
の。
ペプチド及びポリペプチドを含有することもできる。
このような自己触媒反応のセットを確立するのにその生産物が必要とされるとこ
ろの、ストキャスティック遺伝子のセットは、既述したように、形質転換クロー
ンのライブラリーの逐次消失によって、これを単離することができる。また、ス
トキャスティック遺伝子によって最初にコード化されそして自己触媒反応のセッ
ト内で連続的に合成されたコード化ペプタイドを、自己触媒反応のセットは含む
こともできる。ペプチド及び蛋白質のコード化されたこのサブセットを単離する
ために、自己触媒反応のセット(autocatalytic 5et)を使用
して、動物の免疫を通し、自己触媒反応のセットを構成する非常に数多くの構成
成分を認識するポリクローナル血清を得ることができる。
これらの血清は、ストキャスティック遺伝子ライブラリーのスクリーニングに利
用することができ、血清中に存在する抗体と結合しうる蛋白質を発現するこれら
の遺伝子を発見することができる。
このストキャスティック遺伝子のセットは、ストキャスティック セットの中に
存続しているコード化されたストキャスティック蛋白質を、非常に数多く発現す
るもので蕊る。このような自己触媒反応セットのコード化された構成4分の残り
の部分は、ストキャスティック遺伝子ライブラリーの逐次消失によって、これを
単離することができるが、該ライブラリーから、免疫法によって検出されたサブ
セットを、はじめに除去しておく。
記述したところによって得た、このようなペプタイド及び蛋白質の自己触媒反応
セットには、実用的な応用を数多く見出すことが可能である。
・ 国際調査報告
ANNEX To THE INTERNATIONALSEARC!(REF
ORT ON
Claims (55)
- 1.生物学的手段によってペプタイドまたはポリペプタイドを製造するための方 法であって、 少なくとも部分的にはストキャスティック合成ポリヌクレオチドからなる遺伝子 を、1つの共通の培地内で同時に作成し;このようにして得た遺伝子を宿主細胞 内に導入し;ストキャスティック遺伝子をクローニングしそしてこれらのストキ ャスティック遺伝子の各々によって発現される蛋白質の製造に至るよう、これら の遺伝子を含有する形質転換宿主細胞の独立クローンを同時に培養し;特定され た性質を少なくとも1つ有するペプタイドまたはポリペプタイドを生産するこれ らのクローンを確認するよう、形質転換されたこのようなクローンについて、ス クリーニング及び/又は選択を行い;このようにして確認したクローンを単離し 、次いで、該性質を有する少なくとも1つのペプタイドまたはポリペプタイドを 生産するように、該クローンを生長させること、 を特徴とする方法。
- 2.請求の範囲第1項において、該遺伝子は次のようにして製造することを特徴 とする方法: 予じめ直線化じた1つの発現ベクターの2つの末端からはじめて、4つのタイプ のデオキシホスホヌクレオチドA、C、G及びTをストキャスティック共重合さ せることにより;次いで、それらの3′末端が相補的であるところの2つのスト キャスティック配列を有する発現ベクター1分子によって構成されるストキャス ティック第1DNA鎖を創製するよう、コヘッシブーエンドを形成することによ り;そしてひき続いて第2のストキャスティックDNA鎖を合成せしめることに よって;製造する方法。
- 3.請求の範囲第1項において、ストキャスティックDNAフラグメントを生成 するよう、コヘッシブーエンドを有しない2本鎖オリゴヌクレオチドをストキャ スティック共重合せしめることによリ;ひき続いて、予じめ直線状とした1つの 発現ベクター内にこれらのフラグメントを連結することによって;該遺伝子を製 造する方法。
- 4.請求の範囲第2項又は第3項において、発現ベクターがプラスミドであるこ と、を特徴とする同項記載の方法。
- 5.請求の範囲第4項において、発現ベクターがpUC8であること、を特徴と する同項記載の方法。
- 6.請求の範囲第2項又は第3項において、発現ベクターがウィルスDNAの断 片であること、を特徴とする同項記載の方法。
- 7.請求の範囲第2項又は第3項において、発現ベクターがプラスミドとウィル スDNAとのハイブリッドであること、を特徴とする同項記載の方法。
- 8.請求の範囲第1項〜第6項において、宿主細胞が原核細胞であること、を特 徴とする同項記載の方法。
- 9.請求の範囲第1項〜第7項において、宿主細胞が真正核細胞であること、を 特徴とする同項記載の方法。
- 10.請求の範囲第8項において、該細胞がHB101及びC600から選ばれ ること、を特徴とする同項記載の方法。
- 11.請求の範囲第3項において、オリゴヌクレオチドが1群のパルインドロミ ックオクタマーを形成すること、を特徴とする同項記載の方法。
