KR20010032861A - 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 형성하는 방법 - Google Patents

폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 형성하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 목적하는 성질을 획득하도록 폴리펩티드를 진화시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 이형 두가닥 사슬을 포함하는 어닐링된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 조건하에 어버이 폴리뉴클레오티드 변형체 군을 항온처리하는 단계를 수반한다. 그 다음 이형 두가닥 사슬을 세포 DNA 복원계에 노출시켜 이형 두가닥 사슬을 어버이 폴리뉴클레오티드 변형체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 변형체로 전환시킨다. 목적하는 성질에 대해 생성 폴리뉴클레오티드를 검색 또는 선별한다.

Description

폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 형성하는 방법{METHOD FOR CREATING POLYNUCLEOTIDE AND POLYPEPTIDE SEQUENCES}
합리적 설계 및 유도 진화를 비롯한 각종 접근법을 사용하여 단백질 기능을 최적화시켜 왔다(1,2). 주어진 최적화 문제에 대한 접근 방법의 선택은, 부분적으로는 서열, 구조 및 기능사이의 관계 이해 정도에 좌우된다. 합리적 재설계는 통상적으로 구조-기능 관계에 대한 확대된 지식을 요한다. 유도 진화는 구조-기능 관계에 관한 특별한 지식은 거의 또는 전혀 필요로 하지 않는다. 그 보다는 최적화하고자 하는 기능을 평가할 수 있는 수단이 필수적이다. 유도 진화는 돌연변이 분자의 라이브러리 형성 후 소정 기능의 선별 또는 검색을 수행한다. 목적하는 성질 또는 성질 세트에 대한 개선을 나타내는 유전자 생성물은 선별 또는 검색으로 확인한다. 이들 생성물을 암호화하는 유전자(들)에 대해 추가의 처리 사이클을 수행하여 유용한 돌연변이를 축적할 수 있다. 이러한 진화는 진행되기를 바라는 정도 및 각 세대에서 통상적으로 관찰되는 돌연변이 효과에 따라 수 세대 또는 여러 세대를 포함할 수 있다. 이러한 접근법을 이용하여 신규 기능성 핵산(3,4), 펩티드 및 기타 소분자(3), 항체(3) 뿐 아니라 효소 및 기타 단백질(5,6,7)을 형성하였다. 이들 절차는 기능 평가에 있어서 부정확성 및 노이즈에 대한 상당한 용인성이 있다.
일부 공보는 유도 진화에 있어서 유전자 재조합의 역할을 논의하고 있다(참조, WO 97/07205, WO 98/42727, US 5,807,723, US 5,721,367, US 5,776,744 및 WO 98/41645, US 5,811,238, WO 98/41622, WO 98/41623 및 US 5,093,257).
PCR계 군의 재조합 방법은 DNA 재편성[5,6], 지그재그 연장 과정[89,90] 및 무작위 프라이밍 재조합[87]으로 구성된다. 이러한 방법은 통상적으로 어셈블리/재조합 단계 동안 상당량의 DNA의 합성과 연속되는 최종 생성물의 증폭을 포함하며, 증폭의 효율은 유전자 크기가 증가함에 따라 감소된다.
상동성 재조합에 대한 활성계를 보유하는 효모 세포를 생체내 재조합에 사용하였다. 벡터와 부분적으로 중첩된 삽입체로 형질전환시킨 세포는 상동성 영역에서 효율적으로 삽입체를 함께 연결시키고, 기능적, 공유적으로 폐쇄된 플라스미드를 복구시킨다[91]. 이 방법은 임의의 재조합 단계에서 PCR 증폭을 필요로 하지 않으며, 따라서 이 방법에서는 고유 크기에 대한 고려를 할 필요가 없다. 그러나, 재조합 현상에 도입되는 교차 수는 다중 삽입체를 이용한 세포의 형질전환 효율에 의해 제한된다. 기타 생체내 재조합 방법은 직렬 방향으로 동일한 플라스미드에 클로닝된 2개의 어버이 유전자 사이의 재조합을 수반한다. 한 방법은 키메라 유전자를 생성하는 박테리아 세포의 상동성 재조합 기구에 좌우된다[92]. 직렬 방향의 제1 유전자는 표적 단백질의 N 말단 부분을 제공하고, 제2 유전자는 C 말단 부분을 제공한다. 그러나, 이 방법으로는 1회의 교차만을 형성할 수 있다. 또 다른 생체내 재조합 방법은 벡터내 기질의 동일한 직렬 구성을 이용한다[93]. E.콜리 세포내로 형질전환시키기 전에, 플라스미드는 어버이 서열 사이의 엔도뉴클레아제 분해로 선형화된다. 재조합은 2본쇄 절단 복원을 담당하는 효소에 의해 생체내에서 수행된다. 선형 분자의 말단은 5' →3' 엑소뉴클레아제 활성으로 분해한 뒤 상보성 1본쇄 3' 말단의 어닐링과 2본쇄 플라스미드의 복구를 수행한다[94]. 이 방법은 환형 플라스미드상에서의 직렬 재조합법과 유사한 장점 및 단점을 갖는다.
본 출원은 1997년 12월 8일에 제출된 USSN 60/067908의 우선권으로부터 유래된 것으로서, 그 전문을 참고로 인용하였다.
본 발명은 유전학 기술 분야, 더욱 구체적으로는 목적하는 성질을 획득하도록 한 폴리뉴클레오티드의 분자 수준에서의 진화에 관한 것이다.
도 1은 서로 다른 서열에 대한 한 세트의 프라이머와 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 표적 서열 및 벡터를 증폭시키는 이형 두가닥 사슬 형성 방법을 예시한다.
도 2는 제한 효소를 사용하여 표적 서열 및 벡터를 선형화하는 이형 두가닥 사슬 형성 방법을 예시한다.
도 3은 서로 다른 서열에 대한 한 세트의 프라이머와 비대칭 또는 단일 프라이머 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 표적 서열 및 벡터를 증폭시키는 이형 두가닥 사슬 형성 방법을 도시한다.
도 4는 고유 제한 효소(X 및 Y)를 사용하여 동형 두가닥 사슬을 제거하는 이형 두가닥 사슬 재조합법을 예시한다.
도 5는 R. 루피니(R. lupini)에서 유래한 FlaA의 아미노산 서열(서열 번호 1) 및 R. 멜리로티(R.meliloti)에서 유래한 FlaA 아미노산 서열(서열 번호 2)을 도시한다.
도 6A 및 도 6B는 pRL20 및 pRM40을 선형화하는데 이용되는 고유 제한 부위의 위치를 도시한다.
도 7A, 7B, 7C 및 7D는 시험관내 이형 두가닥 사슬 형성과 생체내 복원으로 형성되는 4개의 모자이크 flaA 유전자의 DNA 서열을 도시한다((a)는 서열 번호 3, (b)는 서열 번호 4, (c)는 서열 번호 5, 및 (d)는 서열 번호 5)
도 8은 이형 두가닥 사슬 복원 과정으로 2개의 어버이 유전자로부터의 서열 정보를 함유하는 모자이크 flaA 유전자를 형성하는 방법을 예시한다.
도 9는 특이적 활성이 증강된 액티노플레인 우타헨시스(Actinoplanes utahensis) ECB 데아실라제 돌연변이의 물리적 지도를 도시한다((a)는 돌연변이 7-2에 대한 pM7-2, (b)는 돌연변이 16에 대한 pM16임).
도 10은 돌연변이 7-2 및 돌연변이 16에서 돌연변이를 재조합하여 특이적 활성이 더욱 증강된 ECB 데아실라제 재조합체를 산출하기 위해서 실시예 2에 사용된 절차를 예시한다.
도 11은 야생형 ECB 데아실라제 및 개선된 돌연변이체인 돌연변이 7-2, 돌연변이 16 및 재조합된 돌연변이 15의 특이적 활성을 도시한다.
도 12는 돌연변이 7-2 및 돌연변이 16의 어버이 서열에 대한 재조합된 ECB 데아실라제 돌연변이 15내 DNA 염기 변화 및 아미노산 치환 위치를 도시한다.
도 13a, 13b, 13c, 13d 및 13e는 시험관내 이형 두가닥 사슬 형성 및 생체내 복원으로 형성된 A.우타헨시스 ECB 데아실라제 유전자 돌연변이 M-15 유전자의 DNA 서열을 도시한다(서열 번호 7).
도 14는 RC1 및 RC2내 돌연변이를 재조합하여 열안정성 서브틸리신 E를 산출하기 위해 실시예 3에 사용된 과정을 예시한다.
도 15는 RC1 및 RC2의 서열과, 실시예 3에 개시된 바와 같은 두가닥 사슬 형성의 반응 생성물의 형질전환체로부터 무작위적으로 선택한 10개의 클론을 도시한다. x는 RC1 및 RC2 사이에 상이한 염기 위치에 해당한다. 995에서의 돌연변이는 서브틸리신 단백질 서열의 181번에서의 아미노산 치환에 해당하고, 1107에서의 돌연변이는 서브틸리신 단백질 서열의 218번 위치에서의 아미노산 치환에 해당한다.
도 16은 이형 두가닥 사슬 형성 및 초기 활성(Ai) 및 잔여 활성(Ar)에 대한 복원에 의해 형성된 라이브러리로부터의 400개 클론의 검색 결과를 도시한다. Ai/Ar을 사용하여 효소 열안정성을 평가하였다. 활성 변형체로부터 얻은 데이타를 분류하고 내림순으로 플롯하였다. 약 12.9%의 클론은 N181D 및 N218S 돌연변이를 포함하는 이중 돌연변이에 해당하는 표현형을 나타낸다.
정의
일반적으로, 검색은 2 단계 과정으로 이루어지는데, 제1 단계는 세포를 물리적으로 분리하고, 제2 단계는 세포가 목적하는 성질을 보유하는지 아닌지를 결정한다. 선별이란, 기타 세포는 죽는 반면 마커를 발현하는 세포가 생존하는(또는 역으로 마커 발현 세포는 죽는 반면 기타 세포는 생존하는) 일부 유전자 환경에서 선별 마커 발현으로 확인 및 물리적 분리를 동시에 수행하는 검색 형태이다. 검색 구성원의 예로는 루시퍼라제, β갈락토시다제 및 녹색 형광 단백질이 있다. 선별 마커로는 약물 및 독소 내성 유전자를 포함한다. 자발적 선별이 자연 진화 과정에서 발생할 수 있지만, 본 방법에서 선별은 사람이 수행한다.
외인성 DNA 분절이란 세포에 대해 외래성(또는 이종성)이거나 또는 세포에 상동성이지만 그 성분이 대개 존재하지 않는 숙주 세포 핵산내 위치에 존재하는 것이다. 외인성 DNA 분절은 발현되어 외인성 폴리펩티드를 산출한다.
유전자라는 용어는 광범위하게는 생물학적 기능과 관련된 임의의 DNA 분절을 의미한다. 따라서, 유전자는 발현에 필요한 암호 서열 및/또는 조절 서열을 포함한다. 유전자는, 예컨대 기타 단백질에 대한 인지 서열을 형성하는 비발현 DNA 분절을 포함한다.
"야생형"은 핵산 단편이 임의의 돌연변이를 포함하지 않는다는 것을 의미한다. "야생형" 단백질은 단백질이 천연에서 발견되는 활성 레벨로 활성을 갖는다는 것을 의미하며, 통상적으로 천연에서 발견되는 아미노산을 포함한다. "야생형" 또는 "어버이 서열"은 본 발명의 조작 전의 개시 서열 또는 기준 서열을 의미하는 것일 수 있다.
"실질적으로 순수한"은 대상 종이 존재하는 우성 종(즉, 몰 단위에서 조성물내 임의의 개별적인 기타 거대 분자 종보다 더욱 풍부한 종)을 의미하며, 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획은 대상 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 약 50% 이상(몰단위)을 포함하는 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물내 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80∼90% 이상을 포함한다. 더욱 바람직하게는 대상 종은 실질적으로 균질하게 정제되어(오염종은 통상의 검출 방법으로는 조성물에서 검출될 수 없음) 조성물이 주로 단일 거대분자 종으로 구성된다. 용매 종, 소분자(〈500 달톤) 및 원소 이온 종은 거대분자 종으로서 간주되지 않는다.
서열 동일성(%)은 비교창에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 서열 염기가 양 서열에서 발생하여 다수의 정합 위치를 산출하는 위치의 갯수를 결정한 다음, 정합 위치의 수를 비교창에서 그 위치의 총수로 나누어 계산한다.
비교창의 정렬에 대한 서열의 최적 정렬은 알고리즘 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA[미국 위스콘신주 위스콘신 제네틱 소프트웨어 패키지 릴리즈 7.0 제네틱 컴퓨터 그룹 575 사이언스, 닥터 매디슨]의 컴퓨터 실행으로 수행할 수 있다.
