KR20110048509A - 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 융합 이환식 프롤린 화합물의 제조를 위한 생체촉매 공정 - Google Patents

실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 융합 이환식 프롤린 화합물의 제조를 위한 생체촉매 공정 Download PDF

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쉴라 멀리
잭 리앙
리사 엠. 뉴먼
지윤 장
제임스 랄론드
마이클 디. 클레이
준 주
존 엠. 그루버
제프리 콜벡
존 디. 주니어 멍거
자가디쉬 마빈할리
로저 쉘던
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Abstract

본 발명의 개시내용은 본원에 기술된 바와 같은 화학식 II 내지 VII의 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 융합 이환식 프롤린 화합물, 및 이의 제조를 위한 생체촉매 공정, 및 이러한 공정에서 사용되는 효소를 제공한다.

Description

실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 융합 이환식 프롤린 화합물의 제조를 위한 생체촉매 공정{BIOCATALYTIC PROCESSES FOR THE PREPARATION OF SUBSTANTIALLY STEREOMERICALLY PURE FUSED BICYCLIC PROLINE COMPOUNDS}
1. 기술 분야
본 발명의 개시내용은 화학식 II 내지 VII의 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 융합 이환식 프롤린 화합물, 이의 제조를 위한 생체촉매 공정, 및 이러한 공정에서 사용되는 생체촉매 효소에 관한 것이다:
[화학식 II(a)]
Figure pct00001
[화학식 II(b)]
Figure pct00002
[화학식 III(a)]
Figure pct00003
[화학식 III(b)]
Figure pct00004
[화학식 IV(a)]
Figure pct00005
[화학식 V]
Figure pct00006
[화학식 VI]
Figure pct00007
[화학식 VII]
Figure pct00008
[식 중, A, M, M', 및 R5는 본원에 기술된 바와 같다].
2. 서열 목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램에 대한 언급
컴퓨터 판독가능 형태 (CRF)로 37 C.F.R. § 1.821 하에 파일명 CX2-020WO01.txt로 동시에 전자 제출된 "서열 목록"이 거명에 의해 본원에 포함된다. 서열 목록의 전자 복사본은 110 kb의 파일 크기로 2009년 6월 23일 생성되었다.
3. 배경기술
펩티도모방체(peptidomimetic) 약물의 발견 및 개발에서 이환식 프롤린 유사체가 사용된다. ([A. Trabocchi et al. (2008) Amino Acids (2008) 34: 1-24]). C형 간염 바이러스 프로티에이스(protease) 억제제인 보세프레비르(boceprevir) (SCH 505034; ((1R,2S,5S)-N-(4-아미노-1-시클로부틸-3,4-디옥소부탄-2-일)-3-((S)-2-(3-tert-부틸우레이도)-3,3-디메틸부타노일)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르복사미드) ([Malcolm et al. (2006) Antimicrob. Agents Chemother. 50(3): 1013 20]), 및 텔라프레비르(telaprevir) (VX 950; N-((S)-1-시클로헥실-2-((S)-1-((1S,3aR,6aS)-1-((R)-3-(2-(시클로프로필아미노)-2-옥소아세틸)헥사노일)헥사하이드로시클로펜타[c]피롤-2(1H)-일)-3,3-디메틸-1-옥소부탄-2-일아미노)-2-옥소에틸)피라진-2-카르복사미드) ([Perni et al. (2006) Antimicrob. Agents Chemother. 50(3): 899 909]).
Figure pct00009
보세프레비르 (SCH-505034)
Figure pct00010
텔라프레비르 (VX-950)
보세프레비르 및 텔라프레비르는 하기에 제시된 시스(cis)-융합 이환식 L-프롤린 유사체 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산 및 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산의 에스테르로부터 각각 제조된다:
Figure pct00011
.
WO 2000/20824 및 WO 2000/218369에는 화학식 VI에 상응하는 다양한 융합 이환식 L-프롤린 유사체가 포함되는 다수의 기타 C형 간염 프로티에이스 억제제들이 기술되어 있다.
유기 화학의 방법 및 도구를 사용하는 이같은 복합 분자의 합성을 위한 방법들이 보고되어 있지만, 일반적으로 이러한 합성은 다단계이고, 복잡하며, 고가이고, 비효율적이고, 전체적인 수율이 낮은 공정이다.
WO 2007/075790 (Wu et al.)에는 이환식 프롤린 유사체 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산의 메틸 에스테르를 상응하는 화학식 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산의 대칭성 (아키랄(achiral)) 이환식 아민으로부터 생산하는 것이 개시되어 있고, 이는 상기 아민이 하기 화학식의 상응하는 라세믹(racemic) 이민으로 산화되는 것으로부터 시작된다:
Figure pct00012
이어서 라세믹 이민을 시아나이드와 반응시켜 하기 화학식의 라세믹 아미노니트릴을 제공하고:
Figure pct00013
그후, 이를 산 및 메탄올과 반응시켜 하기 화학식의 라세믹 아미노산 메틸 에스테르를 제공한다:
Figure pct00014
마지막으로, 이러한 (1R, 2S, 5S) (원치 않는 화합물) 및 (1S, 2R, 5R) (원하는 화합물) 입체이성질체적 메틸 에스테르를 부분입체이성질체적 염 분할에 의해 분리하고, 이때 전자의 거울상이성질체와의 디-p-톨릴-D-타르타르산 염 또는 후자의 거울상이성질체와의 디-p-톨릴-L-타르타르산 염이 형성된다.
WO 2007/022459 (Tanoury et al.)에는 N-Boc 유도체를 제조하고, 이를 화학양론적 양을 초과하는 양의 대형(bulky) 디아민 킬레이트의 존재 하에 발화제인 sec-부틸리튬에 이어서 이산화탄소와 반응시켜 (모두 -70℃ 미만에서), 하기에 도해된 라세믹 N-Boc 아미노산을 생산시킴으로써, 상응하는 대칭성 (아키랄) 이환식 아민으로부터 라세믹 (t-부톡시카르보닐)옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산을 합성하는 것이 개시되어 있다:
Figure pct00015
그후, 이러한 라세믹 Boc 산의 (1R, 2S, 5S) (원치 않는 화합물) 및 (1S, 2R, 5R) (원하는 화합물) 입체이성질체를 S-1-아미노테트랄린과 같은 단일 거울상이성질체 키랄(chiral) 염기를 사용하여 부분입체이성질체적 염 분할에 의해 분리한다.
아미노산 유도체의 원하는 입체이성질체가 이러한 방법에 의해 수득되지만, 이러한 이환식 프롤린 유사체의 거울상이성질체들의 혼합물의 분할은 라세믹 혼합물의 생산에서 사용된 물질 (예를 들어, 원료, 시약, 용매, 촉매) 모두의 절반 이상의 소모를 본질적으로 수반한다.
(i) N-아세틸-3-아자바이시클로[3.3.0]옥탄의 양극 산화 (EA 00090362), 및 (ii) 티아졸륨 일라이드 접근법 ([Letters in Drug Design & Discovery (2005) 2(7): 497 502)]; [J. Org. Chem. 1994, 59, 2773-8])을 수반하는, 아미노산 (1S, 3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 및 이의 에스테르의 화학적 합성을 위한 추가적인 방법들이 또한 보고되었다.
라세믹 혼합물의 형성을 방지하고 결과적으로 거울상이성질체들을 분리할 필요를 방지하는, 화학식 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산의 아미노산 및 화학식 V의 이의 에스테르를 상응하는 화학식 I ((1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산)의 대칭성 (아키랄) 이환식 아민으로부터 비대칭적으로 생산하는 방법은 상기 기술된 분할-기반 방법들보다 더욱 효율적이고, 덜 소모적이며, 더욱 비용면에서 효과적일 수 있다.
모노아민 옥시데이스 효소가 산소를 사용하여 한 거울상이성질체가 상응하는 이민으로 입체특이적으로 산화되는 것을 통해 라세믹 키랄 아민을 분할하고 탈라세미화(deracemization)하는데 사용되었다. 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)의 플라빈 의존적 모노아민 옥시데이스의 유도체 (MAO N) ([Shilling et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1243: 529 37])가, 비-특이적 화학적 환원제와 함께, 거울상이성질체적으로 순수한 (93％ ee) (d) α 메틸벤질아민을 제공하는 (d/l) α 메틸벤질아민의 탈라세미화에 유용한 것으로 보고되었다 ([Alexeeva et al. (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 3177-3180]). 아스페르길루스 니게르의 플라빈 의존적 모노아민 옥시데이스의 유도체는 거울상이성질체적으로 순수한 (98％ ee) (R)-2-페니피롤리딘을 제공하는 (R/S)-2-페니피롤리딘의 탈라세미화에 또한 사용되었다 ([Carr et al. (2005), ChemBioChem 6: 637 39]; [Gotor et al. "Enantioselective Enzymatic Desymmetrization in Organic Synthesis", Chem. Rev. (2005) 105: 313-54).
따라서, 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 키랄 화합물, 특히 합성 중간체로서 유용한 키랄 아민 화합물을 제공할 뿐만 아니라, 이의 비대칭 합성을 위한 효율적이고 규모가 조정가능한 생체촉매 공정을 제공하는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 생체촉매 공정에 유용한 효소를 제공하는 것이 또한 바람직하다.
4. 개요
본 발명의 개시내용은 입체이성질체적으로 규정되는 치료제의 합성에서 신규 중간체로서 특히 유용한, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 II(a)의 이환식 이민 화합물 (및 화학식 II(b)의 이의 이량체) (이들의 염 및 수화물 포함)을 제공한다:
[화학식 II(a)]
Figure pct00016
및
[화학식 II(b)]
Figure pct00017
[식 중, A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl, 및 Br로부터 선택되고; M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고; 단, (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고; (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다].
본 발명의 개시내용은 거울상이성질체적으로 규정되는 치료제의 합성에서 신규 중간체로서 특히 유용한, 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 III(a) 및 화학식 III(b)에 따른 아미노술포네이트 화합물 (이들의 염 및 수화물 포함)을 추가로 제공한다:
[화학식 III(a)]
Figure pct00018
[화학식 III(b)]
Figure pct00019
[식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다].
또한, 본 발명의 개시내용은 입체이성질체적으로 규정되는 치료제의 합성에서 신규 중간체로서 유용한 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV(a)의 아미노니트릴 화합물을 제공한다. 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV(a)의 트랜스(trans) 아미노니트릴 화합물은 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV(b)의 시스 아미노니트릴 화합물을 포함하는 혼합물로서 또한 제공될 수 있다 (이들의 염 및 수화물 포함):
[화학식 IV(a)]
Figure pct00020
[화학식 IV(b)]
Figure pct00021
[식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다].
본 발명의 개시내용은 거울상이성질체적으로 규정되는 치료제의 합성에서 중간체로서 특히 유용한, 임의적으로 보호된 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 V의 화합물 (이의 염 및 수화물 포함)을 제공한다:
[화학식 V]
Figure pct00022
[식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같고, R5는 보호기 (예를 들어 벤질 또는 트리메틸실릴 등), -(C1-C2)알킬, -(C1-C3)알킬, -(C1-C4)알킬 및 -(C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다]. 비-제한적인 특정 실시양태에서, R5는 메틸, 에틸 또는 t-부틸이다.
본 발명의 개시내용은 임의적으로 보호된 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 V(b)의 화합물 (화학식 V의 화합물의 시스 거울상이성질체에 상응함) (이의 염 및 수화물 포함)을 또한 제공한다:
[화학식 V(b)]
Figure pct00023
[식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같고, R5는 보호기 (예를 들어 벤질 또는 트리메틸실릴 등), -(C1-C2)알킬, -(C1-C3)알킬, -(C1-C4)알킬 및 -(C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다]. 비-제한적인 특정 실시양태에서, R5는 메틸, 에틸 또는 t-부틸이다.
본 발명의 개시내용은 거울상이성질체적으로 규정되는 치료제의 합성에서 중간체로서 특히 유용한, 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 VI의 카르복실-치환 화합물 (이의 염 및 수화물 포함)을 또한 제공한다:
[화학식 VI]
Figure pct00024
[식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다].
본 발명의 개시내용은 임의적으로 보호된 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 VI(b)의 화합물 (화학식 VI의 화합물의 시스 거울상이성질체에 상응함) (이의 염 및 수화물 포함)을 또한 제공한다:
[화학식 VI(b)]
Figure pct00025
[식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다].
또한, 본 발명의 개시내용은 거울상이성질체적으로 규정되는 치료제의 합성에서 중간체로서 특히 유용한, 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 VII의 화합물 (이의 염 및 수화물 포함)을 제공한다:
[화학식 VII]
Figure pct00026
[식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다].
본 발명의 개시내용은 임의적으로 보호된 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 VII(b)의 화합물 (화학식 VII의 화합물의 시스 거울상이성질체에 상응함) (이의 염 및 수화물 포함)을 또한 제공한다:
[화학식 VII(b)]
Figure pct00027
[식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다].
따라서, 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 개시내용은 하나 이상의 치료제의 합성을 위한 중간체로서 유용한 하기의 융합 이환식 프롤린 화합물들, 뿐만 아니라 적어도 하기의 융합 이환식 프롤린 화합물들의 합성을 위한 생체촉매 공정을 제공한다:
Figure pct00028
본 발명의 개시내용은 하나 이상의 치료제의 합성을 위한 중간체로서 유용한 하기의 융합 이환식 프롤린 화합물들, 뿐만 아니라 적어도 하기의 융합 이환식 프롤린 화합물들의 합성을 위한 생체촉매 공정을 제공한다:
Figure pct00029
또다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 개시내용은 하나 이상의 치료제의 합성을 위한 중간체로서 유용한 하기의 화합물들, 뿐만 아니라 이러한 화합물들의 합성을 위한 생체촉매 공정을 제공한다:
Figure pct00030
.
따라서, 본 발명의 개시내용은 하나 이상의 치료제의 합성을 위한 중간체로서 유용한 융합 이환식 프롤린 화합물들, 뿐만 아니라 이러한 융합 이환식 프롤린 화합물들의 합성을 위한 생체촉매 공정을 제공한다.
본 발명의 개시내용은 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 II 내지 VII의 화합물의 생체촉매 합성 방법을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 개시내용은 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 II [식 중 A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다)에 따른 이민 화합물 (이의 염 포함)의 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법은 모노아민 옥시데이스 효소가 상응하는 화학식 II(a)의 이민 화합물, 화학식 II(b)의 이의 이량체 및 이들의 혼합물로 화학식 I의 아민 화합물을 산화시키는 조건 하에 화학식 I에 따른 대칭성 (아키랄) 이환식 아민 화합물을 보조인자의 존재 하에 산소 및 모노아민 옥시데이스 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00031
[식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]. 특정 실시양태에서, 보조인자는 FAD, FMN, NADP 및 NAD로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특별한 실시양태에서, 보조인자는 FAD이다. 특정 실시양태에서, 반응 혼합물은 반응식 2 (하기)에 도해된 바와 같은, 모노아민 옥시데이스 촉매 반응의 과산화수소 부산물의 산소 분자 및 물로의 불균등화를 용이하게 하는데 유용한 성분을 더 포함한다. 특정 실시양태에서는 이러한 성분이 Pd 및 Fe 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 화학 작용제들로부터 선택되는 한편, 또다른 실시양태에서는 이러한 성분은 효소, 예컨대 카탈레이스(catalase) 효소이다. 특별한 실시양태에서, 반응 혼합물은 과산화수소 (H2O2)가 산소 분자 및 물로 분해되는 반응식 2에 도해된 불균등화 반응을 촉매하는 카탈레이스 효소를 더 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II(a)의 이민 화합물로 산화시킬 수 있는 모노아민 옥시데이스는 아스페르길루스(Aspergillus) 종으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서는 모노아민 옥시데이스가 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스인 한편, 또다른 실시양태에서는 모노아민 옥시데이스가 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae) 모노아민 옥시데이스이다. 어느 경우든, 모노아민 옥시데이스는 상응하는 아스페르길루스 종으로부터 정제될 수 있거나, 또는 대장균과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 이종 숙주에서 발현되는 재조합 단백질로서 단리될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II(a)의 이민 화합물로 산화시킬 수 있는 모노아민 옥시데이스는 1가지를 초과하는 모노아민 옥시데이스의 일부분들, 예를 들어, 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스의 아미노 말단 부분 및 아스페르길루스 오리자에 모노아민 옥시데이스로부터의 카르복시 말단 부분을 포함하는 융합 또는 하이브리드 단백질을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스는 아미노 말단의 아미노산 314개는 아스페르길루스 니게르 (서열 2)의 아미노 말단 아미노산 314개에 상응하고, 카르복시 말단의 아미노산 181개는 아스페르길루스 오리자에 (서열 32)의 카르복시 말단 아미노산 181개에 상응하는 아미노산 495개의 단백질 (서열 6)이다. 또다른 구체적인 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스는 서열 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 36으로부터 선택된, 서열 6의 아미노산 495개의 단백질의 유도체이고, 이들 각각은 서열 6의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 보유한다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II(a)의 이민 화합물로 산화시킬 수 있는 모노아민 옥시데이스는 서열 2의 아스페르길루스 모노아민 옥시데이스로부터 유래되고, 서열 2의 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스의 아미노산 서열과 비교하여 2개 이상의 아미노산 치환이 있다. 구체적인 실시양태에서, 화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II의 이민 화합물로 산화시킬 수 있는 모노아민 옥시데이스는 서열 4 또는 서열 8의 아미노산 서열을 포함한다.
또다른 실시양태들에서, 화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II(a)의 이민 화합물로 산화시킬 수 있는 모노아민 옥시데이스는 아미노 말단 아미노산 서열은 제1 아스페르길루스 모노아민 옥시데이스로부터 유래되는 한편 카르복시 말단 아미노산 서열은 또다른 아스페르길루스 모노아민 옥시데이스로부터 유래되는 융합 단백질이다. 비-제한적인 특정 실시양태에서, 이같은 융합 단백질의 아미노 말단 및 카르복시 말단 부분 둘 모두는 서열 22, 24, 26, 28, 30, 32 및 34로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 특별한 실시양태에서, 융합 단백질의 아미노 말단 부분은 서열 32의 단백질로부터 유래되는 한편, 융합 단백질의 카르복시 말단 부분은 서열 2의 단백질로부터 유래된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 개시내용은 화학식 III(a) 또는 III(b) [식 중 A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노술포네이트 화합물 (이의 염 및 수화물 포함)의 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법은 아미노술포네이트 (이민-바이설파이트 부가물)이 산출되는 조건 하에 화학식 I [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 대칭성 이환식 아민 화합물을 산소, 모노아민 옥시데이스 효소, 및 바이설파이트와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 산화 반응 혼합물은 카탈레이스 효소를 더 포함한다.
본 발명의 개시내용은 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 IV(a) [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노니트릴 화합물 (이의 염 및 수화물 포함)의 제조 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방법은 화학식 I [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 대칭성 이환식 아민을 산소, 모노아민 옥시데이스 효소 및 바이설파이트와 접촉시킨 후, 아미노니트릴 화합물이 산출되는 조건 하에 시아나이드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 산화 반응 혼합물은 카탈레이스 효소를 더 포함한다.
본 발명의 개시내용은 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 IV [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노니트릴 화합물 (이의 염 포함)의 제조 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방법은 화학식 I [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 대칭성 이환식 아민을 산소 및 모노아민 옥시데이스 효소와 접촉시켜 화학식 II(a)의 이민, 화학식 II(b)의 이의 이량체 또는 이들의 혼합물을 형성시킨 후, 아미노니트릴 화합물이 산출되는 조건 하에 시아나이드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특별한 실시양태에서, 산화 반응 혼합물은 카탈레이스 효소를 더 포함한다.
본 발명의 개시내용은 화학식 II(a)의 화합물 (또는 화학식 II(b)의 화합물)로부터 또는 화학식 IV(a)의 아미노니트릴 화합물로부터 출발하는, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 VI [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노산 화합물 (이의 염 포함)의 제조 방법을 또한 제공한다. 이러한 방법은 아미노니트릴 화합물이 화학식 VI의 아미노산 화합물로 전환되는 조건 하에 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 IV [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노니트릴 화합물을 산 및 물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 개시내용은 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 VI [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노산 화합물 (이의 염 및 공결정 (예를 들어 NH4Cl) 포함)의 제조 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방법은 화학식 I [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 대칭성 (아키랄) 아민 화합물을 산소 및 모노아민 옥시데이스 효소와 접촉시킨 후, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 IV에 따른 아미노니트릴 화합물이 산출되는데 적절한 조건 하에 시아나이드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 산화 반응 혼합물은 카탈레이스 효소를 더 포함한다. 이렇게 형성된 아미노니트릴 화합물을 아미노니트릴 화합물이 화학식 VI의 아미노산 화합물로 전환되는 조건 하에 산 및 물과 접촉시킨다.
본 발명의 개시내용은 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 VI [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노산 화합물 (이의 염 및 공결정 (예를 들어 NH4Cl) 포함)의 제조 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방법은 화학식 I [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 대칭성 (아키랄) 아민 화합물을 산소, 모노아민 옥시데이스 효소 및 바이설파이트와 접촉시킨 후, 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV에 따른 아미노니트릴 화합물이 산출되는데 적절한 조건 하에 시아나이드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 산화 반응 혼합물은 카탈레이스 효소를 더 포함한다. 이렇게 형성된 아미노니트릴 화합물을 아미노니트릴 화합물이 화학식 VI의 아미노산 화합물로 전환되는 조건 하에 산 및 물과 접촉시킨다. 또다른 실시양태들에서, 이렇게 형성된 아미노니트릴 화합물을 아미노니트릴 화합물이 화학식 V의 아미노 에스테르 화합물로 전환되는 조건 하에 산 및 알코올과 접촉시킨다.
또한, 본 발명의 개시내용은 본원에 개시된 신규 화합물 및 방법 (생체촉매 방법 포함)을 사용하여 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한, 보호된 화학식 V [식 중, A, M, M' 및 R5는 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노산 화합물 (이의 염 포함)을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 아미노니트릴 화합물이 화학식 V의 아미노산 에스테르 화합물로 전환되는 조건 하에 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 IV [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노니트릴 화합물을 산 및 알코올과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 개시내용은 본원에 개시된 신규 화합물 및 방법 (생체촉매 방법 포함)을 사용하여 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 VI [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노산 화합물 (이의 염 포함)을 제조하는 방법을 또한 제공한다. 이러한 방법은 아미노니트릴 화합물이 화학식 VI의 아미노산 화합물로 전환되는 조건 하에 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노니트릴 화합물을 산 (예를 들어 HCl)과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 개시내용은 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 VI [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노산 화합물 (이의 염 및 공동 결정 (예를 들어 NH4Cl) 포함)의 제조 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방법은 화학식 I [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아민 화합물을 산소 및 모노아민 옥시데이스 효소 및 NaHSO3과 접촉시킨 후, 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV에 따른 아미노니트릴 화합물이 산출되는데 적절한 조건 하에 시아나이드와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 반응 혼합물은 카탈레이스 효소를 더 포함한다. 이렇게 형성된 아미노니트릴 화합물을 아미노니트릴 화합물이 화학식 VI의 아미노산 화합물로 전환되는 조건 하에 HCl과 접촉시킨다.
또한, 본 발명의 개시내용은 본원에 개시된 신규 화합물 및 방법 (생체촉매 방법 포함)을 사용하여 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 V [식 중, A, M, M' 및 R5는 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노산 에스테르 화합물 (이의 염 포함)을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 아미노니트릴 화합물이 화학식 V의 아미노 에스테르 화합물로 전환되는 조건 하에 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV [식 중, A, M, M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노니트릴 화합물을 산 (예를 들어 HCl) 및 알코올과 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 개시내용은 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 VII [식 중, A, M 및 M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노 아미드 화합물 (이의 염 포함)의 제조 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방법은 화학식 I [식 중, A, M, M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아민 화합물을 산소 및 모노아민 옥시데이스 효소, 및 임의적으로 카탈레이스 효소 및 바이설파이트와 접촉시키고, 이어서 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV [식 중, A, M, M'은 상기 기술된 바와 같다]에 따른 아미노니트릴 화합물이 산출되는데 적절한 조건 하에 시아나이드와 접촉시킨 후, 아미노니트릴 화합물이 화학식 VII의 아미노산 아미드 화합물로 전환될 수 있는 조건 하에 아미노니트릴 화합물을 HCl 및 물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II의 이민 화합물로 산화시킬 수 있는 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스에는 서열 2, 서열 32 및 서열 6의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환이 있다. 이같은 아미노산 치환은 효소 활성, 입체특이성, 열안정성, 용매 안정성에서의 증가, 감소된 생성물 억제, 감소된 기질 억제, 또는 반응 공동-생성물에 대한 감소된 민감도가 포함되는 하나 이상의 개선된 성질이 있는 모노아민 옥시데이스를 제공한다. 이같은 아미노산 치환은, 예를 들어, 대장균 숙주 세포와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 이종 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 단백질로서, 숙주 세포에서의 모노아민 옥시데이스의 용해도, 안정성 및 발현 수준을 또한 개선시킬 수 있다.
본 발명의 개시내용은 이같은 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 개시된 생체촉매 공정에서 이러한 폴리펩티드를 사용하는 방법을 또한 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 모노아민 옥시데이스는 효소 활성 속도, 즉 화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II의 이민 화합물로 전환시키는 속도와 관련하여 서열 2, 서열 32 또는 서열 6의 효소와 비교하여 개선된다. 일부 실시양태에서, 개시된 모노아민 옥시데이스는 서열 2, 서열 32 또는 서열 6의 모노아민 옥시데이스가 나타내는 속도의 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 또는 100배 초과인 속도로 기질을 생성물로 전환시킬 수 있다. 이같은 성질이 있는 예시적인 폴리펩티드에는 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 36에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 모노아민 옥시데이스는 약 95％ 이상의 거울상이성질체 과량 백분율로 화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II의 이민 화합물로 전환시킬 수 있다. 이같은 성질이 있는 예시적인 폴리펩티드에는 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 36에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20의 서열식을 기초로 하고, 이에 대하여 적어도 약 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 차이는 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 또는 이같은 변화들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열 차이는 비-보존적 아미노산 치환, 보존적 아미노산 치환, 뿐만 아니라 비-보존적 아미노산 치환과 보존적 아미노산 치환의 조합을 포함할 수 있다. 이같은 변화가 이루어질 수 있는 다양한 아미노산 잔기 위치들이 본원에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 99 및 서열 32의 잔기 97에 상응하는 아미노산인 글루타민이 산성 아미노산, 즉, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 글루타민 잔기는 글루탐산 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 365 및 서열 32의 잔기 363에 상응하는 아미노산인 타이로신이 다른 방향족 아미노산, 즉, 페닐알라닌 또는 트립토판으로 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 타이로신 잔기는 트립토판 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 382 및 서열 32의 잔기 380에 상응하는 아미노산인 페닐알라닌이 비-극성 아미노산, 즉, 발린, 이소류신, 알라닌, 글리신, 메티오닌 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 페닐알라닌 잔기는 류신 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 465 및 서열 32의 잔기 463에 상응하는 아미노산인 세린이 비-극성 아미노산, 즉, 발린, 이소류신, 알라닌, 메티오닌, 류신 또는 글리신으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 세린 잔기는 글리신 잔기로 교체된다.
또다른 실시양태들에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 135에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 또다른 극성 아미노산, 즉, 세린, 글루타민 또는 아스파라긴으로 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 트레오닌 잔기는 글루타민 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 284에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 산성 아미노산, 즉, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 아스파라긴 잔기는 글루탐산 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2의 잔기 289에 상응하는 아미노산이 또다른 비-극성 아미노산, 즉, 글리신, 발린, 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 알라닌 잔기는 발린 잔기로 교체된다.
또다른 실시양태들에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2의 잔기 384에 상응하는 아미노산인 라이신이 또다른 극성 아미노산, 즉, 세린, 트레오닌 또는 글루타민으로 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 라이신 잔기는 글루타민 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 아스페르길루스 니게르의 모노아민 옥시데이스 (서열 2)의 동족체 또는 아스페르길루스 오리자에의 모노아민 옥시데이스 (서열 44)의 동족체이고 본원에 개시된 것들에 상응하는 아미노산 치환들 중 하나 이상을 보유하는 모노아민 옥시데이스이다. 예시적인 동족체에는 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 및 서열 34의 모노아민 옥시데이스가 포함된다. 또다른 실시양태들에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32 및 서열 34의 효소로부터 선택되고 본원에 개시된 것들에 상응하는 아미노산 치환들 중 하나 이상을 보유하는 모노아민 옥시데이스이다.
또다른 양상에서, 본 발명의 개시내용은 본원에 기술된 조작된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 고도로 엄격한 조건 하에 이같은 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 코딩된 조작된 모노아민 옥시데이스의 발현에 유용한 프로모터 및 기타 조절 요소를 포함할 수 있고, 특정한 원하는 발현 시스템에 대해 최적화된 코돈을 활용할 수 있다. 예시적인 폴리뉴클레오티드에는 서열 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 31 및 35가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
또다른 양상에서, 본 발명의 개시내용은 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 및/또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 아스페르길루스 종, 예를 들어 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 오리자에, 또는 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans)의 세포일 수 있거나, 또는 상이한 생물, 예를 들어, 대장균 또는 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae)일 수 있다. 숙주 세포는 본원에 기술된 조작된 모노아민 옥시데이스 효소의 발현 및 단리에 사용될 수 있거나, 또는 별법적으로, 기질을 입체이성질체 생성물로 전환시키는데 직접적으로 사용될 수 있다.
전체 세포로, 세포 추출물로 또는 정제된 모노아민 옥시데이스로 방법을 수행하는지 여부와 관계 없이, 단일 모노아민 옥시데이스가 사용될 수 있거나, 또는 별법적으로 2가지 이상의 모노아민 옥시데이스의 혼합물이 사용될 수 있다.
본원에 기술된 모노아민 옥시데이스 효소는 화학식 )의 화합물의 화학식 II(a)의 화합물로의 산화를 촉매할 수 있다:
[화학식 I]
Figure pct00032
[화학식 II(a)]
Figure pct00033
특별한 실시양태에서, 본원에 기술된 모노아민 옥시데이스 효소는 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산, 화합물 (1)의 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔, 화합물 (2)로의 산화를 촉매할 수 있다:
[화학식 1]
Figure pct00034
[화학식 2]
Figure pct00035
또다른 특별한 실시양태에서, 본원에 기술된 모노아민 옥시데이스 효소는 (3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 화합물 (3)의 (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (4)로의 산화를 촉매할 수 있다:
[화학식 3]
Figure pct00036
[화학식 4]
Figure pct00037
화학식 I의 화합물을 화학식 II(a)의 화합물로 산화시키는 방법의 일부 실시양태에서, 기질은 약 99％를 초과하는 입체이성질체 과량으로 생성물로 산화되고, 이때 모노아민 옥시데이스는 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 36에 상응하는 서열을 포함한다.
화학식 I의 화합물을 화학식 II(a)의 화합물로 산화시키는 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 1-100 g/ℓ 기질의 적어도 약 10-20％가 약 1-10 g/ℓ의 폴리펩티드로 약 24시간 미만 내에 생성물로 전환되고, 이때 폴리펩티드는 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 36에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
