JP4363183B2 - アザ糖化合物 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、新規なアザ糖化合物、より詳細には糖鎖関連酵素阻害活性を有するアザ糖化合物に関する。本発明は上記アザ糖化合物を用いた医薬にも関する。
背景技術
グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼなどの糖鎖関連酵素（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）は、タンパク質（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．，他（１９８５）．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，６３１−６６４；及びＢｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，Ｉ．，他（１９９９）．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４７３，６７−９５）及びスフィンゴ脂質（Ｂｕｔｔｅｒｓ，Ｔ．Ｄ．，他（２０００）．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００．４６８３−４６９６）上の特定のオリゴ糖構造の合成に関与する重要な分子群である。そのような酵素の特異的阻害剤を使用することにより細胞機能を調節できるため、これらの阻害剤は興味深い。グリコシド結合の酵素加水分解は一般的には、２つの必須残基（即ち、プロトンドナーとヌクレオフィル）を必要とする通常の酸及び塩基触媒を介して行われる（Ｓｉｎｎｏｔｔ，Ｍ．Ｌ．，他（１９９０）．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０，１１７１−１２０２；Ｒｙｅ，Ｃ．Ｓ．，他（２０００）．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４，５７３−５８０；及びＵｎｌｉｇｉｌ，Ｕ．Ｍ．，他（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０，５１０−５１７）。カルボキソニウムイオンを生じる屈曲した半イス様遷移状態がこの反応に関与していると考えられる（図１）。反応性糖成分の遷移状態の形状と電荷に類似するように特定の方向に水酸基を有する５員のイミノシクリトールは、そのような酵素の阻害剤となる可能性が示されている（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｂ．，他（１９９３）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９０，７４３−７４９；Ｆｌｅｅｔ，Ｇ．Ｗ．Ｊ．，他（１９８５）．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６，３１２７−３１３０；Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．−Ｃ．，他（１９９１）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６，６２８０−６２８９；Ｋａｔｏ，Ａ．，他（１９９９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３１６−９５−１０３；Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，他（１９９９）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，５２８０−５２９１；及びＳａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）。カチオン様遷移状態は、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼに触媒される両反応に関与することが予想されるため、５員及び６員のイミノシクリトールは両酵素の遷移状態アナログ阻害剤の開発のための中心成分として使用できる（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｂ．，他（１９９３）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９０，７４３−７４９；Ｆｌｅｅｔ，Ｇ．Ｗ．Ｊ．，他（１９８５）．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６，３１２７−３１３０；Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．−Ｃ．，他（１９９１）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６，６２８０−６２８９；Ｋａｔｏ，Ａ．，他（１９９９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ，Ｒｅｓ．３１６−９５−１０３；Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，他（１９９９）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，５２８０−５２９１；Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１；Ｋａｊｉｍｏｔｏ，Ｔ．，他（１９９１）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３，６１８７−６１９６；Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｙ．，他（１９９８）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，３００７−３０１８；Ｌｅｇｌｅｒ，Ｇ．，他（１９８６）．Ｃａｒｏｂｙｄｒ．Ｒｅｓ．１５５，１１９−１２９；Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．，他（１９９５）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，４１２−４３２；Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．，他（１９９５）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，５２１−５４６；Ｈｕｇｈｅｓ，Ａ．Ｂ．，他（１９９４）．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．１３５−１６２；及びＱｉａｎ，Ｘ．，他（２０００）．Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｒｎｓｔ，Ｂ．，Ｈａｒｔ，Ｇ．Ｗ．＆ Ｓｉｎａｙ，Ｐ．，ｅｄ．）ｖｏｌ．３，ｐｐ．２９３−３１２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｈｎｈｅｉｍ）。
発明の開示