자연발생적이라는 용어는 인간이 인공적으로 만들어낸 것과는 다른 천연에서 발견될 수 있는 대상을 설명하는데 사용된다. 예를 들어, 천연에서 공급원으로부터 분리할 수 있고 실험실에서 인간이 의도적으로 변형시키지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연발생적이다. 일반적으로, 자연발생적은 그 종에는 전형적인, 비병원성(질병이 없는) 개체에 존재하는 대상을 의미한다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계가 있는 경우 작동가능하게 결합된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인헨서는 암호 서열의 전사를 증가시키면 암호 서열에 작동가능하게 결합된 것이다. 작동가능하게 결합된다는 것은 결합되는 DNA 서열이 통상적으로 인접해있고, 2개의 단백질 암호화 영역을 결합시킬 필요가 있는 경우에는 인접하고 리딩 프레임내에 있어야 한다는 것을 의미한다. 그러나, 프로모터가 수 킬로베이스로 분리되는 경우 일반적으로 인헨서가 기능하기 때문에, 인트론 서열은 가변 길이일 수 있고, 일부 폴리뉴클레오티드 성분은 작동가능하게 결합되나 인접하지 않을 수 있다.
예컨대 리간드 및 수용체간의 특이적 결합 친화도는 1 ×106M-1이상의 결합 친화도를 의미한다.
본원에서 사용한 "동족의"는 종간에 진화적으로 및 기능적으로 관련된 유전자 서열을 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들자면, 인간 게놈에서 인간 CD4 유전자는 마우스 CD4 유전자와 동족 유전자이다. 왜냐하면 2개의 유전자 사이의 서열 및 구조로부터 2개의 유전자가 고도의 상동성이 있음을 알 수 있고, 2개의 유전자가 MHC 클래스 II 제한 항원 인식을 통해 T 세포 활성화를 신호화하는데 기능하는 단백질을 암호화하기 때문이다.
"이형 두가닥 사슬(heteroduplex)"이라는 용어는 상이한 어버이 두가닥 사슬 분자로부터 유도된 상보성 1본쇄 사이의 염기 대합으로 형성된 하이브리드 DNA를 의미하며, "동형 두가닥 사슬(homoduplex)"은 동일한 어버이 두가닥 사슬 분자로부터 유도된 상보성 1본쇄 사이의 염기 대합으로 형성된 2본쇄 DNA를 의미한다.
두가닥 사슬 DNA에서 "틈(nick)"이란 한 가닥상의 2개의 인접 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 결합의 부재를 의미한다. 두가닥 사슬 DNA내 "갭"은 두가닥 사슬 중 1 가닥내 하나 이상의 뉴클레오티드의 부재를 의미한다. 두가닥 사슬 DNA내 "루프"는 한 가닥내 쌍을 이루지 않은 하나 이상의 뉴클레오티드를 의미한다.
돌연변이 또는 변형 서열은 1 이상의 위치에서 야생형 또는 기준 서열과 다른, 야생형 또는 기준 서열로부터 유래한 실질적인 변형을 나타내는 서열을 의미한다.
상세한 설명
1. 개론
본 발명은 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법에 대한 기질은 서로 유사성 영역을 포함하지만 상이한 점(들) 또는 영역도 갖는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 변형체의 군이다. 기질은 유사성 영역에서 시험관내 어닐링된다. 어닐링은 초기 기질을 재생시키거나 또는 이형 두가닥 사슬을 형성할 수 있으며, 성분 가닥은 상이한 어버이에서 유래한다. 어닐링 생성물을 DNA 복원 효소에 노출시키고, 임의적으로 부정합 대합을 복원하는 복제계에 노출시킨다. 어닐링된 생성물을 숙주 세포내로 형질전환시키고 숙주 DNA 복원계에 노출시키는 경우와 같이 생체내 노출시킬 수 있다. 대안적으로, 어닐링된 생성물을 기능성 DNA 복원계를 함유하는 세포 추출물에 노출시키는 경우와 같이 시험관내 노출시킬 수 있다. DNA 복원계에 대한 이형 두가닥 사슬의 노출은 DNA 부정합에 기인한 이형 두가닥 사슬의 볼록부에서 DNA를 복원한다. 복원 과정은 가닥 사이의 다양성의 비상호 변화를 촉진한다는 점에서 상동성 재조합과는 다르다. DNA 복원 과정은 통상적으로 이형 두가닥 사슬 분자의 두개의 성분 가닥에 대해 실시하며, 임의의 특정 부정합에서 가닥의 복원은 통상적으로 무작위적이다. 따라서, 생성 군은 어버이 가닥 사이의 차이 지점의 거의 무작위한 재분류를 행한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드군은 목적하는 성질을 획득했는지 여부에 대해 검색한다. 그 성질은 폴리뉴클레오티드 그 자체의 성질, 예컨대 단백질에 결합하는 DNA 분자의 능력이거나, 또는 이의 발현 생성물, 예컨대 mRNA 또는 단백질의 성질일 수 있다.
II. 재편성용 기질
재편성용(shuffling) 기질은 기준 서열과 유사성을 갖는 일부 영역과 기타 차이 영역(들) 또는 지점(들)을 나타내는 기준 폴리뉴클레오티의 변형체이다. 유사성 영역은 폴리뉴클레오티드의 어닐링을 지지하기에 충분하여 안정한 이형 두가닥 사슬을 형성할 수 있어야 한다. 변형체 형태는 종종 서로 실질적인 서열 동일성을 나타낸다(예, 50% 이상, 75% 이상, 90% 이상 또는 99% 이상). 최소한 기질 사이의 다양성이 충분하여 재조합으로부터 출발 물질보다 더욱 다양한 생성물을 형성할 수 있어야 한다. 따라서, 2 이상의 위치에서 차이가 있는 2개 이상의 기질이 있어야 한다. 다양성 정도는 재조합시킬 기질의 길이, 진화시킬 기능 변화 범위에 따라 달라진다. 0.1∼25%의 위치에서의 다양성이 통상적이다. 매우 밀접하게 관련된 유전자 또는 심지어 더 먼 관계에 있는 유전자 또는 유전자 세트로부터 유래한 서열의 전체 부분의 돌연변이의 재조합은 진화율을 증가시키고 바람직한 신규 성질 획득을 개선시킬 수 있다. 키메라 또는 모자이크 유전자를 형성하는 재조합은 2 이상의 어버이 유전자의 바람직한 특징을 단일 유전자 또는 유전자 세트에 조합하거나 또는 어버이에서 발견되지 않는 신규 기능 특징을 형성하는데 유용할 수 있다. 조합하고자 하는 상이한 기질의 수는 2 내지 10, 100, 1000, 또는 105이상, 107이상 또는 109이상의 구성원을 갖는 크기로 광범위할 수 있다.
돌연변이를 갖는 특정 핵산 서열의 초기 소군은 여러 상이한 방법으로 형성할 수 있다. 착오 가능성이 높은(error-prone) PCR로 돌연변이를 형성할 수 있다. 착오 가능성이 높은 PCR은 낮은 레벨의 점 돌연변이가 긴 서열에 걸쳐 무작위로 도입되도록 하는 저 충실도 중합 반응 조건을 사용한다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 지향성 돌연변이 유발로 주형 폴리뉴클레오티드내로 돌연변이를 도입할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 지향성 돌연변이유발법에서, 폴리뉴클레오티드의 단 서열은 제한 효소 분해를 이용하여 폴리뉴클레오티드로부터 제거하고 각종 염기를 원서열로부터 변형시킨 합성 폴리뉴클레오티드로 대체한다. 폴리뉴클레오티드 서열은 화학적 돌연변이유발법으로 변경할 수 있다. 화학적 돌연변이원의 예로는 아황산수소나트륨, 아질산, 히드록실아민, 히드라진 또는 포름산 등이 있다. 뉴클레오티드 전구체의 유사체인 기타 제제로는 니트로소구아니딘, 5-브로모우라실, 2-아미노푸린 또는 아크리딘 등이 있다. 일반적으로, 이들 제제를 뉴클레오티드 전구체 대신 PCR 반응에 첨가하여 서열에 돌연변이를 유발한다. 삽입제, 예컨대 프로플라빈, 아크리플라빈, 퀴나크린 등을 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오디드 서열의 무작위 돌연변이 유발법은 X선 또는 자외선으로 조사하여 수행할 수 있다. 일반적으로, 돌연변이 유발된 플라스미드 DNA 또는 DNA 단편을 E.콜리내로 도입하여 돌연변이 플라스미드의 푸울 또는 라이브러리로서 증식시킨다.
대안적으로, 특정 핵산의 혼합된 소군은 상이한 관련 종에서 유래한 동일한 유전자(즉, 동족 유전자) 또는 동일한 유전자의 상이한 대립 유전자의 형태로 천연에서 발견될 수 있다. 대안적으로, 기질은 관련되어 있으나, 면역글로불린 유전자와 같은 비대립 유전자일 수 있다. 다양성은 전술한 재조합 또는 재편성의 결과일 수 있다. 다양성은 대체 암호 사용으로 천연 단백질을 암호화하는 유전자를 재합성함으로써 초래될 수 있다.
출발 기질은 진화시키고자 하는 서열의 변형 형태를 암호화한다. 일부 방법에서, 기질은 신규 또는 변형 특징의 진화가 바람직한 단백질의 변형 형태를 암호화한다. 기타 방법에서, 기질은 복유전자 경로를 구성하는 다수의 유전자의 변형 형태를 암호화할 수 있다. 이러한 방법에서 변형은 하나 또는 임의 수의 성분 유전자에서 발생할 수 있다. 기타 방법에서 기질은 진화시키고자 하는 변형체 분절을 DNA 또는 RNA 결합 서열로서 포함할 수 있다. 출발 기질이 암호 서열을 포함하는 이 방법에서, 발현에 필요한 임의의 필수적인 조절 서열, 예컨대 프로모터 또는 폴리아데닐화 서열이 기질의 성분으로서 존재할 수 있다. 대안적으로, 이러한 조절 서열은 기질의 클로닝에 사용되는 벡터의 성분으로서 제공될 수 있다.
출발 기질은 길이가 약 50, 250, 1000, 10,000, 100,000, 106또는 그 이상의 염기로 다양할 수 있다. 출발 기질은 2본쇄 또는 1본쇄 형태로 제공될 수 있다. 출발 물질은 DNA 또는 RNA나 이의 유사체일 수 있다. DNA인 경우, 출발 기질은 게놈 또는 cDNA일 수 있다. 기질이 RNA인 경우, 기질은 통상적으로 이형 두가닥 사슬을 형성하기 전에 cDNA로 역전사된다. 기질은 클로닝된 단편, 화학적으로 합성된 단편 또는 PCR 증폭된 생성물로서 제공될 수 있다. 기질은 염색체, 플라스미드 또는 바이러스 공급원으로부터 유도할 수 있다. 일부 방법에서, 기질은 연쇄 형태로 제공된다.
III. 이형 두가닥 사슬을 형성하는 절차
이형 두가닥 사슬은 DNA 기질을 변성시키고, 어닐링 조건하에 항온처리하여 2본쇄 DNA 기질로부터 형성된다. 이형 두가닥 사슬 형성을 위한 하이브리드화 조건은 서열 의존성이며, 환경에 따라 다르다. 더 긴 서열은 고온에서 특이적으로 하이브리드화한다. 일반적으로 하이브리드화 조건은 지정 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm) 보다 낮은 약 25℃에서 선택된다. Tm은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 평형에서 표적 서열에 하이브리드화하는 온도(지정 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에서)이다.
2본쇄 기질의 변성 및 재생 조건의 예는 다음과 같다. 동몰 농도(∼1.0∼5.0 nM)의 기질을 1 ×SSPE 완충액(180 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 10 mM NaH2PO4, pH 7.4)에서 혼합한다. 10분 동안 96℃에서 가열한 후에, 반응 혼합물을 5 분 동안 0℃에서 즉시 냉각한다. 그 다음 혼합물을 2∼6 시간 동안 68℃에서 항온처리한다. 변성 및 재어닐링은 NaOH와 같은 변성제를 첨가 및 제거하여 수행할 수 있다. 이 과정은 1본쇄 DNA 기질에 대한 절차와 동일하지만, 단 짧은 서열에 대한 변성 단계는 생략할 수 있다.
이형 두가닥 사슬 형성에 대한 기질을 적절히 고안하여, 개선된 어버이 동형 두가닥 사슬에 대하여 이형 두가닥 사슬을 선별할 수 있다. 동형 두가닥 사슬은 어버이 기질을 재구성하여 후속되는 검색 단계에서 효과적으로 재조합 생성물을 희석한다. 일반적으로 이형 두가닥 사슬은 개방된 환형으로 형성되고 동형 두가닥 사슬은 선형 분자로서 형성되도록 기질을 고안하여 선별한다. 후속되는 형질전환 단계는 환형의 이형 두가닥 사슬을 실질적으로 풍부하게 한다(예, 100 배).