기질을 생성물로 환원시키는 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 약 25-50 g/ℓ를 초과하는 기질 및 약 1-5 g/ℓ 미만의 폴리펩티드로 수행되는 경우 기질의 적어도 약 95％가 약 24시간 미만 내에 생성물로 전환되고, 이때 폴리펩티드는 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 36에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
5. 상세한 설명
5.1 본 발명의 개시내용의 융합 이환식 프롤린 화합물
5.1.1 화학식 II(a) 및 (b)의 융합 이환식 프롤린 화합물
본 발명의 개시내용은 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 II(a)의 융합 이환식 프롤린 화합물 및 이의 이량체인 화학식 II(b)의 화합물, 및 이들의 혼합물 (이들의 염 및 수화물 포함)을 제공한다:
[화학식 II(a)]
Figure pct00038
및
[화학식 II(b)]
Figure pct00039
[식 중, A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl, 및 Br로부터 선택되고; M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고; 단, (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고; (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다].
한 실시양태에서, A는 -CH2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH2CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)(CH3)-이다.
한 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -C(C2H5)2, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)-, 및 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -C(CH3)2-, -C(CH3)2- 및 -C(C2H5)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2-, -C(CH3)2-, -CH(CH3)-, -C(C2H5)2-, -CH(C2H5)-, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)- 및 -C(H2)NHC(NH)NH2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2- 및 -C(CH3)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시양태에서, M 및 M'은 -O-이고, A는 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -C(C2H5)2-, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)- 및 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 -O-이고, A는 -CH2-, -C(CH3)2- 및 -C(C2H5)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
피롤리딘 화합물의 다수의 이민 (예를 들어, 3,4-디하이드로-2H-피롤)은 이량체에 더하여 또는 이량체 대신에 고리 스트레인(strain)으로 인해 열역학적으로 선호되는 삼량체를 형성하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 임의의 상기 화학식 II(a)의 화합물은 화학식 II(c)의 삼량체 형태로 또한 존재할 수 있다:
[화학식 II(c)]
Figure pct00040
특정 실시양태에서, 본 발명의 개시내용은 화학식 II(a)의 화합물의 삼량체, 예를 들어, 화학식 II(c)의 화합물, 및 화학식 II(a) 및/또는 화학식 II(b)의 화합물과 이의 혼합물을 제공한다.
5.1.2 화학식 III의 아미노술포네이트
본 발명의 개시내용은 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 III(a) 및 (b)의 아미노술포네이트 화합물 (이의 염, 수화물 및 혼합물 포함)을 추가로 제공한다:
[화학식 III(a)]
Figure pct00041
[화학식 III(b)]
Figure pct00042
[식 중, A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl, 및 Br로부터 선택되고; M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고; 단, (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고; (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다].
한 실시양태에서, A는 -CH2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH2CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)(CH3)-이다.
한 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -C(C2H5)2, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)-, 및 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -C(CH3)2-, -C(CH3)2- 및 -C(C2H5)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2-, -C(CH3)2-, -CH(CH3)-, -C(C2H5)2-, -CH(C2H5)-, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)- 및 -C(H2)NHC(NH)NH2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2- 및 -C(CH3)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시양태에서, M 및 M'은 -O-이고, A는 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -C(C2H5)2-, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)- 및 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 -O-이고, A는 -CH2-, -C(CH3)2- 및 -C(C2H5)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
5.1.3 화학식 IV의 아미노니트릴 화합물
또한, 본 발명의 개시내용은 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV(a) 및 (b)의 아미노니트릴 화합물 (이의 염, 수화물 및 혼합물 포함)을 추가로 제공한다:
[화학식 IV(a)]
Figure pct00043
[화학식 IV(b)]
Figure pct00044
[식 중, A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl, 및 Br로부터 선택되고; M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고; 단, (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고; (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다].
한 실시양태에서, A는 -CH2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH2CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)(CH3)-이다.
한 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -C(C2H5)2, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)-, 및 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -C(CH3)2-, -C(CH3)2- 및 -C(C2H5)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2-, -C(CH3)2-, -CH(CH3)-, -C(C2H5)2-, -CH(C2H5)-, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)- 및 -C(H2)NHC(NH)NH2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2- 및 -C(CH3)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
5.1.4 화학식 V의 융합 이환식 프롤린 화합물
본 발명의 개시내용은 화학식 V의 융합 이환식 프롤린 화합물 (이의 염 및 수화물 포함)을 제공한다:
[화학식 V]
Figure pct00045
[식 중, A, M, 및 M'은, R5는 보호기 (예를 들어 벤질 또는 트리메틸실릴 등), -(C1-C2)알킬, -(C1-C3)알킬, -(C1-C4)알킬 및 -(C1-C6)알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다]. 비-제한적인 특정 실시양태에서, R5는 메틸, 에틸 또는 t-부틸이고, 이의 염 및 수화물이 포함되며, 식 중 A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl, 및 Br로부터 선택되고; M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고; 단, (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고; (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다].
한 실시양태에서, A는 -CH2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH2CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)(CH3)-이다.
한 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -C(C2H5)2, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)-, 및 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -C(CH3)2-, -C(CH3)2- 및 -C(C2H5)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2-, -C(CH3)2-, -CH(CH3)-, -C(C2H5)2-, -CH(C2H5)-, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)- 및 -C(H2)NHC(NH)NH2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2- 및 -C(CH3)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, R5는 벤질이다.
한 실시양태에서, R5는 트리메틸실릴이다.
또다른 실시양태에서, R5는 메틸이다.
추가적인 실시양태에서, R5는 에틸이다.
또다른 실시양태에서, R5는 t-부틸이다.
5.1.5 화학식 VI의 융합 이환식 프롤린 화합물
본 발명의 개시내용은 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 VI에 따른 화합물 (이의 염 및 수화물 포함)을 또한 제공한다:
[화학식 VI]
Figure pct00046
[식 중, A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl, 및 Br로부터 선택되고; M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고; 단, (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고; (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다].
한 실시양태에서, A는 -CH2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH2CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)(CH3)-이다.
한 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -C(C2H5)2, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)-, 및 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -C(CH3)2-, -C(CH3)2- 및 -C(C2H5)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2-, -C(CH3)2-, -CH(CH3)-, -C(C2H5)2-, -CH(C2H5)-, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)- 및 -C(H2)NHC(NH)NH2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2- 및 -C(CH3)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
5.1.6 화학식 VII의 융합 이환식 프롤린 화합물
또한, 본 발명의 개시내용은 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 VII의 헤테로이환식(heterobicyclic) 이미노산 화합물 (이의 염 및 수화물 포함)을 제공한다:
[화학식 VII]
Figure pct00047
[식 중, A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl, 및 Br로부터 선택되고; M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고; 단, (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고; (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다].
한 실시양태에서, R6 및 R7은 둘 모두 H이다.
한 실시양태에서, A는 -CH2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -CH(CH2CH3)-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)2-이다.
또다른 실시양태에서, A는 -C(CH2CH3)(CH3)-이다.
한 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -C(C2H5)2, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)-, 및 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 존재하지 않고, A는 -CH2-, -C(CH3)2-, -C(CH3)2- 및 -C(C2H5)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2-, -C(CH3)2-, -CH(CH3)-, -C(C2H5)2-, -CH(C2H5)-, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)- 및 -C(H2)NHC(NH)NH2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가적인 실시양태에서, M 및 M'은 -CH2-이고, A는 -O-, -CH2- 및 -C(CH3)2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
5.2 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스
화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II의 이민 화합물로 산화시킬 수 있는 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스에는 서열 2, 서열 6 및 서열 32의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환이 있다. 이같은 아미노산 치환은 효소 활성, 입체특이성, 열안정성, 용매 안정성에서의 증가, 감소된 생성물 억제, 감소된 기질 억제, 또는 반응 부산물에 대한 감소된 민감도가 포함되는 하나 이상의 개선된 성질이 있는 모노아민 옥시데이스를 제공한다. 이같은 아미노산 치환은, 예를 들어, 대장균 숙주 세포와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 이종 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 단백질로서, 숙주 세포에서의 모노아민 옥시데이스의 발현 수준, 용해도 및/또는 안정성을 또한 개선시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 아미노산 치환 S465G는 대장균에서의 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스의 발현 수준, 용해도 및/또는 안정성에서의 실질적인 증가를 제공한다.
본 발명의 개시내용은 이같은 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 개시된 생체촉매 공정에서 이러한 폴리펩티드를 사용하는 방법을 또한 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 모노아민 옥시데이스는 효소 활성 속도, 즉 화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II의 이민 화합물로 전환시키는 속도와 관련하여 서열 2, 서열 6 또는 서열 32의 효소와 비교하여 개선된다. 일부 실시양태에서, 개시된 모노아민 옥시데이스는 서열 2, 서열 6 및 서열 32의 모노아민 옥시데이스가 나타내는 속도의 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 또는 100배 초과인 속도로 기질을 생성물로 전환시킬 수 있다. 이같은 성질이 있는 예시적인 폴리펩티드에는 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 36에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 모노아민 옥시데이스는 약 95％ 이상의 부분입체이성질체 과량 백분율로 화학식 I의 아민 화합물을 상응하는 화학식 II의 이민 화합물로 전환시킬 수 있다. 이같은 성질이 있는 예시적인 폴리펩티드에는 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 36에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20의 서열식을 기초로 하고, 이와 적어도 약 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 차이는 아미노산 삽입, 결실, 치환, 또는 이같은 변화들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열 차이는 비-보존적 아미노산 치환, 보존적 아미노산 치환, 뿐만 아니라 비-보존적 아미노산 치환과 보존적 아미노산 치환의 조합을 포함할 수 있다. 이같은 변화가 이루어질 수 있는 다양한 아미노산 잔기 위치들이 본원에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 99 및 서열 32의 잔기 97에 상응하는 아미노산인 글루타민이 산성 아미노산, 즉, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 글루타민 잔기는 글루탐산 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 365 및 서열 32의 잔기 363에 상응하는 아미노산인 타이로신이 다른 방향족 아미노산, 즉, 페닐알라닌 또는 트립토판으로 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 타이로신 잔기는 트립토판 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 382 및 서열 32의 잔기 380에 상응하는 아미노산인 페닐알라닌이 비-극성 아미노산, 즉, 발린, 이소류신, 알라닌, 글리신, 메티오닌 또는 류신으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 페닐알라닌 잔기는 류신 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 465 및 서열 32의 잔기 463에 상응하는 아미노산인 세린이 비-극성 아미노산, 즉, 발린, 이소류신, 알라닌, 메티오닌, 류신 또는 글리신으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 세린 잔기는 글리신 잔기로 교체된다.
또다른 실시양태들에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 135에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 또다른 극성 아미노산, 즉, 세린, 글루타민 또는 아스파라긴으로 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 트레오닌 잔기는 글루타민 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 284에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 산성 아미노산, 즉, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 아스파라긴 잔기는 글루탐산 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2 및 서열 6의 잔기 289에 상응하는 아미노산인 알라닌이 또다른 비-극성 아미노산, 즉, 글리신, 발린, 류신, 이소류신 또는 메티오닌으로 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 알라닌 잔기는 발린 잔기로 교체된다.
또다른 실시양태들에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 서열 2의 잔기 384에 상응하는 아미노산인 라이신이 또다른 극성 아미노산, 즉, 세린, 트레오닌 또는 글루타민으로 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 실시양태에서, 이러한 라이신 잔기는 글루타민 잔기로 교체된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 아스페르길루스 니게르의 모노아민 옥시데이스 (서열 2)의 동족체 또는 아스페르길루스 오리자에의 모노아민 옥시데이스 (서열 32)의 동족체이고 본원에 개시된 것들에 상응하는 아미노산 치환들 중 하나 이상을 보유하는 모노아민 옥시데이스이다. 예시적인 동족체에는 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32 및 서열 34의 모노아민 옥시데이스가 포함된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스는 본원에 개시된 것들에 상응하는 아미노산 치환들 중 하나 이상을 보유하는 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32 및 서열 34의 효소로부터 선택되는 모노아민 옥시데이스이다.
5.3 정의
본원에서 사용된 하기의 용어들은 하기의 의미를 지니도록 의도된다.
"모노아민 옥시데이스"는 상기 화학식 I의 화합물을 상응하는 상기 화학식 II의 생성물로 산화시키는 효소 능력이 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 폴리펩티드는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD), 플라빈 아데닌 모노뉴클레오티드 (FMN), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD), 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADP)와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 산화된 보조인자를 전형적으로 이용한다. 특별한 실시양태에서, 산화된 보조인자는 FAD이다. 본원에서 사용되는 모노아민 옥시데이스에는 천연 발생 (야생형) 모노아민 옥시데이스, 뿐만 아니라 인간의 조작에 의해 생성된, 조작된(engineered) 비-천연 발생 폴리펩티드가 포함된다.
"코딩 서열"은 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 부분 (예를 들어, 유전자)을 지칭한다.
"천연 발생" 또는 "야생형"은 천연에서 발견되는 형태를 지칭한다. 예를 들어, 천연 발생 또는 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있고 인간의 조작에 의해 고의적으로 변형되지 않은 생물 내에 존재하는 서열이다.
"재조합"은, 예를 들어, 세포, 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우, 재조합 물질이 아니라면 자연에 존재하지 않을 방식으로 변형된, 또는 자연 또는 천연 형태의 물질과 동일하지만 합성 물질로부터 및/또는 재조합 기술을 사용하는 조작에 의해 생산 또는 유래된 물질, 또는 자연 또는 형태 형태의 이러한 물질에 상응하는 물질을 지칭한다. 비-제한적인 예로는, 천연 (비-재조합) 형태의 세포에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는 재조합 세포가 아니라면 상이한 수준으로 발현되는 천연 유전자를 발현하는 재조합 세포가 특히 포함된다.
"서열 동일성의 백분율" 및 "상동성 백분율"은 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드들 간의 비교를 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 비교 창(window)에서 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정되며, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 비교 창 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분은 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. 양쪽 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭(matching)되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 창 내의 위치의 전체 개수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 백분율이 계산될 수 있다. 별법적으로, 양쪽 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하거나 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 갭과 함께 정렬되는 위치의 개수를 결정하여 매칭되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 창 내의 위치의 전체 개수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 백분율이 계산될 수 있다. 당업자는 2개의 서열을 정렬하는데 이용할 수 있는 다수의 확립된 알고리즘이 있음을 이해한다. 비교를 위한 서열들의 최적의 정렬은, 예를 들어, [Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, [Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이러한 알고리즘들의 컴퓨터화된 실행 (GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지(Wisconsin Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 육안 검사에 의해 수행될 수 있다 (일반적으로, [Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)] 참조). 서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하기에 적절한 알고리즘들의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이고, 이들은 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 [Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402]에 각각 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 <National Center for Biotechnology Information>의 웹사이트로부터 공개적으로 입수가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드(word)와 정렬되는 경우 약간의 양성 값의 역치 점수 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드들을 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치로 지칭된다 ([Altschul et al., 상기 문헌]). 이러한 초기 이웃 워드 히트(hit)는 이를 함유하는 더 긴 HSP를 찾기 위한 검색을 시작하기 위한 시드(seed)로 작용한다. 그후, 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 만큼 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 워드 히트가 확장된다. 뉴클레오티드 서열에 대해, 파라메터 M (매칭되는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 0 초과) 및 N (미스매칭된 잔기에 대한 페널티 점수; 항상 0 미만)을 사용하여 누적 점수가 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 누적 점수를 계산하기 위해 채점 매트릭스가 사용된다. 누적 정렬 점수가 이의 최대 달성치로부터 X의 양만큼 하락한 경우, 하나 이상의 음성으로 채점된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하가 된 경우, 또는 어느 한쪽 서열의 끝부분에 도달한 경우, 각각의 방향으로의 워드 히트의 확장이 정지된다. BLAST 알고리즘 파라메터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M = 5, N = -4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열용으로, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 (W) 3, 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 채점 매트릭스 ([Henikoff and Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 89:10915] 참조). 서열 정렬 및 ％ 서열 동일성의 예시적인 측정법은, 제공된 디폴트 파라메터를 사용하여, GCG 위스콘신 소프트웨어 패키지 (Accelrys, Madison WI) 내의 BESTFIT 또는 GAP 프로그램을 사용할 수 있다.
"기준 서열"은 서열 비교를 위한 기준물로 사용되는 규정된 서열을 지칭한다. 기준 서열은 더 큰 서열의 부분집합, 예를 들어, 전장 유전자 또는 폴리펩티드 서열의 절편일 수 있다. 일반적으로, 기준 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 20개 이상의 길이, 잔기 25개 이상의 길이, 잔기 50개 이상의 길이, 또는 전장 핵산 또는 폴리펩티드이다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 각각 (1) 2개의 서열 간에 유사한 서열 (즉, 전체 서열의 일부분)을 포함할 수 있고, (2) 2개의 서열 간에 다른 서열을 더 포함할 수 있기 때문에, 2개 (또는 이를 초과하는) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 간의 서열 비교는 국소적인 서열 유사성 영역을 확인 및 비교하기 위해 "비교 창"에서 2개의 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교함으로써 전형적으로 수행된다.
"비교 창"은 약 20개 이상의 인접한 뉴클레오티드 위치 또는 아미노산 잔기의 개념적인 절편을 지칭하고, 이러한 창에서 서열이 20개 이상의 인접한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 기준 서열에 비교될 수 있으며, 비교 창 내의 서열의 일부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20％ 이하의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 창은 20개보다 긴 인접한 잔기들일 수 있고, 임의적으로 30개, 40개, 50개, 100개 또는 이보다 긴 창을 포함한다.
"실질적 동일성"은 잔기 위치 20개 이상의 비교 창, 종종 잔기 30-50개 이상의 비교 창에서 기준 서열에 비교하여 서열 동일성이 80％ 이상, 85％ 이상, 89 내지 95％ 이상, 더욱 일반적으로는 99％ 이상인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭하고, 이때 서열 동일성의 백분율은 비교 창에서 총계가 기준 서열의 20％ 이하인 결실 또는 부가를 포함하는 서열에 기준 서열을 비교함으로써 계산된다. 폴리펩티드에 적용되는 구체적인 실시양태에서, 용어 "실질적 동일성"은 2개의 폴리펩티드 서열이, 최적으로 정렬되었을 때 (예컨대 디폴트 갭 폭을 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해), 80％ 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 89％ 이상의 서열 동일성, 95％ 이상의 서열 동일성 또는 이를 초과하는 서열 동일성 (예를 들어, 99％ 서열 동일성)을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다.
소정의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 번호매김의 문맥에서 사용되는 경우의 "~에 상응하는", "~를 기준으로" 또는 "~에 비하여"는 소정의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 서열에 비교될 때 특정 기준 서열의 잔기의 번호매김을 지칭한다. 달리 말하면, 소정의 중합체의 잔기 번호 또는 잔기 위치가 소정의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내에서의 잔기의 실제 수적 위치에 의해서보다는 기준 서열에 관하여 지정된다. 예를 들어, 갭을 도입하여 2개의 서열 간의 잔기 매치를 최적화함으로써 소정의 아미노산 서열, 예컨대 조작된 모노아민 옥시데이스의 서열이 기준 서열에 대해 정렬될 수 있다. 이러한 경우, 갭이 존재하기는 하지만, 소정의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내의 잔기의 번호매김은 이러한 서열이 정렬되는 기준 서열에 관하여 이루어진다.
"입체선택성"은 화학 또는 효소 반응에서 하나의 입체이성질체가 또다른 입체이성질체에 비해 우선적으로 형성되는 것을 지칭한다. 입체선택성은 하나의 입체이성질체의 형성이 다른 입체이성질체에 비해 선호되는 경우 부분적일 수 있거나, 또는 하나의 입체이성질체만 형성되는 경우 완전할 수 있다. 입체이성질체가 거울상이성질체인 경우, 입체선택성은 양쪽 거울상이성질체의 합계 중 하나의 거울상이성질체의 분율 (전형적으로 백분율로 보고됨)인 거울상선택성으로 지칭된다. 별법적으로, 이는 [다수 거울상이성질체 - 소수 거울상이성질체]/[다수 거울상이성질체 + 소수 거울상이성질체]의 식에 따라 계산된 거울상이성질체 과량 (e.e.)으로 당업계에서 통상적으로 보고된다 (전형적으로, 백분율). 입체이성질체가 부분입체이성질체인 경우, 입체선택성은 2개의 부분입체이성질체의 혼합물 내의 하나의 부분입체이성질체의 분율 (전형적으로 백분율로 보고됨)인 부분입체선택성으로 지칭되고, 별법적으로 부분입체이성질체 과량 (d.e.)으로 통상적으로 보고된다. 거울상이성질체 과량 및 부분입체이성질체 과량은 입체이성질체 과량의 유형들이다.
"고도로 입체선택적"은 약 99％ 이상의 입체이성질체 과량으로 기질을 상응하는 생성물로 전환시킬 수 있는 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 지칭한다.
"입체특이성"은 화학 또는 효소 반응에서 하나의 입체이성질체가 또다른 입체이성질체에 비해 우선적으로 전환되는 것을 지칭한다. 입체특이성은 하나의 입체이성질체의 전환이 다른 입체이성질체에 비해 선호되는 경우 부분적일 수 있거나, 또는 하나의 입체이성질체만 전환되는 경우 완전할 수 있다
"화학선택성"은 화학 또는 효소 반응에서 하나의 생성물이 또다른 생성물에 비해 우선적으로 형성되는 것을 지칭한다.
"개선된 효소 성질"은 기준 모노아민 옥시데이스와 비교하여 임의의 효소 성질에서의 개선을 나타내는 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에 기술된 조작된 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드에 대해, 일반적으로 야생형 모노아민 옥시데이스에 대해 비교가 이루어지지만, 일부 실시양태에서, 기준 모노아민 옥시데이스는 또다른 개선된 조작된 모노아민 옥시데이스일 수 있다. 개선이 바람직한 효소 성질에는 효소 활성 (기질 전환 백분율로 표현될 수 있음), 열 안정성, pH 활성 프로파일, 보조인자 요건, 억제제 (예를 들어, 생성물 억제)에 대한 불응, 입체특이성, 입체선택성 (거울상선택성 포함), 용해도, 및 숙주 세포에서의 안정성 및 발현 수준이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
"증가된 효소 활성"은 기준 모노아민 옥시데이스 효소와 비교하여 고유 활성 (예를 들어, 생산된 생성물/시간/단백질 중량)에서의 증가 또는 기질의 생성물로의 전환 백분율 (예를 들어, 특정 기간 동안 특정량의 모노아민 옥시데이스를 사용하여 출발량의 기질이 생성물로 전환되는 백분율)에서의 증가로 표시될 수 있는, 조작된 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드의 개선된 성질을 지칭한다. 효소 활성을 결정하는 예시적인 방법들이 실시예에서 제공된다. K m , V max 또는 k cat 의 고전적인 효소 성질이 포함되는 효소 활성에 관한 임의의 성질이 영향을 받을 수 있고, 이들의 변화가 증가된 효소 활성에 이를 수 있다. 효소 활성에서의 개선은 이러한 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드가 유래된 천연 발생 모노아민 옥시데이스 또는 또다른 조작된 모노아민 옥시데이스보다 상응하는 야생형 모노아민 옥시데이스의 효소 활성의 약 1.5배에서 많게는 2배, 5배, 10배, 20배, 25배, 50배, 75배, 100배 또는 그 이상까지일 수 있다. 촉매적 교체 속도(turnover rate)가 기질 (임의의 필요한 보조인자 포함)의 확산 속도를 초과할 수 없도록 임의의 효소의 활성이 확산에 의해 제한되는 것으로 당업자에게 이해된다. k cat / K m 또는 확산 한계의 이론적 최대값 은 일반적으로 약 108 내지 109 (M-1 s-1)이다. 따라서, 모노아민 옥시데이스의 효소 활성에서의 임의의 개선은 모노아민 옥시데이스 효소가 작용하는 기질의 확산 속도와 관련된 상한이 있을 것이다. Zhou 등의 문헌 [Zhou et al., "A One-Step Fluorometric Method for the Continuous Measurement of Monoamine Oxidase Activity", 1997 Anal. Biochem. 253:169-74] 및 Szutowicz 등의 문헌 [Szutowicz et al., "Colorimetric Assay for Monoamine Oxidase in Tissues Using Peroxidase and 2,2'-Azino(3-ethtylbenzthaizoline-6-sulfonic Acid) as Chromogen", 1984, Anal. Biochem. 138:86-94]에 개시된 것들과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 모노아민 옥시데이스를 측정하기 위한 공개된 방법 또는 이의 개조물을 사용하여 모노아민 옥시데이스 활성을 측정할 수 있다. 본원에서 상세하게 추가로 기술된 바와 같은, 규정된 효소 제제, 설정된 조건 하의 규정된 분석법, 및 하나 이상의 규정된 기질을 사용하여, 또는, 예를 들어, [Zhou 상기 문헌] 및 [Szutowicz 상기 문헌]의 방법을 사용하여, 효소 활성의 비교가 이루어진다. 일반적으로, 용해물이 비교되는 경우, 세포의 개수 및 분석되는 단백질의 양이 결정될 뿐만 아니라, 숙주 세포에 의해 생산되어 용해물 내에 존재하는 효소의 양에서의 변동을 최소화하기 위해 동일한 발현 시스템 및 동일한 숙주 세포가 사용된다.
"전환"은 기질이 상응하는 생성물로 효소에 의해 산화되는 것을 지칭한다. "전환 백분율"은 특정 조건 하에 일정 기간 내에 생성물로 산화되는 기질의 백분율을 지칭한다. 따라서, 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드의 "효소 활성" 또는 "활성"은 기질의 생성물로의 "전환 백분율"로 표현될 수 있다.
"열 안정적"은 일정 기간 (예를 들어 0.5-24시간) 동안 상승된 온도 (예를 들어 40-80℃)에 노출된 후 처리되지 않은 효소와 비교하여 유사한 활성 (예를 들어 60％ 내지 80％ 초과)을 유지하는 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 지칭한다.
"용매 안정적"은 일정 기간 (예를 들어 0.5-24시간) 동안 다양한 농도 (예를 들어 5-99％)의 용매 (이소프로필 알코올, 테트라하이드로푸란, 2-메틸테트라하이드로푸란, 아세톤, 톨루엔, 부틸 아세테이트, 메틸 tert-부틸에테르 등)에 노출된 후 처리되지 않은 효소와 비교하여 유사한 활성 (예를 들어 60％ 내지 80％ 초과)을 유지하는 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 지칭한다.
"pH 안정적"은 일정 기간 (예를 들어 0.5-24시간) 동안 높은 pH 또는 낮은 pH (예를 들어 4.5-6 또는 8 내지 12)에 노출된 후 처리되지 않은 효소와 비교하여 유사한 활성 (예를 들어 60％ 내지 80％ 초과)을 유지하는 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 지칭한다.
"열 및 용매 안정적"은 열 안정적이고 용매 안정적인 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 지칭한다.
조작된 모노아민 옥시데이스 효소의 문맥에서 본원에서 사용된 "~ 로부터 유 래된"은 이러한 조작이 기초로 하는, 기원이 되는 모노아민 옥시데이스 효소, 및/또는 이같은 모노아민 옥시데이스 효소를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 예를 들어, 서열 8의 조작된 모노아민 옥시데이스 효소는 서열 2의 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스 효소를 코딩하는 유전자를 여러 세대에 걸쳐 인공적으로 진화시킴으로써 수득되었다. 따라서, 이러한 조작된 모노아민 옥시데이스 효소는 서열 2의 야생형 모노아민 옥시데이스"로부터 유래"된다
"친수성 아미노산 또는 잔기"는 [Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142]의 표준화된 컨센서스(consensus) 소수성 척도에 따라 0 미만의 소수성을 나타내는 측쇄가 있는 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전적으로 코딩되는 친수성 아미노산에는 L-Thr (T), L-Ser (S), L-His (H), L-Glu (E), L-Asn (N), L-Gln (Q), L-Asp (D), L-Lys (K) 및 L-Arg (R)이 포함된다.
"산성 아미노산 또는 잔기"는 아미노산이 펩티드 또는 폴리펩티드 내에 포함되는 경우에 약 6 미만의 pK 값을 나타내는 측쇄가 있는 친수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 전형적으로, 산성 아미노산에는 수소 원자의 손실로 인해 생리학적 pH에서 음성 전하를 띠는 측쇄가 있다. 유전적으로 코딩되는 산성 아미노산에는 L-Glu (E) 및 L-Asp (D)가 포함된다.