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼなどの糖鎖関連酵素の特異的阻害活性を有する化合物を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記した糖鎖関連酵素の特異的阻害剤を利用した医薬を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために検討してきた結果、一群の５員のイミノシクリトールを合成し、そのうちの幾つかの化合物がグリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼに対する強力で興味深い阻害活性を有することを示した（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，他（１９９９）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，５２８０−５２９１；及びＳａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）。本発明者らは、所望の阻害を付与する合理的な設計及び合成は、活性部位の構造に関する情報が限られているために困難であったため、５員のイミノシクリトールから誘導したコンビナトリアルライブラリーを用いる方法で所望の阻害活性を示す化合物をスクリーニングできないかどうかを検討した。本発明者らは、先ず多様性が小さいライブラリーを作製し、これらが糖鎖関連酵素の阻害剤となるかどうかを評価した。即ち、５員のイミノシクリトールに属する一連の化合物を合成し、各種のグリコシルヒドロラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼに対する阻害作用を評価することにより、本発明は完成するに至った。
即ち、本発明によれば、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩が提供される。
（式中、Ｒ１は水素原子、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基、又はＮの保護基を示し；Ｒ２は置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基又は置換基を有していてもよいＣ２〜Ｃ１０のアルケニル基を示し；Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素原子又は水酸基の保護基を示し；Ｘは−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、又はアミノ酸若しくはペプチドのアミノ基由来の残基を示し、Ｒ５及びＲ６は各々独立に水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ１０のアルキル基、又は置換基を有していてもよいＣ３−Ｃ１２のシクロアルキル基を示し；Ｙは、水素原子、−ＣＨ２ＮＨ２、−ＣＯＮＨ２、又は−ＣＯＯＨを示す。）
好ましくは、一般式（Ｉ）の立体構造は以下の一般式（Ｉａ）である。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、及びＹは、上記と同義である）
さらに好ましくは、一般式（Ｉ）の立体構造は以下の一般式（Ｉｂ）である。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、及びＹは、上記と同義である）
特に好ましくは、一般式（Ｉ）の立体構造は以下の一般式（Ｉｃ）である。
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、及びＹは、上記と同義である）
好ましくは、Ｒ２は−ＣＨ２ＯＲ１２（ただし、Ｒ１２は水素原子又は水酸基の保護基を示す）である。
本発明の別の側面によれば、上記した一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含む糖鎖関連酵素阻害剤、並びに上記した一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を有効成分として含む医薬が提供される。本発明の医薬は、例えば、糖鎖関連酵素が関与する疾患の治療又は予防のための医薬として使用でき、具体的には、抗ウイルス剤、抗がん剤又は免疫賦活剤として使用することができる。
本発明のさらに別の側面によれば、薬学的に有効量の一般式（Ｉ）の化合物又はその塩をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、糖鎖関連酵素を阻害する方法；並びに、薬学的に有効量の一般式（Ｉ）の化合物又はその塩をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、糖鎖関連酵素が関与する疾患を治療又は予防する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、糖鎖関連酵素阻害剤の製造における一般式（Ｉ）の化合物又はその塩の使用；並びに、医薬（具体的には、糖鎮関連酵素が関与する疾患の治療又は予防のための医薬であり、例えば、抗ウイルス剤、抗がん剤又は免疫賦活剤など）の製造における一般式（Ｉ）の化合物又はその塩の使用が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、一般式（ＩＩ）で示される化合物：
（式中、Ｒ１は水素原子、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基、又はＮの保護基を示し；Ｒ２は置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基又は置換基を有していてもよいＣ２〜Ｃ１０のアルケニル基を示し；Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素原子又は水酸基の保護基を示す）
を還元剤の存在下で、
式：Ｘ−Ｈ
（式中、Ｘは、一Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、又はアミノ酸若しくはペプチドのアミノ基由来の残基を示し、Ｒ５及びＲ６は各々独立に水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ１０のアルキル基、又は置換基を有していてもよいＣ３−Ｃ１２のシクロアルキル基を示す）
で示される化合物と反応させて一般式（ＩＩＩ）で示される化合物：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＸは上記定義の通りである）
を製造する工程を含む、上記一般式（Ｉ）で示される化合物の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、一般式（ＩＩ）で示される化合物：
（式中、Ｒ１は水素原子、置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基、又はＮの保護基を示し；Ｒ２は置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基又は置換基を有していてもよいＣ２〜Ｃ１０のアルケニル基を示し；Ｒ３及びＲ４は各々独立に水素原子又は水酸基の保護基を示す）
をルイス酸の存在下で、
式：Ｘ−Ｈ
（式中、Ｘは、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、又はアミノ酸若しくはペプチドのアミノ基由来の残基を示し、Ｒ５及びＲ６は各々独立に水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ１０のアルキル基、又は置換基を有していてもよいＣ３−Ｃ１２のシクロアルキル基を示す）