도 1은 별도의 벡터내 2개의 기질 서열이 2개의 상이한 프라이머 세트(P1, P2 및 P3, P4)를 사용하여 PCR 증폭되는 방법을 도시한다. 통상적으로, 제1 및 제2 기질은 동일한 벡터의 별도의 카피내로 삽입된다. 2개의 상이한 프라이머쌍은 2개의 벡터상에 상이한 지점에서 증폭을 개시한다. 도 1은 P1/P2 프라이머쌍이 기질과 벡터의 2개의 경계선 중 하나에서 증폭을 개시하고, P1/P2 프라이머쌍은 제2 벡터의 다른 경계선에서 복제를 개시한다는 것을 보여준다. 각 프라이머 쌍에서 2개의 프라이머는 환형 플라스미드 주변의 반대 방향으로 증폭을 도모한다. 이 증폭에 의해 생성된 증폭 생성물은 제1 기질 및 제2 기질이 벡터의 대향 말단에서 발생하는 선형화된 2본쇄 벡터 분자이다. 증폭 생성물을 혼합하고, 변성 및 어닐링시킨다. 혼합 및 변성은 어느 쪽 순서로도 수행할 수 있다. 재어닐링은 2개의 선형 동형 두가닥 사슬과, 각 가닥내 하나의 틈을 함유하는 개방된 환형의 이형 두가닥 사슬을 PCR 증폭 개시점에서 형성한다. 증폭 생성물을 숙주 세포내로 도입하면 이형 두가닥 사슬은 동형 두가닥 사슬 보다 더 효과적으로 형질전환되기 때문에 동형 두가닥 사슬에 대하여 이형 두가닥 사슬을 선별할 수 있다.
상기 계획에서 증폭이 기질 및 잔여 벡터사이의 계면에서 개시되는 것이 필수 조건은 아니다. 그 보다는 증폭은 기질을 보유하는 2개 벡터의 임의 지점에서 개시할 수 있다. 단 증폭은 벡터 사이의 상이한 지점에서 개시되어야 한다. 일반적인 경우, 이러한 증폭은 제1 및 제2 기질이 각각 벡터의 잔여 부분에 비하여 상이한 위치를 점유하는 2개의 선형화된 벡터를 형성한다. 변성 및 재어닐링은 도 1에 도시된 바와 유사한 이형 두가닥 사슬을 형성한다. 단 틈은 플라스미드와 기질 사이의 계면에서보다 벡터 성분내에서 발생한다. 벡터의 기질 성분 외의 증폭 개시는 벡터에 의해 생긴 기질 특이적인 프라이머를 설계할 필요가 없다는 것이 그 장점이다.
도 1은 2개의 기질에 대해 예시하였지만, 상기 방법을 임의의 수의 기질에 대한 방법으로 확장할 수 있다. 예를 들어, 기질을 보유하는 벡터의 초기 군을 2개의 푸울을 나눌 수 있다. 하나의 푸울은 한 세트의 프라이머로부터 PCR 증폭시키고, 다른 푸울은 또 다른 프라이머로부터 증폭시킨다. 증폭 생성물은 전술한 바와 같이 변성 및 어닐링시킨다. 제1 푸울내 임의의 기질로부터 유래한 한 가닥과 제2 푸울내 임의의 기질로부터 유래한 한 가닥을 포함하는 이형 두가닥 사슬을 형성할 수 있다. 대안적으로, 벡터의 다중 카피내로 클로닝시킨 3 이상의 기질은 상이한 지점에서 출발하는 각 벡터내 증폭으로 증폭을 수행할 수 있다. 각 기질의 경우, 이 과정은 인접 벡터 DNA가 기질의 2 면으로 나뉘는 방법에 따라 다양한 증폭 생성물을 형성한다. 예를 들어, 하나의 증폭 생성물은 기질의 한 면에 벡터의 대부분을 보유하고, 다른 증폭 생성물은 기질의 다른 면에 벡터의 대부분을 보유한다. 또한, 증폭 생성물은 기질에 인접한 벡터 서열의 동일한 분할면을 보유할 수 있다. 후속되는 어닐링 단계에서, 기질 가닥은 임의의 다른 기질의 가닥과 환형의 이형 두가닥 사슬을 형성할 수 있고, 동일한 기질의 가닥은 서로 재어닐링되어 선형 동형 두가닥 사슬을 형성할 수 있다. 도 1에 도시된 방법을 여러번 반복 수행하여 다중 기질의 변형을 추가로 수행할 수 있다. 제1 반복 후에, 벡터내 재조합체 폴리뉴클레오티드는 벡터의 추가의 카피내로 병입된 제3 기질과 이형 두가닥 사슬 형성을 진행할 수 있다. 재조합 폴리뉴클레오티드를 보유한 벡터와 제3 기질을 보유한 벡터는 상이한 프라이머쌍으로부터 별도로 PCR 증폭된다. 증폭 생성물은 변성 및 어닐링된다. 이 과정을 수회 더 반복하여 또 다른 기질과 재조합시킬 수 있다.
이형 두가닥 사슬 형성에 대한 대안적인 방법은 도 2에 도시되어 있다. 여기서, 제1 및 제2 기질은 벡터의 별도의 카피내로 병입된다. 그 다음 2개의 카피를 각각 상이한 제한 효소로 분해한다. 도 2는 제한 효소가 기질과 벡터 사이의 반대 경계에서 절단시키지만, 상이한 위치를 절단시키는 2개의 상이한 제한 효소를 사용해야 하는 배열을 나타낸다. 분해시켜 제1 및 제2 기질을 보유하는 선형화된 제1 및 제2 벡터를 형성하며, 제1 및 제2 기질은 잔여 벡터 서열에 비하여 상이한 위치를 점유한다. 변성 및 재어닐링은 개방 환형의 이형 두가닥 사슬 및 선형 동형 두가닥 사슬을 형성한다. 이 방법은 도 1에 대하여 개시된 것과 유사한 전략을 사용하여 2 이상의 기질간의 재조합으로 확대할 수 있다. 하나의 변형에서, 기질의 2개의 푸울을 형성하고, 각각을 벡터내로 별도로 클로닝시킨다. 그 다음 2개의 푸울을 상이한 효소로 절단하고, 2개의 기질에 대한 어닐링을 진행한다. 또 다른 변형예에서, 3 이상의 기질을 벡터의 3 이상의 카피내로 클로닝하고, 3 이상의 생성 분자를 3 이상의 효소로 절단함으로서, 3이상의 부위에서 절단시킨다. 이는 벡터내 기질 부분과 인접한 벡터 서열의 분할과 다른 3개의 상이한 선형화된 벡터 형태를 형성한다. 대안적으로 임의의 수의 기질은, 각 회에서 새로운 기질과의 재조합 어닐링의 1회의 생성물과 반복하여 쌍을 짓는 방식으로 재조합시킬 수 있다.
또 다른 변형예에서, 이형 두가닥 사슬을 무벡터형내 기질 분자로부터 형성한 후, 벡터내로 클로닝시킬 수 있다. 이는 도 3에 도시된 바와 같이 제1 및 제2 기질의 비대칭 증폭으로 달성할 수 있다. 비대칭 또는 단일 프라이머 PCR은 두가닥 사슬 중 한 가닥만을 증폭시킨다. 프라이머를 적절히 선별하여, 반대 가닥을 2개의 상이한 기질로부터 증폭시킬 수 있다. 증폭 생성물의 재어닐링시, 이형 두가닥 사슬은 2개의 기질의 반대 가닥으로부터 형성된다. 단지 하나의 가닥만이 각 기질로부터 증폭되기 때문에, 재어닐링은 다시 동형 두가닥으로 만들지 않는다(소량의 비증폭된 기질 제외). 이 과정은 도 1에 관하여 개시된 바와 유사한 전략을 사용하여 임의의 수의 기질의 재조합 분야로 그 범위를 확장할 수 있다. 예를 들어, 기질을 2개의 푸울로 나누고, 각 푸울은 동일한 비대칭 증폭을 수행함으로써, 하나의 푸울의 증폭 생성물만이 다른 푸울의 증폭 생성물과 어닐링할 수 있고, 서로는 어닐링할 수 없다. 대안적으로, 재편성은 반복 방식으로 쌍을 지어 진행될 수 있으며, 제1 및 제2 기질의 이형 두가닥 사슬로부터 형성된 재조합체는 제3 기질과 이형 두가닥 사슬을 형성한다. 점 돌연변이는 PCR 증폭 과정에서 소정 레벨로 도입될 수 있다.
도 4는 동형 두가닥 사슬에 대하여 이형 두가닥 사슬을 선별하는 또 다른 접근 방법을 도시한다. 제1 및 제2 기질은 별도의 벡터로부터 PCR 증폭으로 분리된다. 기질을 변성시키고 어닐링시켜 이형 두가닥 사슬 및 재구성된 동형 두가닥 사슬을 모두 형성한다. 어닐링 생성물은 제한 효소 X 및 Y로 분해한다. X는 제1 기질내 부위이지만 제2 기질내 부위는 아니며, Y는 제2 기질내 부위이지만 제1 기질내 부위는 아니다. 효소 X는 제1 기질에서 유래한 재구성된 동형 두가닥 사슬을 절단하고, 효소 Y는 제2 기질에서 유래한 재구성된 동형 두가닥 사슬을 절단한다. 효소는 이형 두가닥 사슬을 절단하지 않는다. 이형 두가닥 사슬은 제1 및 제2 기질의 말단에 인접한 부위를 갖는 효소 A 및 B로 추가 절단하고, A 및 B를 이용한 분해로부터 생긴 말단에 적합한 점착 말단을 갖는 벡터내로 생성물을 결찰시켜 동형 두가닥 사슬의 제한 단편으로부터 효과적으로 분리할 수 있다. A 및 B로 절단된 이형 두가닥 사슬만을 벡터와 결찰시킬 수 있다. 이형 두가닥 사슬은 겔에서 크기 선별로 동형 두가닥 사슬의 제한 단편으로부터 분리할 수 있다. 상기 과정은 N개 효소로 이형 두가닥 사슬 및 동형 두가닥 사슬의 혼합물을 절단하여 N개 기질로 일반화시는데, 각 효소는 하나의 상이한 기질을 절단하고 다른 기질은 절단하지 않는다. 이형 두가닥 사슬은 지향적 클로닝으로 형성할 수 있다. 이형 두가닥 사슬 형성에 대한 2개의 기질은 염색체 DNA의 PCR 증폭으로 얻고, 선형 벡터의 대향 말단에 연결할 수 있다. 지향성 클로닝은 2개의 상이한 효소로 벡터를 분해하고, 벡터를 절단하는데 사용되는 2개의 효소 중 하나의 점착 말단에 적합하게 제1 및 제2 기질을 분해 또는 채택하여 달성할 수 있다. 따라서, 제1 및 제2 기질은 선형화된 벡터 단편의 반대 말단에서 결찰시킬 수 있다. 이 방법은 도 1에 도시된 것과 유사한 원리를 사용하여 임의 수의 기질에 대해 확장할 수 있다. 예를 들어, 기질을 2개의 푸울로 나누고 벡터에 결찰시킨다. 대안적으로, 제1 및 제2 기질의 이형 두가닥 사슬 형성으로 형성된 재조합 생성물은 제3 기질과의 이형 두가닥 사슬 형성을 진행할 수 있다.
IV 벡터 및 형질전환
일반적으로, 기질은 이형 두가닥 사슬 형성 단계 전 또는 후에 벡터내로 병입시킨다. 통상적으로 유전자 조작에 사용되는 각종 클로닝 벡터가 적절하다.
해당 DNA 분절을 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 표준 방법으로 숙주 세포내로 전달할 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질전환법은 일반적으로 원핵 세포에 이용되는 반면, 인산 칼슘 처리, 리포펙틴 또는 전기사출법은 기타 세포 숙주에 이용할 수 있다. 포유류 세포의 형질전환에 사용되는 기타 방법으로는 폴리브렌의 사용, 원형질체 융합, 리포좀, 전기사출 및 미세주사법과 바이오리시틱스(biolisitics)가 있다(일반적으로 Sambrook 등의 문헌 참조). 바이러스 벡터를 시험관내에서 패키징하여 감염으로 도입할 수 있다. 벡터는 숙주 세포에 따라 선택한다. 일반적으로 적절한 벡터는 목적하는 숙주 세포내에서 인식되는 복제 기점, 숙주 세포내에서 발현시킬 수 있는 선별 마커 및/또는 재편성하고자 하는 기질내 유전자 발현을 지지하는 조절 서열을 갖는다.
V. 숙주 세포 유형
일반적으로 세포내로 도입된 이형 두가닥 사슬의 DNA 복원 및 복제를 지지할 수 있는 임의 유형의 세포를 사용할 수 있다. 구체적인 해당 세포는 유전자 조작에 통상적으로 사용되는 표준 세포 유형이며, 예컨대 박테리아, 구체적으로 E.콜리(16,17)이다. 적절한 E.콜리 균주의 예로는 E.콜리 mutS, mutL, dam-, 및/또는 recA+, E.콜리 XL-10-골드([TetrΔ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte][F' proAB Lac1qZΔM15 Tn10(Tetr) Amy Camr]), E.콜리 ES1301 murS[유전자형: lacZ53, mutS201::Tn5, thyA36. rha-5, metB1, deoC, IN(rrnD-rrnE)](20, 24, 28-42)가 있다. 바람직한 E.콜리 균주의 예로는 E.콜리 SCS110[유전자형:rpsl, (Strr), thr, leu, enda, thi-1, lacy, galk, galt, ara tona, tsx, dam, dcm, supE44, Δ(lac-proAB), [F.traD36, proA_B_lac1qZΔM15]가 있으며, 보통의 세포 부정합 복원계를 갖는다(17). 이 균주 유형은 이형 두가닥 사슬에서 가닥 특이적 선호도를 나타내지 않고 부정합 및 비정합을 복원한다. 또한, 이 균주는 dam-및 dcm-이기 때문에, 이 균주로부터 분리된 플라스미드는 비메틸화되고, 따라서 DNA 두가닥 형성/부정합 복원을 추가로 수행할 수 있다(후술). 기타 적절한 박테리아 세포는 그람 음성 및 그람 양성, 예컨대 바실러스(Bacillus). 슈도모나스(Pseudomonas) 및 살모넬라(Salmonella) 등이 있다.