"염기성 아미노산 또는 잔기"는 아미노산이 펩티드 또는 폴리펩티드 내에 포함되는 경우에 약 6을 초과하는 pK 값을 나타내는 측쇄가 있는 친수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 전형적으로, 염기성 아미노산에는 하이드로늄 이온과의 회합으로 인해 생리학적 pH에서 양성 전하를 띠는 측쇄가 있다. 유전적으로 코딩되는 염기성 아미노산에는 L-Arg (R) 및 L-Lys (K)이 포함된다.
"극성 아미노산 또는 잔기"는 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않지만 2개의 원자가 공통으로 공유하는 한쌍의 전자가 이러한 원자들 중 하나에 의해 더욱 가깝게 유지되는 결합이 1개 이상 있는 측쇄가 있는 친수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전적으로 코딩되는 극성 아미노산에는 L-Asn (N), L-Gln (Q), L-Ser (S) 및 L-Thr (T)이 포함된다.
"소수성 아미노산 또는 잔기"는 [Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179:125-142]의 표준화된 컨세서스 소수성 척도에 따라 0을 초과하는 소수성을 나타내는 측쇄가 있는 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전적으로 코딩되는 소수성 아미노산에는 L-Pro (P), L-Ile (I), L-Phe (F), L-Val (V), L-Leu (L), L-Trp (W), L-Met (M), L-Ala (A) 및 L-Tyr (Y)이 포함된다.
"방향족 아미노산 또는 잔기"는 1개 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 측쇄가 있는 친수성 또는 소수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전적으로 코딩되는 방향족 아미노산에는 L-Phe (F), L-Tyr (Y) 및 L-Trp (W)이 포함된다. L-His (H)은 이의 헤테로방향족 질소 원자의 pKa로 인해 때로는 염기성 잔기로 분류되거나, 또는 이의 측쇄가 헤테방향족 고리를 포함하기 때문에 방향족 잔기로 분류되지만, 본원에서는 히스티딘은 친수성 잔기로 또는 "구속형(constrained) 잔기" (하기 참조)로 분류된다.
"구속형 아미노산 또는 잔기"는 기하구조가 구속된 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 본원에서, 구속형 잔기에는 L-pro (P) 및 L-his (H)이 포함된다. 히스티딘은 비교적 작은 이미다졸 고리가 있기 때문에 구속된 기하구조를 지닌다. 프롤린 또한 5원 고리가 있기 때문에 구속된 기하구조를 지닌다.
"비-극성 아미노산 또는 잔기"는 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않고 2개의 원자가 공통으로 공유하는 한쌍의 전자가 일반적으로 2개의 원자 각각에 의해 균등하게 유지되는 결합 (즉, 측쇄가 극성이지 않음)이 있는 측쇄가 있는 친수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전적으로 코딩되는 비-극성 아미노산에는 L-Gly (G), L-Leu (L), L-Val (V), L-Ile (I), L-Met (M) 및 L-Ala (A)가 포함된다.
"지방족 아미노산 또는 잔기"는 지방족 탄화수소 측쇄가 있는 소수성 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 유전적으로 코딩되는 지방족 아미노산에는 L-Ala (A), L-Val (V), L-Leu (L) 및 L-Ile (I)이 포함된다.
"시스테인". 아미노산 L-Cys (C)은 다른 L-Cys (C) 아미노산 또는 다른 설파닐- 또는 설프하이드릴-함유 아미노산과 함께 디설파이드 다리를 형성할 수 있다는 점에서 독특하다. "시스테인-유사 잔기"에는 시스테인 및 디설피드 다리의 형성에 이용가능한 설프하이드릴 모이어티(moiety)를 함유하는 기타 아미노산이 포함된다. 환원된 유리-SH 또는 산화된 디설피드-다리 형태로 펩티드 내에 존재하는 L-Cys (C) (및 -SH 함유 측쇄가 있는 또다른 아미노산)의 능력은 L-Cys (C)이 펩티드에 알짜(net) 소수성 또는 친수성 특성을 기여하는지 여부에 영향을 미친다. L-Cys (C)은 [Eisenberg et al., 1984, 상기 문헌]의 표준화된 컨센서스 척도에 따라 0.29의 소수성을 나타내지만, 본 발명의 개시내용의 목적을 위해 L-Cys (C)은 자신만의 독특한 군으로 분류되는 것으로 이해되어야 한다.
"소형 아미노산 또는 잔기"는 총 3개 이하의 탄소 및/또는 헤테로원자 (α-탄소 및 수소 제외)로 구성되는 측쇄가 있는 아미노산 또는 잔기를 지칭한다. 소형 아미노산 또는 잔기는 상기의 정의에 따라 지방족, 비-극성, 극성 또는 산성 소형 아미노산 또는 잔기로 추가로 분류될 수 있다. 유전적으로 코딩되는 소형 아미노산에는 L-Ala (A), L-Val (V), L-Cys (C), L-Asn (N), L-Ser (S), L-Thr (T) 및 L-Asp (D)이 포함된다.
"하이드록실 -함유 아미노산 또는 잔기"는 하이드록실 (-OH) 모이어티가 있는 아미노산을 지칭한다. 유전적으로 코딩되는 하이드록실-함유 아미노산에는 L-Ser (S) L-Thr (T) 및 L-Tyr (Y)이 포함된다.
"보존적" 아미노산 치환 또는 돌연변이는 유사한 측쇄가 있는 잔기들의 상호교환가능성을 지칭하고, 따라서 폴리펩티드 내의 아미노산이 동일하거나 유사한 규정된 아미노산 클래스 내의 아미노산으로 치환되는 것을 전형적으로 수반한다. 그러나, 본원에서 사용된 보존적 돌연변이는 친수성 → 친수성, 소수성 → 소수성, 하이드록실-함유 → 하이드록실-함유, 또는 소형 → 소형 잔기 치환을 포함하지 않고, 그보다는 보존적 돌연변이는 지방족 → 지방족, 비-극성 → 비-극성, 극성 → 극성, 산성 → 산성, 염기성 → 염기성, 방향족 → 방향족, 또는 구속형 → 구속형 잔기 치환일 수 있다. 추가로, 본원에서 사용된 A, V, L 또는 I는 또다른 지방족 잔기로 또는 또다른 비-극성 잔기로 보존적으로 돌연변이될 수 있다. 하기의 표 1은 예시적인 보존적 치환을 나타낸다.
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"비-보존적 치환"은 폴리펩티드 내의 아미노산이 측쇄 성질이 유의하게 상이한 아미노산으로 치환 또는 돌연변이되는 것을 지칭한다. 비-보존적 치환은 상기 열거된 규정된 군들 내에서보다는 이러한 군들 사이의 아미노산을 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 비-보존적 돌연변이는 (a) 치환 영역 내의 펩티드 골격의 구조 (예를 들어, 프롤린이 글리신을 치환하는 경우), (b) 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기(bulk)에 영향을 미친다.
"결실"은 기준 폴리펩티드로부터의 1개 이상의 아미노산의 제거에 의한 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. 결실은 효소 활성을 유지하고/하거나 조작된 모노아민 옥시데이스 효소의 개선된 성질을 유지하면서 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산, 기준 효소를 구성하는 아미노산의 전체 개수의 10％ 이하 또는 아미노산의 전체 개수의 20％ 이하를 제거하는 것을 포함할 수 있다. 결실은 폴리펩티드의 내부 부분 및/또는 말단 부분에 대해 지시될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 결실은 연속 절편을 포함할 수 있거나, 또는 불연속적일 수 있다.
"삽입"은 기준 폴리펩티드로부터의 하나 이상의 아미노산의 부가에 의한 폴리펩티드의 변형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 개선된 조작된 모노아민 옥시데이스 효소는 천연 발생 모노아민 옥시데이스에 대한 1개 이상의 아미노산의 삽입, 뿐만 아니라 또다른 개선된 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드에 대한 1개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 폴리펩티드의 내부 부분 내에서, 또는 카르복시 또는 아미노 말단에 삽입될 수 있다. 본원에서 사용되는 삽입은 당업계에 공지된 바와 같은 융합 단백질을 포함한다. 삽입은 아미노산들의 연속 절편일 수 있거나, 또는 천연 발생 폴리펩티드 내의 아미노산들 중 하나 이상에 의해 분리될 수 있다.
지정된 기준 서열에 관한 "~와 상이한" 또는 "~와 상이하다"는 기준 서열에 정렬되었을 때의 소정의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 차이를 지칭한다. 일반적으로, 2개의 서열이 최적으로 정렬되었을 때 차이를 결정할 수 있다. 차이는 기준 서열과 비교하여 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환을 포함한다.
본원에서 사용된 "단편"은 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 결실이 있지만 나머지 아미노산 서열이 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 폴리펩티드를 지칭한다. 단편은 아미노산 14개 이상, 아미노산 20개 이상, 아미노산 50개 이상 또는 이보다 길 수 있고, 전장 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드의 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 및 99％ 이하일 수 있다.
"단리된 폴리펩티드"는 천연적으로 자신에 동반되는 다른 오염물, 예를 들어, 단백질, 지질 및 폴리뉴클레오티드로부터 실질적으로 분리된 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 용어는 자신의 천연 발생 환경 또는 발현 시스템 (예를 들어, 숙주 세포 또는 시험관내 합성)으로부터 제거 또는 정제된 폴리펩티드를 포함한다. 개선된 모노아민 옥시데이스는 세포 내에 존재할 수 있거나, 세포 배지 내에 존재할 수 있거나, 또는 용해물 또는 단리된 제제와 같은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 개선된 모노아민 옥시데이스는 단리된 폴리펩티드일 수 있다.
"실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 이러한 폴리펩티드 종이 우세하게 존재하는 종 (즉, 몰 또는 중량 기준으로 조성물 내의 어떠한 다른 개별적인 거대분자 종보다 더 풍부함)인 조성물을 지칭하고, 일반적으로, 몰 또는 중량％ 기준으로 대상 종이 존재하는 거대분자 종들의 약 50％ 이상을 구성하는 경우에 실질적으로 정제된 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 모노아민 옥시데이스 조성물은 몰 또는 중량％ 기준으로 조성물 내에 존재하는 모든 거대분자 종들의 약 60％ 이상, 약 70％ 이상, 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상을 구성할 것이다. 일부 실시양태에서, 대상 종은 조성물이 본질적으로 단일 거대분자 종으로 구성되는 본질적인 균질성 (즉, 통상적인 검출 방법에 의해 오염물 종이 조성물 내에서 검출될 수 없음)으로 정제된다. 용매 종, 소형 분자 (<500 돌턴), 및 원소성 이온 종은 거대분자 종으로 간주되지 않는다. 일부 실시양태에서, 단리된 개선된 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물이다.
"엄격한 혼성화"는 핵산 하이브리드가 안정적인 조건을 지칭하도록 본원에서 사용된다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 하이브리드의 안정성은 하이브리드의 용융 온도 (T m )에 반영된다. 일반적으로, 하이브리드의 안정성은 이온 강도, 온도, G/C 함량, 및 무질서유발제(chaotropic agent)의 존재의 함수이다. 용융 온도를 예측하기 위한 공지된 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드에 대한 T m 값을 계산할 수 있다 (예를 들어, [Baldino et al., Methods Enzymology 168:761-777]; [Bolton et al., 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390]; [Bresslauer et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:8893-8897]; [Freier et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:9373-9377]; [Kierzek et al., Biochemistry 25:7840-7846]; [Rychlik et al., 1990, Nucleic Acids Res 18:6409-6412] (정오표: [1991, Nucleic Acids Res 19:698]); [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Suggs et al., 1981, In Developmental Biology Using Purified Genes (Brown et al., eds.), pp. 683-693, Academic Press]; 및 [Wetmur, 1991, Crit Rev Biochem Mol Biol 26:227-259]를 참조하고, 모든 간행물들은 거명에 의해 본원에 포함된다). 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 폴리펩티드를 코딩하고, 규정된 조건, 예컨대 중등도로 엄격한 조건 또는 고도로 엄격한 조건 하에, 본 발명의 개시내용의 조작된 모노아민 옥시데이스 효소를 코딩하는 서열의 상보물에 혼성화한다.
"혼성화 엄격도"는 핵산의 이같은 세정 조건에 관한 것이다. 일반적으로, 낮은 엄격도의 조건 하에서 혼성화 반응이 수행된 후, 다양한 더 높은 엄격도의 세정이 이어진다. 용어 "중등도로 엄격한 혼성화"는 표적 DNA에 대한 동일성이 약 60％, 바람직하게는 약 75％, 약 85％인 상보적인 핵산에 표적 DNA가 결합하도록 하는 조건을 지칭한다: 표적-폴리뉴클레오티드에 대한 약 90％를 초과하는 동일성. 예시적인 중등도로 엄격한 조건은 42℃에서 50％ 포름아미드, 5× 덴하르트(Denhart) 용액, 5×SSPE, 0.2％ SDS에서의 혼성화에 이어서 42℃에서 0.2×SSPE, 0.2％ SDS에서 세정하는 것과 등가인 조건이다. "고-엄격도 혼성화"는 규정된 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 용액 조건 하에 결정된 열 용융 온도 T m 으로부터 약 10℃ 이하인 조건을 일반적으로 지칭한다. 일부 실시양태에서, 고-엄격도 조건은 65℃에서 0.018 M NaCl에서 안정적인 하이브리드를 형성하는 핵산 서열만 혼성화되도록 하는 조건을 지칭한다 (즉, 하이브리드가 65℃에서 0.018 M NaCl에서 안정적이지 않으면, 이는 본원에서 고려되는 고-엄격도 조건 하에 안정적이지 않을 것이다). 예를 들어, 42℃에서의 50％ 포름아미드, 5× 덴하르트 용액, 5×SSPE, 0.2％ SDS와 등가인 조건에서의 혼성화에 이어서, 65℃에서 0.1×SSPE, 및 0.1％ SDS에서 세정하는 것에 의해, 고-엄격도 조건이 제공될 수 있다. 또다른 고-엄격도 혼성화 조건들, 뿐만 아니라 중등도로 엄격한 조건들이 상기 언급된 참고문헌에 기술되어 있다.
"이종" 폴리뉴클레오티드는 실험실 기술에 의해 숙주 세포 내로 도입된 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭하고, 숙주 세포로부터 제거되어 실험실 조작에 적용된 후, 숙주 세포 내로 재도입된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"코돈 최적화"는 코딩되는 단백질이 관심 생물에서 효율적으로 발현되도록, 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈이 특정 생물 내에서 우선적으로 사용되는 것으로 변화되는 것을 지칭한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의성" 코돈으로 칭해지는 여러 코돈에 의해 표시된다는 점에서 유전자 코드는 축퇴성(degenerate)이지만, 특정 생물에 의한 코돈 용법은 무작위성이지 않고 특정 코돈 3문자(triplet)를 향해 편향된다는 것이 잘 알려져 있다. 이러한 코돈 용법 편향은 소정의 유전자, 기능 또는 조상 기원이 공통적인 유전자들, 고도로 발현되는 단백질 대 카피수가 낮은 단백질, 및 생물의 게놈의 응집 단백질 코딩 영역에 관하여 더 높을 수 있다. 일부 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 발현에 선택된 숙주 생물로부터의 최적의 생산을 위해 코돈이 최적화될 수 있다.
"바람직한, 최적의, 코돈 용법 편향이 높은 코돈"은 동일한 아미노산을 코딩하는 다른 코돈들보다 단백질 코딩 영역에서 더 높은 빈도로 사용되는 코돈을 상호교환가능하게 지칭한다. 바람직한 코돈은 단일 유전자, 기능 또는 기원이 공통적인 유전자들의 셋트, 고도로 발현되는 유전자, 전체 생물의 응집 단백질 코딩 영역에서의 코돈 빈도, 관련된 생물들의 응집 단백질 코딩 영역에서의 코돈 빈도, 또는 이들의 조합에 관하여 결정될 수 있다. 유전자 발현 수준과 함께 빈도가 증가하는 코돈이 전형적으로 발현을 위한 최적의 코돈이다. 클러스터 분석 또는 상응 분석을 예를 들어 사용하는 다변량 분석, 및 유전자에서 사용되는 코돈의 유효 개수가 포함되는, 특정 생물에서의 코돈 빈도 (예를 들어, 코돈 용법, 상대적인 동의성 코돈 용법) 및 코돈 선호도를 결정하기 위한 다양한 방법들이 공지되어 있다 ([GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, John Peden, University of Nottingham]; [McInerney, J. O, 1998, Bioinformatics 14:372-73]; [Stenico et al., 1994, Nucleic Acids Res. 222437-46]; [Wright, F., 1990, Gene 87:23-29] 참조). 생물들의 증가 중인 목록에 대한 코돈 용법 표가 입수가능하다 (예를 들어, [Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:2111-2118]; [Nakamura et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28:292]; [Duret, et al., 상기 문헌]; [Henaut and Danchin, "Escherichia coli and Salmonella", 1996, Neidhardt, et al. Eds., ASM Press, Washington D.C., p. 2047-2066] 참조. 코돈 용법을 수득하기 위한 데이터 공급원은 단백질을 코딩할 수 있는 임의의 입수가능한 뉴클레오티드 서열에 의존적일 수 있다. 이러한 데이터 세트는 발현된 단백질 (예를 들어, 완전한 단백질 코딩 서열-CDS), 발현된 서열 태그 (ESTS), 또는 게놈 서열의 예상되는 코딩 영역을 코딩하는 것으로 실제로 공지된 핵산 서열을 포함한다 (예를 들어, [Mount, D., Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Chapter 8, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001]; [Uberbacher, E. C., 1996, Methods Enzymol. 266:259-281]; [Tiwari et al., 1997, Comput. Appl. Biosci. 13:263-270] 참조).
"제어 서열"은 본 발명의 개시내용의 폴리펩티드의 발현에 필요하거나 유리한 모든 성분을 포함하는 것으로 본원에서 정의된다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대해 천연 서열 또는 외래 서열일 수 있다. 이같은 제어 서열에는 리더(leader), 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드(propeptide) 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결인자가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 최소한, 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함한다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 코딩 영역과 제어 서열의 결찰을 용이하게 하는 특이적 제한 부위를 도입하기 위한 목적으로 링커가 제어 서열에 제공될 수 있다.
"작동가능하게 연결된"은 제어 서열이 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 지시하도록 제어 서열이 DNA 서열의 코딩 서열과 관련되는 위치에 적합하게 놓인 배치로 본원에서 정의된다
"프로모터 서열"은 코딩 영역의 발현을 위해 숙주 세포가 인식하는 핵산 서열이다. 제어 서열은 적합한 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 폴리펩티드의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 말단절단(truncated) 및 하이브리드 프로모터가 포함되는, 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포에 대해 동종 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다.
"-(C1-C10)알킬"은 1개 내지 10개의 탄소 원자가 있는 직쇄 또는 분지형 비환식(non-cyclic) 탄화수소를 의미한다. 대표적인 직쇄 -(C1-C10)알킬에는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸, -n-옥틸, -n-노닐, 및 -n-데실이 포함된다. 분지형 알킬은 하나 이상의 직쇄 -(C1-C8)알킬 기, 예컨대 -메틸, -에틸 또는 -프로필이 직쇄 알킬의 -CH2- 기 내의 1개 또는 둘 모두의 수소를 교체하는 것을 의미한다. 분지형 비환식 탄화수소는 하나 이상의 직쇄 -(C1-C10)알킬 기, 예컨대 -메틸, -에틸 또는 -프로필이 비환식 직쇄 탄화수소의 -CH2- 기 내의 1개 또는 둘 모두의 수소를 교체하는 것을 의미한다. 대표적인 분지형 -(C1-C10)알킬에는 이소-프로필, sec-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, 이소-펜틸, 네오펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-메틸헥실, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 1,2-디메틸펜틸, 1,3-디메틸펜틸, 1,2-디메틸헥실, 1,3-디메틸헥실, 3,3-디메틸헥실, 1,2-디메틸헵틸, 1,3-디메틸헵틸, 및 3,3-디메틸헵틸이 포함된다.
"-(C1-C6)알킬"은 1개 내지 6개의 탄소 원자가 있는 직쇄 또는 분지형 비환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 직쇄 -(C1-C6)알킬에는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, 및 -n-헥실이 포함된다. 대표적인 분지형 (C1-C6)알킬에는 이소-프로필, -sec-부틸, -이소-부틸, -tert-부틸, -이소-펜틸, -네오펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 및 3,3-디메틸부틸이 포함된다.
"-(C1-C4)알킬"은 1개 내지 4개의 탄소 원자가 있는 직쇄 또는 분지형 비환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 직쇄 -(C1-C4)알킬에는 -메틸, -에틸, -n-프로필, 및 -n-부틸이 포함된다. 대표적인 분지형 -(C1-C4)알킬에는 -이소-프로필, -sec-부틸, -이소-부틸, 및 -tert-부틸이 포함된다.
"-(C1-C3)알킬"은 1개 내지 3개의 탄소 원자가 있는 직쇄 또는 분지형 비환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 직쇄 (C1-C3)알킬에는 -메틸, -에틸, 및 -n-프로필이 포함된다. 대표적인 분지형 -(C1-C3)알킬에는 -이소-프로필이 포함된다.
"-(C1-C2)알킬"은 1개 또는 2개의 탄소 원자가 있는 비환식 직쇄 탄화수소를 의미한다. 대표적인 직쇄 -(C1-C2)알킬에는 -메틸 및 -에틸이 포함된다.
"-(C2-C10)알케닐"은 2개 내지 10개의 탄소 원자가 있고 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지형 비환식 탄화수소를 의미한다. 분지형 알케닐은 하나 이상의 직쇄 -(C1-C8)알킬 기, 예컨대 -메틸, -에틸 또는 -프로필이 직쇄 알케닐의 -CH2- 또는 -CH= 기의 1개 또는 둘 모두의 수소를 교체하는 것을 의미한다. 대표적인 직쇄 및 분지형 (C2-C10)알케닐에는 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, -이소-부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, -1-헥세닐, -2-헥세닐, -3-헥세닐, -1-헵테닐, -2-헵테닐, -3-헵테닐, -1-옥테닐, -2-옥테닐, -3-옥테닐, -1-노네닐, -2-노네닐, -3-노네닐, -1-데세닐, -2-데세닐, -3-데세닐 등이 포함된다.
"-(C2-C6)알케닐"은 2개 내지 6개의 탄소 원자가 있고 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지형 비환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 직쇄 및 분지형 -(C2-C6)알케닐에는 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, -이소-부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, -1-헥세닐, -2-헥세닐, -3-헥세닐 등이 포함된다.
"-(C2-C10)알키닐"은 2개 내지 10개의 탄소 원자가 있고 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지형 비환식 탄화수소를 의미한다. 분지형 알키닐은 하나 이상의 직쇄 -(C1-C8)알킬 기, 예컨대 -메틸, -에틸 또는 -프로필이 직쇄 알키닐의 -CH2- 기의 1개 또는 둘 모두의 수소를 교체하는 것을 의미한다. 대표적인 직쇄 및 분지형 -(C2-C10)알키닐에는 -아세틸레닐, -프로피닐, -1-부티닐, -2-부티닐, -1-펜티닐, -2-펜티닐, -3-메틸-1-부티닐, -4-펜티닐, -1-헥시닐, -2-헥시닐, -5-헥시닐, -1-헵티닐, -2-헵티닐, -6-헵티닐, -1-옥티닐, -2-옥티닐, -7-옥티닐, -1-노니닐, -2-노니닐, -8-노니닐, -1-데시닐, -2-데시닐, -9-데시닐 등이 포함된다.
"-(C2-C6)알키닐"은 2개 내지 6개의 탄소 원자가 있고 1개 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 직쇄 또는 분지형 비환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 직쇄 및 분지형 (C2-C6)알키닐에는 -아세틸레닐, -프로피닐, -1-부티닐, -2-부티닐, -1-펜티닐, -2-펜티닐, -3-메틸-1-부티닐, -4-펜티닐, -1-헥시닐, -2-헥시닐, -5-헥시닐 등이 포함된다.
"-(C1-C6)알콕시"는 1개 이상의 에테르 기 및 1개 내지 6개의 탄소 원자가 있는 직쇄 또는 분지형 비환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 직쇄 및 분지형 (C1-C6)알콕시에는 -메톡시, -에톡시, -메톡시메틸, -2-메톡시에틸, -5-메톡시펜틸, -3-에톡시부틸 등이 포함된다.
"-(C3-C12)시클로알킬"은 3개 내지 12개의 탄소 원자가 있는 포화된 단환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 (C3-C12)시클로알킬은 -시클로프로필, -시클로부틸, -시클로펜틸, -시클로헥실, -시클로헵틸, -시클로옥틸, -시클로노닐, -시클로데실 및 -시클로도데실이다.
"-(C4-C8)시클로알킬" 또는 "4- 내지 8-원 시클로알킬 고리"는 4개 내지 8개의 탄소 원자가 있는 포화된 단환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 -(C4-C8)시클로알킬은 -시클로부틸, -시클로펜틸, -시클로헥실, -시클로헵틸 및 -시클로옥틸이다.
"-(C3-C8)시클로알킬"은 3개 내지 8개의 탄소 원자가 있는 포화된 단환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 -(C3-C8)시클로알킬에는 -시클로프로필, -시클로부틸, -시클로펜틸, -시클로헥실, -시클로헵틸 및 -시클로옥틸이 포함된다.
"-(C3-C7)시클로알킬"은 3개 내지 7개의 탄소 원자가 있는 포화된 단환식 탄화수소를 의미한다. 대표적인 -(C3-C7)시클로알킬에는 -시클로프로필, -시클로부틸, -시클로펜틸, -시클로헥실 및 -시클로헵틸이 포함된다.
"-(6- 내지 10-원)헤테로이환식" 또는 "-(6- 내지 10-원)바이시클로헤테로시클로"는 포화, 불포화, 비-방향족 또는 방향족인 6 내지 10원의 이환식, 헤테로환식 고리를 의미한다. -(6- 내지 10-원)헤테로이환은 질소 (4가화될 수 있음), 산소 및 황 (설폭시드 및 설폰 포함)으로부터 독립적으로 선택된 1개 내지 4개의 헤테로원자를 함유한다. -(6- 내지 10-원)헤테로이환식 화합물은 질소 또는 탄소 원자를 통해 부착될 수 있다. 대표적인 -(6- 내지 10-원)헤테로이환식 화합물에는 -3-아자바이시클로[3.1.0]헥산, -퀴놀리닐, -이소퀴놀리닐, -크로모닐, -쿠마리닐, -인돌릴, -인돌리지닐, 벤조[b]푸라닐, 벤조[b]티오페닐, -인다졸릴, -푸리닐, -4H-퀴놀리지닐, -이소퀴놀릴, -퀴놀릴, -프탈라지닐, -나프티리디닐, -카르바졸릴, -β-카르볼리닐, -인돌리닐, -이소인돌리닐, -1,2,3,4-테트라하이드로퀴놀리닐, -1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀리닐, -피롤로피롤릴 등이 포함된다.
"-CH2(할로)"는 메틸 기의 수소 중 하나가 할로겐으로 교체된 메틸 기를 의미한다. 대표적인 -CH2(할로) 기에는 -CH2F, -CH2Cl, -CH2Br 및 -CH2I가 포함된다.
"-CH(할로)2"는 메틸 기의 수소 중 2개가 할로겐으로 교체된 메틸 기를 의미한다. 대표적인 -CH(할로)2 기에는 -CHF2, -CHCl2, -CHBr2, -CHBrCl, -CHClI 및 -CHI2가 포함된다.
"-C(할로)3"은 메틸 기의 수소 각각이 할로겐으로 교체된 메틸 기를 의미한다. 대표적인 -C(할로)3 기에는 -CF3, -CCl3, -CBr3 및 -CI3이 포함된다.
"-할로겐" 또는 "-할로"는 -F, -Cl, -Br 또는 -I를 의미한다.
본원에서 사용된 "옥소", "=O" 등은 탄소 또는 또다른 원소에 이중 결합된 산소 원자를 의미한다.
제1 기가 "하나 이상의 제2 기로 치환"된 경우, 제1 기의 하나 이상의 수소 원자가 상응하는 개수의 제2 기로 교체된다. 제2 기의 개수가 2개 이상인 경우, 각각의 제2 기는 동일하거나 상이할 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 기는 3개 이하의 제2 기로 치환된다.
또다른 실시양태에서, 제1 기는 1개 또는 2개의 제2 기로 치환된다.
또다른 실시양태에서, 제1 기는 오직 1개의 제2 기로 치환된다.
본원에서 사용된 용어 "입체이성질체", "입체이성질체 형태" 등은 공간 내에서의 원자들의 배향만이 상이한 개별적인 분자들의 모든 이성질체에 대한 일반명이다. 이는 거울상이성질체, 및 서로에 대해 거울상이 아닌, 1개를 초과하는 키랄 중심이 있는 화합물들의 이성질체 ("부분입체이성질체")를 포함한다.
용어 "키랄 중심"은 4개의 상이한 기가 부착되어 있는 탄소 원자를 지칭한다.
용어 "거울상이성질체" 또는 "거울상이성질체적"은 거울상이성질체가 한 방향으로 편광면을 회전하고, 이의 거울상이 반대 방향으로 편광면을 회전하는 경우 거울상 상에서 완전히 겹쳐지지 않고(non-superimposeable), 따라서 광학적으로 활성인 분자를 지칭한다.
용어 "라세믹"은 광학적으로 불활성인, 동일한 분량의 거울상이성질체들의 혼합물을 지칭한다.
용어 "분할"은 분자의 2개의 거울상이성질체 형태들 중 하나의 분리 또는 농축 또는 고갈을 지칭한다.
본원에서 사용된 "실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한"은 화합물의 지시된 거울상이성질체가 동일한 화합물의 또다른 거울상이성질체보다 큰 정도로 존재한다는 것을 의미한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화합물은 동일한 화합물의 또다른 거울상이성질체보다 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 거울상이성질체 과량으로 존재한다.
본원에서 사용된 "실질적으로 입체이성질체적으로 순수한"은 화합물의 지시된 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체가 동일한 화합물의 또다른 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체보다 큰 정도로 존재한다는 것을 의미한다. "입체선택성"에 관하여 상기 언급된 바와 같이, 거울상입체이성질체 과량 및 부분입체이성질체 과량이 입체이성질체 과량의 유형들이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화합물은 동일한 화합물의 또다른 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체보다 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 입체이성질체 과량으로 존재한다.
5.4 본 발명의 개시내용의 헤테로이환식 화합물의 제조 방법
본원에 개시된 모노아민 옥시데이스를 생물학적 촉매로 사용하여, 하기에 개시된 생체촉매 공정을 사용하여, 본 발명의 개시내용의 헤테로이환식 화합물이 조립된다.
[반응식 1]
Figure pct00049
반응식 1은 2차 아민, 즉, 화학식 I에 따른 헤테로이환식 화합물이 상응하는 화학식 II(a)의 이민 화합물로 산화되는 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스에 의해 촉매되는 반응을 도해한다.
[반응식 2]
Figure pct00050
반응식 2는 반응식 1에 도해된 전체적인 알짜 반응을 함께 제공하는 3가지 기초적인 반응을 도해한다. 반응식 2의 제1 반응에서, 화학식 I에 따른 헤테로이환식 화합물인 2차 아민이 본 발명의 개시 내용의 모노아민 옥시데이스 (플라빈 아데닌 뉴클레오티드 보조인자 (FAD)와 복합체를 형성함)에 의해 상응하는 화학식 II(a)의 이민 화합물로 거울상선택적으로 산화되어, 상응하는 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 II의 이민 및 환원된 모노아민 옥시데이스 FAD 복합체 (효소-FAD-H2)를 제공한다. 제2 단계에서, 환원된 모노아민 옥시데이스 (효소-FAD-H2 복합체)가 산소 분자에 의해 다시 산화되어, 부산물로서 과산화수소 (H2O2)가 산출된다. 제3 반응 (모노아민 옥시데이스에 의해 촉매되지 않음)에서, 과산화수소 (H2O2)가 물 및 산소로 분해된다.
기질인 화학식 I의 2차 아민은 시판되거나, 또는 당업계에 공지되어 있는 방법 및 시약 또는 당업계에 공지된 방법 및 시약으로부터 본 발명의 개시내용의 견지에서 쉽게 개조된 방법 및 시약을 사용하여 쉽게 합성된다 (예를 들어, [Delalu et al. (1999) J. Heterocyclic Chem. 36, 681]; WO 2007/022459; 및 WO 2007/075790, 및 이들에 인용된 참고문헌 참조).
과산화수소는 모노아민 옥시데이스 효소를 비가역적으로 불활성화시킬 수 있는 강력한 산화제이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 과산화수소 (H2O2)가 산소 분자 및 물로 분해되는 상기 반응식 2의 단계 3에서 도해된 불균등화 반응을 용이하게 하는데 유용한 성분. 특정 실시양태에서는 이러한 성분이 Pd, Fe 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 화학 작용제로부터 선택되는 한편, 또다른 실시양태들에서는 이러한 성분이 카탈레이스 효소와 같은 효소이다. 특별한 실시양태에서, 반응 혼합물은 2개의 과산화수소 분자가 분해되어 2개의 물 분자 및 1개의 산소 분자를 제공하는 반응식 2의 단계 3의 불균등화 반응을 촉매하는 카탈레이스 효소를 더 포함한다. 특정 실시양태에서, 카탈레이스는 약 0.01％ 내지 약 1％ (w/v), 약 0.05％ 내지 약 0.5％ (w/v), 또는 약 0.1％ 내지 약 0.2％ (w/v)의 농도로 반응에 포함되는 아스페르길루스 니게르 카탈레이스이다.
화학식 I의 화합물이 휘발성 액체인 경우에, 취급을 용이하게 하기 위해, 이러한 화합물이 염으로서 제공될 수 있다. 이러한 실시양태의 한 양상에서, 헵탄 내에 예를 들어 용해된 유리 염기의 10％ 용액에 1 당량의 아세트산을 첨가함으로써 아민 기질이 아세테이트 염으로 전환된다. 침전된 염을 수집하고, 용매 (예를 들어, 염이 침전된 용매, 예를 들어, 헵탄)로 세정하고, 감압 하에 실온 (약 21℃)에서 건조시킨다.
반응식 1에 지시된 바와 같이, 궁극적인 산화제는 산소 분자이다. 물에서의 산소의 제한된 용해도를 고려하여, 그리고 온도 및 염도 (용질 농도)가 증가함에 따른 이러한 용해도의 감소의 견지에서, 반응용 용액 내의 산소 분자는 기체 상으로부터의 기체-액체 물질 전달에 의해 보충되어야 한다. 전형적으로, 실용적인 반응 속도를 위해 제공된 바람직한 모노아민 옥시데이스의 활성 및 양은 반응이 기체-액체 물질 전달의 속도에 의해 제한되기에 충분하다. 주지된 바와 같이, 기체-액체 물질 전달의 속도는 액체 내의 기체의 부분압, 액체에서의 기체의 용해도, 및 기체-액체 계면 면적에 좌우된다. 따라서, 분사, 중공축 임펠러 흡인, 역류 기체-액체 순환, 수직 S자형 관상 유동 등에 의한 혼합이 포함되는, 적극적인 기체-액체 혼합을 제공하는 환경을 조작하는 것에 의해 기체-액체 물질 전달 속도에 의해 한정되는 반응의 속도가 증가될 수 있다. 추가적으로, 임의의 조작 환경에서, 전체 기체압을 증가시키거나, 기체 내의 산소 분획을 증가시킴 (예컨대 공기를 정제된 산소로 강화시키거나, 교체하거나, 또는 강화시키고 교체함)으로써 산소의 부분압을 증가시키는 것에 의해 산소 기체-액체 물질 전달 속도에 의해 한정되는 반응의 속도가 증가될 수 있다. 특별한 실시양태에서, 용해된 산소의 농도 및/또는 기체 상으로부터의 산소 소비 속도를 계속 모니터링하고, 산소 공급 속도, 부분압, 혼합 효율, 또는 이들의 조합을 조정하여, 이로운 반응 속도 또는 완결까지의 전체적인 반응 시간을 제공한다.
특정 실시양태에서, 반응 혼합물은 하나 이상의 소포제를 또한 포함할 수 있다. 특별한 실시양태에서, 소포제는 안티폼(Antifoam)-204 또는 안티폼 Y-30 (Sigma (St. Louis MO)) 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 시판되는 물질이다. 또다른 실시양태들에서, 반응은 1가지를 초과하는 소포제를 포함할 수 있다. 소포제는 약 0.01％ 내지 약 1％ (고체인 경우 w/v, 또는 액체인 경우 v/v), 약 0.05％ 내지 약 0.5％, 또는 약 0.1％ 내지 약 0.2％의 농도로 반응 내에 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, 화학식 II의 산화된 이민 화합물을 반응 혼합물로부터 단리하고, 정제하고, 특성화할 수 있다. 하기 기술된 또다른 실시양태에서, 화학식 II의 이민 화합물이 또다른 부가물 또는 중간체로 전환되어, 단리 또는 정제 없이 후속 반응에서 사용될 수 있다.
[반응식 3]
Figure pct00051
특정 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스가 화학식 II의 이민 생성물에 의해 억제될 수 있다. 따라서, 특별한 실시양태에서, 화학식 I의 화합물이 화학식 II의 화합물로 산화되는 반응은, 반응식 3에 도해된 바와 같이, 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스를 억제하는 능력이 감소 또는 제거된 부가물을 형성하도록 화학식 II의 이민 화합물과 반응할 작용제를 더 포함한다. 이러한 실시양태의 한 양상에서, 작용제는 억제량의 화학식 II의 이민 화합물의 축적을 방지하기에 충분히 높지만 효소-억제량의 이러한 작용제의 축적을 피하는데 충분히 낮은 양으로 반응이 시작될 때 첨가되거나 또는 간헐적으로 또는 지속적으로 첨가된다. 한 실시양태에서, 작용제는 중아황산나트륨이고, 이는 물에서 중아황산나트륨으로 수화되는 메타중아황산나트륨으로 편리하게 공급될 수 있다. 바이설파이트와 화학식 II의 이민 화합물의 반응은 화학식 III의 설파이트 부가물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 중아황산나트륨은 이러한 시약이 "즉각적으로" 소비되고, 잠재적으로 억제성인 화학식 II의 이민 생성물이 덜 억제성이거나 억제성이지 않은 화학식 III의 설파이트 부가물 화합물로서 "트래핑(trapping)"되는 속도로 반응에 지속적으로 첨가된다.
모노아민 옥시데이스가 이민 생성물에 의해 억제되는지 여부와 관계 없이, 이민 생성물과 반응하도록 바이설파이트를 첨가하는 것은 실용적인 공정 조작 선택권을 또한 제공한다. 본 발명의 특정 이민은 고도로 휘발성이고, 그중에서도, 일부는 악취성 및/또는 유독성이다. 이들을 유리 염기로서 봉쇄하는 것은 기체 유동이 없는 밀폐된 반응, 또는 화학적 트래핑 (예를 들어, 바이설파이트 용액에 의한 트래핑)의 효율적인 응축을 필요로 한다. 바이설파이트 부가물 (아미노술포네이트)로의 원위치 반응은 이러한 조작 제약을 미연에 방지하는 한편, 동일한 반응 용기에서 시아나이드와의 후속 반응을 수행할 선택권을 또한 제공한다.
상승된 pH에서 화학식 III의 바이설파이트 부가물 화합물의 형성이 역전될 수 있고, 이에 의해 상응하는 화학식 II의 이민이 재생된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 염기, 예를 들어, 10 N NaOH를 첨가하여 pH를 약 13으로 상승시키는 것에 의해 반응식 3의 반응이 켄칭(quenching)되고, 화학식 II의 이민이 재생되며, 이를, 예를 들어, 메틸 t-부틸 에테르 ("MBTE")로 추출할 수 있고, 특정 실시양태에서는, 증류에 의해 단리하여 화학식 II의 이민이 무색 오일로서 제공될 수 있다.
특정 실시양태에서, 화학식 I의 기질, 격리제 (예를 들어, 중아황산나트륨), 및 pH 제어제 (예를 들어 NaOH)의 첨가 속도를 모니터링하고 제어하여, 부분적으로, 화학식 I의 화합물의 화학식 II의 화합물로의 전환을 위한 생체촉매로 사용된 모노아민 옥시데이스의 기질 억제 및 생성물 억제 둘 모두를 최소화하거나 미연에 방지한다.
[반응식 4]
Figure pct00052
또다른 실시양태에서, NaCN이 반응식 3의 반응에 첨가되고, pH가 약 pH 10으로 상승됨으로써, 반응식 4에 도해된 바와 같이, 화학식 III의 설파이트 부가물이 화학식 IV(a)의 트랜스 아미노니트릴 화합물로 입체선택적으로 전환된다. 이러한 실시양태의 양상에서, 약 1 내지 약 3 당량, 약 1 내지 약 2 당량, 약 1.05 내지 약 1.5 당량, 또는 약 1.1 내지 약 1.2 당량의 NaCN (화학식 II의 이민 화합물에 비하여)이 반응에 첨가되어, 화학식 III의 설파이트 부가물을 화학식 IV(a)의 트랜스 아미노니트릴 화합물로 전환시킨다. 추가적으로, 화학식 III의 화합물의 반응으로 화학식 IV(b)의 시스 아미노니트릴 화합물이 생산된다.
2-메틸 테트라하이드로푸란, MTBE, 또는 이소-프로필 아세테이트를 예를 들어 사용하여, 화학식 IV(a)의 트랜스 아미노니트릴 화합물을 반응 혼합물 (1:1 유기 용매:수성 반응 혼합물)로부터 추출할 수 있다. 트랜스 아미노니트릴 화합물을 유기 용매 추출물로부터 회수할 수 있고, 예를 들어, 임의적인 중간의 추가적인 정화와 함께, 유기 추출물을 감압 하에 농축하여 화학식 IV의 아미노니트릴 화합물을 제공할 수 있다.
[반응식 5]
Figure pct00053
특정 실시양태에서, 반응식 5에 도해된 이량체성 구조를 형성하도록 화학식 II의 이민 화합물이 반응되고 (예를 들어, [Int. J. Chem. Kinet. 1998, 30(2), 129-136] 참조), 이에 의해 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스의 생성물 억제가 최소화되거나 미연에 방지된다. 모노아민 옥시데이스가 이민 생성물에 의해 억제되는지 여부와 관계 없이, 이량체화는 실용적인 공정 조작 선택권을 또한 제공할 수 있다. 이량체는 상응하는 이민보다 훨씬 덜 휘발성이어서 (휘발성이 있는 경우), 휘발성 이민의 조작 봉쇄에 대한 필요를 실질적으로 완화시킨다. 또한, 이량체는 전형적으로 여과, 추출 또는 증기 증류에 의해 반응 혼합물로부터 쉽게 회수될 수 있고, 전형적으로 공정의 후속 단계에서 직접 사용될 수 있다. 별법적으로, 전형적으로 이량체는 산성 용액에 직접 용해되어, 원하는 이환식 프롤린 유사체 및 유도체를 생산하기 위한 후속 단계들에서 사용하기에 적절한 단량체성 이미늄 염 용액을 제공할 수 있다.