で示される化合物及びシアノ化剤と反応させて一般式（ＩＶ）で示される化合物：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＸは上記定義の通りである）
を製造する工程を含む、上記一般式（Ｉ）で示される化合物の製造方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書において、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基としては、例えば、直鎖状、分岐状、環状、又はそれらの組み合わせから成る炭素数１から１０のアルキル基が挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ペンチル基、ヘキシル基などを挙げることができる。
本明細書において、Ｃ２〜Ｃ１０のアルケニル基としては、例えば、直鎖状、分岐状、環状、又はそれらの組み合わせから成る炭素数２から１０のアルケニル基が挙げられ、具体的には、上記したアルキル基の中の炭素間結合の１以上が二重結合になっている基が挙げられ、例えば、アリル基、ブテニル基、オクテニル基などが挙げられる。
本明細書において、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基などが挙げられる。
上記したアルキル基、アルケニル基並びにシクロアルキル基は所望により１又はそれ以上の置換基を有していてもよい。このような置換基の種類は特に限定されないが、例えば、水酸基、オキソ基（＝Ｏ）、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい）、低級アルコキシル基（メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基など）、置換若しくは無置換のアリールオキシ基（フェノキシ基など）、アミノ基、モノアルキルアミノ基（メチルアミノ基、エチルアミノ基など）、ジアルキルアミノ基（ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基など）、メルカプト基、アルキルチオ基（メチルチオ基、エチルチオ基など）、アミジノ基、グアニジノ基、ウレイド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基（置換若しくは無置換のフェニル基など）、シクロアルキル基（シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基など）、ヘテロ環基などを挙げることができる。ここで言うヘテロ環基の具体例としては、Ｎ、ＯまたはＳ原子の少なくとも一つを含む３ないし１０員の飽和もしくは不飽和のヘテロ環基が挙げられ、これらは単環であってもよいし、さらに他の環と縮合環を形成してもよい。ヘテロ環の具体例としては、例えばテトラヒドロフラン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルフォリン、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、トリアゾール、トリアジン、インドール、インダゾール、プリン、チアジアゾール、オキサジアゾール、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、アクリジン、フェナントロリン、フェナジン、テトラゾール、チアゾール、オキサゾール、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズチアゾール、ベンズセレナゾール、インドレニン、テトラザインデンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記した置換基のうち、酵素特異性を付与したり、酵素とのアフィニティーを増強するために好ましい置換基は、上記式中のＸまたはＲ２の置換基として、酵素活性部位近傍のアミノ酸側鎖と疎水的相互作用するもの、水素結合を形成するもの、電荷の相互作用をするもの等、またこれらの総体としてある種のアグリコン、例えば、核酸塩基やアミノ酸等を挙げることができる。さらに、電子吸引性の異なる置換基（Ｙ）は、ピロリジン環イミノ基の電子の局在性に影響し、阻害活性を調整する。
本明細書で言うＮの保護基の種類は特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。Ｎの保護基の具体例を以下に列挙するが、これらに限定されるものではない。
ｔ−ブトキシカルボニル基、メチルカルボニル基、９−フルオレニルメチルカルボニル基、２，２，２−トリクロロエチルカルボニル基、２−トリメチルシリルエチルカルボニル基、ビニルカルボニル基、アリルカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、トルエンスルフォニル基、ベンゼンスルフォニル基、トリクロロメチルスルフォニル基、またはそれらの末端がレジンに結合したもの；
本明細書で言う水酸基の保護基の種類は特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。水酸基の保護基の具体例を以下に列挙するが、これらに限定されるものではない。
（エーテル型）
メチル基、メトキシメチル基、メチルチオメチル基、ベンジルオキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基、２−メトキシエトキシメチル基、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、３−ブロモテトラヒドロピラニル基、テトラヒドロチオピラニル基、４−メトキシテトラヒドロピラニル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロチオフラニル基；
１−エトキシエチル基、１−メチル−１−メトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、２−（フェニルセレニル）エチル基、ｔ−ブチル基、アリル基、シンナミル基、ｐ−クロロフェニル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｏ−ニトロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−ハロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド基、ジフェニルメチル基、５−ジベンゾスベリル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ｐ−（ｐ’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル基、９−アントリル基、９−（９−フェニル）キサンテニル基、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル基、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド基、；
トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＭＤＭＳ基）、（トリフェニルメチル）ジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリフェニルシリル基；
（エステル型）
ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、ｐ−Ｐ−フェニルアセテート、３−フェニルプロピオネート、３−ベンゾイルプロピオネート、イソブチレート、モノスクシノエート、４−オキソペンタノエート、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ベンゾエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、ｐ−Ｐ−ベンゾエート、α−ナフトエート；
（カーボネート型）
メチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、イソブチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネート、シンナミルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、ベンジルカーボネート、ｐ−メトキシベンジルカーボネート、３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、ｏ−ニトロベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、Ｓ−ベンジルチオカーボネート；
（その他）
Ｎ−フェニルカルバメート、Ｎ−イミダゾリルカルバメート、ボレート、ニトレート、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダート、２，４−ジニトロフェニルスルフェネート：
なお、上記したような保護基の導入法及び脱保護法は当業者に公知であり、例えば、Ｔｅｏｄｏｒａ，Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９８１）などに記載されている。
本発明において、Ｘは−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、又はアミノ酸若しくはペプチドのアミノ基由来の残基を示す。
本明細書で言うアミノ酸の種類は特に限定されず、天然型アミノ酸残基、非天然型アミノ酸残基、又はそれらの誘導体の何れでもよい。即ち、アミノ酸としてはＬ−アミノ酸であってもよいし、Ｄ−アミノ酸であってもよいし、これらの混合物でもよい。また、アミノ酸の種類としては、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸の何れでもよいが、天然型アミノ酸であるα−アミノ酸が好ましい。本明細書で言う非天然型アミノ酸とは、天然型蛋白質を構成する天然型アミノ酸２０種類（グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン）以外の全てのアミノ酸を意味し、具体的には、（１）天然型アミノ酸中の原子を他の物質で置換した非天然型アミノ酸、（２）天然型アミノ酸の側鎖の光学異性体、（３）天然型アミノ酸の側鎖に置換基を導入した非天然型アミノ酸、並びに（４）天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能などを変化させた非天然型アミノ酸などが挙げられる。
また、本明細書で言うペプチドとは、複数のアミノ酸がペプチド結合で結合して成るものであり、その長さは特に限定されないが、一般的には２〜２０アミノ酸残基であり、好ましくは２〜１０アミノ酸残基であり、さらに好ましくは２〜５アミノ酸残基である。
このような本発明の化合物としては、Ｒ１は水素原子が好ましく、Ｒ２は−ＣＨ２ＯＨ、Ｒ３およびＲ４は水素原子が好ましい。また、Ｘはブチルアミノ基、２，２−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミノ基、ドデシルアミノ基、エタノールアミノ基（２−ヒドロキシエチルアミノ基）、アダマンタンアミノ基、メトキシプロピルアミノ基（３−メトキシプロピルアミノ基）、テトラヒドロフルフリルアミノ基、フェネチルアミノ基、又はシクロヘキシルアミノ基が好ましく、Ｙは水素原子、アミノメチル基、又はカルボキソアミド基が好ましい。さらに、Ｘとしては、ドデシルアミノ基又はフェネチルアミノ基が最も好ましく、Ｙとしては水素原子が最も好ましい。
一般式（Ｉ）の化合物は、置換基の種類によっては塩の形態で存在することができる場合があるが、一般式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容される塩を本発明の医薬において使用することもできる。
塩の種類は特に限定されないが、例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、又は有機アミン付加塩等が包含される。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、又はクエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、又は亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、アンモニウム又はテトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、モルホリン又はピペリジン等の付加塩が挙げられる。
一般式（Ｉ）の化合物には、位置異性体、幾何異性体、互変異性体、又は立体異性体（立体配座異性体を含む）、光学異性体のような異性体が存在するが、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の医薬において使用することができる。一般式（Ｉ）の化合物の立体異性体の具体例を本明細書中に一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）として示す。なお、Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ，Ｍ他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，６４，５２８０−５２９１には、ジオールの立体配置の異なるピロリジン化合物の研究において、当該位置の立体異性体２種を合成し、Ｒの立体の化合物群が、Ｓ体と比較して、Ｄ型糖関連加水分解酵素に対して良好な阻害能を発揮することが示されている。
一般式（Ｉ）の化合物の塩を取得したい場合、一般式（Ｉ）の化合物が塩の形態で得られる場合にはそのまま精製すればよく、また、遊離の形態で得られる場合には適当な溶媒に溶解又は懸濁させ、酸又は塩基を加えて塩を形成させ単離、精製すればよい。
また、一般式（Ｉ）の化合物及びその塩は、水あるいは各種溶媒との付加物（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の医薬において使用することができる。
また、一般式（Ｉ）の化合物及びその塩の任意の結晶形も本発明の医薬において使用することができる。
次に、一般式（Ｉ）の化合物の製造方法について説明する。一般式（Ｉ）の化合物は、以下の実施例に記載したスキーム１に記載した通り、アルデヒド体３から出発して、以下の２種類の経路の何れかにより合成することができる。以下で用いる化合物２、化合物３、化合物４及び化合物５は、スキーム１に示した化合物と同義である。
本発明で出発物質として用いるアルデヒド体３は公知化合物であり、Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１に記載の方法により合成することができる。また、一般式（Ｉ）において、Ｒ１が置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基である場合、Ｒ２が各種の置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基、又は各種の置換基を有していてもよいＣ２〜Ｃ１０のアルケニル基を示す場合についても、適当な出発物質を選択し、また当業者に公知の官能基変換反応を用いて、Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１に記載の方法に準じて、所望の置換基を有するアルデヒド体３を合成することができる。