진핵 유기체는 부정합 복원을 수행할 수 있다(43-48). 원핵 및 진핵 세포에서의 부정합 복원계는 DNA 복제 과정에서 유전자 충실도 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 원핵 세포에서 부정합 복원에 중요한 역할을 하는 일부 유전자, 특히 mutS 및 mutL은 진핵세포, 유전자 재조합의 결과 및 게놈 안정성에서 유사하다. 야생형 또는 돌연변이 S. 세레비시에는 COS-1 원숭이 세포(57)를 보유하는 경우 이형 두가닥 사슬의 부정합 복원을 수행하는 것으로 확인되었다(49-56). 바람직한 효모 균주는 피치아(Picchia) 및 사카로마이시스(Saccharomyces)이다. 포유류 세포는 쇼트-패치(short-patch) 기작으로 G-T 염기쌍을 G-C 염기쌍으로 복원하는 능력을 갖는다(38, 58-63). 포유류 세포(예, 마우스, 햄스터, 영장류, 인간), 양 세포주 및 영장류 배양물을 사용할 수 있다. 이러한 세포의 예로는 간세포, 예컨대 배야 간세포, 접합체, 섬유아세포, 림프구, 중국산 햄스터 난소(CHO), 마우스 섬유아세포(NIH3T3), 신장, 간, 근육 및 피부 세포가 있다. 기타 해당 진핵 세포로는 식물 세포, 예컨대 옥수수, 벼, 밀, 면화, 대두, 사탕수수, 담배 및 아라비돕시스; 어류, 조류(藻類), 진균류(아스퍼질러스, 포도스포라, 뉴로스포라), 곤충(예, 바큘로레피돕테라) 등이 있다[본원에서 참고로 인용한 Winnacker, "From Genes to Clones," VCH Publishers N.Y.,(1987)].
생체내 복원은 각종 원핵 세포 및 진핵 세포에서 발생한다. 포유류 세포의 사용은 기질이 포유류 세포에서만 발현되는 폴리펩티드를 암호화하는 특정 용도 또는 포유류 세포에 사용하고자 의도한 특정 용도에 유용하다. 그러나, 박테리아 세포 및 효모 세포는 이들 균주에서 얻을 수 있는 더 많은 형질 전환 빈도수로 인한 거대 라이브러리를 검색하는데 유용하다.
V. 시험관내 DNA 복원계
어닐링된 생성물을 숙주 세포내로 도입하는 대신에, 어닐링된 생성물을 시험관내에서 DNA 복원계에 노출시킬 수 있다. DNA 복원계는 복원능이 있는 E.콜리, 효모 또는 기타 임의의 세포로부터 추출물로서 얻을 수 있다(64-67). 복원능 세포는 적절한 완충액에서 세포 용해시키고 뉴클레오티드로 보충한다. DNA는 이 세포 추출물에서 항온처리하고, 복제용 복원능 세포내로 형질전환시킨다.
VI. 검색 및 선별
어닐링된 생성물을 숙주 세포내로 도입한 후에, 숙주 세포를 통상적으로 배양하여 발현시키고자 하는 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 유전자에 대해 복원 및 복제시킨다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 전술한 이형 두가닥 사슬 과정 또는 전술한 기타 재편성 방법을 사용하여 추가의 재조합을 수행할 수 있다. 그러나, 재조합의 1 사이클 또는 수회 사이클 후에, 재조합 폴리뉴클레오티드를 목적하는 성질에 대해 검색 또는 선별할 수 있다. 일부 경우, DNA 복원에 사용되는 동일한 숙주 세포에서 검색 또는 선별을 수행할 수 있다. 기타의 경우, 재조합 폴리뉴클레오티드, 이의 발현 생성물, 발현 생성물이 생성하는 2차 대사물질을 세포로부터 분리하고 시험관내 검색한다. 기타 경우, 재조합 폴리뉴클레오티드는 재조합이 발생하는 숙주 세포로부터 분리하고, 기타 숙주 세포내에서 선별 및 검색한다. 예를 들어, 일부 방법에서, 박테리아 숙주 균주내에서 DNA 복원을 수행하지만, 진핵 세포에서 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현 생성물을 검색하는 것이 유용하다. 검색 또는 선별에서 남게된 이 재조합 폴리뉴클레오티드는 때때로 그 자체가 유용한 생성물이다. 기타 예에서, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는 서로 또는 다른 기질과 추가로 재조합시킨다. 이러한 재조합은 전술한 이형 두가닥 사슬법 또는 임의의 기타 재편성 방법으로 실시할 수 있다. 추가로 1회(또는 수회)의 재조합을 수행한 후 반복 단위로 검색 또는 선별을 수회 더 수행한다. 임의적으로, 선별의 엄중성을 각 회에서 증가시킬 수 있다.
검색 또는 선별의 특성은 획득하고자 하는 목적하는 성질에 좌우된다. 바람직한 효소의 성질의 예로는 고 촉매 활성, 약물에 대한 내성을 부여하는 능력, 고 안정성, 더 광범위한(또는 더 협소한) 기질을 허용하는 능력, 또는 유기 용매와 같은 비천연 환경에서 작용하는 능력 등이 있다. 기타 바람직한 단백질의 성질로는 선별된 표적에 결합하는 능력, 분비능, 주어진 표적에 대한 면역 반응을 생성하는 능력, 면역원성 결핍 및 병원성 미생물에 대한 독성 등이 있다. 바람직한 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 서열의 특징으로는 주어진 단백질 표적에 특이적으로 결합하는 능력, 및 작동가능하게 결합된 암호화 서열의 발현을 조절하는 능력 등이 있다. 상기 성질의 일부, 예컨대 약물 내성은 약물상에서 세포를 평판배양하여 선별할 수 있다. 기타 성질, 예컨대 발현시 조절 서열에 대한 영향은 조절 서열에 결합된 리포터 유전자의 발현 생성물 출현으로 검출하여 검색할 수 있다. 기타 성질, 예컨대 분비시키고자 하는 발현 단백질의 성능은 단백질에 대한 표지된 항체를 사용하여 FACSTM로 검색할 수 있다. 기타 성질, 예컨대 면역원성 또는 면역원성 결핍은 개별 세포 또는 세포의 푸울로부터 단백질을 분리하고, 이 단백질을 시험관내 또는 실험실용 동물에서 분석하여 검색할 수 있다.
VII. 변형체
1. 탈메틸화
대부분의 세포 유형은 일부 방식으로 DNA를 메틸화시키고, 메틸화 패턴은 세포 유형사이에 차이가 있다. 메틸화 부위는 5-메틸시토신(m5C), N4-메틸시토신(m4C) 및 N6-메틸아데닌(m6A), 5-히드록시메틸시토신(hm5C) 및 5-히드록시메틸우라실(hm5U) 등이 있다. E.콜리에서, 메틸화는 Dam 및 Dcm 효소로 수행한다. dam 유전자에 의한 메틸라제는 서열 GATC내 아데닌 잔기의 N6 위치를 메틸화시키고, dcm 유전자에 의한 메틸라제는 서열 CCWGG내 내부 시토신 잔기의 C-5 위치를 메틸화시킨다. 식물 및 포유류에서 유래한 DNA는 종종 CG 메틸화되는데, 이는 CG 또는 CNG 서열이 메틸화됨을 의미한다. 세포 복원시 메틸화의 가능한 효과는 참조 문헌 18-20에 논의되어 있다.
일부 방법에서, 이형 두가닥 사슬 형성용 DNA 기질은 하나 또는 양 가닥, 바람직하게는 양 가닥이 최소한 부분적으로 탈메틸화된다. 기질 DNA의 탈메틸화는 이형 두가닥 사슬의 효과적 및 무작위적 복원을 촉진한다. 한 가닥 dam 메틸화 및 한 가닥 비메틸화로 형성된 이형 두가닥 사슬에서, 복원은 비메틸화된 가닥에 편중되며, 메틸화된 가닥은 보정을 위한 주형으로 작용한다. 가닥이 메틸화되어 있지 않으면, 부정합 복원이 발생하여 무의미한 가닥 선택을 나타낸다(23,24).
탈메틸화는 각종 방법으로 수행할 수 있다. 일부 방법에서 기질 DNA는 PCR 증폭으로 탈메틸화된다. 일부 경우, DNA 탈메틸화는 전술한 이형 두가닥 사슬 형성 절차의 PCR 단계 중 하나에서 수행한다. 기타 방법에서, 추가의 PCR 단계는 탈메틸화시킨다. 기타 방법에서, 탈메틸화는 메틸화 결핍 숙주 세포(예, E.콜리 dam-dcm-균주에 기질 DNA를 통과시켜 실시한다. 기타 방법에서, 기질 DNA는 탈메틸화 효소를 사용하여 시험관내에서 탈메틸화시킨다. 탈메틸화 DNA는 전술한 바와 동일한 절차를 사용하여 이형 두가닥 사슬 형성에 사용한다. 그 다음 이형 두가닥 사슬을 DNA 복원능이 있지만 제한 효소가 결핍된 세포내로 도입하여 비메틸화된 이형 두가닥 사슬의 분해를 방지한다.
2. 틈 밀봉
전술한 이형 두가닥 사슬 형성에 대한 일부 방법은 각 가닥에 틈을 보유하는 환형의 이형 두가닥 사슬을 산출한다. 이들 틈은 숙주 세포내로 이형 두가닥 사슬을 도입하기 전에 밀봉할 수 있다. 표준 결찰 조건하에 DNA 리가아제로 처리하여 밀봉할 수 있다. 결찰은 포스포디에스테르 결합을 형성하여 DNA의 이중 나선 중 한 가닥내 틈으로 분리된 2개의 인접 염기를 연결시킨다. 틈 밀봉은 숙주 세포내로 이형 두가닥 사슬을 도입한 후에 재조합 빈도수를 증가시킨다.
3. 증폭에 부수적인 착오 가능성이 높은 PCR
전술한 일부 구성은 PCR 증폭 단계를 포함한다. 임의로, 이러한 단게는 돌연변이 조건하에 수행하여 기질 사이의 추가의 다양성을 유도할 수 있다.
VIII. 기타 재편성 방법
전술한 이형 두가닥 사슬 형성 방법을 기타 재편성 방법과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 이형 두가닥 사슬 재편성, 검색 또는 선별의 1 사이클 후에 또 다른 방법으로 재편성을 1 사이클 수행하고, 검색 또는 선별의 추가 1 사이클을 수행할 수 있다. 기타 재편성 구성은 WO 95/22625; US 5,605,793; US 5,811,238; WO 96/19256; Stemmer, Science 270. 1510(1995); Stemmer et al., Gene, 164.49-53(1995); Stemmer, Bio/Technology, 13. 549-553(1995); Stemmer, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91. 10747-10751(1994); Stemmer, Nature 370. 389-391 (1994); Crameri et al., Nature Medicine. 2(1):1-3 (1996): Crameri et al., Nature Biotechnology 14, 315-319(1996): WO 98/42727; WO 98/41622; WO 98/05764 및 WO 98/42728. WO 98/27230(각각은 그 전문을 참고로 인용하였다)에 개시되어 있다.
IX. 단백질 유사체
이 방법으로 분리된 단백질은 유도체 화합물 형성을 위한 선도 화합물로서 기능한다. 유도체 화합물은 아미노산의 화학적 변형을 포함하거나 아미노산의 화학 구조를 바꿀 수 있다. 유사체는 주요 기능기를 선도 단백질과 실질적으로 동일한 방식으로 제공하도록 안정화된 전자 배치 및 분자 구조를 가져야 한다. 특히, 비펩티드 화합물은 폴리펩티드 결합 영역과 비견할 만한 공간 전자 특징을 가지지만, 통상적으로 폴리펩티드보다 휠씬 작은 분자이며, 종종 분자량이 약 2CHD 이하, 바람직하게는 약 1 CHD 이하이다. 이러한 비펩티드 화합물은 몇가지 표준 방법, 예컨대 자체일관장(CSF) 분석, 배치간 상호작용(CHI) 분석 및 정상 모드 동적 분석법으로 확인할 수 있다. 이들 기법을 이행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 쉽게 이용할 수 있다. Rein 등, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions(Alan Liss, New York, 1989) 참조.