- 12.請求の範囲第11項において、回帰性オクタマーの該グループが次のグル ープであること、を特徴とする同項記載の方法: 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】
- 13.請求の範囲第3項において、オリゴヌクレオチドが1群の回帰性ヘプタマ ーを生成すること、を特徴とする同項記載の方法。
- 14.請求の範囲第13項において、パリンドロミックヘプタマーの該グループ が次のグループであること、を特徴とする同項記載の方法: 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 式中、X=A、G、C又はTそして R=A又はT
- 15.請求の範囲第4項、及び請求の範囲第12項又は第14項のいずれか1項 において、 請求の範囲第11項又は第13項に特定した方法にしたがって得た形質転換され た宿主細胞のインデペンデントクローンの培養物から誘導したトランスフォーミ ングDNAを先ず最初に、分離、精製し;次いで、これら回帰性オクタマーまた はヘプタマー中には存在するけれども使用した発現ベクターには存在しない特定 の制限部位に対応する少なくとも1つの制限酵素を用いて、該精製されたDNA を切断し;しかる後に、新規なストキャスティックシーケンスを有するDNAの 新規アンサンブルを創製するよう、上記によって得た線状ストキャスティックD NA断片のアンサンブル(ensemble)を、T4DNAリガーゼによって 同時に処理し;この新規なトランスフォーミングDNAのアンサンブルを用いて 、宿主細胞の形質転換とこのような遺伝子のクローニングを行い;そして最後に 、スクリーニング及び/又は選択を行い、そして形質転換された細胞の新しいク ローンを単離し;そして、これらを生長せしめて、希望する性質を有するペプタ イドまたはポリペプタイドを少なくとも1つ製造すること、を特徴とする同項記 載の方法。
- 16.請求の範囲第1項において、該性質がある与えられた化学反応を触媒し得 る能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
- 17.請求の範囲第1項において、該性質が、ある与えられた最初の化合物グル ープから少なくとも1つのターゲット化合物へと至る1つの反応連鎖を触媒し得 る能力であること、を特徴とする同項記載のいくつかのペプタイド及び/又はポ リペプタイドを製造するための方法。
- 18.請求の範囲第16項に記載された、再帰的自己触媒性の(reflexi vely autocatalytic)ペプタイド及び/又はポリペプタイド の1つ以上からなるアンサンブル(ensemble)を製造するための方法で あって、 該性質が、アミノ酸及び/又はオリゴペプタイドを出発原料として該アンサンブ ルそれ自体を合成する能力であること、を特徴とする方法。
- 19.請求の範囲第1項において、該性質が、ある与えられた化合物の化学的及 び/又は生物学的性質を選択的に修正し得る能力であること、を特徴とする同項 記載の方法。
- 20.請求の範囲第19項において、該性質が、あるポリペプタイドの触媒活性 を選択的に修飾し得る能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
- 21.請求の範囲第19項において、該性質が、少なくとも1つの生物学的活性 化合物の少なくとも1つの生物学的機能をシミュレートしまたはモディファイし 得る能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
- 22.請求の範囲第21項において、該生物学活性化合物は、ホルモン、神経伝 播体、ゆ着又は生長因子、及び、DNAの複製及び/又は転写の特異的レギュレ ータ、及び/又はRNAの翻訳の特異的レギュレータから選択すること、を特徴 とする同項記載の方法。
- 23.請求の範囲第1項において、該性質が、与えられたリガンドに結合し得る 能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
- 24.請求の範囲第23項に記載した方法によって得たペプタイドまたはポリペ プタイドの、リガンドの検出及び/又はタイトレーションのための利用。
- 25.請求の範囲第1項において、該性質が、ある与えられた抗原のエピトープ の1つに類似したエピトープを少なくとも1つ有すること、を特徴とする同項記 載の方法。
- 26.請求の範囲第19項及び第25項において、該性質が、生物学的活性分子 の効果をシミュレート又は修飾する能力であり、そして、この性質を有するペプ タイドまたはポリペプタイドを少なくとも1つ製造するところの形質転換宿主細 胞のクローンのスクリーニング及び/又は選択は、次のようにして行う、すなわ ち、該分子に対する抗体を調製しそしてこのようにして得たこれらの抗体を利用 してこれらのペプタイドまたはポリペプタイドを含有するクローンを確認し、次 に、このようにして確認したクローンを生長せしめ、そしてこれらのクローンに よって製造されたペプタイドまたはポリペプタイドを分離、精製し、そして最後 に、この(これらの)ペプタイド又はポリペプタイドをinvitroでアッセ イにかけて、それが該分子の効果をシミュレートまたは修飾する能力を有するこ とを確認することにより、上記スクリーニング及び/又は選択を行うこと、を特 徴とする同項記載の方法。