第１の方法は、一般式（Ｉ）（一般式（Ｉａ）、一般式（Ｉｂ）、及び一般式（Ｉｃ）を含む。以下同様）においてＹが水素原子である化合物を製造する方法である。先ず、化合物３を還元アミノ化して化合物４を製造し、次に、所望により保護基を脱保護することにより、一般式（Ｉ）においてＹが水素原子である化合物に相当する化合物２を合成することができる。
化合物３あるいはその立体異性体を還元アミノ化して化合物４を製造する反応は、例えば、適当な不活性溶媒（例えば、トルエン等）中の化合物３の溶液に式Ｘ−Ｈで示されるアミン化合物（該アミン化合物としては、アミノ酸またはペプチドを使用することもできる）を添加し、攪拌した後、適当な不活性溶媒（例えば、ＴＨＦ等）中の還元剤溶液を添加することにより行うことができる。反応温度は反応が進行する限り特に限定されず、通常は０℃から５０℃程度、好ましくは室温で行うことができる。反応時間も特に限定されず、数時間から数日間行うことができる。ここで用いることができる還元剤としては、アルデヒドを還元することなくイミンを選択的に還元する試薬が用いられるが、具体的には、例えば、ＮａＢＨ３ＣＮなどが挙げられる。反応後の反応混合物は、常法により洗浄及び乾燥などの後処理を施して、所望により脱保護反応に使用することができる。脱保護反応は、保護基の種類に応じて適宜選択することができる。
第２の方法は、一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＨ２ＮＨ２、又は−ＣＯＮＨ２である化合物を製造する方法である。先ず、化合物３をＳｔｒｅｃｋｅｒ反応に付して化合物５を製造し、次に、ニトリル基をアミノ基又はアミド基に変換することにより、一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＨ２ＮＨ２、又は−ＣＯＮＨ２である化合物に相当する化合物２を合成することができる。
化合物３をＳｔｒｅｃｋｅｒ反応に付して化合物５を製造する反応は、例えば、適当な不活性溶媒（例えば、トルエンなど）中のアルデヒド体３の溶液に式Ｘ−Ｈで示されるアミン化合物（該アミン化合物としては、アミノ酸またはペプチドを使用することもできる）を添加し、攪拌した後、シアノ化剤及びルイス酸を添加することにより行うことができる。反応温度は反応が進行する限り特に限定されず、通常は０℃から５０℃程度、好ましくは室温で行うことができる。反応時間も特に限定されず、数時間から数日間行うことができる。
ここで用いることができるシアノ化剤としては、例えば、ＴＭＳＣＮ（ＴＭＳシアニド）、ＨＣＮ（青酸）などが挙げられる。
また、ここで用いることができるルイス酸としては、例えば、三塩化亜鉛、三塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素、四塩化スズ、四塩化チタン、イットリビウムトリフラートなどが挙げられる。
反応後の反応混合物は、常法により洗浄及び乾燥などの後処理を施した後に、以後の反応に使用することができる。
次に、上記のＳｔｒｅｃｋｅｒ反応により得られた化合物５を以下の２種類の反応の何れかに付することにより、一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＨ２ＮＨ２、又は−ＣＯＮＨ２である化合物に相当する化合物２が得られる。
一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＨ２ＮＨ２である化合物を製造するためには、化合物５中のニトリルをアミノ基へ転換すればよい。この反応は、例えば、化合物５をメタノール及び塩酸に溶解し、炭素担持Ｐｄ（ＯＨ）２を添加して、Ｈ２雰囲気下で攪拌することにより行うことができる。反応温度は反応が進行する限り特に限定されず、通常は０℃から５０℃程度、好ましくは室温で行うことができる。反応時間も特に限定されず、数時間から数日間行うことができる。得られた反応混合物は、常法により後処理及び精製することにより、一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＨ２ＮＨ２である化合物に相当する化合物２を得ることができる。
一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＯＮＨ２である化合物を製造するためには、化合物５中のニトリルをアミド基へ転換すればよい。この反応は、例えば、化合物５をメタノール及びＫＯＨに溶解した後、過酸化水素を添加して攪拌する。得られた反応混合物を抽出し、乾燥した後、メタノール及びＫＯＨに再度溶解し、炭素担持Ｐｄ（ＯＨ）２を添加する。反応混合物をＨ２雰囲気下で攪拌することにより目的化合物を製造することができる。反応温度は反応が進行する限り特に限定されず、通常は０℃から５０℃程度、好ましくは室温で行うことができる。反応時間も特に限定されず、数時間から数日間行うことができる。得られた反応混合物は、常法により後処理及び精製することにより、一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＯＮＨ２である化合物に相当する化合物２を得ることができる。
一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＯＯＨである化合物を製造するためには、化合物５中のニトリルを加水分解することによりカルボキシル基に転換すればよい。具体的には、化合物５を塩酸およびジオキサンに溶解し、これを還流することにより一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＯＯＨである化合物を製造することができる。反応時間は特に限定されず、数十分から数日間行うことができる。
本発明はさらに、一般式（Ｉ）（一般式（Ｉａ）、一般式（Ｉｂ）、及び一般式（Ｉｃ）を含む。以下同様）の化合物又はその塩を含む糖鎖関連酵素阻害剤並びに一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含む医薬にも関する（本明細書中ではこれらを総称して本発明の医薬とも称する）。
本発明の医薬は、糖鎖関連酵素が関与する疾患の治療又は予防のために有用であり、例えば、抗ウイルス剤、抗がん剤又は免疫賦活剤として使用することができる。
本発明の化合物を糖鎖関連酵素阻害剤として使用する場合、対象となる糖鎖関連酵素としては、糖分解酵素（糖加水分解酵素など）、糖転移酵素などが挙げられる。
本発明の医薬を抗ウイルス剤として使用する場合、投与対象となるウイルス疾患の種類は特に限定されない。ウイルスの感染によって起こる疾患には、日本脳炎、デング熱、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、インフルエンザ、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、黄熱病、出血熱、髄膜炎、小児性下痢症、狂犬病、エボラ出血熱、ラッサ熱、ポリオ、セントルイス脳炎、成人Ｔ細胞白血病、エイズ等があり、さらにウイルス感染が原因と推定されている難治性疾患としては、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、亜急性硬化性全脳炎、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、クローン病、川崎病、糖尿病等があることが知られている。本発明の抗ウイルス剤はこれら疾患の治療や予防のために有用である。