IX 약학 조성물
상기 방법으로 형성된 폴리뉴클레오티드, 이의 발현 생성물 및 발현 생성물에 의해 그 형성이 촉매되는 2차 대사물질은 약학 조성물로 제형화할 수도 있다. 이러한 조성물은 1종 이상의 활성제와 약학적 허용 담체를 포함한다. 각종 수성 담체, 예컨대 물, 완충된 물, 인산염 완충 염수(PBS), 0.4% 염수, 0.3% 글리신, 인간 알부민 용액 등을 사용할 수 있다. 이들 용액은 멸균되며, 일반적으로 미립자 물질이 없다. 조성물은 생리학적 조건에 접근시키는데 필요한 약학적 허용 보조제, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 독성 조정제 등, 예를 들면 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘을 포함할 수 있으며, 나트륨은 주로 선택되는 특정 투여 방식과 유체 부피, 점도 등을 기준으로 선택된다.
발명의 개요
본 발명은 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 이형 두가닥 사슬을 포함하는 어닐링된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 조건하에서 어버이 폴리뉴클레오티드 변형체의 군을 항온처리하는 단계를 수반한다. 그 다음 이형 두가닥 사슬을 세포 DNA 복원계에 노출시켜 이형 두가닥 사슬을 어버이 폴리뉴클레오티드 변형체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 변형체로 전환시킨다. 생성 폴리뉴클레오티드를 목적하는 성질에 대해 검색 또는 선별한다.
일부 방법에서는, 이형 두가닥 사슬을 시험관내 DNA 복원계에 노출시킨다. 적절한 복원계는 세포 추출물의 형태로 제조할 수 있다.
기타 방법에서, 이형 두가닥 사슬을 비롯한 어닐링 생성물을 숙주 세포내로 도입한다. 따라서, 이형 두가닥 사슬은 생체내에서 숙주 세포의 DNA 복원계에 노출된다.
몇몇 방법에서는, 어닐링된 생성물을 숙주 세포내로 도입하여 동형 두가닥 사슬을 포함하는 형질전환된 세포에 대하여 이형 두가닥 사슬을 선별한다. 예컨대 제1 벡터의 성분으로서 제1 폴리뉴클레오티드 변형체를 제공하여 선별할 수 있으며, 제2 폴리뉴클레오티드 변형체는 제2 벡터의 성분으로서 제공된다. 제1 벡터 및 제2 벡터는, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 변형체가 대향 말단에서 발생하는 선형화된 형태로 전환된다. 항온처리 단계에서, 제1 선형화된 벡터의 1본쇄 형태를 서로 재어닐링시켜 선형 제1 벡터를 만들고, 제2 선형화된 벡터의 1본쇄 형태를 서로 재어닐링시켜 선형 제2 벡터를 만들며, 제1 및 제2 벡터의 1본쇄 선형화된 형태를 서로 어닐링시켜 각 가닥에 틈을 보유하는 환형의 이형 두가닥 사슬을 형성한다. 따라서, 세포내로 생성물을 도입하면 선형 제1 및 제2 벡터에 대해 환형의 이형 두가닥 사슬이 선별된다. 임의적으로, 상기 방법에서 제1 및 제2 벡터는 PCR에 의해 선형화된 형태로 전환시킬 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 벡터는 제1 및 제2 제한 효소로 분해하여 선형화된 형태로 전환시킬 수 있다.
일부 방법에서, 폴리뉴클레오티드 변형체는 2본쇄 형태로 제공되며, 어닐링 단계 전에 1본쇄 형태로 전환된다. 임의로, 제1 및 제2의 2본쇄 폴리뉴클레오티드 변형체의 비대칭 증폭을 수행하여 제1 폴리뉴클레오티드 변형체의 제1 가닥과 제2 폴리뉴클레오티드 변형체의 제2 가닥을 증폭시킴으로써 전환시킬 수 있다. 제1 및 제2 가닥은 항온처리 단계에서 어닐링되어 이형 두가닥 사슬을 형성한다.
일부 방법에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드군은 2본쇄 형태로 제공되며, 이 방법은 제1 및 제2 벡터의 성분으로서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 병입시켜 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 제1 및 제2 벡터의 대향 말단을 점유하도록 하는 단계를 추가로 포함한다. 항온처리 단계에서, 제1 선형화된 벡터의 1본쇄 형태를 서로 재어닐링시켜 선형 제1 벡터를 형성하고, 제2 선형화된 벡터의 1본쇄 형태를 서로 재어닐링시켜 선형 제2 벡터를 형성하였으며, 제1 및 제2 벡터의 1본쇄 선형화된 형태를 서로 어닐링시켜 각 가닥에 틈을 보유하는 환형의 이형 두가닥 사슬을 형성한다. 도입 단계에서, 선형 제1 및 제2 벡터에 대해 환형의 이형 두가닥 사슬을 포함하는 형질전환 세포를 선별한다.
일부 방법에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 염색체 DNA로부터 얻는다. 일부 방법에서, 폴리뉴클레오티드 변형체는 폴리펩티드 변형체를 암호화한다. 일부 방법에서, 폴리뉴클레오티드 변형체의 군은 20개 이상의 변형체를 포함한다. 일부 방법에서, 폴리뉴클레오티드 변형체의 군은 길이가 10 kb이상이다.
일부 방법에서, 폴리뉴클레오티드 변형체는 천연 변형체를 포함한다. 기타 방법에서, 폴리뉴클레오티드 변형체는 돌연변이 유발 PCR 또는 카세트 돌연변이유발법으로 형성된 변형체를 형성한다. 일부 방법에서, 이형 두가닥 사슬이 도입된 숙주 세포는 박테리아 세포이다. 일부 방법에서, 변형 폴리뉴클레오티드 변형체의 군은 서로 서열 동일성이 90% 이상인 5 개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 방법은 변형 폴리펩티드를 최소한 부분적으로 탈메틸화하는 단계를 추가로 포함한다. 탈메틸화는 PCR 증폭이나 변형체의 메틸화 결핍 숙주 세포 통과로 수행할 수 있다.
일부 방법은 이형 두가닥 사슬 분자내 하나 이상의 틈을 봉한 다음 DNA 복원계에 이형 두가닥 사슬을 노출시키는 단계를 추가로 포함한다. DNA 리가아제로 처리하여 틈을 봉할 수 있다.
일부 방법은 검색된 재조합 폴리뉴클레오티드 변형체를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 방법에서, 폴리뉴클레오티드 변형체는 재조합 단백질 또는 이 단백질에 의해 그 생산이 촉진되는 2차 대사물질을 형성하는 지에 대하여 검색한다.
일부 방법에서, 재조합 단백질 또는 2차 대사물질은 담체와 함께 제형화되어 약학 조성물을 형성한다.
일부 방법에서, 폴리뉴클레오티드 변형체는 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 쿠티나제, 셀룰라제, 아밀라제, 옥시다제, 퍼옥시다제 및 파이타제로 구성된 군에서 선택된 효소를 암호화한다. 다른 방법에서, 폴리뉴클레오티드 변형체는 인슐린, ACTH, 글루카곤, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 티모신, 부갑상선 호르몬, 색소 호르몬, 소마토메딘, 에르트로포이에틴, 황체형성 호르몬, 융모막 고나도트로핀, 고시상 방출인자, 항이뇨 호르몬, 갑상선자극 호르몬, 릴렉신, 인터페론, 트롬보포이에틴(TPO) 및 프로락틴으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 암호화한다.
일부 방법에서, 변형 폴리뉴클레오티드의 군내 각 폴리뉴클레오티드는 대사 경로를 형성하는 다수의 효소를 암호화한다.
실시예 1
리조븀 루피니 FlaA 및 리조븀 멜리로티 FlaA의 재조합으로부터 얻은 신규 리조븀 FlaA 유전자
박테리아 편모는 나선형 필라멘트, 기부(基部) 부근의 후크 및 편모 모터를 보유한 기본체를 갖는다(68). 이 기본적인 고안은 E.콜리 및 S.티피뮤리움(S. typhimurium)에서 널리 조사되었으며, 다수의 기타 박테리아 뿐 아니라 일부 시원 세포에도 광범위하게 적용된다. 긴 나선형 필라멘트는 플라겔린 서브유닛으로부터 조립된 중합체이고, 그 분자량은 20,000 내지 65,000으로 박테리아 종에 따라 다양하다(69). 2가지 유형의 편모 필라멘트, 즉 단순형과 복합형은 전자 현미경으로 결정되는 표면 구조로 구별되었다(70). 단순형 필라멘트는 나선이 희미한 평할 표면을 보유하지만, 복합형 필라멘트는 마루와 홈이 교대로 있는 현저한 나선 패턴을 나타낸다. 복합형 편모 필라멘트의 특징으로 인해 점성 매체에서 박테리아를 효과적으로 추진시키는 메짐성이 있고 단단한 구조(함축적으로)가 되는 것으로 생각된다(71-73). 단순형 필라멘티를 갖는 편모는 시계 방향 회전 및 반시계 방향 회전을 번갈아 수행할 수 있으며(68), 모든 알려진 복합형 필라멘트를 갖는 편모는 간헐적으로 중단되면서 시계 방향으로만 회전한다(74). 후자의 이동 패턴이 박테리아 또는 시원 세포에서 발견되기 때문에, 복합형 편모는 고대 기본 운동성 디자인의 공통적인 배경을 반영할 수 있는 것으로 제안되었다(69).
현저한 나선형 밴드가 조절하는 필라멘트의 미세 구조 및 취성에 있어서의 단순형 박테리아 편모와 달라서, 필라멘트는 열 분해에 대한 내성이 있다(72). Schmitt 등(75)은 박테리오파지 7-1-1이 R. 루피니(R.lupini) H13-3의 복합형 편모를 특이적으로 흡수하고 숙주의 생산성 감염을 위한 운동성을 필요로 한다. R.멜리로티 및 R.루피니에서 유래한 플라겔린은 매우 유사하지만, 박테리오파지 7-7-1은 R.멜리로티를 감염시키지 않는다. 현재까지 복합형 편모는 3종류의 토양 박테리아(슈도모나스 로도스(Pseudomonas rhodos)(73), R. 멜리로티(76) 및 R. 루피니 H13-3(70,72))에서만 관찰되었다. R.루피니 13-3 세포는 5 내지 10개의 주모 삽입된 복합형 편모를 보유하는데, 고분해능 전자 현미경 및 광학 회절로 처음 분리 및 분석되었다(70).
Maruyama 등(77)은 복합형 필라멘트내에 있는 소수성 아미노산 잔기의 함량이 높으면 복합형 편모의 비정상적인 성질을 나타내는 주 원인이 된다는 것을 추가로 발견하였다. Trachtenberg 등(73, 78)은 단위 길이당 질량을 측정하고 전자 현미경사진으로부터 3차원적 재구성을 함으로써, R. 루피니의 복합형 필라멘트가 작용성 이량체로 구성된다고 제안하였다. 도 6은 R.루피니 H13-3 FlaA의 추론 아미노산 서열과 R.멜리로티 FlaA의 추론 아미노산 서열을 비교하였다. 완전한 정합은 수직선으로 나타내었으며, 보존적 교환은 콜론으로 나타내었다. 전체 동일성은 56% 였다. R. 루피니 flaA 및 R. 멜리로티 flaA를 시험관내 이형 두가닥 사슬 형성한 다음 생체내에서 복원하여 신규 FlaA 분자 및 구조를 형성하였다.
A. 방법
R.루피니 H13-3 flaA 유전자를 함유하는 pRL20 및 R.멜리로티 flaA 유전자를 함유하는 pRM40은 도 6A 및 도 6B에 도시되어 있다. 이들 플라스미드를 E.콜리 SCS110(dam-형 및 dcm-형 메틸화가 없음)로부터 분리하였다. 약 3.0 pg의 비메틸화된 pRL20 및 pRM40 DNA를 37℃에서 1 시간 동안 각각 BamHI 및 EcoRI로 분해하였다. 아가로스 겔 분리 후에, 선형화된 DNA를 Wizard PCR 프렙 키트(미국 위스콘신주에 소재하는 프로메가)로 정제하였다. 동몰 농도(2.5 nM)의 선형화된 비메틸화 pRL20 및 pRM40을 1 ×SSPE 완충액(180 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH2PO4, pH 7.4)에서 혼합하였다. 10분 동안 96℃에서 가열한 다음, 반응 혼합물을 5 분 동안 0℃에서 즉시 냉각하였다. 혼합물을 2 시간 동안 68℃에서 항온처리하여 이형 두가닥 사슬을 형성하였다.
1 ㎕의 반응 혼합물을 사용하여 50 ㎕의 E.콜리 ES 1301 mutS, E.콜리 SCS110 및 E.콜리 JM109 콤피턴트 세포를 형질전환시켰다. E.콜리 JM109 콤피턴트 세포를 이용한 형질전환 효율은 E.콜리 SCS110의 경우보다 약 7배 정도 높았으며, E.콜리 ES1301 mutS의 경우보다 10배 정도 높았지만, 전체 형질 전환 효율은 폐쇄형, 공유결합된 환형 pUC19 플라스미드로 형질전환시킨 대조군보다는 10∼200배 낮았다.
E.콜리 SCS 110 형질전환체로부터 2개, E.콜리 ES1301 mutS 형질전환체로부터 2개를 무작위 선별하고, 플라스미드 DNA를 이들 4개의 클론으로부터 추가의 DNA 서열 결정 분석을 위해 분리하였다.