[반응식 6]
Figure pct00054
일부 조건 하에, 피롤리딘 단량체 화합물 (예를 들어, 3,4-디하이드로-2H-피롤)의 이민이 이량체를 형성한 후, 열역학적으로 선호되는 삼량체 구조를 형성하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 화학식 II(a)의 특정 화합물들이 이량체를 형성할 뿐만 아니라, 이어서 배타적으로 또는 단량체성 및 이량체성 화합물과의 약간의 혼합물로서 삼량체 (예를 들어, 화학식 II(c)의 화합물)를 형성하도록 진행될 수 있다.
[화학식 II(c)]
Figure pct00055
이같은 삼량체 형성의 선호도는 치환기에 좌우될 수 있다. 그러나, 화학식 II(c)의 이같은 삼량체 화합물은 본 발명의 개시내용의 반응에서 사용될 때 이량체와 비교하여 반응성 면에서 차이를 거의 나타내지 않을 것으로 예상된다. 따라서, 메커니즘에 속박되지 않으면서, 화학식 II(c)의 삼량체 형성이 진행되는 임의의 화학식 II(a)의 화합물이 이량체 형태와 등가의 반응성을 나타낼 것으로 예상된다.
용매, 예를 들어, MTBE 또는 톨루엔 내로의 추출 시, 반응식 5에 따라 형성된 이량체가 NaCN 및 산 (예를 들어, 시트르산, 아세트산 또는 염산)과 또는 HCN과 (0℃에서) 접촉되어 화학식 IV(a)의 트랜스 아미노니트릴 화합물 및 화학식 IV(b)의 시스 아미노니트릴 화합물을 제공할 수 있다.
[반응식 7]
Figure pct00056
예를 들어 반응식 4 또는 반응식 6에 따라 제조된 화학식 IV(a)의 트랜스 아미노니트릴 화합물이 수성 산 (예를 들어, HCl 또는 H2SO4)과 접촉되어 화학식 VI의 아미노산을 제공할 수 있다. 반응식 7에 도해된 바와 같이, 화학식 VI의 아민 화합물을 산 (예를 들어, 메탄 설폰산) 및 이소부틸렌 또는 t-부틸 에스테르 (예를 들어, t-부틸 아세테이트)와 접촉시킴으로써 상응하는 화학식 V [식 중, R5 모이어티는 -t-부틸이다]의 t-부틸 에스테르가 제조된다.
[반응식 8]
Figure pct00057
또다른 실시양태에서, 예를 들어 반응식 4 또는 반응식 6에 따라 제조된 화학식 IV(a)의 트랜스 아미노니트릴 화합물이, 반응식 8에 도해된 바와 같이, 피너(Pinner) 반응에서 HCl 및 메탄올과 접촉되어, 화학식 V [식 중, R5 모이어티는 -CH3이다]의 메틸 에스테르가 제공된다.
[반응식 9]
Figure pct00058
반응식 9는 화학식 I의 2차 아민으로부터의 화학식 V 및 VI에 따른 화합물의 전반적인 제조 공정을 도해하고, 이때 화학식 II의 이민 생성물은 화학식 IV의 아미노니트릴로 전환되는 도중에 화학식 III의 설파이트 부가물로서 수용액에서 유지된다.
[반응식 10]
Figure pct00059
반응식 10은 화학식 I의 2차 아민으로부터의 화학식 V 및 VI에 따른 화합물의 전반적인 제조 공정을 도해하고, 이때 화학식 II의 이민 생성물은 화학식 IV의 아미노니트릴로 전환되는 도중에 화학식 II(b)의 화합물로 이량체화된다.
[반응식 11]
Figure pct00060
반응식 11은 반응식 4 및 7의 반응이 조합된, 화학식 I의 2차 아민으로부터의 화학식 VI 및 화학식 V (식 중 R5 모이어티는 -t-부틸이다)에 따른 화합물의 전반적인 제조 공정을 도해한다.
[반응식 12]
Figure pct00061
반응식 12는 반응식 4 및 8의 반응이 조합된, 화학식 I의 2차 아민으로부터의 화학식 V (식 중 R5 모이어티는 -CH3이다)에 따른 화합물의 전반적인 제조 공정을 도해한다.
[반응식 13]
반응식 13은 반응식 6 및 7의 반응이 조합된, 화학식 I의 2차 아민으로부터의 화학식 V (식 중 R5 모이어티는 -t-부틸이다)에 따른 화합물의 전반적인 제조 공정을 도해한다.
[반응식 14]
Figure pct00063
반응식 14는 반응식 6 및 8의 반응이 조합된, 화학식 I의 2차 아민으로부터의 화학식 V (식 중 R5 모이어티는 -CH3이다)에 따른 화합물의 전반적인 제조 공정을 도해한다.
[반응식 15]
Figure pct00064
반응식 15는 반응식 4의 반응을 포함하는, 화학식 I의 2차 아민으로부터의 화학식 VII에 따른 화합물의 전반적인 제조 공정을 도해한다.
[반응식 16]
Figure pct00065
반응식 16은 반응식 6의 반응을 포함하는, 화학식 I의 2차 아민으로부터의 화학식 VII에 따른 화합물의 전반적인 제조 공정을 도해한다.
또다른 실시양태에서, 화학식 IV(a)의 트랜스-아미노니트릴 화합물이 수반되는 반응식 7-16의 공정들 중 임의의 것이 화학식 IV(b)의 시스-아미노니트릴 화합물과 함께 수행될 수 있다. 반응식 7-16에 상응하는 반응이 화학식 IV(b)의 시스-아미노니트릴 화합물을 사용하여 수행되는 경우, 화학식 V(b), VI(b), 및 VII(b)의 시스 아미노산 및 아미드가 형성된다.
[화학식 V(b)]
Figure pct00066
[화학식 VI(b)]
Figure pct00067
[화학식 VII(b)]
Figure pct00068
메커니즘에 속박되지 않으면서, 반응 동안 이미데이트 중간체가 형성되어, 반응식 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 화학식 V, VI, VII의 화합물이 형성되는 것으로 인식된다. 따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명의 개시내용은 화학식 VIII [식 중 R6은 H 또는 알킬 기이다]의 이미데이트 화합물을 제공한다.
[화학식 VIII]
Figure pct00069
따라서, 상기 방법들의 일부 실시양태에서, 화학식 VIII의 이미데이트 화합물이 화학식 V, VI, 및 VII의 화합물의 제조에서 사용된다.
5.5 모노아민 옥시데이스 효소
본 발명의 개시내용은 기질인 화학식 I의 화합물을 화학식 II의 화합물로 입체선택적으로 산화 또는 전환시킬 수 있는 조작된 모노아민 옥시데이스 효소를 제공한다. 특별한 실시양태에서, 본 발명의 개시내용은 기질인 화합물 (1)을 화합물 (2)로 입체선택적으로 산화 또는 전환시킬 수 있는 조작된 모노아민 옥시데이스 효소를 제공한다. 또다른 실시양태들에서, 본 발명의 개시내용은 기질인 화합물 (3)을 화합물 (4)로 입체선택적으로 산화 또는 전환시킬 수 있는 조작된 모노아민 옥시데이스 효소를 제공한다. 양쪽 경우에, 본 개시내용의 모노아민 옥시데이스는 아스페르길루스 니게르 (서열 2) 또는 아스페르길루스 오리자에 (서열 32)의 천연 발생 야생형 모노아민 옥시데이스, 또는 이들의 하이브리드 (서열 6)와 비교했을 때, 또는 또다른 조작된 모노아민 옥시데이스 효소 (예를 들어, 서열 8의 효소)와 비교했을 때 개선된 성질을 또한 나타낼 것이다. 개선이 바람직한 효소 성질에는 효소 활성, 열 안정성, pH 활성 프로파일, 보조인자 요건, 억제제 (예를 들어, 생성물 억제)에 대한 불응, 입체특이성, 입체선택성, 용매 안정성, 용해도, 및 숙주 세포에서의 안정성 및 발현 수준이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 개선은 단일 효소 성질, 예컨대 효소 활성, 또는 여러 효소 성질들의 조합, 예컨대 효소 활성과 입체선택성에 관련될 수 있다.
아스페르길루스 니게르 및 아스페르길루스 오리자에의 천연 발생 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 따라서 상응하는 아미노산 서열은 아스페르길루스 니게르에 대한 진뱅크(Genbank) 접속 번호 L38858, 및 아스페르길루스 오리자에에 대한 진뱅크 접속 번호 XM_001822832에서 입수가능하다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 모노아민 옥시데이스에는 개선된 모노아민 옥시데이스 성질을 초래하는 기준 서열 (예를 들어, 천연 발생 폴리펩티드 또는 조작된 폴리펩티드)에 대한 다수의 변형이 있을 수 있다. 이같은 실시양태에서, 아미노산 서열에 대한 변형 개수는 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산, 8개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 15개 이상의 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산, 기준 효소 서열의 아미노산의 전체 개수의 10％ 이하, 아미노산의 전체 개수의 20％ 이하, 또는 아미노산의 전체 개수의 30％ 이하를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 개선된 모노아민 옥시데이스 성질을 초래하는 천연 발생 폴리펩티드 또는 조작 폴리펩티드에 대한 변형의 개수는 기준 서열에 대한 약 1-2개, 1-3개, 1-4개, 1-5개, 1-6개, 1-7개, 1-8개, 1-9개, 1-10개, 1-15개, 1-20개, 1-21개, 1-22개, 1-23개, 1-24개, 1-25개, 또는 약 1-30개의 변형을 포함할 수 있다. 변형은 삽입, 결실, 치환, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형은 기준 서열에 대한 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 개선된 모노아민 옥시데이스 성질을 초래할 수 있는 치환은 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산, 8개 이상의 아미노산, 10개 이상의 아미노산, 또는 20개 이상의 아미노산, 기준 효소 서열의 아미노산의 전체 개수의 10％ 이하, 아미노산의 전체 개수의 20％ 이하, 또는 아미노산의 전체 개수의 30％ 이하에서의 치환일 수 있다. 일부 실시양태에서, 개선된 모노아민 옥시데이스 성질을 초래하는 천연 발생 폴리펩티드 또는 조작 폴리펩티드에 대한 치환의 개수는 기준 서열의 약 1-2개, 1-3개, 1-4개, 1-5개, 1-6개, 1-7개, 1-8개, 1-9개, 1-10개, 1-15개, 1-20개, 1-21개, 1-22개, 1-23개, 1-24개, 1-25개, 또는 약 1-30개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 야생형 또는 또다른 조작된 폴리펩티드와 비교했을 때 모노아민 옥시데이스의 개선된 성질은 화학식 I의 화합물을 화학식 II의 화합물로 산화시키기 위한, 또는 특별한 실시양태에서, 화합물 (1)을 화합물 (2)로 산화 또는 전환시키기 위한, 또는 화합물 (3)을 화합물 (4)로 산화시키기 위한 이의 입체선택성의 증가, 즉, 본원에서, 생성물의 입체이성질체 과량에서의 증가에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스의 개선된 성질은 더 큰 백분율의 기질을 생성물로 전환시키거나 환원시키는 이의 능력에서의 증가에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스의 개선된 성질은 기질을 생성물로 전환시키는 이의 속도에서의 증가에 관한 것이다. 효소 활성에서의 이러한 개선은 개선된 모노아민 옥시데이스를 야생형 또는 또다른 기준 서열과 비교하여 덜 사용하여 동일한 양의 생성물을 산화 또는 전환시키는 능력에 의해 명시될 수 있다. 일부 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스의 개선된 성질은 이의 안정성 또는 열안정성에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스는 1가지를 초과하는 개선된 성질을 지닌다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스는 약 95％ 이상의 입체이성질체 과량 백분율 및 서열 2, 서열 32 또는 서열 6의 아미노산 서열을 지니는 기준 폴리펩티드에 비해 개선된 속도로 기질 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산, 화합물 (1)을 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔, 화합물 (2)로 전환시킬 수 있다. 이같은 성질이 있는 예시적인 폴리펩티드에는 서열 4, 8 및 10에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스는 약 95％ 이상의 부분입체이성질체 과량 백분율 및 서열 2, 서열 32 또는 서열 6의 아미노산 서열을 지니는 기준 폴리펩티드에 비해 개선된 속도로 기질 (3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (3)을 (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (4)로 전환시킬 수 있다. 이같은 성질이 있는 예시적인 폴리펩티드에는 서열 10, 14, 16, 18, 20 및 36에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
하기의 표 2 및 3은 본원에 개시된 서열 번호들의 목록을 관련된 활성과 함께 제공한다. 하기의 서열들은 달리 상술되지 않는 한 야생형 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스 서열 (서열 1 및 2)을 기초로 한다. 하기 표 2 및 3에서, 각각의 행은 2개의 서열 번호를 열거하고, 이때 홀수는 짝수가 제공하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 돌연변이 (즉, 잔기 변화)의 개수를 열거하는 열은 서열 1 및 2의 야생형 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스 아미노산 서열과 비교했을 때의 아미노산 치환의 개수를 지칭한다. 각각의 문맥에서의 기호 "+" "++" "+++" 및 "++++"의 의미를 가리키는 설명문이 각각의 표에 이어진다.
Figure pct00070
Figure pct00071
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스는 서열 2의 서열을 포함하는 기준 서열과 비교하여 적어도 약 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 단 폴리펩티드는 잔기 위치 289에 상응하는 아미노산 잔기가 발린이고, 잔기 위치 348에 상응하는 아미노산 잔기가 글루타민이며, 잔기 위치 382에 상응하는 아미노산 잔기가 류신이고, 잔기 465에 상응하는 아미노산이 글리신인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 모노아민 옥시데이스는 서열 12의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형이 있을 수 있다. 변형은 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 치환은 비-보존적 치환, 보존적 치환, 또는 비-보존적 치환과 보존적 치환의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스는 서열 2의 서열을 포함하는 기준 서열과 비교하여 적어도 약 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 단 폴리펩티드는 잔기 위치 289에 상응하는 아미노산 잔기가 발린이고, 잔기 위치 348에 상응하는 아미노산 잔기가 글루타민이며, 잔기 위치 365에 상응하는 아미노산 잔기가 트립토판이고, 잔기 465에 상응하는 아미노산이 글리신인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 모노아민 옥시데이스는 서열 14의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형이 있을 수 있다. 변형은 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 치환은 비-보존적 치환, 보존적 치환, 또는 비-보존적 치환과 보존적 치환의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스는 서열 2의 서열을 포함하는 기준 서열과 비교하여 적어도 약 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 단 폴리펩티드는 위치 99에서의 잔기에 상응하는 아미노산 잔기가 글루탐산이고, 잔기 위치 289에 상응하는 잔기가 발린이고, 잔기 위치 348에 상응하는 아미노산 잔기가 글루타민이며, 잔기 위치 365에 상응하는 아미노산 잔기가 트립토판이고, 잔기 위치 465에 상응하는 아미노산 잔기가 글리신인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 모노아민 옥시데이스는 서열 16의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형이 있을 수 있다. 변형은 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 치환은 비-보존적 치환, 보존적 치환, 또는 비-보존적 치환과 보존적 치환의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스는 서열 2의 서열을 포함하는 기준 서열과 비교하여 적어도 약 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 단 폴리펩티드는 잔기 위치 99에 상응하는 아미노산 잔기가 글루탐산이고, 위치 135에 상응하는 잔기가 글루타민이고, 잔기 289에 상응하는 잔기가 발린이며, 잔기 위치 348에 상응하는 아미노산 잔기가 글루타민이고, 잔기 위치 365에 상응하는 아미노산 잔기가 트립토판이고, 잔기 위치 465에 상응하는 아미노산 잔기가 글리신인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 모노아민 옥시데이스는 서열 18의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형이 있을 수 있다. 변형은 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 치환은 비-보존적 치환, 보존적 치환, 또는 비-보존적 치환과 보존적 치환의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스는 서열 2의 서열을 포함하는 기준 서열과 비교하여 적어도 약 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 단 폴리펩티드는 잔기 위치 99에 상응하는 아미노산 잔기가 글루탐산이고, 위치 135에 상응하는 잔기가 글루타민이고, 위치 284에 상응하는 잔기가 아스파르트산이며, 잔기 289에 상응하는 잔기가 발린이고, 잔기 위치 348에 상응하는 아미노산 잔기가 글루타민이고, 위치 356에 상응하는 아미노산 잔기가 발린이며, 잔기 위치 365에 상응하는 아미노산 잔기가 트립토판이고, 잔기 위치 465에 상응하는 아미노산 잔기가 글리신인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 모노아민 옥시데이스는 서열 20의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형이 있을 수 있다. 변형은 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 치환은 비-보존적 치환, 보존적 치환, 또는 비-보존적 치환과 보존적 치환의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 개선된 모노아민 옥시데이스는 표 2 및 3에 열거된 바와 같은 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 36에 상응하는 아미노산 서열과 적어도 약 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이때 개선된 모노아민 옥시데이스 아미노산 서열은 표 2 및 3의 아미노산 서열 내에 존재하는 상술된 아미노산 치환 조합 중 임의의 한 셋트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 모노아민 옥시데이스는 또다른 아미노산 잔기에 추가적으로 약 1-2개, 1-3개, 1-4개, 1-5개, 1-6개, 1-7개, 1-8개, 1-9개, 1-10개 또는 1-20개의 돌연변이가 있을 수 있다. 돌연변이는 삽입, 결실, 또는 치환, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가적인 돌연변이는 보존적 치환을 포함한다.
당업자에게 명백할 바와 같이, 본원에 기술된 폴리펩티드는 유전적으로 코딩되는 아미노산에 한정되지 않는다. 유전적으로 코딩되는 아미노산에 더하여, 본원에 기술된 폴리펩티드는, 전체적으로 또는 부분적으로, 천연 발생 및/또는 합성 비-코딩 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 모노아민 옥시데이스가 포함할 수 있는 약간의 통상적으로 발견되는 비-코딩 아미노산에는 하기의 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다: 유전적으로 코딩되는 아미노산의 D-입체이성질체; 2,3-디아미노프로피온산 (Dpr); α-아미노이소부티르산 (Aib); ε-아미노헥산산 (Aha); δ-아미노발레르산 (Ava); N-메틸글리신 또는 사르코신 (MeGly 또는 Sar); 오르니틴 (Orn); 시트룰린 (Cit); t-부틸알라닌 (Bua); t-부틸글리신 (Bug); N-메틸이소류신 (MeIle); 페닐글리신 (Phg); 시클로헥실알라닌 (Cha); 노르류신 (Nle); 나프틸알라닌 (Nal); 2-클로로페닐알라닌 (Ocf); 3-클로로페닐알라닌 (Mcf); 4-클로로페닐알라닌 (Pcf); 2-플루오로페닐알라닌 (Off); 3-플루오로페닐알라닌 (Mff); 4-플루오로페닐알라닌 (Pff); 2-브로모페닐알라닌 (Obf); 3-브로모페닐알라닌 (Mbf); 4-브로모페닐알라닌 (Pbf); 2-메틸페닐알라닌 (Omf); 3-메틸페닐알라닌 (Mmf); 4-메틸페닐알라닌 (Pmf); 2-니트로페닐알라닌 (Onf); 3-니트로페닐알라닌 (Mnf); 4-니트로페닐알라닌 (Pnf); 2-시아노페닐알라닌 (Ocf); 3-시아노페닐알라닌 (Mcf); 4-시아노페닐알라닌 (Pcf); 2-트리플루오로메틸페닐알라닌 (Otf); 3-트리플루오로메틸페닐알라닌 (Mtf); 4-트리플루오로메틸페닐알라닌 (Ptf); 4-아미노페닐알라닌 (Paf); 4-요오도페닐알라닌 (Pif); 4-아미노메틸페닐알라닌 (Pamf); 2,4-디클로로페닐알라닌 (Opef); 3,4-디클로로페닐알라닌 (Mpcf); 2,4-디플루오로페닐알라닌 (Opff); 3,4-디플루오로페닐알라닌 (Mpff); 피리드-2-일알라닌 (2pAla); 피리드-3-일알라닌 (3pAla); 피리드-4-일알라닌 (4pAla); 나프트-1-일알라닌 (1nAla); 나프트-2-일알라닌 (2nAla); 티아졸릴알라닌 (taAla); 벤조티에닐알라닌 (bAla); 티에닐알라닌 (tAla); 푸릴알라닌 (fAla); 호모페닐알라닌 (hPhe); 호모타이로신 (hTyr); 호모트립토판 (hTrp); 펜타플루오로페닐알라닌 (5ff); 스티릴크알라닌 (sAla); 오트릴알라닌 (aAla); 3,3-디페닐알라닌 (Dfa); 3-아미노-5-페니펜탄산 (Afp); 페니실라민 (Pen); 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴롤린-3-카르복실산 (Tic); β-2-티에닐알라닌 (Thi); 메티오닌 설폭시드 (Mso); N(w)-니트로아르기닌 (nArg); 호모라이신 (hLys); 포스포노메틸페닐알라닌 (pmPhe); 포스포세린 (pSer); 포스포트레오닌 (pThr); 호모아스파르트산 (hAsp); 호모글루탐 (hGlu); 1-아미노시클로펜트-(2 또는 3)-엔-4 카르복실산; 피페콜산 (PA), 아제티딘-3-카르복실산 (ACA); 1-아미노시클로펜탄-3-카르복실산; 알릴글리신 (aOly); 프로파르길글리신 (pgGly); 호모알라닌 (hAla); 노르발린 (nVal); 호모류신 (hLeu), 호모발린 (hVal); 호모이소류신 (hIle); 호모아르기닌 (hArg); N-아세틸 라이신 (AcLys); 2,4-디아미노부티르산 (Dbu); 2,3-디아미노부티르산 (Dab); N-메틸발린 (MeVal); 호모시스테인 (hCys); 호모세린 (hSer); 하이드록시프롤린 (Hyp) 및 호모프롤린 (hPro). 본원에 기술된 모노아민 옥시데이스가 포함할 수 있는 추가적인 비-코딩 아미노산은 당업자에게 명백할 것이다 (예를 들어, [Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 3-70] 및 이에 인용된 참고문헌 (모두 거명에 의해 본원에 포함됨)에서 제공된 다양한 아미노산 참조). 이러한 아미노산들은 L- 또는 D-형상일 수 있다.
당업자는 본원에 개시된 모노아민 옥시데이스가 측쇄 보호기를 보유하는 아미노산 또는 잔기를 또한 포함할 수 있음을 인지할 것이다. 이같은 보호된 아미노산 (이러한 경우, 방향족 카테고리에 속함)의 비-제한적인 예로는 하기의 것들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다 (괄호 안에 보호기가 열거됨): Arg(tos), Cys(메틸벤질), Cys(니트로피리딘설페닐), Glu(δ-벤질에스테르), Gln(잔틸), Asn(N-δ-잔틸), His(bom), His(벤질), His(tos), Lys(fmoc), Lys(tos), Ser(O-벤질), Thr(O-벤질) 및 Tyr(O-벤질).
본원에 기술된 모노아민 옥시데이스가 포함할 수 있는, 형상 면에서 구속된 비-코딩 아미노산에는 N-메틸 아미노산 (L-형상); 1-아미노시클로펜트-(2 또는 3)-엔-4-카르복실산; 피페콜산; 아제티딘-3-카르복실산; 호모프롤린 (hPro); 및 1-아미노시클로펜탄-3-카르복실산이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
상기 기술된 바와 같이, 조작된 모노아민 옥시데이스가 생성되도록 천연 발생 폴리펩티드 내로 도입된 다양한 변형이 효소의 특이적 성질에 표적화될 수 있다.
5.6 조작된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
또다른 양상에서, 본 발명의 개시내용은 본원에 개시된 조작된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오티드가 생성되도록 유전자 발현을 제어하는 하나 이상의 이종 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 조작된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 구축물이 상응하는 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 발현하도록 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
다양한 아미노산에 상응하는 코돈이 공지되어 있기 때문에, 단백질 서열이 입수가능하면 대상을 코딩할 수 있는 모든 폴리뉴클레오티드가 기술된다. 동일한 아미노산이 별법적인 또는 동의성 코돈에 의해 코딩되는 유전자 코드의 축퇴성은 매우 많은 수의 핵산이 제조되도록 하고, 이들 모두는 본원에 개시된 개선된 모노아민 옥시데이스를 코딩한다. 따라서, 특정 아미노산 서열이 확인되면, 당업자는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 방식으로 하나 이상의 코돈의 서열을 간단하게 변형시킴으로써 임의 개수의 상이한 핵산을 제조할 수 있다. 이와 관련하여, 가능한 코돈 선택을 기초로 조합을 선택함으로써 제조될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 각각의 모든 가능한 변종이 본 발명의 개시내용에서 명확하게 고려되고, 모든 이같은 변종은 표 2 및 3에 제시된 아미노산 서열들을 포함하여 본원에 개시된 임의의 폴리펩티드에 대해 명확하게 개시된 것으로 간주되어야 한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 조작된 모노아민 옥시데이스 기준물 중 임의의 것에 대한 서열 동일성이 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 96％ 이상, 약 97％ 이상, 약 98％ 이상, 또는 99％ 이상인 아미노산 서열의 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 조작된 모노아민 옥시데이스를 코딩한다.
다양한 실시양태에서, 바람직하게는 코돈은 단백질이 생산되는 숙주 세포에 맞도록 선택된다. 예를 들어, 박테리아에서 사용되는 바람직한 코돈이 박테리아에서 유전자를 발현시키는데 사용되고, 효모에서 사용되는 바람직한 코돈이 효모에서의 발현에 사용되며, 포유동물에서 사용되는 바람직한 코돈이 포유류 세포에서의 발현에 사용된다. 예를 들어, 서열 1의 폴리뉴클레오티드가 대장균에서의 발현에 대해 코돈-최적화되었지만, 그렇지 않은 경우 이는 아스페르길루스 니게르의 천연 발생 모노아민 옥시데이스를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 천연 서열이 바람직한 코돈을 포함할 것이고, 바람직한 코돈의 사용이 모든 아미노산 잔기에 대해 요구되지 않을 수 있기 때문에, 모노아민 옥시데이스의 코돈 용법을 최적화하도록 모든 코돈이 교체될 필요는 없다. 결과적으로, 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 코돈-최적화 폴리뉴클레오티드는 바람직한 코돈을 전장 코딩 영역의 코딩 위치들의 약 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 또는 90％ 초과에서 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조작된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 35로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 고도로 엄격한 조건 하에 서열 5 또는 31을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있고, 이때 고도로 엄격한 조건 하에 혼성화할 수 있는 이러한 폴리뉴클레오티드는 기능성 모노아민 옥시데이스를 코딩한다.
또다른 실시양태들에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 모노아민 옥시데이스를 코딩하지만, 조작된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 기준 폴리뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 수준에서의 서열 동일성이 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상, 또는 99％ 이상인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 기준 폴리뉴클레오티드는 서열 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 35로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 선택된다.
개선된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 발현을 제공하도록 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 발현 벡터에 따라, 단리된 폴리뉴클레오티드를 벡터 내로의 삽입 전에 조작하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 활용하여 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열을 변형시키는 기술이 당업계에 주지되어 있다. [Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2006]에서 지침이 제공된다.
박테리아 숙주 세포에 대해, 본 발명의 개시내용의 핵산 구축물의 전사를 지시하기 위한 적절한 프로모터에는 대장균 lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor) 아가레이스(agarase) 유전자 (dagA), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크레이스(levansucrase) 유전자 (sacB), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀레이스(amylase) 유전자 (amyL), 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) 말토제닉(maltogenic) 아밀레이스 유전자 (amyM), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀레이스 유전자 (amyQ), 바실루스 리케니포르미스 페니실리네이스(penicillinase) 유전자 (penP), 바실루스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 및 원핵생물 베타-락타메이스(lactamase) 유전자 ([Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl Acad. Sci. USA 75: 3727-3731])로부터 수득된 프로모터, 뿐만 아니라 tac 프로모터 ([DeBoer et al., 1983, Proc. Natl Acad. Sci. USA 80: 21-25])가 포함된다. 추가적인 프로모터들이 ["Useful proteins from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242:74-94]; 및 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기술되어 있다.
필라멘트형 진균 숙주 세포에 대해, 본 발명의 개시내용의 핵산 구축물의 전사를 지시하기 위한 적절한 프로모터에는 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀레이스, 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르틱(aspartic) 프로테이네이스(proteinase), 아스페르길루스 니게르 중성 알파-아밀레이스, 아스페르길루스 니게르 산-안정적 알파-아밀레이스, 아스페르길루스 니게르 또는 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀레이스(glucoamylase) (glaA), 리조무코르 미에헤이 라이페이스(lipase), 아스페르길루스 오리자에 알칼리성 프로티에이스(protease), 아스페르길루스 오리자에 트리오스 포스페이트 아이소머레이스(isomerase), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아세트아미데이스(acetamidase), 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로티에이스 (WO 96/00787)에 대한 유전자들로부터 수득된 프로모터, 뿐만 아니라 NA2-tpi 프로모터 (아스페르길루스 니게르 중성 알파-아밀레이스 및 아스페르길루스 오리자에 트리오스 포스페이트 아이소머레이스에 대한 유전자로부터의 프로모터들의 하이브리드), 및 이들의 돌연변이체, 말단절단형 및 하이브리드 프로모터가 포함된다.
효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 에놀레이스(enolase) (ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아에 갈락토카이네이스(galactokinase) (GAL1), 사카로마이세스 세레비지아에 알코올 탈수소효소/글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 (ADH2/GAP), 및 사카로마이세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 카이네이스(kinase)에 대한 유전자들로부터의 프로모터일 수 있다. 효모 숙주 세포를 위한 또다른 유용한 프로모터들이 [Romanos et al., 1992, Yeast 8:423-488]에 기술되어 있다.
또한 제어 서열은 전사를 종결하도록 숙주 세포에 의해 인식되는 서열인 적절한 전사 종결인자 서열일 수 있다. 종결인자 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능성인 임의의 종결인자가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 필라멘트형 진균 숙주 세포에 대한 예시적인 전사 종결인자는 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀레이스, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀레이스, 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신테이스(synthase), 아스페르길루스 니게르 알파-글루코시데이스(glucosidase), 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로티에이스에 대한 유전자들로부터 수득될 수 있다.
효모 숙주 세포에 대한 예시적인 전사 종결인자는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀레이스, 사카로마이세스 세레비지아에 사이토크롬 C (CYC1), 및 사카로마이세스 세레비지아에 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소에 대한 유전자들로부터 수득될 수 있다. 효모 숙주 세포에 대한 또다른 유용한 종결인자들이 [Romanos et al., 1992, 상기 문헌]에 기술되어 있다.
또한 제어 서열은 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비-번역 영역인 적절한 리더 서열일 수 있다. 리더 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능성인 임의의 리더 서열이 사용될 수 있다. 필라멘트형 진균 숙주 세포를 위한 예시적인 리더는 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀레이스 및 아스페르길루스 니둘란스 트리오스 포스페이트 아이소머레이스에 대한 유전자들로부터 수득된다. 효모 숙주 세포를 위한 적절한 리더는 사카로마이세스 세레비지아에 에놀레이스 (ENO-1), 사카로마이세스 세레비지아에 3-포스포글리세레이트 카이네이스, 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자, 및 사카로마이세스 세레비지아에 알코올 탈수소효소/글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 (ADH2/GAP)에 대한 유전자들로부터 수득된다.
또한 제어 서열은 핵산 서열의 3' 말단에 작동적으로 연결되고, 전사되는 경우, 폴리아데노신 잔기를 전사된 mRNA에 부가하는 신호로서 숙주 세포에 의해 인식되는 서열인 폴리아데닐화 서열일 수 있다. 선택된 숙주 세포에서 기능성인 임의의 폴리아데닐화 서열이 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 필라멘트형 진균 숙주 세포에 대한 예시적인 폴리아데닐화 서열은 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀레이스, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀레이스, 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신테이스, 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로티에이스, 및 아스페르길루스 니게르 알파-글루코시데이스에 대한 유전자들로부터의 것일 수 있다. 효모 숙주 세포에 대한 유용한 폴리아데닐화 서열이 [Guo and Sherman, 1995, Mol Cell Bio 15:5983-5990]에 기술되어 있다.
또한 제어 서열은 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코딩하고, 코딩된 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 지시하는 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있다. 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 끝부분은 번역 리딩 프레임 내에서 분비형 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 절편에 원래 연결되어 있는 신호 펩티드 코딩 영역을 본래부터 함유할 수 있다. 별법적으로, 코딩 서열의 5' 끝부분은 코딩 서열에 대해 외래성인 신호 펩티드 코딩 영역을 함유할 수 있다. 코딩 서열이 원래 신호 펩티드 코딩 영역을 함유하지 않는 경우 외래성 신호 펩티드 코딩 영역이 필요할 수 있다.
별법적으로, 폴리펩티드의 분비를 강화하기 위해 천연 신호 펩티드 코딩 영역이 외래성 신호 펩티드 코딩 영역으로 간단하게 교체될 수 있다. 그러나, 발현 폴리펩티드를 선택된 숙주 세포의 분비 경로로 지시하는 임의의 신호 펩티드 코딩 영역이 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포에 대한 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 바실루스(Bacillus) NC1B 11837 말토제닉 아밀레이스, 바실루스 스테아로테르모필루스 알파-아밀레이스, 바실루스 리케니포르미스 서브틸리신, 바실루스 리케니포르미스 베타-락타메이스, 바실루스 스테아로테르모필루스 중성 프로티에이스 (nprT, nprS, nprM), 및 바실루스 서브틸리스 prsA에 대한 유전자들로부터 수득된 신호 펩티드 코딩 영역이다. 추가적인 신호 펩티드들이 [Simonen and Palva, 1993, Microbiol Rev 57: 109-137]에 기술되어 있다.
필라멘트형 진균 숙주 세포에 대한 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 아스페르길루스 오리자에 TAKA 아밀레이스, 아스페르길루스 니게르 중성 아밀레이스, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀레이스, 리조무코르 미에헤이 아스파르틱 프로테이네이스, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 셀룰레이스(cellulase), 및 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 라이페이스에 대한 유전자들로부터 수득된 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있다.
효모 숙주 세포에 대한 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지아에 인버테이스(invertase)에 대한 유전자들로부터의 것일 수 있다. 또다른 유용한 신호 펩티드 코딩 영역들이 [Romanos et al., 1992, 상기 문헌]에 기술되어 있다.
또한 제어 서열은 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치하는 아미노산 서열을 코딩하는 프로펩티드(propeptide) 코딩 영역일 수 있다. 생성된 폴리펩티드는 효소전구체(proenzyme) 또는 프로폴리펩티드(propolypeptide) (또는 일부 경우에는 효소원(zymogen))로 공지된다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 불활성이고, 프로폴리펩티드로부터의 프로펩티드의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 성숙형 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 영역은 바실루스 서브틸리스 알칼리스 프로티에이스 (aprE), 바실루스 서브틸리스 중성 프로티에이스 (nprT), 사카로마이세스 세레비지아에 알파-인자, 리조무코르 미에헤이 아스파르틱 프로테이네이스, 및 마이셀리오프토라 테르모필라(Myceliophthora thermophila) 락테이스(lactase) (WO 95/33836)에 대한 유전자들로부터 수득될 수 있다.
신호 펩티드 및 프로펩티드 영역 둘 모두가 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역이 폴리펩티드의 아미노 말단 옆에 놓이고, 신호 펩티드 영역이 프로펩티드 영역의 아미노 말단 옆에 놓인다.
숙주 세포의 성장과 관련하여 폴리펩티드의 발현이 제어되도록 하는 조절 서열을 부가하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예는 화학적 또는 물리적 자극 (조절 화합물의 존재 포함)에 응답하여 유전자의 발현이 켜지거나 꺼지도록 하는 것이다. 원핵생물 숙주 세포에서, 적절한 조절 서열에는 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터(operator) 시스템이 포함된다. 효모 숙주 세포에서, 적절한 조절 시스템에는, 예를 들어, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 포함된다. 필라멘트형 진균에서, 적절한 조절 서열에는 TAKA 알파-아밀레이스 프로모터, 아스페르길루스 니게르 글루코아밀레이스 프로모터, 및 아스페르길루스 오리자에 글루코아밀레이스 프로모터가 포함된다.