本発明の医薬を抗がん剤として使用する場合、投与対象となる腫瘍または癌の種類は特に限定されず、悪性腫瘍および良性腫瘍の全てを包含し、癌腫（上皮性の悪性腫瘍）、肉腫（非上皮性の悪性腫瘍）、並びにこれらの混合型の全てを包含する。
癌の種類はその発生部位によっても分類することもでき、例えば、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症、皮膚癌、軟部肉腫、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、形質細胞性腫瘍、褐色リンパ腫および膵内分泌腫瘍などが挙げられるが、上記具体例は癌の具体例を例示したものにすぎず、これらに限定されるわけではない。
本発明の化合物はマクロファージ活性化因子の不活性化因子（α−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅ）を阻害することが判明したことから、免疫賦活剤として有用である。本発明の医薬を免疫賦活剤として使用する場合としては、例えば、感染やストレスなどによる生体の免疫能力の低下に基づくと考えられる各種疾患を予防する場合が挙げられる。具体的には、例えば、病原性細菌やウイルスの感染防御や癌の予防などを目的として使用することができる。
本発明の医薬においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩、並びにそれらの水和物及び溶媒和物からなる群から選ばれる物質の１種又は２種以上を有効成分として用いることができる。異性体の任意の混合物又は純粋な形態の異性体を用いてもよい。
本発明の医薬は、１又は２以上の製剤学的に許容される製剤用添加物と有効成分である上記物質とを含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
本発明の医薬は経口的又は非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与など）に投与することができる。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明の医薬の剤形はこれらに限定されることはない。
本発明の医薬の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。
経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
本発明の医薬はヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の医薬の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたりの有効成分の量として１μｇ／ｋｇから１，０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。上記投与量の医薬は一日一回に投与してもよいし、数回（例えば、２〜４回程度）に分けて投与することもできる。
本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願２００１−１７３８５５号の明細書に開示した内容は全て引用により本明細書に開示したものとする。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例
（Ａ）材料及び方法
（１）材料
以下の酵素は下記の通り購入した：Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ．Ｓｐ．由来α−グルコシダーゼ（α−Ｇｌｃ−ａｓｅ；α−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２０）（ＴｏＹｏＢｏ）；Ｊａｃｋ Ｂｅａｎ由来α−マンノシダーゼ（α−Ｍａｎ−ａｓｅ；α−Ｄ−マンノシドマンノヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２４）（Ｓｉｇｍａ）；Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｆｆｅｅ Ｂｅａｎ由来α−ガラクトシダーゼ（α−Ｇａｌ−ａｓｅ；α−Ｄ−ガラクトシドガラクトヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２２）（Ｓｉｇｍａ）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ−ａｓｅ；β−Ｄ−ガラクトシドガラクトヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２３）（Ｓｉｇｍａ）；Ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ由来α−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅ（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトシドアセトアミドデオキシガラクトヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．４９）（Ｓｉｇｍａ）；Ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ由来β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅ；ＥＣ２．４．１．２２）（Ｓｉｇｍａ）；Ｐｉｇ由来、Ｅ．ｃｏｌｉ組み換え体α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅ；ＥＣ２．４．１．９０）（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ）。
４−メチルウンベルリフェリル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ）は和光純薬から購入した。ＵＤＰガラクトース及び５’−ジホスホネート（ＵＤＰ）はＳｉｇｍａから購入した。カコジル酸ナトリウム塩、ＨＥＰＥＳ［２−｛４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル｝エタンスルホン酸］、ＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、ＭｎＣｌ２、テトラホウ酸ナトリウム、及び水酸化カリウムはナカライテスク社から購入した。二重脱イオン水はＭｉｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）で調製した。Ｓｅｐ−ＰａｋカートリッジはＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．から購入した。Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶシリンジフィルター（０．２２ｍｍ×４ｍｍ、ｉ．ｄ．）は日本ミリポアから購入した。
（２）化学合成の一般的方法