- 27.請求の範囲第1項又は第26項に係る方法によって取得され、薬学的及び /又は化学療法的作用を有する活性物質として利用することができる、ペプタイ ドまたはポリペプタイド。
- 28.請求の範囲第25項に係る方法によって取得されたペプタイドまたはポリ ペプタイドであって、該抗原に対して特異的な遊離抗体とこれらのペプタイドま たはポリペプタイドとの間で結合を形成せしめることによって、これら遊離の抗 体の濃度をin vitro又はin vivoで減少せしめるのに利用するこ とができる、ペプタイドまたはポリペプタイド。
- 29.免疫学的過感作性を抑制する剤として利用することができる、請求の範囲 第27項又は第28項に係るペプタイドまたはポリペプタイド。
- 30.請求の範囲第25項に係る方法によって取得され、該抗原に関する耐性を 創製する剤として利用することができるペプタイドまたはポリペプタイド。
- 31.請求の範囲第25項において、抗原がEGFであることを特徴とする同項 記載の方法。
- 32.請求の範囲第31項に係る方法によって取得され、エピテリオマス(ep itheliomas)の化学療法的処置のために利用することができるペプタ イドまたはポリペプタイド。
- 33.請求の範囲第1項において、希望する性質を有するペプタイドまたはポリ ペプタイドを生産する形質転換宿主細胞のクローンについて、DNAハイブリッ ドの天然のフラグメントによって発現される1つの蛋白質に対応する抗体上で親 和クロマトグラフィー処理することにより、該クローンを、確認しそして分離す ること、を特徴とする同項記載の方法。
- 34.請求の範囲第33項において、DNAハイブリッドの天然フラグメントが β−ガラクトシダーゼ発現遺伝子を含有し、そして、抗−β−ガラクトシダーゼ 抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって、形質転換宿主細胞の該 クローンを確認しそして単離すること、を特徴とする同項記載の方法。
- 35.請求の範囲第1項又は第34項において、ハイブリッドペプタイドまたは ポリペプタイドの発現と精製を行った後に、新規フラグメントを分離しそして単 離すること、を特徴とする同項記載の方法。
- 36.請求の範囲第25項又は第26項に係る方法を、ワクチンの調製に応用す ることであって、 病原剤(pathogenic agent)に対する抗体を取得し、そして、 病原剤のエピトープの1つに類似したエピトープを少なくとも1つ有する少なく とも1つの蛋白質を生産するこれらのクローンを確認するために、該抗体を使用 し;形質転換宿主細胞の対応するクローンを、この蛋白質を生産するように、生 長せしめ;この蛋白質を、細胞クローンの培養物(culture)から単離、 精製し;そして、この蛋白質を、病原剤に対するワクチンの製造のために使用す ること、を特徴とする同項記載の方法の応用。
- 37.請求の範囲第36項に係る、抗HVBワクチンの調製のための応用であっ て、 HVBウィルスの少なくとも1つのカプシド蛋白質(capsidprotei n)を抽出、精製し;この蛋白質を、この蛋白質に対する抗体を形成しうる動物 の体内に注入し;これらの抗体を回収、精製し;これらの抗体を用いて、HVB ウィルスのエピトープの1つに似た少なくとも1つのエピトープを有する少なく とも1つの蛋白質を製造するこれらのクローンを確認し;この蛋白質を産生する よう、これらのクローンに対応する形質転換宿主細胞のクローンを生育せしめ; 宿主細胞のこれら培養物から、この蛋白質を単離、精製し;そして、抗−HVB ワクチン製造のために、この蛋白質を使用すること、 を特徴とする同項記載の応用。
- 38.請求の範囲第1項において、 宿主細胞が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)タイプ のバクテリアから成るものであるが、そのゲノムには天然のβ−ガラクトシダー ゼ遺伝子もEBG遺伝子も含まれていない、つまり、Z−,EBG− E co liから成るものであり;インデューサ(inducer)IPTGをも含有す るX−ga1培地中で、これらの形質転換宿主細胞を培養し;β−ガラクトシダ ーゼ機能に対して陽性であるところのクローンを、培地中で検出し;しかる後に 、β−ガラクトシダーゼ機能を備えたペプタイド、ポリペプタイド又は蛋白質の 少なくとも1つを工業的に製造するのに適した宿主細胞クローンに、このDNA を移入(transplant)すること、を特徴とする同項記載の方法。