B. 결과
도 7은 (a) SCS01(E.콜리 SCS110 형질전환체 라이브러리에서 클론 #1)의 서열, (b) SCS02(E.콜리 SCS110 형질전환체 라이브러리에서 클론 #2)의 서열, (c) ES01(E.콜리 ES1301 형질전환체 라이브러리에서 클론 #1)의 서열 및 (d) ES02(E.콜리 ES1301 형질전환체 라이브러리에서 클론 #2)의 서열을 나타낸다. 모든 4개의 서열은 야생형 R.루피니 flaA 및 R.멜리로티 flaA 서열과 달랐다. 클론 SCS02, ES01 및 ES02는 모두 완전한 개방 해독틀을 함유하지만, SCS01은 절두되었다. 도 8은 재조합이 주로 루프 영역(쌍을 이루지 않은 영역)에서 발생함을 도시한다. R. 멜리로티 flaA 및 R.루피니 flaA로부터 생성된 flaA 돌연변이 라이브러리를 E.콜리 SCS110, ES1301, XL10-골드 및 JM109내로 형질전환시키고, 형질전환체를 기능성 FlaA 재조합체에 대해 검색하였다.
실시예 2
특이 활성이 증강된 변형체에 대한 ECB 데아실라제의 유도 진화
스트렙토마이시스는 다량의 효소 뿐 아니라 여러 중요한 2차 대사물질(예, 여러 항생물질)을 생산하는 능력으로 인하여 가장 중요한 산업용 미생물 중 하나이다. 전술한 방법을 거의 변형시키지 않고 천연 스트렙토마이시스 효소의 유도 진화에 사용할 수 있으며, 대사 경로의 일부 또는 전부의 유전자 뿐 아니라 기타 이종 효소도 스트렙토마이시스에서 발현시킬 수 있다.
신규 항진균제는 거대한 그 수가 증가하고 있는 면역타협성 AIDS, 기관 이식 및 암 화학요법 환자(기회 감염으로 고생하는 환자)에게 중요하다. 아스퍼질러스의 일부 종이 생성하는 리포펩티드인 에시노칸딘 B(ECB)는 유효 항진균제로서 널리 연구되었다. 독성이 상당히 감소된 각종 항진균제는 A.니듈란스(A.nidulans) 에시노카르딘 B의 리놀레산 측쇄를 상이한 아릴 측쇄로 치환하여 생성하였다(79-83). 화학적 아실화를 위한 시클릭 헥사펩티드 ECB 핵 전구체는 액티노플레인 우타헨시스 ECB 데아실라제를 사용하여 ECB를 효소 가수분해하여 얻는다. 온전한 핵내로 ECB의 전환을 최대화하기 위해서, 소량의 혼화성 유기 용매를 사용하여 pH5.5에서 반응시켜 ECB 기질을 용해시킨다. 생성 시클릭 헥사펩티드 핵은 완전히 ECB를 탈아실화하는데 필요한 장시간의 항온처리 과정 동안 pH5.5 이상에서는 불안정하다. 그러나, ECB 데아실라제의 최적 pH는 8.0∼8.5이고, 그 활성은 2.5% 이상의 에탄올의 존재하에 pH5.5에서 감소된다(84). ECB 핵의 생성을 개선시키기 위해서, 이들 처리 관련 조건하에서 ECB 데아실라제의 활성을 증가시킬 필요가 있다.
ECB 데아실라제에 대해 알려진 것은 상대적으로 거의 없다. 효소는 헤테로이량체로서 두개의 서브 유닛이 단일 전구체 단백질의 프로세싱으로부터 유도된다(83). 19.9 kD α-서브유닛은 단일 펩티드를 따라 제거되는 15개 아미노산의 스페이서 펩티드와 천연 유기체내의 또 다른 스페이서 펩티드에 의해 60.4 kD β 서브유닛으로부터 분리된다. 또한, 폴리펩티드는 재조합 ECB 데아실라제에 의해 ECB의 대규모 전환에 사용되는 유기체인 스트렙토마이시스 리비단스(Streptomyces lividans)내 기능성 효소로 발현 및 프로세싱된다. 효소의 3차원적 구조는 결정되지 않았으며, 그 서열은 페닐실린 아실라제와 같은 관련성이 있는 기타 가능한 효소와 거의 유사성이 없어서 ECB 데아실라제를 조작하는 합리적인 노력을 인도하기에 충분히 믿을만한 구조적 모델을 설정하기 어렵다. 따라서, 이 중요한 활성을 개선시키는 유도 진화(85)를 사용하기로 하였다.
2.4 kb ECB 데아실라제 유전자(73% G+C)의 돌연변이 유발 PCR 및 무작위 프라이밍 재조합에 적절한 프로토콜이 최근 개시되어 있다(86). 여기서, 본 발명자들은 특이 활성이 증가된 신규 ECB 데아실라제를 형성하는 이형 두가닥 사슬 재조합의 용도를 추가로 개시하고 있다.
이 경우, 2개의 액티노플레인 우타헨시스 ECB 데아실라제 돌연변이 M7-2 및 M16은 pH 5.5 및 10% MeOH의 존재하에 특이 활성이 높은데, 시험관내 이형 두가닥 사슬 형성 및 생체내 부정합 복원 기법을 사용하여 재조합시켰다.
도 12는 M7-2 및 M16 ECB 데아실라제 돌연변이체에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드 pM7-2 및 M-16의 물리적 지도이다. 돌연변이 M7-2는 플라스미드 pSHP150-2*로부터 발현된 야생형 ECB 데아실라제 유전자를 함유하는 전체 스트렙토마이시스 리비단스 세포상에서 직접 PCR 수행하여 얻었으며, pM7-2를 보유한 스트렙토마이시스는 야생형 ECB 데아실라제를 발현하는 세포의 특이 활성의 1.5배를 나타낸다(86). 클론 pM16은 문헌(86,87)에 개시된 바와 같은 무작위 프라이밍 재조합으로 얻었다. 클론 pM16은 야생형 ECB 데아실라제 클론의 특이 활성의 2.4배를 나타낸다.
A. 방법
M7-2 및 M16 플라스미드 DNA(p7-2 및 pM16)(도 9)를 E.콜리 SCS110(개별 반응)으로부터 정제하였다. 약 5.0 ㎍의 비메틸화된 M7-2 및 M16 DNA를 37℃에서 1시간 동안 각각 XhoI 및 PshI로 분해하였다(도 10). 아가로스 겔 분리 후에, 선형화된 DNA는 Wizard PCR 프렙 키트(미국 위스콘신주에 소재하는 프로메가)를 사용하여 정제하였다. 동몰 농도(2.0 nM)의 선형화된 비메틸화 pM7-2 및 pM16 DNA를 1 ×SSPE 완충액(180 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH2PO4, pH 7.4)에서 혼합하였다. 10분 동안 96℃에서 가열한 다음, 반응 혼합물을 5 분 동안 0℃에서 즉시 냉각하였다. 혼합물을 3 시간 동안 68℃에서 항온처리하여 이형 두가닥 사슬 형성을 촉진하였다.
1 ㎕의 반응 혼합물을 사용하여 50 ㎕의 E.콜리 ES 1301 mutS, E.콜리 SCS110 및 E.콜리 JM109 콤피턴트 세포를 형질전환시켰다. E.콜리 ES1301 musS로부터 유래한 모든 형질전환체를 모으고, E.콜리 SCS110을 모았다. 플라스미드 푸울을 각 푸울된 라이브러리로부터 분리하고, 이 푸울을 사용하여 S.리비단스 TK23 원형질체를 형질전환시켜 데아실라제 활성 검색에 대한 돌연변이 라이브러리를 형성하였다. S.리비단스 TK23 라이브러리로부터 유래한 형질전환체를 동일계 평판 분석으로 ECB 데아실라제 활성에 대해 검색하였다. 형질전환된 원형질체는 30℃에서 24시간 동안 R2YE 아가 평판에서 재생시키고, 티오스트렙톤의 존재하에 48 시간 동안 형성시켰다. 콜로니가 적절한 크기로 성장하면, 0.1M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5)내 0.5 ㎎/㎖ ECB를 함유하는 0.7% 아가로스 용액 6 ㎖을 각 R2YE 아가 평판의 상부에 붓고, 30℃에서 18∼24 시간 동안 형성시켰다. 야생형 플라스미드 pSHP150-2*를 함유하는 대조 콜로니의 것보다 더 큰 투명 구간으로 둘러싸인 콜로니는 추가의 특징에 대해 선별하였다.
선별된 형질전환체를 티오스트렙톤을 함유하는 20 ㎖ 배지내로 접종하고, 48 시간 동안 30℃에서 호기적으로 증식시켰으며, 이 때 HPLC를 사용하여 ECB 데아실라제 활성에 대해 분석하였다. 전체 브로스 100 ㎕를 사용하여 10%(v/v) MeOH 및 200 ㎍/㎖의 ECB 기질을 함유하는 0.1 M NaAc 완충액(pH5.5)내에서 30℃에서 30분 동안 반응시켰다. 메탄올 2.5 부피를 첨가하여 이 반응을 종결시키고, 50:50의 A:B(A=93% 아세토니트릴, 0.1% 인산; B=70% 아세토니트릴, 0.1% 인산)로 시작하여 2.2 ㎖/분의 유속으로 22분 동안 30:70 A:B로 종결한 선형 아세토니트릴 구배를 사용하여 실온에서 100 ×4.6 mm 폴리히드록시에틸 아스파트아미드 컬럼(미국 매릴랜드주 콜롬비아에 소재하는 폴리LC 인코포레이티드)상에서 HPLC로 각 시료 20 ㎕를 분석하였다. ECB 및 ECB 핵 피크의 영역을 계산하고, pIJ702*를 함유하는 S. 리비단스의 시료 배양물로부터 해당 피크의 면적을 제하여 ECB 데아실라제 활성을 추정하였다.
양성 돌연변이의 예비배양물 2 ㎖를 사용하여 50 ㎖ 배지를 접종하고 96 시간 동안 30℃에서 증식시켰다. 분자량 컷오프가 10 kd인 아미콘 여과 유닛(미국 매사츄세츠주 비벌리)를 사용하여 원부피의 1/30으로 추가 농축시켰다. 생성 효소 시료를 동 부피의 50 mM KH2PO4(pH 6.0) 완충액으로 희석하고, 하이-트랩 이온 교환 컬럼(미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 바이오테크)에 적용하였다. 결합 완충액은 50 mM KH2PO4(pH6.0)이었으며, 용출 완충액은 0.1 M NaCl을 함유한 50 mM KH2PO4(pH 6.0)이었다. 0∼1.0M NaCl의 선형 구배를 유속 2.7 ㎖/분으로 8 컬럼 부피에 가하였다. 0.3 M NaCl에서 용출시킨 ECB 데아실라제 분획을 농축하고, 완충액을 센트리콘-10 유닛을 사용하여 50 mM KH2PO4(pH6.0)에 대해 교환하였다. 효소 순도는 코마씨 블루 염색을 사용하여 SDS-PAGE로 확인하였고, 농도는 Bio-Rad 단백질 분석 시약(미국 캘리포니아주 헤라클레스)을 사용하여 측정하였다.
변형 HPLC 분석을 이용하여 ECB 기질상에서 ECB 데아실라제 돌연변이의 활성을 측정하였다(84). 4 ㎍의 각 정제된 ECB 데아실라제 돌연변이체를 10% (v/v) MeOH 및 상이한 농도의 ECB 기질을 함유하는 0.1M NaAc 완충액내에서 30분 동안 30℃에서의 활성 분석 반응에 사용하였다. 분석은 이중으로 수행하였다. 반응은 메탄올 2.5 부피를 첨가하여 정지시키고, HPLC 분석으로 전술한 바와 같이 수행하였다. 흡광도 값을 기록하고, Km 및 kcat를 계산한 시간 진행 곡선의 최소 제곱 회귀로 계산하였다.
pH의 함수로서 활성은 상이한 pH 값, 즉 5, 5.5 및 6(0.1 M 아세테이트 완충액); 7, 7.5, 8 및 8.5(0.1 M 인산염 완충액); 9 및 10(0.1 M 탄산염 완충액), 30℃에서 HPLC 분석을 이용하여 정제된 ECB 데아실라제에 대해 측정하였다. 정제된 ECB 데아실라제의 안정성은 10% 메탄올을 함유하는 0.1 M NaAc 완충액(pH 5.5)내 30℃에서 측정하였다. 시료는 상이한 시간 간격을 두고 배출하고, 잔여 활성은 전술한 HPLC 분석으로 동일한 완충액에서 측정하였다.
B. 결과
도 11은 돌연변이 M7-2 및 M16 유전자에 이형 두가닥 사슬 복원 기법을 1회 적용한 후 약 500 개의 원래 형질전환체로부터 하나의 돌연변이(M15)가 야생형 특이 활성의 3.1배를 보유한다는 것을 발견하였음을 도시하고 있다. 야생형 및 진화된 M15 ECB 데아실라제를 정제하고, ECB의 탈아실화에 대한 역학 매개변수를 HPLC로 측정하였다. 진화된 데아실라제 M15는 촉매 속도 상수, kcat가 205% 증가하였다. M 20의 촉매 효율(kcat/Km)은 야생형 효소보다 2.9 배 개선된다.