全ての反応に乾燥溶媒を使用した。溶液は減圧下で浴温度が５０℃を越えないようにして蒸発させた。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０）又はＩａｔｒｏ Ｂｅａｄｓ（６０μｌ）（Ｄｉａ−Ｉａｔｒｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で行った。ゲルろ過クロマトグラフィーは、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−２を用いて行った。ＴＬＣスポットはエタノール中の７％１２モリブド（ＶＩ）リン酸ｎ−ハイドレートを用いて可視化した。ＪＥＯＬ ＥＸ−２７０分光光度計を使用して２５℃でＮＭＲスペクトルを取得した。１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ）は、内部標準としてＭｅ４Ｓｉ（δ０．００）又はＤＯＨ（δ４．８０）を使用してＣＤＣｌ３又はＤ２Ｏ中で記録した。１３Ｃ ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ）は、内部標準としてＭｅ４Ｓｉ（δ０．０）、ＣＤＣｌ３（δ７７．０）又はＣＤ３ＣＮ（δ１１８．２）を使用してＣＤＣｌ３又はＤ２Ｏ中で記録した。部分割当てのみを報告する。ＭＡＬＤＩＴＯＦ質量スペクトルは、マトリックスとして２，５−ジヒドロキシ安息香酸を用いてＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｙａｇｅｒ上で記録した。ＴＬＣの発色はＡＴＴＯ写真濃度ソフトウエアライブラリーレーンアナライザー（ＡＴＴＯ Ｃｏｒｐ．）を用いて測定した。
（３）グリコシル転移反応および分析の一般的方法
酵素反応は全量２５０μｌのマイクロチューブ中で行った。反応混合物には、０．１Ｍのカコジル酸塩緩衝液（ｐＨ７）、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、０．１ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ、０．２ｍＭの４−Ｍｕ−グリコシド、０．５ｍＭの阻害剤、及び２０ｍＵ／ｍＬのガラクトシルトランスフェラーゼを含めた。３７℃で５分間インキュベーションした後、０．１Ｍのホウ酸溶液を５０μｌ添加して８０℃で１０分間加熱することによって反応を停止した。得られた混合物をＭｉｌｌｅｘ ＧＶフィルターを用いてろ過し、沈殿物を除去した。
反応速度分析を、ｉ．ｄ．７５μｍの融合シリカキャピラリーを備えたＷａｔｅｒｓ Ｑｕａｎｔａ ４０００Ｅキャピラリー電気泳動システムで行った。試料を１０ｃｍ高い所で１０秒間静水力学的圧力により充填した。検出は、カソードから７．５ｃｍのところで２１４ｎｍでＵＶ吸収をカラム上で測定することにより行った。フェログラムはＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ ２０１０システム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）上に記録した。
（４）化合物３の還元アミン化の典型的方法
トルエン（３００μｌ）中のアルデヒド体３（９ｍｇ，０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液にフェネチルアミン（４．４μＬ，０．０３５ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で２時間攪拌し、ＴＨＦ（５１．０μＬ，３当量）のＮａＢＨ３ＣＮの１Ｍ溶液を０℃で添加し、室温で一晩攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。還元アミン化の転換率をＴＬＣの写真濃度分析で求めた。スポットはモリブドホスフェート試薬で可視化した。保護されたイミノシクリトールに対応するＵＶ腸性スポットのみを分析した。Ｙｉｅｌｄｓ（％）；４（１），９８．１；４（２），４２．４；４（３），８０．３；４（４）．５７．５；４（５），８０．９；４（６），６１．０；４（７），５４．９；４（８），７９．４；４（９），８０．３．
溶媒の除去後、残渣をメタノール（０．８ｍＬ）及び１ＭのＨＣｌ（０．２ｍＬ）に溶解し、Ｈ２雰囲気下で室温で２日間、触媒量の２０％Ｐｄ（ＯＨ）２と一緒に攪拌した。触媒及び溶媒を除去した後に得られた粗物質をＨ２Ｏ（１ｍＬ）に溶解して、Ｄｏｗｅｘ １Ｘ８（ＯＨ ｆｏｒｍ）と一緒に室温で３０分間攪拌した。溶媒をろ過及び除去した後、残渣をＨ２Ｏに溶解し、１ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）で前処理したＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓ ＣＭカートリッジに装着した。カートリッジをＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄し、１０％ＮＨ３（１０ｍＬ）で溶出した後、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶフィルターでろ過し、凍結乾燥して化合物２（８，１）（２．５ｍｇ、化合物３から５３％）を得た。平行した反応で、２（１，１）（５５％），２（２，１）（６５％），２（３，１）（１０％），２（４，１）（８０％），２（５，１）（３６％），２（６，１）（７４％），２（７，１）（６３％），２（９，１）（２９％）を得た。これらの化合物の選択した物性データを以下に示す。
２（１，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．２０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），３．９８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０，８．４Ｈｚ），３．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，１１．２Ｈｚ），３．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．７，１１．２Ｈｚ），３．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５，６．６Ｈｚ），０．９６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ２２Ｎ２Ｏ３：２１８；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２１９（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（２，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），３．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．６Ｈｚ），３．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５，１０．９Ｈｚ），３．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，１１．２Ｈｚ），２．６６（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）２）．