조절 서열의 또다른 예는 유전자 증폭을 허용하는 것들이다. 진핵생물 시스템에서, 여기에는 메토트렉세이트의 존재 하에 증폭되는 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자, 및 중금속으로 증폭되는 메탈로티오네인 유전자가 포함된다. 이러한 경우에, 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 핵산 서열은 조절 서열에 작동가능하게 연결될 것이다.
따라서, 또다른 실시양태에서, 또한 본 발명의 개시내용은 조작된 모노아민 옥시데이스 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 벡터가 도입될 숙주의 유형에 따라 하나 이상의 발현 제어 영역 예컨대 프로모터 및 종결인자, 복제 기원 등을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 기술된 다양한 핵산 및 제어 서열이 함께 연결되어 재조합 발현 벡터가 생산될 수 있고, 이는 하나 이상의 편리한 제한 부위를 포함하여 이같은 부위에서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 삽입 또는 치환되도록 할 수 있다. 별법적으로, 핵산 서열 또는 이러한 서열을 포함하는 핵산 구축물을 발현을 위한 적합한 벡터 내로 삽입함으로써 본 발명의 개시내용의 핵산 서열이 발현될 수 있다. 발현 벡터를 생성시킬 때, 코딩 서열은 발현을 위한 적합한 제어 서열에 코딩 서열이 작동가능하게 연결되도록 벡터 내에 위치한다.
재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있고 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 일으킬 수 있는 임의의 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 벡터와 벡터가 도입될 숙주 세포의 혼화성에 전형적으로 좌우될 것이다. 벡터는 선형 또는 폐환형 플라스미드일 수 있다.
발현 벡터는 벡터의 복제가 염색체 복제에 의존적이지 않는 자가 복제 벡터, 즉, 염색체외 본체로서 존재하는 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 확실하게 하는 임의의 수단을 함유할 수 있다. 별법적으로, 벡터는 숙주 세포 내로 도입되는 경우 게놈 내로 통합되고 자신이 통합된 염색체(들)과 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주 세포의 게놈 내로 도입될 전체 DNA를 함께 함유하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포손(transposon)이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 개시내용의 발현 벡터는 형질전환된 세포의 용이한 선별을 허용하는 하나 이상의 선별성 마커를 함유한다. 선별성 마커는 이의 생성물이 살생물제 또는 바이러스 저항성을 제공하는 것, 중금속에 대한 저항성을 제공하는 것, 영양요구체에 대한 독립영양성을 제공하는 것 등이다. 박테리아에 대한 선별성 마커의 예는 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 리케니포르미스로부터의 dal 유전자, 또는 앰피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 (실시예 1) 또는 테트라사이클린 저항성과 같은 항생제 저항성을 부여하는 마커이다. 효모 숙주 세포에 대한 적절한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3이다.
필라멘트형 진균 숙주 세포에서 사용하기 위한 적절한 마커에는 amdS (아세트아미데이스), argB (오르니틴 카르바모일트랜스퍼레이스), bar (포스피로트리신 아세틸트랜스퍼레이스), hph (하이그로마이신 포스포트랜스퍼레이스), niaD (니트레이트 환원효소), pyrG (오로티딘-5'-포스페이트 디카르복실레이스(decarboxylase)), sC (설페이트 아데닐트랜스퍼레이스), 및 trpC (안트라닐레이트 신테이스), 뿐만 아니라 이들의 등가물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 아스페르길루스 세포에서 사용하기 위한 실시양태는 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리자에의 amdS 및 pyrG 유전자 및 스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)의 bar 유전자를 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 개시내용의 발현 벡터는 벡터가 숙주 세포의 게놈 내로 통합되게 하거나 또는 벡터가 게놈과 독립적으로 세포 내에서 자가 복제되도록 하는 요소(들)을 함유한다. 숙주 세포 게놈 내로의 통합을 위해, 벡터는 상동 또는 비-상동 재조합에 의한 게놈 내로의 벡터의 통합을 위해 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 벡터의 임의의 또다른 요소에 의존할 수 있다.
별법적으로, 발현 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로의 상동 재조합에 의한 통합을 지시하기 위한 추가적인 핵산 서열을 함유할 수 있다. 추가적인 핵산 서열은 벡터가 염색체(들) 내의 정확한 위치(들)에서 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있게 한다. 정확한 위치에서의 통합 가능성을 증가시키기 위해, 바람직하게는 통합 효소는 상동 재조합의 확률을 강화하도록 상응하는 표적 서열과 고도로 상동성인 충분한 개수의 핵산, 예컨대 100개 내지 10,000개의 염기쌍, 바람직하게는 400개 내지 10,000개의 염기쌍, 가장 바람직하게는 800개 내지 10,000개의 염기쌍을 함유하여야 한다. 통합 요소는 숙주 세포의 게놈 내의 표적 서열과 상동성인 임의의 서열일 수 있다. 또한, 통합 요소는 비-코딩 또는 코딩 핵산 서열일 수 있다. 한편, 벡터는 비-상동 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
자가 복제를 위해, 벡터는 벡터가 당해 숙주 세포 내에서 자가 복제할 수 있게 하는 복제 기원을 더 포함할 수 있다. 박테리아의 복제 기원의 예는 P15A ori (도 5의 플라스미드에 제시된 바와 같음) 또는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYCl77 (상기 플라스미드에는 P15A ori가 있음)의 복제 기원, 또는 대장균에서의 복제를 허용하는 pACYC184, 및 바실루스에서의 복제를 허용하는 pUB110, pE194, pTA1060 또는 pAMβ1이다. 효모 숙주 세포에서 사용하기 위한 복제 기원의 예는 2마이크론 복제 기원, ARS1, ARS4, ARS1과 CEN3의 조합물, 및 ARS4와 CEN6의 조합물이다. 복제 기원은 이의 기능을 숙주 세포에서 온도-민감성이게 만드는 돌연변이가 있는 복제 기원일 수 있다 (예를 들어, [Ehrlich, 1978, Proc Natl Acad Sci. USA 75:1433] 참조).
본 발명의 개시내용의 핵산 서열의 1개를 초과하는 카피가 숙주 세포 내로 도입되어 유전자 생성물의 생산이 증가될 수 있다. 서열의 1개 이상의 추가적인 카피를 숙주 세포 게놈 내로 통합시킴으로써, 또는 증폭가능한 선택성 마커 유전자를 핵산 서열과 함께 포함시킴으로써 (이때 증폭된 카피수의 선택성 마커 유전자를 함유하고 이에 의해 핵산 서열의 추가적인 카피를 함유하는 세포를 적합한 선택가능한 작용제의 존재 하에 세포를 배양함으로써 선택할 수 있다), 핵산 서열의 카피수의 증가가 수득될 수 있다.
본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 다수의 발현 벡터들이 시판된다. 적절한 상업적 발현 벡터에는 포유류 숙주 세포에서의 발현을 위한 CMV 프로모터 및 hGH 폴리아데닐화 부위, 및 대장균에서의 증폭을 위한 pBR322 복제 기원 및 앰피실린 저항성 마커를 포함하는 시그마-알드리치 케미칼즈(Sigma-Aldrich Chemicals) (St. Louis MO.)로부터의 p3xFLAGTM™ 발현 벡터가 포함된다. 또다른 적절한 발현 벡터는 스트라타진(Stratagene) (LaJolla CA)으로부터 입수가능한 pBluescriptII SK(-) 및 pBK-CMV, 및 pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pREP4, pCEP4 (Invitrogen) 또는 pPoly ([Lathe et al., 1987, Gene 57:193-201])로부터 유래된 플라스미드이다.
5.7 모노아민 옥시데이스의 발현을 위한 숙주 세포
또다른 양상에서, 본 발명의 개시내용은 숙주 세포 내에서의 모노아민 옥시데이스의 발현을 위한 하나 이상의 제어 서열에 작동적으로 연결된, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 개시내용의 발현 벡터에 의해 코딩되는 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 발현시키는데 사용하기 위한 숙주 세포는 당업계에 주지되어 있고, 박테리아 세포, 예컨대 대장균, 락토바실루스 케피르(Lactobacillus kefir), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실루스 미노르(Lactobacillus minor), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 세포; 진균 세포, 예컨대 효모 세포 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아에 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) (ATCC 접속 번호 201178)); 곤충 세포, 예컨대 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포; 동물 세포, 예컨대 CHO, COS, BHK, 293, 및 보웨스 멜라노마(Bowes melanoma) 세포; 및 식물 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 기술된 숙주 세포들에 대한 적합한 배양 배지 및 성장 조건은 당업계에 주지되어 있다.
당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 모노아민 옥시데이스의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있다. 기술에는 전기천공, 생체탄도(biolistic) 입자 포격, 리포솜-매개 형질감염, 염화칼슘 형질감염, 및 원형질체 융합이 포함된다. 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 다양한 방법이 당업자에게 명백할 것이다.
예시적인 숙주 세포는 대장균 W3110이다. lacI 억제인자의 제어 하의 lac 프로모터에 작동적으로 연결된 플라스미드 pCK110900 내로 개선된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 작동적으로 연결시킴으로써 발현 벡터가 생성되었다. 발현 벡터는 P15a 복제 기원 및 클로람페니콜 저항성 유전자를 또한 함유하였다. 대장균 W3110 내에 대상 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 이러한 세포를 클로람페니콜 선별에 적용함으로써 단리하였다.
5.8 조작된 모노아민 옥시데이스의 생성 방법
일부 실시양태에서, 본 발명의 개시내용의 개선된 모노아민 옥시데이스 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제조하기 위해, 산화 반응을 촉매하는 천연 발생 모노아민 옥시데이스가 아스페르길루스 니게르 또는 아스페르길루스 오리자에로부터 수득된다 (또는 유래된다). 일부 실시양태에서, 어버이 폴리뉴클레오티드 서열이 특정 숙주 세포에서의 모노아민 옥시데이스의 발현을 강화하도록 코돈-최적화된다. 예를 들어, 아스페르길루스 니게르의 야생형 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 코딩하는 어버이 폴리뉴클레오티드 서열이 진뱅크 데이터베이스에서 입수가능한 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스 서열 (진뱅크 접속 번호 L38858)의 공지된 아미노산 서열을 기초로 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 구축되었다. 서열 1로 지정된 어버이 폴리뉴클레오티드 서열은 대장균에서의 발현을 위해 코돈-최적화되었고, 코돈-최적화 폴리뉴클레오티드를 발현 벡터 내로 클로닝하여, 모노아민 옥시데이스 유전자의 발현이 lac 프로모터 및 lacI 억제인자 유전자의 제어 하에 놓이게 하였다. 대장균에서 활성 모노아민 옥시데이스를 발현하는 클론을 확인하고, 유전자를 서열분석하여 이의 신원을 확증하였다. 지정된 서열 (서열 2)은 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스로부터 진화된 조작된 모노아민 옥시데이스의 대부분의 실험 및 라이브러리 구축을 위한 출발점으로서 사용된 어버이 서열이었다.
상기 논의된 바와 같이, 조작된 모노아민 옥시데이스를 천연 발생 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 돌연변이유발 및/또는 지향성 진화 방법에 적용함으로써 수득할 수 있다. 예시적인 지향성 진화 기술은 [Stemmer, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751]; WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767 및 미국 특허 6,537,746에 기술된 바와 같은 돌연변이유발 및/또는 DNA 셔플링(shuffling)이다. 사용될 수 있는 또다른 지향성 진화 절차에는, 특히, 스태거드(staggered) 확장 공정 (StEP), 시험관내 재조합 ([Zhao et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16:258-261]), 돌연변이유발성 PCR ([Caldwell et al., 1994, PCR Methods Appl. 3:S136-S140]), 및 카세트 돌연변이유발 ([Black et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:3525-3529])이 포함된다.
돌연변이유발 처리 후에 수득된 클론을 원하는 개선된 효소 성질이 있는 조작된 모노아민 옥시데이스에 대해 스크리닝한다. 표준 생화학 기술을 사용하여 발현 라이브러리로부터 효소 활성을 측정할 수 있고, 예컨대 모노아민 옥시데이스 활성을 Zhou 등의 문헌 [Zhou et al. "A One-Step Fluorometric Method for the Continuous Measurement of Monoamine Oxidase Activity", 1997 Anal. Biochem. 253:169-74] 및 Szutowicz 등의 문헌 [Szutowicz et al., "Colorimetric Assay for Monoamine Oxidase in Tissues Using Peroxidase and 2,2'-Azino(3-ethtylbenzthaizoline-6-sulfonic Acid) as Chromogen", 1984, Anal. Biochem. 138:86-94]에 개시된 것들과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 모노아민 옥시데이스를 측정하기 위한 공개된 방법 또는 이의 개조물을 사용하여 측정할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 본원에서 상세하게 추가로 기술된 바와 같은, 규정된 효소 제제, 설정된 조건 하의 규정된 분석법, 및 하나 이상의 규정된 기질을 사용하여, 또는, 예를 들어, [Zhou 상기 문헌] 및 [Szutowicz 상기 문헌]의 방법을 사용하여, 효소 활성의 비교가 이루어진다. 일반적으로, 용해물이 비교되는 경우, 세포의 개수 및 분석되는 단백질의 양이 결정될 뿐만 아니라, 숙주 세포에 의해 생산되어 용해물 내에 존재하는 효소의 양에서의 변동을 최소화하기 위해 동일한 발현 시스템 및 동일한 숙주 세포가 사용된다. 원하는 개선된 효소 성질이 열 안정성인 경우, 효소 제제를 규정된 온도에 적용하고, 열 처리 후 남아 있는 효소 활성의 양을 측정한 후에 효소 활성이 측정될 수 있다. 그후, 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 클론을 단리하고, 서열분석하여 뉴클레오티드 서열 변화 (존재하는 경우)를 확인하고, 숙주 세포에서 효소를 발현시키는데 사용한다.
조작된 폴리펩티드의 서열이 공지되어 있는 경우, 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 공지된 합성 방법에 따라 표준 고체-상 방법에 의해 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 약 100개 이하의 단편이 개별적으로 합성된 후, 임의의 원하는 연속 서열이 형성되도록 연결될 수 있다 (예를 들어, 효소적 또는 화학적 결찰 방법, 또는 중합효소 매개 방법에 의해). 예를 들어, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드를 [Beaucage et al., 1981, Tet Lett 22:1859-69]에 기술된 고전적인 포스포르아미다이트 방법 또는 [Matthes et al., 1984, EMBO J. 3:801-05]에 기술된 방법 (예를 들어, 전형적으로 자동 합성 방법으로 실행됨)을 예를 들어 사용하여, 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다. 포스포르아미다이트 방법에 따르면, 예를 들어, 자동 DNA 합성기에서, 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 정제하고, 어닐링(annealing)시키고, 결찰시키고, 적합한 벡터 내에 클로닝한다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산이 임의의 다양한 시판원, 예컨대 <The Midland Certified Reagent Company (Midland, TX)>, <The Great American Gene Company (Ramona, CA)>, <ExpressGen Inc. (Chicago, IL)>, <Operon Technologies Inc., (Alameda, CA)>, 및 다수의 기타 공급원으로부터 수득될 수 있다.
라이소자임 처리, 초음파처리, 여과, 염석, 초원심분리 및 크로마토그래피가 특히 포함되는, 단백질 정제를 위한 주지된 기술들 중 임의의 하나 이상을 사용하여 숙주 세포에서 발현된 조작된 모노아민 옥시데이스를 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 박테리아, 예컨대 대장균으로부터 단백질을 용해시키고 고효율로 추출하기 위한 적절한 용액이 시그마-알드리치 (St. Louis MO)로부터 상표명 셀라이틱 B(CelLytic B)™으로 시판된다.
모노아민 옥시데이스의 단리를 위한 크로마토그래피 기술에는, 특히, 역상 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 젤 전기영동, 및 친화성 크로마토그래피가 포함된다. 특정 효소를 정제하기 위한 조건은, 부분적으로, 알짜 전하, 소수성, 친수성, 분자량, 분자 형상 등에 좌우될 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.
일부 실시양태에서, 친화성 기술이 개선된 모노아민 옥시데이스를 단리하는데 사용될 수 있다. 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 모노아민 옥시데이스에 특이적으로 결합하는 임의의 항체가 사용될 수 있다. 항체의 생산을 위해, 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 숙주 동물이 화합물의 주사에 의해 면역화될 수 있다. 측쇄 관능기 또는 측쇄 관능기에 부착된 링커에 의해, 적절한 담체, 예컨대 BSA에 화합물이 부착될 수 있다. 숙주 종에 따라, 프로인트(Freund) (완전 및 불완전), 미네랄 젤 예컨대 수산화알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 애주번트 예컨대 BCG (칼메트-게랑 간균(bacilli Calmette Guerin)) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 애주번트(adjuvant)가 면역학적 응답을 증가시키는데 사용될 수 있다.
5.9 조작된 모노아민 옥시데이스의 사용 방법 및 이러한 방법으로 제조된 화합물
본원에 기술된 모노아민 옥시데이스는 화학식 I의 기질 화합물의 화학식 II(a)의 입체이성질체 생성물로의 산화를 촉매할 수 있다:
[화학식 I]
Figure pct00072
[화학식 II(a)]
Figure pct00073
[식 중 각각의 A, M, 및 M'은 상기 기술된 바와 같다].
특별한 실시양태에서, 본원에 기술된 모노아민 옥시데이스는 기질 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산, 화합물 (1)의 입체이성질체적 생성물인 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔, 화합물 (2)로의 산화를 촉매할 수 있다:
[화학식 1]
Figure pct00074
[화학식 2]
Figure pct00075
기질인 화합물 (1)을 생성물인 화합물 (2)로 산화시키기 위한 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드는, 서열 2의 야생형 아스페르길루스 니게르 서열과 비교하여, 적어도 하기의 치환들이 있어야 한다: (1) 잔기 465가 글리신임, (2) 잔기 289가 발린임, (3) 잔기 384가 글루타민임, 및 (4) 잔기 382가 류신임.
또다른 특별한 실시양태에서, 본원에 기술된 모노아민 옥시데이스는 기질 (3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (3)의 입체이성질체적 생성물인 (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (4)로의 산화를 촉매하고, 화합물 (4)에 추가로 이량체화가 진행되어 화합물 (5)가 형성될 수 있다:
[화학식 3]
Figure pct00076
[화학식 4]
Figure pct00077
[화학식 5]
Figure pct00078
기질인 화합물 (3)을 생성물인 화합물 (4)로 산화시키기 위한 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드는, 서열 1의 야생형 아스페르길루스 니게르 서열과 비교하여, 하기의 아미노산 치환들 중 하나 이상이 있어야 한다: (1) 잔기 465가 글리신임, (2) 잔기 289가 발린임, (3) 잔기 384가 글루타민임, 및 (4) 잔기 365가 트립토판임. 기질인 화합물 (3)을 생성물인 화합물 (4)로 환원시키기 위한 이러한 방법의 일부 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드는, 서열 1의 야생형 아스페르길루스 니게르 서열과 비교하여, 하기의 아미노산 치환들 중 둘 이상이 있어야 한다: (1) 잔기 465가 글리신임, (2) 잔기 289가 발린임, (3) 잔기 384가 글루타민임, (4) 잔기 365가 트립토판임, 및 (3) 잔기 99가 글루탐산임. 또다른 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스는, 서열 1의 야생형 아스페르길루스 니게르 서열과 비교하여, 하기의 아미노산 치환들 중 셋 이상이 있어야 한다: (1) 잔기 465가 글리신임, (2) 잔기 289가 발린임, (3) 잔기 384가 글루타민임, (4) 잔기 365가 트립토판임, (5) 잔기 99가 글루탐산임, 및 (4) 잔기 135가 글루타민임. 추가적인 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스는, 서열 1의 야생형 아스페르길루스 니게르 서열과 비교하여, 적어도 하기의 아미노산 치환들이 있어야 한다: (1) 잔기 465가 글리신임, (2) 잔기 289가 발린임, (3) 잔기 99가 글루탐산임 및 (4) 잔기 135가 글루타민이고/이거나 잔기 248이 아스파르트산임.
기질을 생성물로 산화시키기 위한 이러한 방법의 한 실시양태에서, 기질이 약 99％를 초과하는 입체이성질체 과량으로 생성물로 산화되고, 이때 모노아민 옥시데이스는 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20에 상응하는 서열을 포함한다.
기질을 생성물로 환원시키기 위한 이러한 방법의 또다른 실시양태에서, 약 25 g/ℓ의 기질 및 약 5 g/ℓ 미만의 폴리펩티드로 수행될 때 기질의 약 50％ 이상이 약 24시간 미만 내에 생성물로 전환되고, 이때 폴리펩티드는 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
또다른 실시양태들에서, 본원에서 제공된 모노아민 옥시데이스들 중 임의의 하나가 바이러스 감염의 치료에 유용한 프로티에이스 억제제인 쉐링(Schering) 505034 ((1R,2S,5S)-N-(4-아미노-1-시클로부틸-3,4-디옥소부탄-2-일)-3-((S)-2-(3-tert-부틸우레이도)-3,3-디메틸부타노일)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르복사미드))의 합성을 위한 중간체의 생산에서 사용될 수 있다 ([Malcolm et al. (2006) Antimicrob. Agents Chemother. 50(3): 1013-20]). 쉐링 505034의 합성에서 중요한 단계는 화학식 I의 화합물의 화합물이 화학식 II의 화합물로, 또는 더욱 구체적으로 화합물 (1)이 화합물 (2)로 전환되는 단계이다. 따라서, 본 발명의 개시내용은 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 사용하여 화합물 (1)을 화합물 (2)로 전환시키는 단계를 포함하는 쉐링 505034의 생산 방법을 제공한다. 쉐링 505034의 생산을 위한 본원에 개시된 방법은 상기 반응식 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12 및 14와 관련되어 도해 및 기술된 단계들 중 하나 이상을 또한 포함할 수 있다.
또다른 실시양태들에서, 본원에서 제공된 모노아민 옥시데이스들 중 임의의 하나가 바이러스 감염의 치료에 유용한 프로티에이스 억제제인 VX-950 ((N-((S)-1-시클로헥실-2-((S)-1-((1S,3aR,6aS)-1-((R)-3-(2-(시클로프로필아미노)-2-옥소아세틸)헥사노일)헥사하이드로시클로펜타[c]피롤-2(1H)-일)-3,3-디메틸-1-옥소부탄-2-일아미노)-2-옥소에틸)피라진-2-카르복사미드의 합성을 위한 중간체의 생산에서 사용될 수 있다 ([Perni et al. (2006) Antimicrob. Agents Chemother. 50(3): 899-909]). VX-950의 합성에서 중요한 단계는 화학식 I의 화합물의 화합물이 화학식 II의 화합물로, 또는 더욱 구체적으로 화합물 (3)이 화합물 (4)로 전환되는 단계이다. 따라서, 본 발명의 개시내용은 본 발명의 개시내용의 모노아민 옥시데이스 폴리펩티드를 사용하여 화합물 (3)을 화합물 (4)로 전환시키는 단계를 포함하는 VX-950의 생산 방법을 제공한다. VX-950의 생산을 위한 본원에 개시된 방법은 상기 반응식 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 및 13과 관련되어 도해 및 기술된 단계들 중 하나 이상을 또한 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 모노아민 옥시데이스가 촉매하는 옥시데이스 반응은 전형적으로 보조인자를 필요로 한다. 본원에 기술된 모노아민 옥시데이스에 의해 촉매되는 산화 반응 또한 전형적으로 보조인자인 플라빈 아데닌 뉴클레오티드 (FAD)를 필요로 한다. 본원에서 사용된 용어 "보조인자"는 모노아민 옥시데이스와 함께 작용하는 비-단백질 화합물을 지칭한다. 일반적으로, 모노아민 옥시데이스에 비-공유결합에 의해 또는 공유결합에 의해 부착될 수 있는 산화된 형태의 보조인자가 반응 혼합물에 첨가된다. 산화된 FAD 형태는 환원된 형태 FAD-H2로부터 산소 분자에 의해 재생될 수 있다. 또다른 실시양태들에서, 산화된 FAD 형태가 NAD(P)에 의해 재생되어, FAD 및 NAD(P)H가 제공될 수 있다. 차례로, NAD(P)는 NAD(P)H-의존적 알코올 탈수소효소/케톤 환원효소를 사용하여 케톤이 알코올로 환원되는 것에 의해 재생될 수 있다.
본원에 기술된, 모노아민 옥시데이스가 촉매하는 옥시데이스 반응은 일반적으로 용매에서 수행된다. 적절한 용매에는 물, 유기 용매 (예를 들어, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 1-옥탄올, 헵탄, 옥탄, 메틸 t-부틸 에테르 (MTBE), 톨루엔 등), 및 이온성 액체 (예를 들어, 1-에틸 4-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트, 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트, 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 헥사플루오로포스페이트 등)이 포함된다. 일부 실시양태에서, 물 및 수성 공용매 시스템이 포함되는 수성 용매가 사용된다.
예시적인 수성 공용매 시스템에는 물 및 하나 이상의 유기 용매가 있다. 일반적으로, 수성 공용매 시스템의 유기 용매 성분은 모노아민 옥시데이스 효소를 완전히 불활성화시키지 않도록 선택된다. 효소 활성 분석법, 예컨대 본원에 기술된 것들을 활용하여, 특정한 조작된 모노아민 옥시데이스 효소의 효소 활성을 후보 용매 시스템의 존재 하에 규정된 관심 기질로 측정함으로써 적합한 공용매 시스템을 쉽게 확인할 수 있다.
수성 공용매 시스템의 유기 용매 성분은 수성 성분과 혼화성이어서 단일 액체 상을 제공할 수 있거나, 또는 수성 성분과 부분적으로 혼화성이거나 비혼화성이어서 2개의 액체 상을 제공할 수 있다. 일반적으로, 수성 공용매 시스템이 사용되는 경우, 이는 물이 유기 용매 내에 분산된 또는 반대인 2상이도록 선택된다. 일반적으로, 수성 공용매 시스템이 이용되는 경우, 수성 상으로부터 쉽게 분리될 수 있는 유기 용매를 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 공용매 시스템 내의 물 대 유기 용매의 비율은 전형적으로 약 90:10 내지 약 10:90 (v/v) 유기 용매 대 물, 및 80:20 내지 20:80 (v/v) 사이의 유기 용매 대 물의 범위 내이다. 공용매 시스템은 반응 혼합물에의 첨가 전에 미리 형성될 수 있거나, 또는 반응 용기에서 원위치에서 형성될 수 있다.
수성 용매 (물 또는 수성 공용매 시스템)는 pH가 완충되거나 완충되지 않을 수 있다. 일반적으로, 약 10 이하, 통상적으로 약 5 내지 약 10 범위의 pH에서 산화가 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 9 이하, 통상적으로 약 5 내지 약 9 범위의 pH에서 산화가 수행된다. 일부 실시양태에서, 약 8 이하, 종종 약 5 내지 약 8 범위, 통상적으로 약 6 내지 약 8 범위의 pH에서 산화가 수행된다. 약 7.8 이하, 또는 7.5 이하의 pH에서 산화가 또한 수행될 수 있다. 별법적으로, 중성 pH, 즉, 약 7에서 산화가 수행될 수 있다.
산화 반응 과정 동안, 반응 혼합물의 pH가 변할 수 있다. 전형적인 화학식 I의 아민은 중성 pH 및 중성 pH 근방에서 양성자화되는 한편, 화학식 II의 이민 생성물은 전형적으로 중성 pH 및 중성 pH 근방에서 양성자화되지 않는다. 따라서, 반응이 중성 pH 및 중성 pH 근방에서 수행되는 전형적인 실시양태에서, 양성자화된 아민이 비-양성자화 이민으로 산화되면 양성자가 수용액 내로 방출된다. 반응 과정 동안 염기를 첨가함으로써 원하는 pH에서 또는 원하는 pH 범위 내에서 반응 혼합물의 pH를 유지할 수 있다. 별법적으로, 완충제를 포함하는 수성 용매를 사용하여 pH를 제어할 수 있다. 원하는 pH 범위를 유지하기 위한 적절한 완충제는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 포스페이트 완충제, 트리에탄올아민 완충제 등을 포함한다. 완충 또는 염기 첨가의 조합을 또한 사용할 수 있다.
산의 중화를 위한 적절한 염기는 유기 염기, 예를 들어, 아민, 알콕시드 등, 및 무기 염기, 예를 들어, 하이드록시드 염 (예를 들어, NaOH), 카르보네이트 염 (예를 들어, NaHCO3), 바이카르보네이트 염 (예를 들어, K2CO3), 염기성 포스페이트 염 (예를 들어, K2HPO4, Na3PO4) 등이다. 반응 과정에 걸쳐 아민이 이민으로 산화될 때 방출된 양성자를 중화하기 위한 바람직한 염기는 아민 기질 자신이다. 반응 혼합물 pH를 모니터링하면서 수동으로, 또는, 더욱 편리하게는, 자동 적정기를 pH 스탯(stat)으로서 사용함으로써, 전환 과정과 동시에 염기를 첨가할 수 있다. 부분적인 완충능과 염기 부가의 조합이 공정 제어에 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 산화 과정에 걸쳐 완충되지 않은 또는 부분적으로 완충된 반응 혼합물에 첨가되는 염기는 수용액에서 첨가된다.
본원에 기술된 입체선택적 산화 반응을 수행하는데 있어서, 조작된 모노아민 옥시데이스는 정제된 효소, 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 유전자(들)로 형질전환된 전체 세포, 및/또는 이같은 세포의 세포 추출물 및/또는 용해물의 형태로 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 조작된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 유전자(들)로 형질전환된 전체 세포 또는 이의 세포 추출물 및/또는 용해물은 고체 (예를 들어, 동결건조된 고체, 분무 건조된 고체 등) 또는 반고체 (예를 들어, 미정제(crude) 페이스트)가 포함되는 다양한 상이한 형태로 사용될 수 있다.
침전 (황산암모늄, 폴리에틸렌이민, 열 처리 등)에 이어서, 동결건조 전의 탈염 절차 (예를 들어, 초여과, 투석 등)에 의해, 세포 추출물 또는 세포 용해물을 부분적으로 정제할 수 있다. 공지된 가교제, 예를 들어, 글루타르알데하이드를 사용하는 가교 또는 고체 상 (예를 들어, 유퍼지트(Eupergit) C 등)에의 고정에 의해 임의의 세포 제제를 안정화시킬 수 있다.
고체 반응물 (예를 들어, 효소, 염 등)은 분말 (예를 들어, 동결건조 분말, 분무 건조 분말 등), 용액, 에멀션, 현탁액 등이 포함되는 다양한 상이한 형태로 반응에 제공될 수 있다. 당업자에게 공지된 방법 및 장치를 사용하여 반응물이 쉽게 동결건조 또는 분무 건조될 수 있다. 예를 들어, 단백질 용액을 -80℃에서 소분획으로 동결시킨 후, 미리 냉각된 동결건조 챔버에 첨가하고 나서, 진공을 적용할 수 있다. 샘플에서 물을 제거한 후, 전형적으로 온도를 2시간 동안 4℃로 상승시키고 나서, 진공을 해제하고 동결건조 샘플을 복구시킨다.
산화 반응에서 사용되는 반응물의 양은 원하는 생성물의 양, 그리고 이와 동시에, 사용된 모노아민 옥시데이스 기질의 양에 따라 일반적으로 변할 것이다. 일반적으로, 약 50 ㎎/ℓ 내지 약 5 g/ℓ의 모노아민 옥시데이스를 사용하여 약 5 g/ℓ 내지 50 g/ℓ의 농도로 기질이 사용될 수 있다. 당업자는 이러한 양을 변화시켜 이를 원하는 수준의 생산성 및 생산 규모에 맞추는 방법을 쉽게 이해할 것이다. 일상적인 실험에 의해 임의적인 작용제, 예컨대 카탈레이스, 소포제, 및 중아황산나트륨 또는 메타중아황산나트륨의 적합한 양을 쉽게 결정할 수 있다.
반응물의 첨가 순서는 결정적이지 않다. 반응물들이 동시에 용매 (예를 들어, 1상 용매, 2상 수성 공용매 시스템 등)에 함께 첨가될 수 있거나, 또는, 별법적으로, 반응물들 중 일부는 분리되어, 일부는 함께 상이한 시점에 첨가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 반응 성분들 중 하나 이상이 모노아민 옥시데이스의 기질 및/또는 생성물 억제를 최소화하거나 방지하는 수준으로 지속적으로 반응에 첨가 ("공급")될 수 있다. 특정 실시양태에서, 모노아민 옥시데이스는 반응 과정에 걸쳐 간격을 두고 첨가될 수 있고, 예를 들어, 약 1시간 마다, 약 2시간 마다, 약 3시간 마다, 또는 약 4시간 마다 첨가될 수 있다.
본원에 기술된, 모노아민 옥시데이스가 촉매하는 산화 반응을 수행하기 위한 적절한 조건에는 조작된 모노아민 옥시데이스 및 기질을 실험 pH 및 온도에서 접촉시키고 생성물을 검출하는 것 (예를 들어, 본원에서 제공되는 실시예에 기술된 방법을 예를 들어 사용함)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 일상적인 실험에 의해 쉽게 최적화될 수 있는 광범위한 조건이 포함된다.
모노아민 옥시데이스가 촉매하는 산화는 약 5℃ 내지 약 75℃ 범위의 온도에서 전형적으로 수행된다. 일부 실시양태에 대해, 약 20℃ 내지 약 55℃ 범위의 온도에서 반응이 수행된다. 또다른 실시양태에서, 약 20℃ 내지 약 45℃, 약 30 ℃ 내지 약 45 ℃, 또는 약 40℃ 내지 약 45℃ 범위의 온도에서 반응이 수행된다. 반응은 주위 온도 (약 21℃)에서 또한 수행될 수 있다.
일반적으로 산화 반응은 기질의 본질적으로 완전한 또는 거의 완전한 산화가 수득될 때까지 진행되게 된다. 기질 및/또는 생성물을 검출함으로써 공지된 방법을 사용하여 기질이 생성물로 산화되는 것을 모니터링할 수 있다. 적절한 방법에는 기체 크로마토그래피, HPLC 등이 포함된다. 전환율은 일반적으로 약 50％ 초과이고, 또한 약 60％ 초과일 수 있으며, 또한 약 70％ 초과일 수 있고, 또한 약 80％ 초과일 수 있고, 또한 90％ 초과일 수 있으며, 종종 약 97％ 초과이다.
6. 실시예
본 발명의 개시내용의 다양한 양상 및 실시양태가 하기의 대표적인 실시예들에서 설명되고, 이는 예시적이지만 제한적이지 않도록 의도된다.
실시예 1: 야생형 모노아민 옥시데이스 유전자 입수 및 발현 벡터의 구축.
모노아민 옥시데이스의 보고된 아미노산 서열 및 미국 가출원 일련 번호 60/848,950 (거명에 의해 본원에 포함됨)의 실시예 1에 기술된 코돈 최적화 알고리즘을 기초로 대장균 (W3110fhuA 또는 UM2)에서의 발현을 위해 모노아민 옥시데이스 코딩 유전자를 디자인하였다. 뉴클레오티드 42개로 예를 들어 구성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유전자를 합성하고, lac 프로모터의 제어 하에 발현 벡터 pCK110900 (미국 특허 출원 공개 20060195947의 도 3에 도해됨) 내로 클로닝하였다. 이러한 발현 벡터는 P15a 복제 기원 및 클로람페니콜 저항성 유전자를 또한 함유한다. 생성된 플라스미드를 표준 방법을 사용하여 대장균 W3110 내로 형질전환시켰다. 코돈이 최적화된 유전자 및 또한 코딩 폴리펩티드가 표 4에 열거된다. Zhou 등의 문헌 [Zhou et al., "A One-Step Fluorometric Method for the Continuous Measurement of Monoamine Oxidase Activity", 1997 Anal. Biochem. 253:169-74] 및 Szutowicz 등의 문헌 [Szutowicz et al., "Colorimetric Assay for Monoamine Oxidase in Tissues Using Peroxidase and 2,2' Azino(3 ethtylbenzthaizoline-6-sulfonic Acid) as Chromogen", 1984, Anal. Biochem. 138:86-94]에 개시된 것들과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지되어 있거나 이로부터 개조된 방법을 사용하여 야생형 모노아민 옥시데이스의 활성을 확증하였다. 본원에서 상세하게 추가로 기술된 바와 같은, 규정된 효소 제제, 설정된 조건 하의 규정된 분석법, 및 하나 이상의 규정된 기질을 사용하여, 또는, 예를 들어, [Zhou 상기 문헌] 및 [Szutowicz 상기 문헌]의 방법을 사용하여, 효소 활성을 비교하였다. 일반적으로, 용해물이 비교된 경우, 세포의 개수 및 분석되는 단백질의 양을 결정할 뿐만 아니라, 숙주 세포에 의해 생산되어 용해물 내에 존재하는 효소의 양에서의 변동을 최소화하기 위해 동일한 발현 시스템 및 동일한 숙주 세포를 사용하였다.
Figure pct00079
본 발명의 개시내용의 조작된 모노아민 옥시데이스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유사하게 대장균 W3110에서의 발현을 위해 벡터 pCK110900 내로 클로닝하였다.
실시예 2: 모노아민 옥시데이스 분말의 생산; 진탕 플라스크 공정.
모노아민 옥시데이스 분말을 하기와 같이 진탕 플라스크 배양으로부터 생산하였다: 관심 모노아민 옥시데이스 유전자가 있는 플라스미드를 함유하는 대장균의 단일 미생물 콜로니를 30 ㎍/㎖ 클로람페니콜및 1％ 글루코스를 함유하는 50 ㎖ 루리아 베르타니(Luria Bertani) 브로스(broth) 내로 접종하였다. 250 rpm에서 진탕하면서 30℃의 인큐베이터에서 하룻밤 (16시간 이상) 동안 세포를 성장시켰다. 배양물을 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)가 0.2이도록 1 ℓ 플라스크 내의 250 ㎖ 2XYT (16 g/ℓ 박토-트립톤, 10 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ NaCl, pH 7.0), 1 mM MgSO4, 30 ㎍/㎖ 클로람페니콜 내로 희석하고, 30℃에서 성장시켰다. 배양물의 OD600이 0.6 내지 0.8일 때 1 mM IPTG로 모노아민 옥시데이스 유전자의 발현을 유도하고, 하룻밤 (16시간 이상) 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 (5000 rpm, 15분, 4℃)에 의해 세포를 수확하고, 상등액을 폐기하였다. 세포 펠릿을 동일한 부피의 저온 (4℃) 100 mM 트리에탄올아민 (하이드로클로라이드) 완충제 (pH 7.0) (2 mM MgSO4를 임의적으로 포함함)로 재현탁시키고, 상기와 같이 원심분리에 의해 수확하였다. 세정된 세포를 2 부피의 저온 트리에탄올아민 (하이드로클로라이드) 완충제 (pH 7.0) 내에 재현탁시키고, 온도를 4℃로 유지시키면서 12000 psi의 프렌치 프레스(French Press)에 2회 통과시켰다. 세포 잔해물을 원심분리 (9000 rpm, 45분, 4℃)에 의해 제거하였다. 투명한 용해물 상등액을 수집하고, -20℃에서 보관하였다. 동결된 투명한 용해물의 동결건조로 미정제 모노아민 옥시데이스 효소의 건식 분말이 제공되었다.
실시예 3: 모노아민 옥시데이스의 생산; 발효 절차.
모노아민 옥시데이스 분말을 하기와 같이 발효에 의해 생산하였다: 통기형 진탕식 15 ℓ 발효기에서, 0.88 g/ℓ 황산암모늄, 0.98 g/ℓ의 시트르산나트륨; 12.5 g/ℓ의 인산수소2칼륨 3수화물, 6.25g/ℓ의 인산2수소칼륨, 6.2 g/ℓ의 타스톤(Tastone)-154 효모 추출물, 0.083 g/ℓ 시트르산철암모늄, 및 2 g/ℓ의 염화칼슘 2수화물, 2.2 g/ℓ의 황산아연 7수화물, 0.5 g/ℓ 황산망간 1수화물, 1 g/ℓ 황산제1구리 7수화물, 0.1 g/ℓ 몰리브덴산암모늄 4수화물 및 0.02 g/ℓ 사붕산나트륨 10수화물을 함유하는 8.3 ㎖/ℓ의 미량 원소 용액을 함유하는 성장 배지 6.0ℓ를 온도 30℃로 만들었다. 0.5 내지 2.0의 출발 OD600으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 진탕 플라스크에서 성장된, 관심 모노아민 옥시데이스 유전자가 있는 플라스미드를 함유하는 대장균 W3110의 후기 지수(late exponential) 배양물을 발효기에 접종하였다. 발효기를 500-1500 rpm에서 진탕시키고, 1.0-15.0 ℓ/분으로 공기를 발효 용기에 공급하여, 30％ 포화도 이상의 용해 산소 수준을 유지시켰다. 20％ v/v 수산화암모늄을 첨가하여 배양물의 pH를 7.0으로 제어하였다. 500 g/ℓ 세렐로스, 12 g/ℓ 염화암모늄 및 10.4 g/ℓ 황산마그네슘 7수화물을 함유하는 공급 용액을 첨가하여 배양물의 성장을 유지시켰다. 일단 배양물이 OD600 50에 도달하면, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG)를 1 mM의 최종 농도로 첨가하여 모노아민 옥시데이스의 발현을 유도하였다. 그후, 배양물을 추가로 14시간 동안 성장시켰다. 배양물을 4℃로 냉각하고, 수확할 때까지 4℃에서 유지시켰다. 4℃의 소르발(Sorval) RC12BP 원심분리기에서 40분 동안 5000 G로 원심분리하여 세포를 수확하였다. 수확된 세포를 이어지는 하류 회수 공정에서 곧바로 사용하거나, 또는 이같이 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