5∼10의 상이한 pH에서의 야생형 및 M15를 이용한 탈아실화의 초기 속도는 ECB 200 ㎍/㎖에서 측정하였다. 재조합 M15는 pH5∼8에서 야생형보다 더욱 활성이 있다. 이 분석에서 효소 활성의 pH 의존성은 강하지 않지만, 야생형과 비교하여 최적 조건의 pH를 1.0∼1.5 더 낮은 pH로 한정적으로 이동시킨다.
정제된 ECB 데아실라제 돌연변이 M15의 탈활성화의 시간 경과는 30℃하에 0.1 M NaAc(pH5.5)에서 측정하였다. 야생형 및 돌연변이 M15사이의 안정성에 있어서 유의할 만한 차이는 없었다.
야생형 ECB 데아실라제 서열에 대한 DNA 돌연변이 및 진화된 변종 M7-2, M16 및 M15내 아미노산 치환 위치가 도 12에 요약되어 있다.
이형 두가닥 재조합 기법은 어버이 서열을 재조합하여 신규 자손을 형성할 수 있다. M7-2 및 M16 유전자의 재조합으로 M15를 형성하였으며, 이의 활성은 그 어버이의 활성보다 높았다(도 13a-13e). M15내 6개의 염기 치환 중 5개의 치환(α50, α171, β57, β129 및 β340)은 M7-2로부터 유전된 것이며, 다른 하나(β30)는 M16으로부터 유래한 것이다.
이 접근법은 DNA 재조합의 기존 방법의 별법을 제공하며, 거대 유전자 또는 전체 오페론을 재조합하는데 특히 유용하다. 이 방법을 사용하여 재조합 단백질을 제조하여 그 성질을 개선하거나 또는 구조-기능 관계를 연구할 수 있다.
실시예 3
신규 열안정성 바실러스 서브틸리스 서브틸리신 E 변형체
본 실시예는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 서브틸리신 E의 열안정성을 개선시키기 위해서 2개의 상이한 서열로부터 서열 정보를 조합하기 위한 시험관내 이형 두가닥 형성과 생체내 복원의 용도를 입증한다.
유전자 RC1 및 RC2는 열안정성 B.서브틸리스 서브틸리신 E 변형체(88)를 암호화한다. RC1내 1107번 및 RC2내 995번의 염기 위치에서의 돌연변이(도 14)는 아미노산 치환 Asn218/Ser(N218S) 및 Asn181/Asp(N181 ID)을 발생시켜, 서브틸리신 E 열안정성을 개선시킨다. 남은 돌연변이는 동일한 것을 나타낼 수도 아닐 수도 있지만 열안정성에 대한 검출가능한 영향은 없다. 65℃에서, 단일 변형체 N181D 및 N218S는 야생 서브틸리신 E의 반감기보다 각각 대략 3배 및 2배 길며, 양 돌연변이를 함유하는 변형체는 8배 더 긴 반감기를 보유한다(88). 서브틸리신 E 변형체 군에서의 상이한 반감기를 이용하여 서열 정보를 조합한 효과를 추정할 수 있다. 특히, 이들 2 돌연변이간의 재조합(열안정성에 영향을 주는 점 돌연변이 없음)은, 군의 25%가 이중 돌연변이의 열안정성을 나타내는 라이브러리를 생성한다. 유사하게, 군의 25%는 야생형 유사 안정성을 나타내며, N181D 및 N218은 동일한 빈도수로 제거된다. 본 발명자들은 진단용으로 재조합 군의 분획을 사용하였다.
A. 방법
후술되는 방법은 도 15에 도시되어 있다.
서브틸리신 E 열안정성 돌연변이 유전자 RC1 및 RC2(도 14)는 서브틸리신 E 프로서열의 45 뉴클레오티드, 전체 성숙 서열 및 종지 코돈 뒤의 113개 뉴클레오티드를 포함하는 986 bp 단편이다. 유전자를 E.콜리, B.서브틸리스 셔틀 벡터 pBE3내 BamHI 및 NdeI 사이에 클로닝시켜 pBE3-1 및 pBE3-2를 각각 산출하였다. 플라스미드 DNA pBE3-1 및 pBE3-2를 E.콜리 SCS110으로부터 분리하였다.
약 5.0 ㎍의 비메틸화된 pBE3-1 및 pBE3-2 DNA를 1시간 동안 37℃에서 BamHI 및 NdeI으로 각각 분해하였다. 아가로스 겔 분리후에, 동몰 농도(2.0 nM)의 선형화된 비메틸화된 pBE3-1 및 pBE3-2를 1 ×SSPE 완충액(180 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH2PO4, pH 7.4)에서 혼합하였다. 10분 동안 96℃에서 가열한 다음, 반응 혼합물을 5 분 동안 0℃에서 즉시 냉각하였다. 혼합물을 2 시간 동안 68℃에서 항온처리하여 이형 두가닥 사슬을 형성하였다.
1 ㎕의 반응 혼합물을 사용하여 50 ㎕의 E.콜리 ES1301 mutS, E.콜리 SCS110 및 E.콜리 HB101 컴피턴트 세포를 형질전환시켰다.
E.콜리 HB101 컴피턴트 세포를 이용한 형질전환 효율은 E.콜리 SCS110의 경우보다 약 10배 크고, E.콜리 ES1301 mutS의 경우보다 약 15배 높다. 그러나, 모든 경우에, 형질 전환 효율은 폐쇄된 공유 결합 환형 대조군 pUC19 플라스미드로 형질 전환시킨 경우보다는 10∼250배 낮았다.
E.콜리 SCS110 돌연변이 라이브러리로부터 5개의 클론과 E.콜리 ES1301 mutS 라이브러리로부터 5개의 클론을 무작위로 선택하고, 추가의 DNA 서열 결정 분석을 위해 QIAprep 스핀 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다.
E.콜리 HB101 돌연변이 라이브러리로부터 얻은 약 2,000개 무작위 클론을 모으고, QIAGEN-100 컬럼을 사용하여 총 플라스미드 DNA를 분리하고, 0.5∼4.0 ㎍의 분리된 플라스미드를 사용하여 전술한 바와 같이 바실러스 서브틸리스 DB428를 형질전환시켰다(88).
바실러스 서브틸리스 DB428 라이브러리로부터 약 400개의 형질전환체를 검색하였다. 검색은 전술한 분석(88)을 사용하여 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐리드에서 수행하였다. B. 서브틸리스 DB428을 함유하는 플라스미드 라이브러리를 카나마이신(20 ㎍/㎖) 함유 LB 평판에서 증식시켰다. 374에서 18 시간 후에, 단일 콜로니를 웰당 200 ㎕ SG/카나마이신 배지를 함유하는 96웰 평판내로 두었다. 이들 평판을 24시간 동안 37℃에서 진탕하면서 항원처리하여 세포를 포화상태로 증식시켰다. 세포를 원심분리하고, 상청액은 열안정성 분석에 대한 시료로 하였다.
레플리카 평판내로 10 ㎕ 상청액을 전달하여 96 웰 분석 평판의 2개의 복제물을 각 증식 평판에 대해 제조하였다. 100 ㎕ 활성 분석 용액(0.2 mM 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐리드, 100 mM 트리스 HCl, 10 mM CaCl2, pH8.0, 37℃)을 첨가하여 서브틸리신 활성을 측정하였다. 반응 속도는 써모막스 미세평판 판독기(미국 캘리포니아주 서니베일에 소재하는 몰리큘라 디바이스)내에서 1.0분 동안 405 nm에서 측정하였다. 실온에서 측정된 활성을 이용하여 활성 클론의 분획을 계산하였다(야생형의 활성보다 10% 낮은 활성을 갖는 클론은 불활성으로 평가함). 초기 활성(Ai)은, 미리 가온시킨(37℃) 분석 용액(0.2 mM 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐리드, 100 mM 트리스 HCl, pH 8.0, 10 mM CaCl2, pH8.0) 100 ㎕를 각 웰내로 즉시 첨가하여 10분 동안 65℃에서 하나의 분석 평판을 항온처리한 후에 측정하였다. 잔여 활성(Ar)은 40분의 항온처리 후에 측정하였다.
B. 결과
시험관내 이형 두가닥 사슬 형성 및 생체내 복원은 전술한 바와 같이 수행하였다. E.콜리 SCS110 돌연변이 라이브러리에서 유래한 5개의 클론 및 E.콜리 ES1301 mutS 라이브러리로부터 유래한 5개의 클론을 무작위로 선별하고 서열결정하였다. 도 14는 10개의 클론 중 4개가 어버이 유전자와 다름을 보여준다. 생성 유전자에서 어버이 RC1 및 RC2로부터의 특정 점 돌연변이 발생 빈도는 0∼50%이며, 이형 두가닥 사슬내 10개 점 돌연변이는 강력한 가닥 특이적 선택없이 복원되었다.
10개의 돌연변이 중 dcm 부위내 위치하는 돌연변이는 없기 때문에, 부정합 복원은 E.콜리 롱-패치(long-patch) 부정합 복원계를 통해 일반적으로 행해지는 것으로 보인다. 시스템은 복원하고자 하는 가닥을 결정하기 위한 주요 기작으로서 GATC 서열내 아데닌의 N6-메틸화의 상태를 사용하여 가닥 특이적 방식으로 상이한 부정합을 복원한다. 오로지 하나의 DNA 가닥상의 GATC서열에서 메틸화된 이형 두가닥 사슬을 이용하면 복원은 비메틸화된 가닥에 고도로 편중되는 것으로 확인되었으며, 메틸화된 가닥은 보정의 주형으로서 작용한다. 가닥이 메틸화되지 않으면, 부정합 복원이 발생하지만, 가닥 선택은 거의 나타내지 않는다(23,24). 이들 결과로부터 재조합하고자 하는 DNA를 메틸화시켜 이형 두가닥 사슬의 효율적인 무작위 복원을 촉진하는 것이 바람직함을 알 수 있다.
65℃에서 서브틸리신 E 열 불활성화 속도는 바실러스 서브틸리스 DB428 라이브러리로부터 400개의 무작위 클론을 분석하여 평가하였다. 96 웰 평판으로부터 얻은 열안정성은 도 16에 도시되어 있으며, 내림순으로 플롯하였다. 약 12.9%의 클론은 N181D 및 N218S 이중 돌연변이를 갖는 돌연변이체와 비견할만한 열 안정성을 나타내었다. 이 속도는 2개의 마커의 무작위 재조합에 대해 예측되는 속도의 단지 1/2이기 때문에, 이형 두가닥 사슬내 위치 995 및 1107에서 2개의 부정합이 더 낮은 위치의 무작위성으로 복원되었음을 제시하는 것이다.
E.콜리 SCS110 이형 두가닥 사슬 라이브러리로부터 유래한 검색된 400개 형질전환체 중 최대 열안정성을 나타내는 클론의 서열 분석으로 N181D 및 N218S 돌연변이의 존재를 확인하였다. 검색한 B.서브틸리스 DB428 라이브러리에서 유래한 400개 형질전환체 중, 약 91%의 클론이 N181D 형 효소 안정성 및/또는 N218S형 효소 안정성을 나타내는 반면, 약 8.0%의 형질전환체는 단지 야생형 서브틸리신 E 안정성을 나타내었다.
1.0% 미만의 불활성 클론이 발견되었으며, 이는 일부 신규 점 돌연변이가 재조합 과정에서 도입되었음을 의미한다. 이는 10개의 서열결정된 유전자에서 신규 점 돌연변이가 확인되지 않은 사실과 일치한다(도 14). 점 돌연변이는 일부 시험관내 진화 용도에 대한 유용한 다양성을 제공할 수 있지만, 특히 돌연변이율이 높은 경우 유리한 돌연변이의 재조합이 문제가 될 수 있다.
실시예 4
이형 두가닥 사슬 재조합에 대한 최적화 조건
본 발명자들은 이형 두가닥 사슬 재조합의 효율이 유전자마다 상당히 다를 수 있다는 것을 발견하였다[17,57]. 이 실시예에서, 본 발명자들은 재조합 효율을 개선시키는 각종 매개변수를 조사하고 최적화하였다. 실시예에 사용된 DNA 기질은 애쿠오레아 빅토리아(Aequorea victoria)로부터 유래한 녹색 형광 단백질의 부위 지향적 돌연변이였다. GFP 돌연변이는 형광성을 없애는 서열을 따라 상이한 위치에 도입되는 종지 코돈을 보유하였다. 형광성 야생형 단백질은 오로지 2 이상의 돌연변이 사이의 재조합으로 복구된다. 형광성 콜로니의 분획을 재조합 효율의 기준으로서 사용하였다.
A. 방법
약 2∼4 ㎍의 각 어버이 플라스미드를 한 재조합 실험에 사용하였다. 하나의 어버이 플라스미드를 PstI 엔도뉴클레아제로 분해하고, 또 다른 어버이 플라스미드는 EcoRI로 분해하였다. 선형화된 플라스미드를 함께 혼합하고, 20 ×SSPE 완충액을 최종 농도 1 ×(180 mM NaCl, 1.0 mM EDTA, 10 mM NaH2PO4, pH 7.4)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 4 분 동안 96℃에서 가열하고, 즉시 4분 동안 얼음상에 옮기고, 2 시간 동안 68℃에서 항온처리하였다.