- 39.請求の範囲第1項において、該性質が、ある与えられた化合物に結合する 能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
- 40.請求の範囲第39項において、該化合物が、ペプタイド、ポリペプタイド 及び蛋白質の中から選択されるものであること、を特徴とする同項記載の方法。
- 41.請求の範囲第40項において、該蛋白質が、DNAの転写活性又は複製を 調節する(requlating)蛋白質であること、を特徴とする同項記載の 方法。
- 42.請求の範囲第39項において、該化合物が、DNA及びRNA配列(se quences)から選択されるものであること、を特徴とする同項記載の方法 。
- 43.請求の範囲第40項又は第42項に記載の方法によって得られた蛋白質。
- 44.DNAを製造するための方法であって、少なくとも一部分はストキャステ ィック合成(stochastic synthetic)ポリヌクレオチドか らなる遺伝子を、同一培地中で製造し;形質転換された宿主細胞のある総体(e nsemble)を製造するよう、上記により製造した遺伝子を宿主細胞内に導 入し;このようにして製造した宿主細胞の独立クローン(independen t clone)を製造するよう、これらを生育せしめ;少なくとも1つの希望 する性質を有するこれらDNAのストキャスティック配列(stochasti csequences)を含むこれら宿主細胞を確認する(identify) よう、この総体について、スクリーニング及び/又は選定を行い;そして、確認 された宿主細胞培養物から、このようなDNAを単離すること、 を特徴とする方法。
- 45.請求の範囲第44項において、該性質が、与えられた化合物に結合する能 力であること、を特徴とする同項記載の方法。
- 46.請求の範囲第45項において、該化合物が、ペプタイド、ポリペプタイド 及び蛋白質の中から選択するものであること、を特徴とする同項記載の方法。
- 47.請求の範囲第45項において、該化合物が、DNAの転写活性又は複製( replication)を調節する化合物であること、を特徴とする同項記載 の方法。
- 48.請求の範囲第47項において、該化合物が、DNAの転写又は複写をコン トロールする調節蛋白質であること、を特徴とする同項記載の方法。
- 49.請求の範囲第46項又は第47項に係る方法によって取得されたDNA配 列の利用であって、近隣DNA配列(neighboring sequenc e of DNA)の複製又は転写のシスー調節配列(cis−regulat ory sequence)としての、利用。
- 50.請求の範囲第42項において、取得された蛋白質が、DNAの転写活性、 複製、又は安定性を修飾する能力を有すること、を特徴とする同項記載の方法。
- 51.請求の範囲第48項に係る方法によって取得した蛋白質の利用であって、 このDNA配列を含有しそしてこの蛋白質を発現する細胞内でのDNA配列の転 写、複製、又は安定性を修飾するための、利用。
- 52.RNAを製造するための方法であって、少なくとも一部分はストキャステ ィック合成ポリヌクレオチドからなる遺伝子を、同一培地中で同時に製造し;こ のようにして得た遺伝子を宿主細胞内に導入して、形質転換宿主細胞の総体を製 造し;このようにして製造した形質転換宿主細胞のインデペンデントクローンを 、同時に生育せめ;この総体についてスクリーニング及び/又は選択を行って、 希望する性質を少なくとも1つ有するRNAのストキャスティックシーケンスを 含有する宿主細胞を確認し;そして、このようにして確認した宿主細胞のカルチ ャーから、RNAを単離すること、 を特徴とする方法。
- 53.請求の範囲第52項において、該性質が、ある与えられた化合物に結合す る能力であること、を特徴とする同項記載の方法。
- 54.請求の範囲第52項において、該性質が、ある与えられた化学反応を触媒 する能力(capacity)あること、を特徴とする同項記載の方法。
- 55.請求の範囲第52項において、該性質がトランスファRNAであること、 を特徴とする同項記載の方法。
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2003
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05503000A (ja) * | 1989-10-05 | 1993-05-27 | オプテイン,インコーポレイティド | 新規の遺伝子及びポリペチドの無細胞合成並びに単離 |
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