세포를 하류 회수 공정에서 곧바로 사용하는 경우, 각각의 부피의 습윤 세포 페이스트에 대해 세포 펠릿을 2 부피의 4℃의 100 mM 트리에탄올아민 (하이드로클로라이드) 완충제 (pH 6.8)에 재현탁시켰다. 12000 psig의 압력을 사용하여 2-단계 균질화 밸브 어셈블리가 장착된 균질화기에 현탁액을 통과시킴으로써 세포내 모노아민 옥시데이스를 세포로부터 방출시켰다. 파열 직후에 세포 균질화물을 4℃로 냉각시켰다. 10％ w/v 폴리에틸렌이민 (pH 7.2)의 용액을 0.5％ w/v의 최종 농도로 용해물에 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 생성된 현탁액을 30분 동안 표준 실험실 원심분리기에서 5000 G에서의 원심분리에 의해 청정화하였다. 투명한 상등액을 따라내어, 분자량 차단값이 30 Kd인 셀룰로스 초여과막을 사용하여 10배 농축하였다. 최종 농축물을 얕은 용기 내로 분배하고, -20℃에서 동결시키고, 분말로 동결 건조시켰다. 모노아민 옥시데이스 분말을 -80℃에서 보관하였다.
실시예 4: 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산, 화합물 (1)의 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔, 화합물 (2)로의 전환에 대한 분석 방법.
6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산의 전환율 및 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔 생성물의 입체이성질체 순도를 하기 기술된 키랄 GC 방법에 의해 결정하였다. 용출 순서는 기질 (1) (체류 시간 약 7분), 원하는 (1R,2S)-이민 (2) (약 10.6분), 원치 않는 (1S,2R) 이민 (약 11.0분)이었다. 칼럼: 수펠코 베타덱스(Supelco Betadex) 225 (파트# 24348), .25 mm × 30 m × .25 um; 오븐 온도: 85℃ 등온선; 담체 유동: 1.1 ㎖/분; 주입 부피: 4 ㎕; 및 주입 분할(Split): 100:1; 주입기 온도=200℃; FID 검출.
실시예 5: 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (3)의 (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (4)로의 전환에 대한 분석 방법.
옥타하이드로시클로펜타[c]피롤의 전환율 및 생성물의 입체이성질체 순도를 하기 기술된 키랄 GC 방법에 의해 결정하였다. 용출 순서는 기질 (3) (체류 시간 약 2.7분), 원하는 (3aS,6aR) 이민 (4) (약 5.5분), 원치 않는 (3aR, 6aS)-이민 (약 5.8분)이었다. 주입기 포트에서 이민 (4)의 이민 이량체가 이민으로 열분해(thermolysis)되었다. 칼럼: 수펠코 베타덱스 225 (파트# 24348), .25 mm × 30 m × .25 um; 오븐 온도: 120℃ 등온선; 담체 유동: 1.1 ㎖/분; 주입 부피: 4 ㎕; 및 주입 분할: 100:1; 주입기 온도=200 ℃; FID 검출.
실시예 6: 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산, 화합물 (1)의 산화에 대한 야생형 모노아민 옥시데이스의 평가
본원에 개시된 야생형 모노아민 옥시데이스를 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산, 화합물 (1)을 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔, 화합물 (2)로 산화시키는 능력에 대해 스크리닝하였다. 공기 중의 50-㎖ 3목 플라스크에 25 ㎖의 100 mM pH 3.0 인산칼륨 완충제 및 330 ㎕의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산을 첨가하여, 균질 용액을 제공하였다. 진한 H3PO4에 의해 pH를 약 7.3으로 조정하였다. pH가 조정된 용액에 60 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515), 및 pH 8.0 인산칼륨 완충제 내의 150 ㎎의 서열 2 (아스페르길루스 니게르) 또는 서열 32 (아스페르길루스 오리자에)의 야생형 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 2의 진탕 플라스크 방법에 의해 제조됨)을 첨가하였다. 생성된 담황색 용액을 공기 중에서 24시간 동안 교반하였다. 1-5 ㎕ 분량으로의 1 N NaOH의 피드백(feedback)-제어 첨가에 의해 pH를 7.2로 유지시켰다. (아민 반응물은 중성 pH에서 양성자화되고, 이민 생성물은 그렇지 않다. pH를 유지하기 위해 중성화되어야 하는 양성자가 반응에서 방출된다)
pH가 약 14에 이르게 하는 10 N NaOH로 반응을 켄칭시키고, 혼합물을 상 분리를 위해 원심분리를 사용하여 CDCl3로 추출하였다. 아스페르길루스 니게르 야생형 모노아민 옥시데이스를 사용하는 반응으로부터의 CDCl3 용액의 1H-NMR 분석은 아민 (1)의 이민 (2)로의 약 20％ 전환율을 가리켰다. 아스페르길루스 오리자에 야생형 모노아민 옥시데이스의 반응은 아스페르길루스 니게르 야생형 모노아민 옥시데이스로의 반응의 약 2배의 양의 NaOH 용액을 소비하였고, 이는 약 2배의 양의 아민 (1)이 전환되었음을 가리킨다.
실시예 4의 방법에 따른 키랄 GC 분석은 원하는 (1R,5S)-이민 (2)를 나타냈다. 원치 않는 (1S,5R)-이민 거울상이성질체는 검출되지 않았다.
이러한 실시예는 이러한 야생형 모노아민 옥시데이스들이 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산, 화합물 (1)에 대한 활성이 낮고, 이를 원하는 (1R,5S)-이민 (2)으로 전환시킨다는 것을 실연한다.
실시예 7: 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (3)의 산화에 대한 야생형 모노아민 옥시데이스의 평가
본원에 개시된 야생형 모노아민 옥시데이스를 (옥타하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (3)을 (3aS,6aR) 1,3a,4,5,6,6a 헥사하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (4)로 산화시키는 능력에 대해 스크리닝하였다. 공기 중의 50-㎖ 3목 플라스크에 25 ㎖의 100 mM pH 8.0 인산칼륨 완충제 및 375 ㎎의 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 하이드로클로라이드를 첨가하고, 1 N NaOH로 pH를 약 7.3으로 조정하였다. pH가 조정된 용액에 60 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치로부터 구입함; 카탈로그 번호 C-3515) 및 pH 8.0 인산칼륨 완충제 내의 150 ㎎의 서열 2 (아스페르길루스 니게르)의 야생형 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 2의 진탕 플라스크 방법에 의해 제조됨)을 첨가하였다. 생성된 담황색 용액을 공기 중에서 24시간 동안 교반하였다. 1-5 ㎕ 분량으로의 1 N NaOH의 피드백-제어 첨가에 의해 pH를 7.2로 유지시켰다. 24시간 후에 NaOH 소비가 거의 관찰되지 않거나 관찰되지 않았다. pH가 약 14에 이르게 하는 10 N NaOH로 반응을 켄칭시키고, 혼합물을 CDCl3로 추출하였다. 원심분리 (5분 동안 6000 rpm)를 통한 상 분리 후, CDCl3 용액의 1H-NMR 분석은 아민 (3)이 이민 (4)로 거의 전환되지 않았거나 전환되지 않았음을 가리켰다.
이러한 실시예는 야생형 모노아민 옥시데이스가 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (3)에 대한 활성이 거의 없다는 것을 실연한다.
실시예 8: 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산, 화합물 (1)에 대한 모노아민 옥시데이스 활성에 대한 고처리량 분석법.
지향성 진화에 의해 수득되고 진화된 모노아민 옥시데이스 유전자를 함유하는 플라스미드 라이브러리를 대장균 내로 형질전환시키고, 1％ 글루코스 및 30 ㎍/㎖ 클로람페니콜 (CAM)을 함유하는 루리아-베르타니 (LB) 브로스 상에 플레이팅하였다. 30℃에서 16시간 이상 동안 인큐베이션한 후, Q-bot® 로봇식 콜로니 채집기 (Genetix USA, Inc. (Beaverton, OR))를 사용하여, 180 ㎕ 터리픽(Terrific) 브로스 (TB), 1％ 글루코스, 30 ㎍/㎖ 클로람페니콜 (CAM) 및 2 mM MgSO4를 함유하는 웰이 얕은 96웰 미량역가 플레이트 내로 콜로니를 채집하였다. 200 rpm에서 진탕시키면서 세포를 하룻밤 동안 30℃에서 성장시켰다. 그후, 20 ㎕의 이러한 배양물을 350 ㎕ 터리픽 브로스 (TB), 2 mM MgSO4 및 30 ㎍/㎖ CAM을 함유하는 웰이 깊은 96웰 플레이트로 옮겼다. 2.5 내지 3시간 동안 250 rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 웰이 깊은 플레이트를 인큐베이션한 후 (OD600 0.6-0.8), 세포 배양물에 의한 재조합 유전자 발현을 이소프로필 β D 티오갈락토시드 (IPTG)를 1 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 유도하였다. 그후, 플레이트를 15-23시간 시간 동안 250 rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 인큐베이션하였다.
세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 400 ㎕ 용해 완충제에 재현탁하고, 2시간 이상 동안 실온에서 진탕시킴으로써 용해시켰다. 용해 완충제는 50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.0), 1 ㎎/㎖ 라이소자임 및 500 ㎍/㎖ 폴리믹신(polymixin) B 설페이트를 함유하였다. 세포 잔해물을 원심분리에 의해 펠릿화하였다.
20 ㎕의 대략적으로 희석된 투명한 용해물 상등액을 50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.5), 4 U/㎖ 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 (Sigma-C3515) 및 40 mM 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 (아세트산 염으로 제공됨)을 함유하는 180 ㎕의 분석법 혼합물이 있는 웰이 깊은 96웰 미량역가 플레이트의 웰 내로 옮김으로써 모노아민 옥시데이스 활성을 측정하였다. 분석법 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 4시간 동안 진탕시켰다. 500 ㎕ 1:1 아세토니트릴:물을 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 플레이트를 원심분리하였다. 원심분리 후, 150 ㎕의 상등액을 실시예 4에 따른 방법에 의한 HPLC 분석을 위해 얕은 플레이트로 옮겼다.
HPLC 조건: 40℃의 2.1 × 75 mm 조르박스 이클립스(Zorbax Eclipse) XDB C-18 3.5 마이크로미터 입자 크기 칼럼 + 0.5 ㎖/분의 60:40 40 mM 아세트산암모늄/아세토니트릴의 이동상. 이민이 약 1분에 용출되었다 (254 nm). 이민만 검출될 수 있었고, 이민 신호의 절대 피크 면적을 사용하여 변이체들의 활성 순위를 매겼다.
별법적으로, 분석법 반응을 100 ㎕의 10 N NaOH로 켄칭시키고, 1:1 v/v MTBE로 추출하고, 실시예 4의 방법에 의한 키랄 GC 분석에 적용하였다.
실시예 9: 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (3)에 대한 모노아민 옥시데이스 활성에 대한 고처리량 분석법.
96-웰 플레이트 상의 모노아민 옥시데이스 변이체들을 함유하는 용해물들을 실시예 8에 기술된 바와 같이 제조하였다.
50 ㎕의 투명한 용해물을 100 mM 인산나트륨 완충제 (pH 7.5), 4 U/㎖ 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 (Sigma-C3515) 및 50 mM 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤을 함유하는 450 ㎕의 분석법 혼합물이 있는 웰이 깊은 96웰 미량역가 플레이트의 웰 내로 옮김으로써 모노아민 옥시데이스 활성을 측정하였다. 분석법 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 16시간 동안 진탕시켰다. 플레이트를 원심분리하고, 100 ㎕의 상등액을 실시예 5에 따른 HPLC 분석을 위해 웰이 얕은 플레이트의 웰 내의 100 ㎕의 아세토니트릴 내로 켄칭시켰다.
100 ㎕ 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 플레이트를 원심분리하였다. 원심분리 후, 100 ㎕의 상등액은 100 ㎕의 아세토니트릴이었고, 이를 실시예 4에 따른 방법에 의한 HPLC 분석을 위해 얕은 플레이트로 옮겼다.
HPLC 조건: 40℃의 2.1 × 75 mm 조르박스 이클립스 XDB C-18 3.5 마이크로미터 입자 크기 칼럼 + 0.5 ㎖/분의 70:30 40 mM 아세트산암모늄/아세토니트릴의 이동상. 이민이 약 1.3분에 용출되었다 (254 nm). 이민만 검출될 수 있었고, 이민 신호의 절대 피크 면적을 사용하여 변이체들의 활성 순위를 매겼다.
별법적으로, 반응을 100 ㎕의 10 N NaOH로 켄칭시키고, 1:1 v/v MTBE로 추출하고, 실시예 5의 키랄 GC 분석에 적용하였다.
이러한 실시예는 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (3)의 산화에 대해 개선된 모노아민 옥시데이스 변이체를 확인하는데 사용된 방법을 기술한다.
실시예 10: (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔, 화합물 (2)의 제조 규모의 생산.
300 rpm의 오버헤드(overhead) 교반기가 장착된 500-㎖ 4목 플라스크에 150 ㎖의 약 25℃의 Milli-Q 물, 및 1.2 ㎖ (약 1.0 g; 약 9 mmol)의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산을 첨가하여, pH 11.8의 균질 용액을 제공하였다. pH 7.5에 도달할 때까지 Na2S2O5를 분할식으로 첨가하였다. 무색 용액에 300 ㎕의 안티폼(Antifoam)-204 (시그마 카탈로그 번호 A-6226) 및 600 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515)을 첨가하여, pH 7.5의 무색 용액을 제공하였다. 이러한 용액에 1.5 g의 서열 10의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 3에 따라 발효에 의해 생산됨)을 첨가하여, 황색 용액을 제공하였다. 공기 스파징(sparging) 프로브를 삽입하였고 (기류 속도 약 60 ㎖/분), 반응 혼합물의 pH가 즉시 강하되기 시작했다. 2 N NaOH의 피드백-제어 투약을 통해 pH를 유지시켰다. 약 30분 후, pH가 안정적이었고, 추가적인 염기 투약이 발생하지 않았다. 추가로 10분 후 (총 40분), 120 ㎖의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 NaHSO3 용액 (20.8 g의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산을 150 ㎖의 dH2O에 첨가하고, pH 7.2에 도달하도록 충분한 Na2S2O5를 첨가함으로써 제조됨)을 0.25 ㎖/분의 속도로 반응에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH가 즉시 강화되기 시작하였고, 2 N NaOH의 투약이 재개되었다. 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 및 NaHSO3의 용액을 첨가하는 것을 약 8시간 후 완료하였다 (총 반응 시간 9시간). 염기 첨가가 계속되었고, 기질 첨가가 완료된 후 염기 첨가 속도가 증가하였다. 200 ㎕ 분취량을 취하고, 200 ㎕의 8 N NaOH로 켄칭시키고 (아미노술포네이트를 유리 이민으로 분해하기 위해), 600 ㎕의 CDCl3로 추출하였다. CDCl3 추출물의 1H-NMR 분석은 기질 (1)의 아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔 화합물 (2)로의 완전한 전환을 나타냈다
Figure pct00080
키랄 GC 분석은 검출가능한 (1S,2R) 거울상이성질체가 없는 (1R,5S) 거울상이성질체 (2)를 나타냈다.
반응 혼합물을 아미노니트릴로의 시안화 반응에 "그대로" 사용하였다.
실시예 11: 모노아민 옥시데이스가 정적인 공기 담요 하에 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 (1)의 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔 (2)으로의 탈대칭화를 촉매하였다.
공기 중의 50-㎖ 3목 플라스크에 25 ㎖의 100 mM pH 3.0 인산칼륨 완충제 및 330 ㎕의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산을 첨가하여 균질 용액을 제공하였다. 진한 H3PO4를 사용하여 pH를 약 7.5로 조정하였다. pH가 조정된 용액에 60 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515) 및 pH 8.0 인산칼륨 완충제 내의 150 ㎎의 서열 4, 6 또는 8의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 2의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하였다. 생성된 담황색 용액을 공기 중에서 24시간 동안 교반하였다. 1-5 ㎕ 분량으로의 1 N NaOH의 피드백-제어 첨가에 의해 pH를 7.4로 유지시켰다. 그후, pH가 약 14에 이르게 하는 10 N NaOH로 반응을 켄칭시켰다. 혼합물의 샘플을 CDCl3로 추출하였다. 원심분리 (5분 동안 6000 rpm)를 통한 상 분리 후, 1H-NMR 분석은 아민 (1)의 이민 (2)로의 95％ 이상의 전환율을 가리켰다. 실시예 4의 방법에 의한 키랄 GC 분석은 (1R,5S)-이민 거울상이성질체 (2)를 나타냈다. (1S,2R) 거울상이성질체는 검출되지 않았다.
실시예 12: 모노아민 옥시데이스가 산소 담요 하에 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 (1)의 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔 (2)으로의 탈대칭화를 촉매하였다.
공기 중의 50-㎖ 3목 플라스크에 25 ㎖의 100 mM pH 3.0 인산칼륨 완충제 및 330 ㎕의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산을 첨가하여 균질 용액을 제공하였다. 진한 H3PO4를 사용하여 pH를 약 7.5로 조정하였다. pH가 조정된 용액에 60 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515) 및 pH 8.0 인산칼륨 완충제 내의 150 ㎎의 서열 4, 6 또는 8의 폴리펩티드의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 2의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하였다. 헤드(head) 공간에 산소 기류를 플러싱(flushing)하고, 생성된 담황색 용액을 공기 중에서 24시간 동안 교반하였다. 1-5 ㎕ 분량으로의 1 N NaOH의 피드백-제어 첨가에 의해 pH를 7.4로 유지시켰다. 그후, pH가 약 14에 이르게 하는 10 N NaOH로 반응을 켄칭시켰다. 혼합물의 샘플을 CDCl3로 추출하였다. 원심분리 (5분 동안 6000 rpm)를 통한 상 분리 후, 1H-NMR 분석은 아민 (1)의 이민 (2)로의 95％ 이상의 전환율을 가리켰다. 실시예 4의 방법에 의한 키랄 GC 분석은 (1R,5S)-이민 거울상이성질체 (2)를 나타냈다. (1S,2R) 거울상이성질체는 검출되지 않았다.
실시예 13: 모노아민 옥시데이스가 바이설파이트의 존재 하에 공기 스파징과 함께 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 (1)의 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔으로의 탈대칭화를 촉매하였다.
100-㎖ 플라스크에 40 ㎖의 dH2O 및 1.8 ㎖의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산을 첨가하여, pH가 약 11.4인 균질 용액을 제공하였다. 이러한 용액에 2.7 g의 Na2S2O5를 첨가하여 균질 용액을 제공하고, 약 1 ㎖의 8 N NaOH의 첨가에 의해 pH를 약 7.5로 조정하였다. 이러한 용액에 60 ㎕의 안티폼-204 (시그마, 카탈로그 번호 A-6226), 120 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515), 및 10 ㎖의 100 mM pH 8.0 인산칼륨 완충제 내의 300 ㎎의 서열 8의 폴리펩티드의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 2의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하였다. 소결 유리를 통해 반응 혼합물 내로 공기를 스파징하고, 생성된 담황색 용액을 공기를 스파징하면서 24시간 동안 실온 (약 21℃)에서 24시간 동안 교반하였다. 1 ㎕ 분량으로의 2.5 N NaOH의 피드백-제어 첨가에 의해 pH를 7.4로 유지시켰다. pH가 약 14에 이르게 하는 10 N NaOH로, 반응을 켄칭시키고, 이민-바이설파이트 부가물 (아미노술포네이트)를 유리 이민으로 분해시키고, 생성물을 MTBE 내로의 추출에 의해 추출 단리하였다. 상 분리 후, (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔이 증류를 통해 86％ 수율로 단리되었다. CDCl3에서의 1H-NMR에 의한 분석 (실시예 10에서와 같음)으로 화합물 (1)의 이민 화합물 (2)로의 전환이 확증되었다. 실시예 4의 방법에 의한 키랄 GC 분석은 (1R,5S)-이민 거울상이성질체 (2)를 나타냈다. (1S,2R) 거울상이성질체는 검출되지 않았다.
이렇게 수득된 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔을 D2O 내의 1.0 당량의 NaHSO3로 처리하였다. 1H-NMR 분석은 바이설파이트 부가물로의 정량적인 전환을 가리켰다
Figure pct00081
실시예 14: 모노아민 옥시데이스가 공기 스파징 및 기질과 바이설파이트의 동시 첨가와 함께 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산의 (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔으로의 탈대칭화를 촉매하였다.
300 rpm의 오버헤드 교반기가 장착된 실온 (약 21℃)의 500-㎖ 4목 플라스크에 150 ㎖의 Milli-Q 물 및 1.2 ㎖ (약 1.0 g; 약 9 mmol)의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산을 첨가하여, pH 11.8의 균질 용액을 제공하였다. pH 7.5에 도달할 때까지 Na2S2O5를 분할식으로 첨가하였다. 무색 용액에 300 ㎕의 안티폼-204 (시그마 카탈로그 번호 A-6226) 및 600 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515)을 첨가하여, pH 7.5의 무색 용액을 제공하였다. 이러한 용액에 1.5 g의 서열 8의 폴리펩티드의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 3의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하여, 황색 용액을 제공하였다. 공기 스파징 프로브를 삽입하고, 공기를 약 60 ㎖/분의 속도로 반응 내로 스파징하였고, 반응 혼합물의 pH가 즉시 강하되기 시작하는 것이 주지되었다. 2 N NaOH의 피드백-제어 첨가를 통해 pH를 유지시켰다. 약 30분 후, pH가 안정적이었고, 추가적인 염기 첨가가 발생하지 않았다. 추가로 10분 후 (총 40분), 120 ㎖의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산/NaHSO3 용액 (20.8 g의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 + 150 ㎖의 dH2O 및 pH 7.2에 도달하기에 충분한 Na2S2O5)을 0.25 ㎖/분의 속도로 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH가 즉시 강화되기 시작하였고, 2 N NaOH의 첨가가 재개되었다. 6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산/NaHSO3 첨가를 약 8시간 후 완료하였다 (총 반응 시간 9시간). 염기 첨가가 계속되었고, 기질 첨가가 완료된 후 염기 첨가 속도가 증가하였다. pH가 약 14에 이르게 하는 10 N NaOH로 반응을 켄칭시키고 (그리고 이민-바이설파이트 부가물을 분해시키고), 혼합물을 MTBE로 추출하였다. 상 분리 후, (1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥스-2-엔이 MTBE 용액의 증류를 통해 72％ 수율로 단리되었다. CDCl3에서의 1H-NMR에 의한 분석 (실시예 10에서와 같음)으로 화합물 (1)의 이민 화합물 (2)로의 전환이 확증되었다. 실시예 4의 방법에 의한 키랄 GC 분석은 (1R,5S)-이민 거울상이성질체 (2)를 나타냈다. (1S,2R) 거울상이성질체는 검출되지 않았다.
실시예 15: (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴의 제조 (정적인 기질 양식).
100-㎖ 플라스크에 40 ㎖의 dH2O 및 1.8 ㎖의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산을 첨가하여, pH가 약 11.4인 균질 용액을 제공하였다. 이러한 용액에 2.7 g의 Na2S2O5를 첨가하여 균질 용액을 제공하고, 약 1 ㎖의 8 N NaOH로 pH를 약 7.5로 조정하였다. 이러한 용액에 60 ㎕의 안티폼-204 (시그마, 카탈로그 번호 A-6226), 120 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515), 및 10 ㎖의 100 mM pH 8.0 인산칼륨 완충제 내의 300 ㎎의 서열 8의 폴리펩티드의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 2의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하였다. 소결 유리를 통해 반응 혼합물 내로 약 10 ㎖/분의 속도로 공기를 스파징하고, 생성된 담황색 용액을 공기 중에서 24시간 동안 실온 (약 21℃)에서 24시간 동안 교반하였다. 전반적으로, 1 ㎕ 분량으로의 2.5 N NaOH의 피드백-제어 첨가에 의해 pH를 7.4로 유지시켰다. 24시간 후, 이제 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-설포네이트를 포함하는 반응 혼합물에 1.0 g (1.3 당량)의 NaCN를 첨가하였다. 실온 (약 21℃)에서 추가로 15분 동안 교반한 후, 혼합물을 MTBE로 추출하였다. (2-Me-THF가 또한 추출에 사용될 수 있다.) 상 분리 및 용매 제거 후, 1.78 g (90％ 수율)의 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴이 담황색 고체로서 단리되었다. CDCl3에서의 1H-NMR에 의한 분석으로 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴의 제조가 확증되었다
Figure pct00082
(1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-설포네이트를 포함하는 반응 혼합물이 이렇게 생산되고, 3.0 당량의 NaCN으로 실온에서 12시간 동안 처리되었을 때, 약 25％의 원치 않는 시스 입체이성질체 (1R,2R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴이 원하는 트랜스 (1R,2S,5S) 입체이성질체와 함께 혼합물에서 관찰되었다. CDCl3에서의 1H-NMR은 4.22 ppm에서의 이중선 (J=4.2)으로서 시스-아미노니트릴 메틴 양성자를 나타냈다.
실시예 16: (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴의 제조 (연속적인 기질 첨가 양식).
단계 1. 오버헤드 교반기 (300 rpm)가 장착된 실온 (약 21℃)의 500-㎖ 4목 플라스크에 150 ㎖의 Milli-Q 물 및 1.2 ㎖ (약 1.0 g 및 9 mmol)의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산을 첨가하여, pH 11.8의 균질 용액을 제공하였다. pH 7.5에 도달할 때까지 Na2S2O5를 분할식으로 첨가하였다. 무색 용액에 300 ㎕의 안티폼-204 (시그마 카탈로그 번호 A-6226) 및 600 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515)을 첨가하여, pH 7.5의 무색 용액을 제공하였다. 이러한 용액에 300 ㎎의 서열 12의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 3의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하여, 황색 용액을 제공하였다. 공기 스파징 프로브를 삽입하였고 (기류 속도 약 60 ㎖/분), 반응 혼합물의 pH가 즉시 강하되기 시작했다. 2 N NaOH의 피드백-제어 첨가를 통해 pH를 유지시켰다. 약 40분 후, pH가 안정적이었고, 추가적인 염기 첨가가 발생하지 않았다. 추가로 10분 후 (총 50분), 150 ㎖의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 NaHSO3 용액 (26.1 g의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 + 160 ㎖의 dH2O 및 pH 7.2에 도달하기에 충분한 Na2S2O5)을 0.12 ㎖/분의 속도로 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH가 즉시 강화되기 시작하였고, 2 N NaOH의 첨가가 재개되었다. 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산/NaHSO3 첨가를 약 21시간 후 완료하였다 (총 반응 시간 약 22시간). 기질 첨가가 완료된 후 염기 첨가가 증가된 속도로 계속되었다. 24시간 후, 1H NMR 분석에 의해 반응이 완료된 것으로 판단되었다.
단계 2. 24시간 후, 1H NMR 분석에 의해 반응이 완료된 것으로 판단되었고, 10.0 g의 NaCN (1.11 당량)을 반응 혼합물에 첨가하여, pH 9.9의 우윳빛 반응 혼합물을 제공하였다. 24시간 후, 1H NMR 분석에 의해 반응이 완료된 것으로 판단되었다. 30분 후, 반응물을 300 ㎖의 MTBE로 추출하였다. 하부의 수성 상을 배수시키고 (약 250 ㎖), 상부의 유기 층을 6 g (2" 직경 × ¼" 높이)의 셀라이트(Celite)®로 여과하였다. 셀라이트®을 300 ㎖의 MTBE로 헹구고, 셀라이트® 헹굼에서 사용된 MTBE를 사용하여 수성 상을 추출하였다. 유기 상들을 합치고, 40℃에서 1시간 동안 회전식 증발기를 사용하여 감압 하에 농축시켜, 백색 고체를 제공하였다. 백색 고체를 감압 하에 30분 동안 추가로 건조시켜, 23.9 g (95％ 수율)의 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴을 제공하였다.
실시예 17: 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산 메틸 에스테르의 제조
PCT 국제 출원 공보 WO 2007/075790에 기술된 절차에 의해, 실시예 16 또는 17에 따라 제조된 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴이 상응하는 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산 메틸 에스테르로 전환되었다.
실시예 18: (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴의 제조, 및 아미노니트릴의 트랜스/시스 비율에 대한 NaCN 등가물 및 반응 시간의 효과.
서열 8의 모노아민 옥시데이스 분말이 실시예 3의 방법에 의해 제조된 것을 제외하고는, 절차가 NaCN의 첨가까지 실시예 15의 절차와 동일하였다. 24시간 후, NaCN을 표 5에 제시된 바와 같이 반응 혼합물에 분할식으로 첨가하였다 (1.0 당량의 NaCN은 720 ㎎의 95％ NaCN이었다). 각각의 규정된 시간 간격 후, 200 ㎕의 분취량을 취하고, 1 ㎖의 CDCl3로 추출한 후, 1H-NMR에 의해 분석하였다. 아미노니트릴 메틴 양성자 공명의 1H-NMR 적분에 의해 트랜스/시스 비율 ((1R,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴의 원하는 2S 에피머와 원치 않는 2R 에피머 간의 비율)이 결정되었다 (트랜스 = 3.92 ppm에서의 이중선; 시스 = 4.22 ppm에서의 이중선).
Figure pct00083
최종 분취 후, 반응 혼합물을 100 ㎖의 에틸 아세테이트로 추출하고, 굵은 모래로 여과하여, 깨끗한 상 분리를 제공하였다. 20 ㎖의 헵탄을 유기 상에 첨가하였다. 40℃에서 1시간 동안 회전식 진공 증발에 의해 유기 상을 건조되도록 증발시켰다. 1H-NMR 분석은 트랜스/시스 비율이 여전히 12:1임을 가리켰다.
실시예 19; (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴의 제조; 공정 로버스트성(robustness)
단계 1. 오버헤드 교반기 (300 rpm)가 장착된 실온 (약 21℃)의 500-㎖ 4목 플라스크에 150 ㎖의 Milli-Q 물 및 1.2 ㎖ (약 1.0 g 및 9 mmol)의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산을 첨가하여, pH 11.8의 균질 용액을 제공하였다. pH 7.5에 도달할 때까지 Na2S2O5를 분할식으로 첨가하였다. 무색 용액에 300 ㎕의 안티폼-204 (시그마 카탈로그 번호 A-6226) 및 600 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515)을 첨가하여, pH 7.5의 무색 용액을 제공하였다. 이러한 용액에 300 ㎎의 서열 12의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 3의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하여, 황색 용액을 제공하였다. 공기 스파징 프로브를 삽입하였고 (기류 속도 약 60 ㎖/분), 반응 혼합물의 pH가 즉시 강하되기 시작했다. 2 N NaOH의 피드백-제어 첨가를 통해 pH를 유지시켰다. 약 40분 후, pH가 안정적이었고, 추가적인 염기 첨가가 발생하지 않았다. 추가로 10분 후 (총 50분), 150 ㎖의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 NaHSO3 용액 (26.1 g의 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산 + 160 ㎖의 dH2O 및 pH 7.2에 도달하기에 충분한 Na2S2O5)을 0.12 ㎖/분의 속도로 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH가 즉시 강화되기 시작하였고, 2 N NaOH의 첨가가 재개되었다. 6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산/NaHSO3 첨가를 약 21시간 후 완료하였다 (총 반응 시간 약 22시간). 기질 첨가가 완료된 후 염기 첨가가 증가된 속도로 계속되었다. 24시간 후, 1H NMR 분석에 의해 반응이 완료된 것으로 판단되었다.
단계 2. 24시간 후, 13.5 g의 NaCN (1.5 당량)을 반응 혼합물에 첨가하여, pH 9.9의 우윳빛 반응 혼합물을 제공하였다. 혼합물을 실온에서 15분 및 45분 동안 교반한 후, 200 ㎕ 분취량을 취했다. 분취량을 1 ㎖의 CDCl3로 추출하고, 추출물을 1H-NMR에 의해 분석하였다. 양쪽 시점에서, 시스-입체이성질체는 1H-NMR 검출 한계 미만이었다.
NaCN을 첨가하고 나서 약 60분 후, 반응물을 300 ㎖의 MTBE로 추출하였다. 하부의 수성 상을 배수시키고 (약 250 ㎖), 상부의 유기 층을 6 g (2" 직경 × ¼" 높이)의 셀라이트®로 여과하였다. 셀라이트®을 300 ㎖의 MTBE로 헹구고, 셀라이트® 헹굼에서 사용된 MTBE를 사용하여 수성 상을 추출하였다. 유기 상들을 합치고, 40℃에서 1시간 동안 회전식 진공 증발기를 사용하여 감압 하에 농축시켜, 백색 고체를 제공하였다. 백색 고체를 감압 하에 30분 동안 추가로 건조시켜, 22.5 g (90％ 수율)의 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴을 제공하였다. 시스 (2R) 에피머는 1H-NMR 검출 한계 미만이었다.
이러한 실시예는 실온에서, pH 9.9에서, 그리고 0.5 당량 과량의 시아나이드의 존재 하에 1시간 후에 이러한 아미노니트릴이 여전히 입체이성질체적으로 순수한 형태임을 실증한다.
실시예 20: (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴의 제조; 공정 로버스트성.
단계 1. 실시예 18의 단계 1과 절차가 동일하였다.
단계 2. 24시간 후, 11.0 g의 NaCN (1.22 당량)을 반응 혼합물에 첨가하여, pH 9.9의 우윳빛 반응 혼합물을 제공하였다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, 200 ㎕ 분취량을 취하고, 1 ㎖의 CDCl3로 추출하였다. 추출 용액의 1H-NMR 분석은 검출가능한 시스 2R 입체이성질체 없이, 트랜스 아미노니트릴인 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르보니트릴로의 완전한 전환을 가리켰다.
반응 혼합물을 실온에서 추가로 16시간 동안 교반하였다. 16시간 후의 1H NMR 분석은 약 15:1의 트랜스/시스 아미노니트릴 비율을 가리켰다 (아미노니트릴 메틴 양성자의 1H-NMR 적분에 의해 트랜스/시스 비율이 결정되었다: 트랜스 = 3.92 ppm에서의 이중선; 시스 = 4.22 ppm에서의 이중선 ).
실시예 21: 모노아민 옥시데이스가 정적인 공기 하에 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤의 (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤로의 탈대칭화를 촉매하였다.
공기 중의 50-㎖ 3목 플라스크에 25 ㎖의 100 mM pH 8.0 인산칼륨 완충제 및 375 ㎎의 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 하이드로클로라이드를 첨가한 후, 1 N NaOH를 첨가하여 pH를 약 7.5로 조정하였다. pH가 조정된 용액에 60 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515) 및 pH 8.0 인산칼륨 완충제 내의 150 ㎎의 서열 4의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 2의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하였다. 생성된 담황색 용액을 공기 중에서 24시간 동안 교반하였고, 이러한 시간 동안 1-5 ㎕ 분량으로의 1 N NaOH의 피드백-제어 첨가에 의해 pH를 7.4로 유지시켰다. pH가 약 14에 이르게 하는 10 N NaOH로 반응을 켄칭시키고, 생성물을 CDCl3 내로의 추출에 의해 단리하고, 1H-NMR에 의해 전환율을 분석하였으며, 이는 1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤의 형성을 나타냈다.
이러한 실시예에서 사용된 서열 4의 모노아민 옥시데이스를 고처리량 스크리닝에서 확인했을 때, 실시예 5의 키랄 GC 분석 방법은 이러한 효소가 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤을 원하는 (3aR,6aS)-이민 (4)로 산화시켰음을 나타냈다. (3aS,6aR) 거울상이성질체는 검출되지 않았다.
실시예 22: (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르보니트릴의 제조
공기 중의 50-㎖ 3목 플라스크에 25 ㎖의 100 mM pH 8.0 인산칼륨 완충제 및 400 ㎎의 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 하이드로클로라이드, 500 ㎎의 Na2S2O5를 첨가하고, 10 N NaOH로 pH를 약 7.5로 조정하였다. pH가 조정된 용액에 30 ㎕의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515) 및 pH 8.0 인산칼륨 완충제 내의 300 ㎎의 서열 10의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 2의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하였다. 생성된 담황색 용액을 공기 중에서 24시간 동안 교반하였고, 이러한 시간 동안 1-5 ㎕ 분량으로의 1 N NaOH의 피드백-제어 첨가에 의해 pH를 7.5로 유지시켰다. 48시간 동안 교반한 후, 300 ㎎의 NaCN을 반응 혼합물에 첨가하여 pH를 약 9.9로 상승시켰다. 실온 (약 21℃)에서 추가로 1시간 동안 교반한 후, 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 상 분리 및 용매 증발 후, 316 ㎎의 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르보니트릴이 단리되었다 (82％ 수율). 1H-NMR은 약 90％의 (1S,3aR,6aS)인 "트랜스" 및 약 10％의 (1R,3aR,6aS) 에피머인 "시스"를 나타냈다
Figure pct00084
실시예 23: (3aR,6aS)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로-시클로-펜타[c]-피롤, 화합물 (4), 및 이의 상응하는 이량체인 화합물 (5)의 제조 규모의 생산.
20℃의 재킷으로 덮여지고 300 rpm에서 교반되는 3 ℓ 3목 플라스크에 500 ㎖의 dH2O 및 20 ㎖의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액을 첨가하였다. 진한 H3PO4로 pH를 약 7.6으로 조정하여, 무색의 균질 용액을 제공하였다. 이러한 용액에 2.0 ㎖의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (시그마 알드리치; 카탈로그 번호 C-3515) 및 5.0 g의 서열 16의 폴리펩티드의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 3의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하여, 담황색 용액을 제공하였다. 용기의 헤드 공간에 약 0.2 ℓ/분의 건조 공기를 스위핑(sweeping)하였다. 380 ㎖이 첨가될 때까지 20-100 ㎕ 분량으로의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액의 피드백-제어 첨가에 의해 반응의 pH를 7.5로 유지시켰다. (중성 용액 내의 아민은 양성자화되고, 이민은 그렇지 않다. 반응에 의해 양성자가 방출되고, 이는 pH를 유지하기 위해 중성화되어야 한다. 이러한 실시예에서, 아민 자체가 pH-스탯을 위한 적정제로서 사용되는 염기이다.) 380 ㎖의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액이 첨가된 후, 반응 (초기의 5 g (45 mmol)의 기질에 상응)이 완료되도록 1 N NaOH의 피드백-제어 첨가에 의해 pH가 유지되었다. 추가적인 NaOH 소비가 관찰되지 않은 후, 슬러리의 분취량을 취하고, 여과하고, 고체를 공기-건조시켰다.
다양한 용매에 용해된 고체의 1H-NMR 스펙트럼은 용액 내의 다양한 비율의 이민 (3aR,6aS) 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 (4) 및 이의 이량체 (5)를 나타냈다. D6-DMSO에서의 1H-NMR (300 MHz)은 이량체를 나타냈고, 유리 이민은 검출되지 않았다
Figure pct00085
CDCl3에서의 1H-NMR (300 MHz)은 이민 및 이량체의 혼합물을 나타냈다
Figure pct00086
17％ D3PO4/D2O에서의 1H-NMR (300 MHz)은 양성자화된 이민 단량체만을 나타냈다
Figure pct00087