표적 유전자는 pGFP 플라스미드의 벡터 서열에 해당하는 프라이머를 사용하여 PCR 반응으로 증폭시켰다.
정방향 프라이머: 5'-CCGACTGGAAAGCGGGCAGTG-3',
역방향 프라이머: 5'-CGGGGCTGGCTTAACTATGCGG-3'
PCR 생성물을 함께 혼합하고, 퀴아겐 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 정제된 생성물을 20 ×SSPE 완충액과 혼합하고, 전술한 바와 같이 하이브리드화시켰다. 어닐링된 생성물을 에탄올로 침전시키거나, 퀴아겐 컬럼에서 정제한 다음 EcoRI 및 PstI 효소로 분해하였다. 분해 생성물을 PstI 및 EcoRI 효소로 분해된 pGFP 벡터내로 결찰시켰다.
dUTP를 200 μM, 40 μM, 8 μM, 1.6 μM, 0.32 μM의 최종 농도로 PCR 반응물에 첨가하였다. PCR 반응후에 클로닝 절차를 전술한 바와 같이 수행하였다.
재조합 플라스미드를 변형 화학적 형질전환법으로 XL10 E.콜리 균주내로 형질전환시켰다. 세포를 앰피실린 함유 LB 아가 평판에서 평판배양하고, 37℃에서 밤새 증식시킨 다음, 실온 또는 4℃에서 형광이 발생할 때까지 항온처리하였다.
B. 결과
1. 재조합 효율에 대한 결찰의 영향
2가지 실험을 수행하여 재조합의 효율에 대한 DNA 이형 두가닥 사슬내 절단의 효과를 시험하였다. 한 실험에서, 이형 두가닥 사슬 플라스미드를 DNA 리가아제로 처리하여 모든 기존의 1본쇄 절단 부위를 폐쇄하고 비결찰된 시료와 동일한 조건에서 형질전환시켰다(표 1 참조). 결찰된 시료는 비결찰된 시료와 비교하여 재조합 효율에서 최대 7배의 개선을 나타낸다.
또 다른 실험에서, dUTP를 PCR 반응에 첨가하여 숙주 세포내 우라실 N-글리코실레이트로 복원시 DNA 내로의 추가의 절단을 도입하였다. 표 2는 dUTP를 병입하면 재조합이 상당히 억제되고, 억제 정도는 dUTP 농도의 증가에 따라 증가함을 보여준다.
2. 이형 두가닥 사슬 형성의 효율에 대한 플라스미드 크기의 영향
플라스미드 크기는 재조합 효율에 영향을 주는 중요한 인자였다. 2개의 플라스미드 pGFP(3.3 kb) 및 바실러스 셔틀 벡터 pCT1(약 9kb)를 전통적인 이형 두가닥 사슬 프로토콜 후에 환형의 이형 두가닥 사슬 플라스미드를 제조하는데 사용하였다. 이 실험을 위해서(이형 두가닥 사슬 형성에 대한 플라스미드 크기의 영향 연구), 양 어버이는 동일한 서열을 갖고 있었다. pGFP가 약 30∼40% 환형 플라스미드를 형성하는 반면, 셔틀 벡터는 이 형태의 10% 미만을 산출하였다.
플라스미드 크기가 증가하면 각각의 부근에 있는 말단의 농도는 감소하고, 1본쇄인 매우 긴(〉0.8 kb) 말단의 어닐링이 더욱 어려워진다. 도 3에 도시된 절차를 이용하면 이러한 난점을 해결할 수 있는데, 이형 두가닥 사슬 형성이 무벡터 형태의 기질 사이에서 발생되며, 그 이형 두가닥 사슬을 벡터내로 삽입한다.
3. 재조합 효율 대 돌연변이간의 거리
일련의 GFP 변종을 쌍 형성 방식으로 재조합하여 재조합 효율에 대한 돌연변이간의 거리의 영향을 연구하였다. 어버이 유전자를 PCR로 증폭시키고, 어닐링 한 다음 pGFP 벡터내로 다시 결찰시켰다. 이형 두가닥 사슬은 XL10 E.콜리 균주내로 형질전환시켰다.
표 3에 제시된 처음 3개의 컬럼은 3가지 독립적인 실험의 결과를 나타내며, 돌연변이간의 거리에 대한 재조합 효율의 의존성을 입증한다. 예측한 바와 같이, 재조합은 매우 유사한 돌연변이에 대해 효율이 차츰 줄어든다.
그러나, 롱-패치 복원은 단지 27 bp로 분리된 돌연변이를 재조합할 수 있음은 주목할 만하다.
표 3의 마지막 라인은 하나의 단일 돌연변이 및 하나의 이중 돌연변이간의 재조합을 나타낸다. 야생형 GFP는 이중 교차의 경우에만 복구될 수 있으며, 각 개개의 교차는 단지 99 bp의 거리에서 발생한다. 이는 다중, 밀접하게 이격되어 있는 돌연변이를 재조합하는 본 방법의 능력을 입증한다.
4. 이형 두가닥 사슬 제조로부터 어버이 2본쇄의 제거
무벡터 형태의 기질을 어닐링하면 벡터의 성분으로서 기질을 어닐링한 것과 비교하여 크기면에서 유용하지만, 단순히 숙주내로 형질전화시켜 동형 두가닥 사슬에 대해 이형 두가닥 사슬이 선별되지 않았다. 미리 증폭되고 정제된 적절한 양의 유전자 단편으로 접종된 각 어버이에 대하여 오직 하나의 프라이머를 이용한 비대칭 PCR 반응을 100 사이클 수행하였고, 다른 가닥에 비하여 한 가닥을 100배 과량으로 유지하였다. 이들 비대칭 반응의 생성물을 혼합하고, 함께 어닐링하여 단지 소량의 비재조합 이형 두가닥 사슬을 형성하였다. 표 3의 최종 컬럼은 이들 농축된 이형 두가닥 사슬로부터 얻은 재조합 효율을 제시한다. 처음 3개의 컴럼을 제4 컬럼과 비교하여 어버이 가닥의 비대칭 합성으로 개선됨을 입증하였다.
전술한 본 발명을 명확성 및 이해를 위해 다소 상세하게 설명하였지만, 당업자에게는 본 개시 내용으로부터 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 상기 형태 및 상세 내용의 각종 변화가 가능함이 자명할 것이다. 본 출원에서 인용한 모든 공보 및 특허 문서는 각 개별적인 공보 또는 특허 문서가 각각 표시되는 바와 동일한 범위로 그 전문을 참고로 인용하였다.
참조 문헌

Claims (34)

  1. (a) 이형 두가닥 사슬을 포함하는 어닐링된 폴리뉴클레오티드를 형성하는 조건하에 어버이 폴리뉴클레오티드 변형체의 군을 항온처리하는 단계,
    (b) 세포 DNA 복원계에 이형 두가닥 사슬을 노출시켜 이형 두가닥 사슬을 어버이 폴리뉴클레오티드 변형체 또는 재조합 폴리뉴클레오티드 변형체로 전환시키는 단계,
    (c) 목적하는 성질에 대해 재조합 폴리뉴클레오티드 변형체를 검색 또는 선별하는 단계를 포함하여 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 이형 두가닥 사슬을 시험관내에서 세포 DNA 복원계에 노출시키는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 세포 DNA 복원계가 세포 추출물을 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 이형 두가닥 사슬을 세포내로 도입하는 단계를 추가로 포함하여 이형 두가닥 사슬을 생체내 세포의 DNA 복원계에 노출시키는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 어닐링된 폴리뉴클레오티드가 동형 두가닥 사슬을 추가로 포함하고, 도입 단계가 동형 두가닥 사슬을 포함하는 형질전환된 세포에 대하여 이형 두가닥 사슬을 포함하는 형질전환된 세포를 선별하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 변형체는 제1 벡터의 성분으로서 제공되고, 제2 폴리뉴클레오티드 변형체는 제2 벡터의 성분으로서 제공되며, 상기 방법이 제1 및 제2 벡터를 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 변형체가 대향 말단에서 발생하는 선형화된 형태로 전환시키는 단계를 추가로 포함하여, 항온처리 단계에서 제1 선형화된 벡터의 1본쇄 형태를 서로 재어닐링시켜 선형 제1 벡터를 만들고, 제2 선형화된 벡터의 1본쇄 형태를 서로 재어닐링시켜 선형 제2 벡터를 만들며, 제1 및 제2 벡터의 1본쇄 선형화된 형태를 서로 어닐링시켜 각 가닥에 틈을 보유하는 환형의 이형 두가닥 사슬을 형성하고, 도입 단계에서 선형 제1 및 제2 벡터에 대하여 환형의 이형 두가닥 사슬을 포함하는 형질전환된 세포를 선별하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제1 및 제2 벡터를 PCR에 의해 선형화된 형태로 전환시키는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 제1 및 제2 벡터를 제1 및 제2 제한 효소에 의해 분해하여 선형화된 형태로 전환시키는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형체의 군이 2본쇄 형태로 제공되고, 상기 방법이 어닐링 단계 전에 2본쇄 폴리뉴클레오티드를 1본쇄 폴리뉴클레오티드로 전환하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 전환 단계가 제1 및 제2의 2본쇄 폴리뉴클레오티드 변형체의 비대칭 증폭을 수행하여 제1 폴리뉴클레오티드 변형체의 제1 가닥과 제2 폴리뉴클레오티드 변형체의 제2 가닥을 증폭시켜 항온처리 단계에서 제1 및 제2 가닥을 어닐링시켜 이형 두가닥 사슬을 형성하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 제1 및 제2의 2본쇄 폴리뉴클레오티드 변형체가 무벡터의 형태로 제공되고, 상기 방법이 이형 두가닥 사슬을 벡터내로 병입시키는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  12. 제4항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 군이 2본쇄 형태로 제공되는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 방법이 제1 및 제2 벡터의 성분으로서 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 병입하는 단계를 추가로 포함하여, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 제1 및 제2 벡터의 대향 말단을 점유하고, 항온처리 단계에서 제1 선형화된 벡터의 1본쇄 형태를 서로 재어닐링시켜 선형 제1 벡터를 만들고, 제2 선형화된 벡터의 1본쇄 형태를 서로 재어닐링시켜 선형 제2 벡터를 만들고, 제1 및 제2 벡터의 1본쇄 선형화된 형태를 서로 어닐링시켜 각 가닥에 틈을 보유하는 환형의 이형 두가닥 사슬을 형성하며, 도입 단계에서 선형 제1 및 제2 벡터에 대하여 환형의 이형 두가닥 사슬을 포함하는 형질전환된 세포를 선별하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  13. 제4항에 있어서, 도입 단계 전에 이형 두가닥 사슬내 틈을 밀봉하여 공유적으로 폐쇄된 환형의 이형 두가닥 사슬을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 제1 및 제2의 폴리뉴클레오티드를 염색체 DNA로부터 얻는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 단계 (a) 내지 (c)를 반복수행하는 단계를 포함하여 연속 사이클내 항온처리 단계를 이전 사이클로부터 유래한 재조합 변형체에서 수행하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형체가 폴리펩티드를 암호화하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 군이 20개 이상의 변형체를 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형체의 군이 그 길이가 10 kb 이상인 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형체의 군이 천연 변형체를 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형체의 군이 돌연변이 유발 PCR로 형성된 변형체를 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형체의 군이 부위 지향적 돌연변이 유발법으로 생성된 변형체를 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 세포가 박테리아 세포인 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 변형 폴리펩티드의 군을 최소한 부분적으로 탈메틸화시키는 단계를 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 최소한 부분적으로 탈메틸화시키는 단계를 변형 폴리뉴클레오티드 군의 PCR 증폭으로 수행하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 최소한 부분적으로 탈메틸화시키는 단계를 숙주 세포내 변형 폴리뉴클레오티드 군의 증폭에 의해 수행하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를진화시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 숙주 세포에 메틸라제 효소를 암호화하는 유전자가 결핍되어 있는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  27. 제1항에 있어서, 변형 폴리뉴클레오티드 변형체 군이 서로 90% 이상의 서열 동일성을 보유하는 5개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  28. 제1항에 있어서, 검색된 재조합 변형체를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 검색된 재조합 변형체를 발현시켜 재조합 단백질을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 담체와 함께 재조합 단백질을 제형화하여 약학 조성물을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  31. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형체가 프로테아제, 리파제, 아밀라제, 쿠티나제, 셀룰라제, 아밀라제, 옥시다제, 퍼옥시다제 및 파이타제로 구성된 군에서 선택된 효소를 암호화하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형체가 인슐린, ACTH, 글루카곤, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 티모신, 부갑상선 호르몬, 색소 호르몬, 소마토메딘, 에르트로포이에틴, 황체형성 호르몬, 융모막 고나도트로핀, 고시상 방출 인자, 항이뇨 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 릴렉신, 인터페론, 트롬보포이에틴(TPO) 및 프로락틴으로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  33. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형체가 대사 경로를 형성하는 다수의 효소를 암호화하는 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
  34. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 변형체가 연쇄 형태인 것이 특징인 목적하는 성질을 획득하도록 폴리뉴클레오티드를 진화시키는 방법.
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