벌크(bulk) 반응 혼합물에 100 ㎖의 진한 HCl을 첨가하여 pH 약 0의 황색 현탁액을 제공하였다 (이량체를 양성자화된 이민으로 분해하기 위해). 황색 현탁액을 4℃에서 10분 동안 8000에서 원심분리하였다. 생성된 황색 상등액을 따라내고, 반응 용기로 돌려보냈다. 백색 페이스트 (원심분리에 의해 펠릿화됨)를 100 ㎖의 dH2O에 재현탁시키고, 여과지로 여과하였다. 잔류물을 dH2O (1 × 100 ㎖)로 헹궜다. (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤 하이드로클로라이드를 함유하는 이렇게 수득된 모든 산성 수용액들을 합치고, 아미노니트릴로의 시안화 반응에서 직접 사용하였다.
이러한 실시예에서 사용된 서열 16의 모노아민 옥시데이스를 고처리량 스크리닝에서 확인했을 때, 실시예 5의 키랄 GC 분석법은 이러한 효소가 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤을 원하는 (3aR,6aS)-이민 (4)로 산화시켰음을 나타냈다. (3aS,6aR) 거울상이성질체는 검출되지 않았다.
실시예 24: 모노아민 옥시데이스가 정적인 공기 또는 산소 하에 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤의 (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤 및 이의 상응하는 이량체로의 탈대칭화를 촉매하였다; 추출을 통한 생성물 단리.
20℃의 재킷으로 덮여지고 300 rpm에서 교반되는 3 ℓ 3목 플라스크에 500 ㎖의 dH2O 및 20 ㎖의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액을 첨가하였다. 진한 H3PO4로 pH를 약 7.6으로 조정하여, 무색의 균질 용액을 제공하였고, 여기에 2.0 ㎖의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (노보자임(Novozyme); "카탈리자임(Catalyzyme) 101") 및 5.0 g의 서열 16의 폴리펩티드의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 3의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하여, 담황색 용액을 제공하였다. 용기의 헤드 공간에 약 0.2 ℓ/분의 건조 공기를 스위핑하였다. 380 ㎖이 첨가될 때까지 20-100 ㎕ 분량으로의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액의 피드백-제어 첨가에 의해 반응물의 pH를 7.5로 유지시켰다. (중성 용액 내의 아민은 양성자화되고, 이민은 그렇지 않다. 반응에 의해 양성자가 방출되고, 이는 pH를 유지하기 위해 중성화되어야 한다. 이러한 실시예에서, 아민 자체가 pH-스탯을 위한 적정제로서 사용되는 염기이다.) 380 ㎖의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액이 첨가된 후, 반응 (초기의 5 g (45 mmol)의 기질에 상응)이 완료되도록 1 N NaOH의 첨가에 의해 pH가 유지되었다. 추가적인 NaOH 소비가 관찰되지 않은 후, 1800 ㎖의 MTBE를 비균질 반응 혼합물에 첨가하고 나서, 이를 45℃로 가열하였다. 셀라이트®로의 여과 후, 하부의 수성 상을 폐기하고, 상부의 유기 상을 10％ 시트르산으로 추출하고, (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤 하이드로클로라이드를 함유하는 산성 수용액을 실시예 29의 방법에 따른 (1R,2S,5S)-6,6-디메틸-3-아자바이시클로[3.1.0]헥산-2-카르복실산의 제조에서 직접 사용하였다.
실시예 25: (3aR,6aS) 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤, 화합물 (3)의 이량체의 제조 규모의 생산
공기 중의 30℃의 재킷으로 덮여지고 300 rpm에서 교반되는 500 ㎖ 3목 플라스크에 100 ㎖의 dH2O 및 2.0 ㎖의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액 (0.5 g의 기질)을 첨가하였다. 진한 H3PO4로 pH를 약 7.8로 조정하여, 무색의 균질 용액을 제공하였다. 이러한 용액에 0.2 ㎖의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (노보자임; "카탈리자임 101") 및 0.25 g의 서열 36의 폴리펩티드의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 3의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하였다. 반응물의 pH가 즉시 강하하기 시작했고, pH를 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액의 피드백-제어 첨가에 의해 pH 7.7로 유지시켰다. 2시간 후, 추가적인 0.25 g의 모노아민 옥시데이스 분말을 첨가하였다. (3aR,6aS) 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤의 이량체가 반응물로부터 침전하기 시작하였고, 실험 기간 동안 반응 혼합물이 백색 슬러리가 되었다. 추가적인 2시간 후 (총 4시간), 헤드 공간에 약 0.6 ㎖/분의 산소를 스위핑하였고, 실험 기간 동안 산소 스위핑을 유지하였다. 24시간의 총 반응 시간 후, 추가적인 0.5 g의 모노아민 옥시데이스를 첨가하였다. 48.5시간의 총 반응 시간 후, 총 32.3 ㎖의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액이 첨가되었다 (총 반응 기질은 8.58 g이었다). 반응 혼합물을 짧은 경로의 증류 헤드가 장착된 500 ㎖ 1목 플라스크로 옮기고, 기구를 가열 맨틀(mantle) 내에 놓았다. 가열 맨틀을 160℃로 가열했을 때, 얼음 욕조에 담궈진 수집(receiving) 플라스크로 이량체가 증기 증류되기 시작하였다. 증기 상의 온도는 약 96℃였다. 약 30분 후, 반응량의 약 1/2이 증류되었고, 증기 상의 온도는 약 98℃였다. 이러한 시점에 증류를 정지시켰다. 수집 플라스크 내의 물 내의 백색 고체의 현탁액을 조립(coarse) 소결 깔때기로 여과하고, 백색 고체를 2시간 동안 공기 건조시켜, 7.17 g (84％ 수율)의 (3aR,6aS) 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤의 이량체를 제공하였다.
실시예 26: 모노아민 옥시데이스가 정적 공기 하에 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤의 (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤 및 이의 상응하는 이량체로의 탈대칭화를 촉매하였다; 증기 증류를 통한 생성물 분리
20℃의 재킷으로 덮여지고 300 rpm에서 교반되는 3 ℓ 3목 플라스크에 500 ㎖의 dH2O 및 20 ㎖의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액을 첨가하였다. 진한 H3PO4로 pH를 약 7.6으로 조정하여, 무색의 균질 용액을 제공하였고, 여기에 2.0 ㎖의 아스페르길루스 니게르 카탈레이스 현탁액 (노보자임; "카탈리자임 101") 및 5.0 g의 서열 16의 폴리펩티드의 모노아민 옥시데이스 분말 (실시예 3의 방법에 의해 제조됨)을 첨가하여, 담황색 용액을 제공하였다. 용기의 헤드 공간에 약 0.2 ℓ/분의 건조 공기를 스위핑하였다. 20-100 ㎕ 분량으로의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액의 피드백-제어 첨가에 의해 반응물의 pH를 7.5로 유지시켰다. (3aR,6aS) 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤의 이량체가 반응물로부터 침전되었고, 반응 혼합물이 백색 슬러리가 되었다. 380 ㎖의 물 내의 25 중량％ 옥타하이드로시클로펜타[c]피롤 용액이 첨가된 후, 생성물이 반응 혼합물로부터 증기 증류를 통해 분리되었다 (증류기 헤드 온도 약 98℃). 수집기 용기는 물 내의 (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤의 이량체의 현탁액을 함유하였다. 1.1-1.2 당량의 진한 HCl을 수집기 용기에 첨가하여 이량체를 분해하고, 물 내의 (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤 하이드로클로라이드의 균질 용액을 제공하였다. 이러한 용액을 실시예 27에서 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르보니트릴을 제조하는데 직접 사용하였다.
실시예 27: (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르보니트릴의 제조
실시예 26에서 제조된 (3aS,6aR)-1,3a,4,5,6,6a-헥사하이드로시클로펜타[c]피롤 하이드로클로라이드의 산성 수용액을 0℃로 냉각하고, 300 rpm에서 교반하였다. 냉각된 0℃ 용액에 100 ㎖의 dH2O 내의 50 g NaCN을 3 ㎖/분으로 첨가하였다. (시아나이드에 의한 하이드로클로라이드 염 용액의 중화로 HCN이 원위치에서 생성되었다). NaCN 첨가를 시작하고 나서 2시간 후, 1000 ㎖의 톨루엔 (얼음 욕조에서 미리 냉각됨)을 첨가하여 2상 혼합물을 제공하고, 여기에 수성 상의 pH가 9.8에 도달할 때까지 K2CO3의 포화 용액을 10 ㎖/분의 속도로 첨가하였다. 그후, 하부의 수성 상을 캐뉼러를 사용하여 제거하고, 표백제 (잔존하는 시아나이드를 파괴하기 위해)로 처리한 후 처분하였다. 상부의 유기 현탁액/에멀션을 실온 (약 21℃)에서 약 15분에 걸쳐 셀라이트® 545의 20 g 베드(bed) (약 ¼" 높이 × 약 3" 직경)로 여과하여, 약 100 ㎖의 "래그(rag) 상" (상부의 유기 상과 하부의 수성 상 사이에 배치된 중간체 층)과 함께 약 1000 ㎖의 무색 유기 상 및 약 300 ㎖의 황색 수성 상을 제공하였다. 셀라이트® 패드(pad)를 톨루엔 2 × 100 ㎖으로 헹궜다. 용액들을 분리용 깔때기에서 합치고, 수성 상 및 래그 층을 배수시키고, 처분용 표백제로 처리하였다. 유기 상으로부터 분취량의 유기 상을 취하고, 건조되도록 증발시켰다. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) 분석은 약 30:1 비율로 존재하는 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르보니트릴 ("트랜스") 및 이의 1R 에피머 ("시스")를 나타냈다
Figure pct00088
유기 상을 약 0℃로 냉각하고, 250 ㎖의 진한 HCl (얼음 욕조에서 미리 냉각됨)로 2회 추출한 후, 깨끗하고 즉각적인 상 분할이 발생하였다. (추출이 발열성이기 때문에 추출 용액을 미리 냉각하는 것이 필요하였다. 용액의 온도가 약 4℃에서 대략 실온으로 상승되었다). (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르보니트릴 하이드로클로라이드를 함유하는 합쳐진 진한 HCl 추출물들 (총 약 600 ㎖)을 합치고, 실시예 28에서 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 하이드로클로라이드를 제조하는데 직접 사용하였다.
6.1 실시예 28: (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 하이드로클로라이드의 제조.
실시예 27로부터의 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르보니트릴 하이드로클로라이드 용액을 24시간 동안 가열하여 환류시킨 후, 약 300 ㎖의 물/HCl을 증류시키고, 나머지 용액을 약 50-60℃로 냉각하였다. 따뜻한 용액에 500 ㎖의 톨루엔을 첨가하고, 나머지 물 (약 100-120 ㎖)을 톨루엔 공비물로서 증류시켰다. 모든 물이 제거된 후, 생성된 갈색 고체 및 담황색 톨루엔의 중질(heavy) 슬러리 현탁액을 실온 (약 21℃)으로 냉각하였다. 고체를 필터 깔때기 상에서 수집하고, 톨루엔 (2 × 200 ㎖)으로 헹궜다. 황갈색 고체를 2시간 동안 공기 건조시키고, 추가로 진공 하에 하룻밤 동안 건조시켜, 159 g (옥타하이드로시클로펜타[c]피롤로부터 72％의 총괄 수율)의 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 하이드로클로라이드를 NH4Cl 공동-생성물과의 1:1 부가혼합물로 제공하였다.
D2O에 용해된 염 부가혼합물의 1H-NMR은 약 17:1의 트랜스/시스 (1S/1R) 비율을 나타냈다.
Figure pct00089
6.2 실시예 29: (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 하이드로클로라이드로부터의 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 t-부틸 에스테르 옥살산 1:1 염의 제조.
단계 1: 자기 교반 막대가 설비된 1650 ㎖의 벽이 두꺼운 유리 내압병 (Ace Glass, Inc., 8648-157)에 75 g (306.9 mmol)의 실시예 28에서 제조된 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 하이드로클로라이드/염화암모늄 부가혼합물, 375 ㎖ 디클로로메탄, 및 497 ㎖ t-부틸 아세테이트를 충전하였다. 생성된 혼합물을 대형 응집물이 분해되도록 주위온도 (약 21℃)에서 격렬하게 교반하여, 자유-교반 현탁액을 제공하였다. 이러한 현탁액을 염수-얼음 욕조를 사용하여 0℃의 내부 온도로 냉각하고, 75.4 ㎖ (1162 mmol)의 메탄설폰산을 15분에 걸쳐 적가하였고, 이러한 시간 동안 내부 온도가 5℃로 상승하였다. 내압병을 밀봉하고, 반응 혼합물을 18시간에 걸쳐 격렬하게 교반하면서 주위 온도 (약 21℃)로 가온되도록 하였으며, 이러한 시간 동안 반응 혼합물이 호박색 용액 내의 백색 무기 염의 현탁액이 되었다. 혼합물을 얼음 욕조에서 냉각하고, 내압병을 조심스럽게 배기시키고, 뚜껑을 벗겼다. 혼합물을 3 ℓ 플라스크로 옮기고, 교반하면서 얼음 욕조에서 냉각하였다. 혼합물의 온도를 20℃ 미만으로 유지하면서 400 ㎖의 물 내의 50％ (wt:wt) NaOH를 35분에 걸쳐 혼합물에 첨가하였다. 교반을 멈추고, 상들이 분리되도록 하였다. 유기 상 (약 850 ㎖)을 별도의 용기로 제거하였다. 나머지 수성 상 및 래그 층 (pH 13, 약 800 ㎖)을 375 ㎖ 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 상들을 합치고 (약 1250 ㎖), 물 (2 × 225 ㎖)로 세정하였다. 생성된 유기 상을 여과하여 래그 층 및 임의의 불용성 물질을 제거하고, 회전식 진공 증발에 의해 용매를 제거하여 48.3 g의 진한 호박색 오일을 제공하였다. 오일의 1H NMR 스펙트럼은 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 t-부틸 에스테르를 나타냈다.
동일한 절차를 따라 산출된 제2 제제는 50.6 g의 트랜스-(1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 t-부틸 에스테르 오일이었다.
단계 2: 단계 1에 따른 2개의 제제로부터의 97.9 g (463.3 mmol)의 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 t-부틸 에스테르를 750 ㎖ t-부틸 아세테이트에 용해시키고, 오버헤드 기계적 교반기, 온도계, 첨가 깔때기 및 환류 응축기가 설비된 3 ℓ 4목 플라스크에 충전하였다. 주위 온도 (약 21℃)에서 교반하면서, 750 ㎖ 2-프로판올 내의 44.0 g (488.6 mmol)의 옥살산의 용액을 37분에 걸쳐 적가하여, 혼합물의 온도를 31℃로 증가시켰다. 약 50 ㎖의 옥살산 용액의 첨가 후 고체가 침전되기 시작하였고, 450 ㎖의 첨가 후 진한 현탁액이 초래되었다. 500 ㎖의 옥살레이트 용액의 첨가 후, 침전된 고체가 다시 용해되어 진황색 용액이 제공되었다. 600 ㎖의 옥살산 용액의 첨가 후 고체가 다시 급속히 침전되었고, 옥살산 첨가 말기까지 지속되었다. 그후, 이러한 현탁액을 78℃로 가열하여 묽은 현탁액을 제공하였고, 이를 교반하면서 주위 온도 (약 21℃)로 소극적으로 냉각되도록 하였다. 냉각이 시작되고 나서 16시간 후, 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 연속적으로 이소프로판올 (450 ㎖), 이소프로필 아세테이트 (450 ㎖), 및 메틸 t-부틸 메틸 에테르 (450 ㎖)로 세정하였다. 고체를 진공 오븐 (30℃, 25" 진공, N2 기류)에서 건조시켜, 118.1 g의 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 t-부틸 에스테르 옥살산 1:1 염 ((1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 하이드로클로라이드로부터 64％ 수율)을 조밀한 황갈색의 자유 유동 분말 (GC 분석에 의한 99.7％ 순도)로서 제공하였고, 이는 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 t-부틸 에스테르 옥살산 (1:1) 염에 대한 예상된 1H-NMR 스펙트럼을 나타냈다.
(1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 t-부틸 에스테르 옥살산 (1:1) 염의 재결정화: 상기 단계 2로부터의 황갈색 분말 (118.1 g, 391.9 mmol) 및 이소프로판올 (1950 ㎖)을 기계적 교반기, 온도계 및 환류 응축기가 설비된 3 ℓ 4목 플라스크에 충전하였다. 현탁액을 교반하고, 염이 완전히 용해되도록 74℃로 가열하여, 황색 용액이 생성되었다. 교반 속도를 느리게 하고, 용액이 주위 온도 (약 21℃)로 소극적으로 냉각되도록 하였다. 냉각이 시작되고 나서 20시간 후, 침전된 고체를 여과에 의해 수집하고, 연속적으로 이소프로판올 (1 ℓ), 이소프로필 아세테이트 (1 ℓ), 및 메틸 t-부틸 메틸 에테르 (1 ℓ)로 세정하였다. 고체를 진공 오븐 (40℃, 28" 진공, N2 기류)에서 건조시켜, 110.45 g의 (1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 t-부틸 에스테르 옥살산 1:1 염 ((1S,3aR,6aS)-옥타하이드로시클로펜타[c]피롤-1-카르복실산 하이드로클로라이드)로부터 59.7％ 수율)을 미세한 회백색 침상 물질 (GC 분석에 의한 99.9％ 순도)로서 제공하였다. 키랄 GC 분석은 원하는 (1S,3aR,6aS)-입체이성질체만 나타냈다. 이의 (2S)-에피머는 검출되지 않았다.
본 개시내용에서 인용된 모든 특허, 특허 공보, 저널 및 기타 참고문헌은 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Mijts, Benjamin Muley, Sheela Liang, Jack Newman, Lisa M. Zhang, Xiyun Lalonde, James Clay, Michael D. Zhu, Jun Gruber, John M. Colbeck, Jeffrey Munger, John D., Jr. Mavinhalli, Jagadeesh Sheldon, Roger <120> BIOCATALYTIC PROCESSES FOR THE PREPARATION OF SUBSTANTIALLY STEREOMERICALLY PURE FUSED BICYCLIC PROLINE COMPOUNDS <130> CX2-020WO1 <150> 61/075,243 <151> 2008-06-24 <160> 36 <210> 1 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspergillus Niger monoamine oxidase (MAON) <400> 1 atgaccagcc gcgacggcta tcagtggacc ccggaaacgg gtctgaccca gggcgtaccg 60 tccctgggtg tcatttcgcc gccgactaac atcgaagata ccgataagga cgggccttgg 120 gatgtcattg tcattggggg cgggtattgt gggctgaccg caacccgtga tttaaccgtc 180 gcagggttca agacgctgct gctggaggcc cgtgatcgta ttggtggccg ctcctggagc 240 agtaatattg acggttaccc gtatgagatg ggtggcactt gggttcattg gcatcaatct 300 cacgtgtggc gtgaaatcac gcgttataaa atgcacaacg cgctgtctcc atcatttaac 360 ttttcacgtg gcgtgaatca cttccaactg cgtaccaatc cgaccaccag tacgtacatg 420 acgcacgaag cggaggatga actgctgcgt agcgcattgc ataaattcac caatgtcgac 480 ggcactaatg gccgtacagt gttgccgttc ccacatgata tgttttatgt gccggaattt 540 cgcaagtatg acgaaatgtc atattccgaa cgcattgacc agatccgcga cgaactgtct 600 ttgaacgaac gctctagttt agaggctttc attttattat gtagcggtgg caccctggaa 660 aactccagct ttggtgaatt tctgcattgg tgggcaatgt cgggttacac gtatcagggc 720 tgtatggatt gtttaatctc ctataaattt aaggatggcc agagtgcgtt cgcgcgtcgc 780 ttctgggaag aagccgctgg cactggccgt ctgggctatg tctttggttg tccggtgcgt 840 tctgtggtga acgaacgcga cgcagcacgt gttaccgcac gtgacggtcg cgaattcgca 900 gcgaaacgtt tggtttgcac gattccgctg aacgtattga gtactattca gtttagccca 960 gcactgtcca cggaacgcat ctccgctatg caggcaggcc atgttaacat gtgcaccaaa 1020 gtgcatgcgg aagtcgataa taaggatatg cgttcatgga cgggtatcgc ctatccgttc 1080 aacaaattat gctacgctat cggcgatggc acgaccccag cgggtaatac gcatctggtg 1140 tgcttcggga cagacgcgaa tcatatccag ccggacgagg acgtgcgcga aacgttgaaa 1200 gccgttggcc aactggcgcc tgggactttc ggtgtcaaac gtctggtctt ccacaactgg 1260 gtaaaggatg aatttgccaa aggcgcgtgg ttcttcagcc gcccaggcat ggtttcagag 1320 tgcctgcagg gtctgcgcga gaaacaccgt ggtgtcgtgt ttgcaaactc cgattgggcc 1380 ttaggttggc gtagttttat cgatggtgct atcgaggagg gcacccgcgc agcgcgtgtt 1440 gtactggagg aactggggac caagcgcgag gtgaaggccc gcctg 1485 <210> 2 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspergillus Niger monoamine oxidase (MAON) <400> 2 Met Thr Ser Arg Asp Gly Tyr Gln Trp Thr Pro Glu Thr Gly Leu Thr 1 5 10 15 Gln Gly Val Pro Ser Leu Gly Val Ile Ser Pro Pro Thr Asn Ile Glu 20 25 30 Asp Thr Asp Lys Asp Gly Pro Trp Asp Val Ile Val Ile Gly Gly Gly 35 40 45 Tyr Cys Gly Leu Thr Ala Thr Arg Asp Leu Thr Val Ala Gly Phe Lys 50 55 60 Thr Leu Leu Leu Glu Ala Arg Asp Arg Ile Gly Gly Arg Ser Trp Ser 65 70 75 80 Ser Asn Ile Asp Gly Tyr Pro Tyr Glu Met Gly Gly Thr Trp Val His 85 90 95 Trp His Gln Ser His Val Trp Arg Glu Ile Thr Arg Tyr Lys Met His 100 105 110 Asn Ala Leu Ser Pro Ser Phe Asn Phe Ser Arg Gly Val Asn His Phe 115 120 125 Gln Leu Arg Thr Asn Pro Thr Thr Ser Thr Tyr Met Thr His Glu Ala 130 135 140 Glu Asp Glu Leu Leu Arg Ser Ala Leu His Lys Phe Thr Asn Val Asp 145 150 155 160 Gly Thr 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agggatgctt ggcgcccatg ccgagtgcga ggaacgggat 180 gcgttttttg atttcgccat gcacagtcag cgtatgtacc gaggtcttgg agaggagcta 240 tttgcattat ccggtatcga tattagaagg catgatggcg gtatgtttaa gcttgcattc 300 tccgaagaag acgtgtcacg cctcagacgg atggacgatt tggattctgt cagctggcat 360 acaaaagaag aagtgctgga aaaagagccg tatacggcca gtgagattta cggggcgagc 420 tttattcagg atgatgttca tgttgagcct tattttgtat gcaaggcata cgctaaatcg 480 gctaaagcgc ttggtgcgga tatttttgag catactcctg ttctcgatgt gacatgtggc 540 ggtgaatcca ttttggtcaa aacagcgtcc ggtgacatgc atgcggatca tgtcgtggtt 600 gccagcgggg tctggagcgg gatgtttttt aagcagctcg ggctgaatca gtcatttttt 660 cctgtaaaag gagagtgcct gtctgtttgg aatgatgaca ttccgctgac aaaaacactt 720 tatcatgatc attgctatat cgtaccgaga aaaagcggca gactggttgt cggcgcgacg 780 atgaagcctg gtgactggag cgagaaggcg gatcttggcg gacttcagtc ggttatggaa 840 aaagcgaaaa cgatgctgcc ggcgattcag aatatgaagg ttgatcgttt ttgggcggga 900 ctgcgtccgg ggacaaagga cggaaagcca tacattggca agcaccctca ggacagccgc 960 attttatttg cggcgggcca tttcagaaac 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Val His Phe Ser Pro Pro Leu 305 310 315 320 Ser Pro Gln Arg Met Ala Ala Ala Asn Ile Gly His Val Asn Gln Cys 325 330 335 Val Lys Val His Ala Glu Val Ser Cys Pro Asp Met Arg Ser Trp Ser 340 345 350 Gly Ile Ser Tyr Pro Phe Asn Lys Leu Ala Tyr Ala Ile Gly Asp Gly 355 360 365 Thr Thr Pro Ala Gly Asn Thr His Ile Val Cys Phe Gly Gly Ala His 370 375 380 Asn His Ile Gln Pro Glu Glu Asp Val Glu Ala Thr Lys Met Ala Val 385 390 395 400 Glu Asn Met Ser Pro Gly Asn Met Asp Ile Lys Arg Leu Val Phe His 405 410 415 Asn Trp Cys Lys Asp Glu Phe Ala Lys Gly Ala Trp Phe Phe Ala Pro 420 425 430 Pro Gln Leu Leu Ser Lys Ser Leu Asp Glu Leu Arg Cys Arg His Gly 435 440 445 Asn Val Leu Phe Ala Asn Ser Asp Trp Ala Val Gly Trp Arg Ser Phe 450 455 460 Ile Asp Gly Ala Ile Glu Glu Gly Thr Arg Ala Ala Val Thr Val Ile 465 470 475 480 Glu Glu Leu Arg Pro Ala Pro Ala Val Arg Ser His Leu 485 490 <210> 33 <211> 1476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> monoamine oxidase MAO-4 <400> 33 atgaccagcc gcgacggcta tcagtggacc gcggaaacgg gtctggtcca gggcgtaccg 60 tccattagtg tcatttcgcc gccgactaac atcagccctg aaagtcgtca gtatgatgtc 120 gttgtcgttg gggccgggta ttctgggctg accgcagccc gtgatacatg cctggcaggg 180 ttgaaggtgc tgctgctgga ggcccgtgat cgtattggtg gccgctcctg gagcagtgat 240 attggcggtt acccgtttga gatgggtggc acttgggttc attggggtca acctcacgtg 300 tggcgtgaaa tctcgcgtta tcaaatgcgc aacgagctgg aatcatcatt tgacttttca 360 cgtggcgtga atcacttcga actgcgtacc aatcagggcc ctgcgatcat gtcgcacaaa 420 gaggaggatg aactgctggc tgccgcattg cataaattcg tcgatgtcga cggcgatctg 480 ggccgtcgtg cggtgccgtt cccacatgat tcgtttcatg tgccggaagc tcgccagtat 540 gaccaaatgt cagctaaaga tcgcatgacc cagatcgccg acacagtgtc tccgcgcgaa 600 cgcgctgctt tagagtcttt cgttttatta tgtagcggtg gcaccctggc aaccaccagc 660 ttttttgaat ttctgcattg gtgggcactg tgcggttact cgtatcaggg ctgtctggat 720 gctttaatct cctataaatt taagcgtggc cagagttcgt tcgcgctgcg cttctttcgt 780 gaagccctga gcactggcaa tctgagctat gcctttaatt ctccgattca gtctattgat 840 gaccaaggcg ccaaagtagt tgttaccaca cgtgaaggtc accgttacgc aggggcacgt 900 ttgattagca cgattccgct gaacgtattg aatactgtta cgattagccc accactgggc 960 acgcaacgca ccgccgctgc gaacacaggc catgttaacc agtgcgtcaa agtgcatgcg 1020 gaaatcgcta gtcgtgatat gcgttcatgg acgggtatct cctatccgtt caacaaatta 1080 tgctacgcta tcggcgatgg cacgacccca gcgggtaata cgcatattgt gtgcttcggg 1140 gggagccata atcatatcca gccggaagag gacattaaac aaacgaagac agccgttgaa 1200 tcactgtcgc ctgggaatat ggatatcaaa cgtctggtct tccacaactg gtcaaaggat 1260 gaatttgcca aaggcgcgtg gttcttcagc cctccagaaa tgctgtcaac gagcctggag 1320 gctctgcgca gccgtcacgg taatgtcgtg ttggcaaact ccgattgggc cttaggttgg 1380 cgtagtttta tcgatggtgc tatcgaggag ggcacccgcg cagcgatgac tgtagtggag 1440 gaactgcgtc ctcagcctgc ggtgcgtgaa cacctg 1476 <210> 34 <211> 492 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monoamine oxidase MAO-4 <400> 34 Met Thr Ser Arg Asp Gly Tyr Gln Trp Thr Ala Glu Thr Gly Leu Val 1 5 10 15 Gln Gly Val Pro Ser Ile Ser Val Ile Ser Pro Pro Thr Asn Ile Ser 20 25 30 Pro Glu Ser Arg Gln Tyr Asp Val Val Val Val Gly Ala Gly Tyr Ser 35 40 45 Gly Leu Thr Ala Ala Arg Asp Thr Cys Leu Ala Gly Leu Lys Val Leu 50 55 60 Leu Leu Glu Ala Arg Asp Arg Ile Gly Gly Arg Ser Trp Ser Ser Asp 65 70 75 80 Ile Gly Gly Tyr Pro Phe Glu Met Gly Gly Thr Trp Val His Trp Gly 85 90 95 Gln Pro His Val Trp Arg Glu Ile Ser Arg Tyr Gln Met Arg Asn Glu 100 105 110 Leu Glu Ser Ser Phe Asp Phe Ser Arg Gly Val Asn His Phe Glu Leu 115 120 125 Arg Thr Asn Gln Gly Pro Ala Ile Met Ser His Lys Glu Glu Asp Glu 130 135 140 Leu Leu Ala Ala Ala Leu His Lys Phe Val Asp Val Asp Gly Asp Leu 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Val Pro Phe Pro His Asp Ser Phe His Val Pro Glu 165 170 175 Ala Arg Gln Tyr Asp Gln Met Ser Ala Lys Asp Arg Met Thr Gln Ile 180 185 190 Ala Asp Thr Val Ser Pro Arg Glu Arg Ala Ala Leu Glu Ser Phe Val 195 200 205 Leu Leu Cys Ser Gly Gly Thr Leu Ala Thr Thr Ser Phe Phe Glu Phe 210 215 220 Leu His Trp Trp Ala Leu Cys Gly Tyr Ser Tyr Gln Gly Cys Leu Asp 225 230 235 240 Ala Leu Ile Ser Tyr Lys Phe Lys Arg Gly Gln Ser Ser Phe Ala Leu 245 250 255 Arg Phe Phe Arg Glu Ala Leu Ser Thr Gly Asn Leu Ser Tyr Ala Phe 260 265 270 Asn Ser Pro Ile Gln Ser Ile Asp Asp Gln Gly Ala Lys Val Val Val 275 280 285 Thr Thr Arg Glu Gly His Arg Tyr Ala Gly Ala Arg Leu Ile Ser Thr 290 295 300 Ile Pro Leu Asn Val Leu Asn Thr Val Thr Ile Ser Pro Pro Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gln Arg Thr Ala Ala Ala Asn Thr Gly His Val Asn Gln Cys Val 325 330 335 Lys Val His Ala Glu Ile Ala Ser Arg Asp Met Arg Ser Trp Thr Gly 340 345 350 Ile Ser Tyr Pro Phe Asn Lys Leu Cys Tyr Ala Ile Gly Asp Gly Thr 355 360 365 Thr Pro Ala Gly Asn Thr His Ile Val Cys Phe Gly Gly Ser His Asn 370 375 380 His Ile Gln Pro Glu Glu Asp Ile Lys Gln Thr Lys Thr Ala Val Glu 385 390 395 400 Ser Leu Ser Pro Gly Asn Met Asp Ile Lys Arg Leu Val Phe His Asn 405 410 415 Trp Ser Lys Asp Glu Phe Ala Lys Gly Ala Trp Phe Phe Ser Pro Pro 420 425 430 Glu Met Leu Ser Thr Ser Leu Glu Ala Leu Arg Ser Arg His Gly Asn 435 440 445 Val Val Leu Ala Asn Ser Asp Trp Ala Leu Gly Trp Arg Ser Phe Ile 450 455 460 Asp Gly Ala Ile Glu Glu Gly Thr Arg Ala Ala Met Thr Val Val Glu 465 470 475 480 Glu Leu Arg Pro Gln Pro Ala Val Arg Glu His Leu 485 490 <210> 35 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variant monoamine oxidase <400> 35 atgaccagcc gcgacggtta tcagtggacc ccggaaacgg gtctgaccca gggcgtaccg 60 tccctgggtg tcatttcgcc gccgactaac atcgaagata ccgataagga cgggccttgg 120 gatgtcattg tcattggggg cgggtattgt gggctgaccg caacccgtga tttaaccgtc 180 gcagggttca agacgctgct gctggaggcc cgtgatcgta ttggtggccg ctcctggagc 240 agtaatattg acggttaccc gtatgagatg ggtggcactt gggttcattg gcatgaatct 300 cacgtgtggc gtgaaatcac gcgttataaa atgcacaacg cgctgtctcc atcatttaac 360 ttttcacgtg gcgtgaatca cttccaactg cgtaccaatc cgcagaccag tacgtacatg 420 acgcacgaag cggaggatga actgctgcgt agcgcattgc ataaattcac caatgtcgac 480 ggcactaatg gccgtacagt gttgccgttc ccacatgata tgttttatgt gccggaattt 540 cgcaagtatg acgaaatgtc atattccgaa cgcattgacc agatccgcga cgaactgtct 600 ttgaacgaac gctctagttt agaggctttc attttattat gtagcggtgg caccctggaa 660 aactccagct ttggtgaatt tctgcattgg tgggcaatgt cgggttacac gtatcagggc 720 tgtatggatt gtttaatctc ctataaattt aaggatggcc agagtgcgtt cgcgcgtcgc 780 ttctgggaag aagccgctgg cactggccgt ctgggttatg tctttggttg tccggtgcgt 840 tctgtggtgg atgaacgcga cgcagtacgt gttaccgcac gtgacggtcg cgaattcgca 900 gcgaaacgtt tggtttgcac gattccgctg aacgtattga gttctgttca gtttagccca 960 ccactgtccc cgcaacgcat ggccgctgcg aacattggcc atgttaacca gtgcgtcaaa 1020 gtgcatgcgg aagtcagttg tccggatatg cgttcatggt cgggtgtgtc ctatccgttc 1080 aacaaattag cctacgctat cggcgatggc acgaccccag cgggtaatac gcatattgtg 1140 tgcttcgggg gcgctcataa tcatatccag ccggaagagg acgtggaagc aacgaagatg 1200 gccgttgaaa acatgtcgcc tgggaatatg gatatcaaac gtctggtctt ccacaactgg 1260 tgcaaggatg aatttgccaa aggcgcttgg ttcttcgccc ctccacagct gctgtcaaag 1320 agcctggatg aactgcgctg ccgtcacggt aatgtcctgt ttgcaaactc cgattgggcc 1380 ttaggttggc gtggttttat tgatggtgct atcgaggagg gcacccgcgc agcggttact 1440 gtaattgagg aactgcgtcc tgcgcctgcg gtgcgttccc acctgtaatg a 1491 <210> 36 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant monoamine oxidase <400> 36 Met Thr Ser Arg Asp Gly Tyr Gln Trp Thr Pro Glu Thr Gly Leu Thr 1 5 10 15 Gln Gly Val Pro Ser Leu Gly Val Ile Ser Pro Pro Thr Asn Ile Glu 20 25 30 Asp Thr Asp Lys Asp Gly Pro Trp Asp Val Ile Val Ile Gly Gly Gly 35 40 45 Tyr Cys Gly Leu Thr Ala Thr Arg Asp Leu Thr Val Ala Gly Phe Lys 50 55 60 Thr Leu Leu Leu Glu Ala Arg Asp Arg Ile Gly Gly Arg Ser Trp Ser 65 70 75 80 Ser Asn Ile Asp Gly Tyr Pro Tyr Glu Met Gly Gly Thr Trp Val His 85 90 95 Trp His Glu Ser His Val Trp Arg Glu Ile Thr Arg Tyr Lys Met His 100 105 110 Asn Ala Leu Ser Pro Ser Phe Asn Phe Ser Arg Gly Val Asn His Phe 115 120 125 Gln Leu Arg Thr Asn Pro Gln Thr Ser Thr Tyr Met Thr His Glu Ala 130 135 140 Glu Asp Glu Leu Leu Arg Ser Ala Leu His Lys Phe Thr Asn Val Asp 145 150 155 160 Gly Thr Asn Gly Arg Thr Val Leu Pro Phe Pro His Asp Met Phe Tyr 165 170 175 Val Pro Glu Phe Arg Lys Tyr Asp Glu Met Ser Tyr Ser Glu Arg Ile 180 185 190 Asp Gln Ile Arg Asp Glu Leu Ser Leu Asn Glu Arg Ser Ser Leu Glu 195 200 205 Ala Phe Ile Leu Leu Cys Ser Gly Gly Thr Leu Glu Asn Ser Ser Phe 210 215 220 Gly Glu Phe Leu His Trp Trp Ala Met Ser Gly Tyr Thr Tyr Gln Gly 225 230 235 240 Cys Met Asp Cys Leu Ile Ser Tyr Lys Phe Lys Asp Gly Gln Ser Ala 245 250 255 Phe Ala Arg Arg Phe Trp Glu Glu Ala Ala Gly Thr Gly Arg Leu Gly 260 265 270 Tyr Val Phe Gly Cys Pro Val Arg Ser Val Val Asp Glu Arg Asp Ala 275 280 285 Val Arg Val Thr Ala Arg Asp Gly Arg Glu Phe Ala Ala Lys Arg Leu 290 295 300 Val Cys Thr Ile Pro Leu Asn Val Leu Ser Ser Val Gln Phe Ser Pro 305 310 315 320 Pro Leu Ser Pro Gln Arg Met Ala Ala Ala Asn Ile Gly His Val Asn 325 330 335 Gln Cys Val Lys Val His Ala Glu Val Ser Cys Pro Asp Met Arg Ser 340 345 350 Trp Ser Gly Val Ser Tyr Pro Phe Asn Lys Leu Ala Tyr Ala Ile Gly 355 360 365 Asp Gly Thr Thr Pro Ala Gly Asn Thr His Ile Val Cys Phe Gly Gly 370 375 380 Ala His Asn His Ile Gln Pro Glu Glu Asp Val Glu Ala Thr Lys Met 385 390 395 400 Ala Val Glu Asn Met Ser Pro Gly Asn Met Asp Ile Lys Arg Leu Val 405 410 415 Phe His Asn Trp Cys Lys Asp Glu Phe Ala Lys Gly Ala Trp Phe Phe 420 425 430 Ala Pro Pro Gln Leu Leu Ser Lys Ser Leu Asp Glu Leu Arg Cys Arg 435 440 445 His Gly Asn Val Leu Phe Ala Asn Ser Asp Trp Ala Leu Gly Trp Arg 450 455 460 Gly Phe Ile Asp Gly Ala Ile Glu Glu Gly Thr Arg Ala Ala Val Thr 465 470 475 480 Val Ile Glu Glu Leu Arg Pro Ala Pro Ala Val Arg Ser His Leu 485 490 495

Claims (48)

  1. 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 II(a), II(b), III(a) 또는 IV(a)에 따른 화합물 (이들의 염 및 수화물 포함).
    [화학식 II(a)]
    Figure pct00090

    [화학식 II(b)]
    Figure pct00091

    [화학식 III(a)]
    Figure pct00092

    [화학식 IV(a)]
    Figure pct00093

    [식 중,
    A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl 및 Br로부터 선택되고;
    M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고;
    단,
    (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고;
    (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다].
  2. 제1항에 있어서, M 및 M'이 존재하지 않고, A가 -CH2-, -CH(CH3)-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-, -C(C2H5)2-, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)- 및 -CH(CH2NHC(NH)NH2)-로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, M 및 M'이 O이고, A가 -CH2-, -C(CH3)2- 및 -C(C2H5)2-로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, M 및 M'이 -CH2-이고, A가 -O-, -CH2-, -C(CH3)2-, -CH(CH3)-, -C(C2H5)2-, -CH(C2H5)-, -CF2-, -CCl2-, -CBr2-, -C(CF3)2-, -CH(COOH)-, -C(COOH)2-, -CH(NH2)- 및 -C(H2)NHC(NH)NH2-로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, M 및 M'이 -CH2-이고, A가 -O-, -CH2- 및 -C(CH3)2-로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, M 및 M'이 존재하지 않는 것인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, M 및 M'이 -CH2-인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, A가 -CH2-인 화합물.
  9. 제1항에 있어서, A가 -C(CH3)2-인 화합물.
  10. 제7항에 있어서, A가 -C(CH3)2-인 화합물.
  11. 제7항에 있어서, A가 -C(CF3)2-인 화합물.
  12. 제8항에 있어서, A가 -CH2-인 화합물.
  13. 제1항에 있어서, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화합물이
    Figure pct00094

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  14. 제1항에 있어서, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화합물이
    Figure pct00095
    및
    Figure pct00096

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  15. 제1항에 있어서, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화합물이
    Figure pct00097
    인 화합물.
  16. 제1항에 있어서, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화합물이
    Figure pct00098
    및
    Figure pct00099

    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  17. 제1항에 있어서, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화합물이
    Figure pct00100
    인 화합물.
  18. 제1항의 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화합물 한 쌍을 포함하고, 이때 화합물들의 쌍이 (i) 화학식 II(a) 및 II(b)의 화합물; (ii) 화학식 III(a) 및 III(b)의 화합물; 및 (iii) 화학식 IV(a) 및 IV(b)의 화합물로부터 선택되는 것인 혼합물.
  19. 제18항에 있어서, 화합물들의 쌍이 화학식 III(a) 및 III(b)의 화합물이고, 혼합물 내의 화학식 III(a)의 화합물의 양이 혼합물 내의 화학식 III(b)의 화합물의 양보다 큰 혼합물.
  20. 제19항에 있어서, 화학식 III(a)의 화합물의 양 대 화학식 III(b)의 화합물의 양의 비율이 5:1 이상인 혼합물.
  21. 제18항에 있어서, 화합물들의 쌍이 화학식 IV(a) 및 IV(b)의 화합물이고, 혼합물 내의 화학식 IV(a)의 화합물의 양이 혼합물 내의 화학식 IV(b)의 화합물의 양보다 큰 혼합물.
  22. 제21항에 있어서, 화학식 IV(a)의 화합물의 양 대 화학식 IV(b)의 화합물의 양의 비율이 10:1 이상인 혼합물.
  23. 모노아민 옥시데이스(oxidase) 효소가 화학식 II(a)의 상응하는 이민 화합물로 화학식 I의 아민 화합물을 산화시키는 조건 하에 화학식 I에 따른 아민 화합물을 모노아민 옥시데이스 효소와 보조인자의 존재 하에 산소와 접촉시키는 단계를 포함하는, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 II(a)에 따른 화합물 (이의 염 및 수화물 포함)의 제조 방법.
    [화학식 II(a)]
    Figure pct00101

    [식 중,
    A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl 및 Br로부터 선택되고;
    M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고;
    단,
    (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고;
    (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다];
    [화학식 I]
    Figure pct00102

    [식 중, A, M 및 M'은 화학식 II(a) 및 II(b)에 대해 정의된 바와 같다].
  24. 제23항에 있어서, 보조인자가 모노아민 옥시데이스 효소와 비-공유결합적으로 회합되는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 보조인자가 FAD, FMN, NAD 및 NADP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 과산화수소 (H2O2)의 산소 분자 및 물로의 불균등화를 촉매하는 성분을 더 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 성분이 Pd, Fe 및 카탈레이스(catalase) 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제23항에 있어서, 모노아민 옥시데이스 효소가 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 또는 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터 수득 또는 유래되는 것인 방법.
  29. 제23항에 있어서, 모노아민 옥시데이스 효소의 아미노산 서열이 서열 2의 야생형 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스와 90％ 이상 동일하거나 또는 서열 32의 야생형 아스페르길루스 오리자에 모노아민 옥시데이스와 90％ 이상 동일한 것인 방법.
  30. 제23항에 있어서, 모노아민 옥시데이스 효소의 아미노산 서열이 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 90％ 이상 동일한 것인 방법.
  31. 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 III(a)에 따른 아미노술포네이트 화합물 및 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 III(b)에 따른 아미노술포네이트 화합물을 포함하는 혼합물이 산출되는 조건 하에 화학식 I에 따른 아민 화합물을 보조인자와 회합된 모노아민 옥시데이스 효소의 존재 하에 산소와, 그리고 바이설파이트와 접촉시키는 단계를 포함하는, 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 III(a)에 따른 아미노술포네이트 화합물 및 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 III(b)에 따른 아미노술포네이트 화합물 (이들의 염 및 수화물 포함)을 포함하는 혼합물의 제조 방법.
    [화학식 III(a)]
    Figure pct00103

    [화학식 III(b)]
    Figure pct00104

    [식 중,
    A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl 및 Br로부터 선택되고;
    M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고;
    단,
    (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고;
    (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다];
    [화학식 I]
    Figure pct00105

    [식 중, A, M 및 M'은 화학식 III에 대해 정의된 바와 같다].
  32. 제31항에 있어서, 바이설파이트가 모노아민 옥시데이스 전에 또는 모노아민 옥시데이스와 동시에 반응에 첨가되는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 바이설파이트가 모노아민 옥시데이스의 첨가 후에 첨가되는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 화학식 I에 따른 아민 화합물이 바이설파이트의 첨가 전에 산소 및 보조인자와 회합된 모노아민 옥시데이스 효소와 접촉되는 것인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 모노아민 옥시데이스 효소가 아스페르길루스 니게르 또는 아스페르길루스 오리자에로부터 수득 또는 유래되는 것인 방법.
  36. 제31항에 있어서, 모노아민 옥시데이스 효소의 아미노산 서열이 서열 2의 야생형 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스와 90％ 이상 동일하거나 또는 서열 32의 야생형 아스페르길루스 오리자에 모노아민 옥시데이스와 90％ 이상 동일한 것인 방법.
  37. 제31항에 있어서, 모노아민 옥시데이스 효소의 아미노산 서열이 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 90％ 이상 동일한 것인 방법.
  38. 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 III(a)에 따른 아미노술포네이트 화합물 및 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 III(b)에 따른 아미노술포네이트 화합물을 포함하는 혼합물이 산출되는 조건 하에 화학식 I에 따른 아민 화합물을 보조인자와 회합된 모노아민 옥시데이스 효소의 존재 하에 산소와, 그리고 바이설파이트와 접촉시키는 단계, 및 화학식 III(a) 및 III(b)에 따른 화합물을 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV(a)에 따른 아미노니트릴 화합물이 산출되는 조건 하에 시아나이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV(a)에 따른 아미노니트릴 화합물 (이의 염 및 수화물 포함)의 제조 방법.
    [화학식 IV(a)]
    Figure pct00106

    [식 중,
    A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl 및 Br로부터 선택되고;
    M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고;
    단,
    (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고;
    (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다];
    [화학식 I]
    Figure pct00107

    [식 중, A, M 및 M'은 화학식 IV에 대해 정의된 바와 같다].
    [화학식 III(a)]
    Figure pct00108

    [화학식 III(b)]
    Figure pct00109
  39. 제38항에 있어서, 보조인자가 모노아민 옥시데이스 효소와 비-공유결합적으로 회합되는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 보조인자가 FAD, FMN, NAD 및 NADP로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 모노아민 옥시데이스 효소가 아스페르길루스 니게르 또는 아스페르길루스 오리자에로부터 수득 또는 유래되는 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 모노아민 옥시데이스 효소의 아미노산 서열이 서열 2의 야생형 아스페르길루스 니게르 모노아민 옥시데이스와 90％ 이상 동일하거나 또는 서열 32의 야생형 아스페르길루스 오리자에 모노아민 옥시데이스와 90％ 이상 동일한 것인 방법.
  43. 제38항에 있어서, 모노아민 옥시데이스 효소의 아미노산 서열이 서열 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 90％ 이상 동일한 것인 방법.
  44. 아미노니트릴 화합물이 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 VI에 따른 아미노산 화합물로 전환되는 조건 하에 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 IV(a)에 따른 아미노니트릴 화합물을 산 및 물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 VI에 따른 아미노산 화합물 (이의 염 포함)의 제조 방법.
    [화학식 VI]
    Figure pct00110

    [식 중,
    A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl 및 Br로부터 선택되고;
    M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고;
    단,
    (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고;
    (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다];
    [화학식 IV(a)]
    Figure pct00111

    [식 중, A, M 및 M'은 화학식 VI의 아미노 화합물에 대해 정의된 바와 같다].
  45. 입체이성질체적으로 순수한 화학식 III(a)에 따른 바이설파이트 아민 부가물 화합물, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 III(b)에 따른 바이설파이트 아민 부가물 화합물 또는 이들의 혼합물을 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 IV(a)에 따른 아미노니트릴 화합물이 산출되는 조건 하에 시아나이드와 접촉시키는 단계, 및 아미노니트릴 화합물이 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 VI에 따른 아미노산 화합물로 전환되는 조건 하에 화학식 IV(a)의 아미노니트릴 화합물을 산 및 물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 VI에 따른 아미노산 화합물 (이의 염 포함)의 제조 방법.
    [화학식 VI]
    Figure pct00112

    [식 중,
    A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl 및 Br로부터 선택되고;
    M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고;
    단,
    (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고;
    (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다];
    [화학식 III(a)]
    Figure pct00113

    [화학식 III(b)]
    Figure pct00114

    [화학식 IV(a)]
    Figure pct00115

    [식 중, A, M 및 M'은 화학식 VI의 아미노 화합물에 대해 정의된 바와 같다].
  46. 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 V에 따른 아미노에스테르 화합물로 화학식 VI에 따른 아미노산 화합물이 전환되는 조건 하에 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 VI에 따른 아미노산 화합물을 산, 및 R5-OH 및 R5OC(O)CH3으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 실질적으로 거울상이성질체적으로 순수한 화학식 V에 따른 화합물 (이의 염 포함)의 제조 방법.
    [화학식 V]
    Figure pct00116

    [식 중,
    R5는 (C1-C6)알킬이고;
    A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl 및 Br로부터 선택되고;
    M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고;
    단,
    (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고;
    (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다];
    [화학식 VI]
    Figure pct00117

    [식 중, A, M 및 M'은 화학식 V의 아미노산 화합물에 대해 정의된 바와 같다].
  47. 입체이성질체적으로 순수한 화학식 III(a)에 따른 바이설파이트 아민 부가물 화합물, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 III(b)에 따른 바이설파이트 아민 부가물 화합물 또는 이들의 혼합물을 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 IV(a)에 따른 아미노니트릴 화합물이 산출되는 조건 하에 시아나이드와 접촉시키는 단계, 및 아미노니트릴 화합물이 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 V에 따른 아미노 에스테르 화합물로 전환되는 조건 하에 화학식 IV(a)의 아미노니트릴 화합물을 산 및 알코올과 접촉시키는 단계를 포함하는, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 V에 따른 아미노 에스테르 화합물 (이의 염 포함)의 제조 방법.
    [화학식 V]
    Figure pct00118

    [식 중,
    R5는 (C1-C6)알킬이고;
    A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl 및 Br로부터 선택되고;
    M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고;
    단,
    (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고;
    (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다];
    [화학식 III(a)]
    Figure pct00119

    [화학식 III(b)]
    Figure pct00120

    [화학식 IV(a)]
    Figure pct00121

    [식 중, A, M 및 M'은 화학식 VI의 아미노 화합물에 대해 정의된 바와 같다].
  48. 입체이성질체적으로 순수한 화학식 III(a)에 따른 바이설파이트 아민 부가물 화합물, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 III(b)에 따른 바이설파이트 아민 부가물 화합물 또는 이들의 혼합물을 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 IV(a)에 따른 아미노니트릴 화합물이 산출되는 조건 하에 시아나이드와 접촉시키는 단계, 및 아미노니트릴 화합물이 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 VII에 따른 아미노 아미드 화합물로 전환되는 조건 하에 화학식 IV(a)의 아미노니트릴 화합물을 산과 접촉시키는 단계를 포함하는, 실질적으로 입체이성질체적으로 순수한 화학식 VII에 따른 아미노 아미드 화합물 (이의 염 포함)의 제조 방법.
    [화학식 VII]
    Figure pct00122

    [식 중,
    A는 O, CR1R2, -C=C-, 또는 -CH2-CH2-이고, 식 중 R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -X, -NH2, -CH2NHC(NH)NH2, -CX3, -CH3, -CH2CH3으로부터 선택되고, 식 중 X는 F, Cl 및 Br로부터 선택되고;
    M 및 M'은 둘 모두 존재할 수 있거나 또는 둘 모두 존재하지 않을 수 있고, M 및 M' 둘 모두가 존재하는 경우, M 및 M'은 동일하고 O 및 CR3R4로부터 선택되고, 식 중 R3 및 R4는 H이거나, 또는 M의 R3 또는 R4와 M'의 R3 또는 R4가 메틸렌 브릿지를 형성하고;
    단,
    (a) M 및 M'이 O인 경우, A는 O가 아니고; A가 O인 경우, M 및 M'은 O가 아니고; (b) M 및 M'이 CR3R4인 경우, A는 -CH=CH- 또는 -CH2-CH2-일 수 있고;
    (c) M 및 M'이 CR3R4이고 M 및 M'에 하나 이상의 입체중심이 있는 경우, M 및 M'의 입체중심은 입체화학이 반대이다];
    [화학식 III(a)]
    Figure pct00123

    [화학식 III(b)]
    Figure pct00124

    [화학식 IV(a)]
    Figure pct00125

    [식 중, A, M 및 M'은 화학식 VI의 아미노 화합물에 대해 정의된 바와 같다].
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