２（３，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），３．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９，７．８Ｈｚ），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，ＣＨ３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１６Ｈ３４Ｎ２Ｏ３：３０２；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３０３（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（４，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），３．９６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３，８．５Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ８Ｈ１８Ｎ２Ｏ４：２０６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２０７（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（５，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），４．１９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５，８．６Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１６Ｈ２８Ｎ２Ｏ３：２９６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２９７（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（６，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），３．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２，８．３Ｈｚ），３．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８，１１．３Ｈｚ），３．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，１１．３Ｈｚ），３．５８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．３８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．７，１２．２Ｈｚ），２．８１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．８５（ｑｕｉｎｔｅｒ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ，Ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ２２Ｎ２Ｏ４：２３４：Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２３５（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（７，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），４．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），４．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，８．６Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ２２Ｎ２Ｏ４：２４６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２４７（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（８，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ７．４３−７．３５（ｍ，５Ｈ），４．１６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），３．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９，８．２Ｈｚ），３．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１１．１Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ２２Ｎ２Ｏ３：２６６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２６７（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（９，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），３．９６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．３Ｈｚ），３．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，１０．８Ｈｚ），３．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，１０．５Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ２４Ｎ２Ｏ３：２４４；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２４５（Ｍ＋Ｈ）＋．
（５）化合物３のＳｔｒｅｃｋｅｒ反応の典型的方法
トルエン（７００μｌ）のアルデヒド体３（２４ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）の溶液にフェネチルアミン（６．９μＬ，０．０５４ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で２時間攪拌し、ＴＭＳＣＮ（１８．１μＬ，０．１４ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（９．０μＬ，０．１当量）中の塩化亜鉛の０．５Ｍ溶液を０℃で添加し、室温で一晩攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去した後、ニトリル化合物５（８）の粗物質（２９ｍｇ，９６．０％ｐ（６：４））を得た。ここで％ｐは、ＴＬＣの写真濃度分析で求めた粗混合物中の生成物の純度を意味し、後ろの括弧内の数字はジアステレオアイソマーの比率を示す。これらのうちで比率がないものは立体異性体が同一のＲｆを有していたことを示す。スポットはモリブドホスフェート試薬で可視化した。保護されたイミノシクリトールに対応するＵＶ陽性スポットのみを分析した。平行した反応で、化合物５（１）（４３ｍｇ，８１．９％ｐ（１：１），化合物３（３９ｍｇ，０．０７４ｍｍｏｌ）から）、化合物５（２）（２６ｍｇ，５８．２％ｐ，化合物３（２７ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）から）、化合物５（３）（２７ｍｇ，９１．２％ｐ（６：４），化合物３（２８ｍｇ，０．０５３ｍｍｏｌ）から）、化合物５（４）（２９ｍｇ，６７．８％ｐ，化合物３（２７ｍｇ，０．０５１ｍｍｏｌ）から）、化合物５（５）（３０ｍｇ，７０．６％ｐ，化合物３（２４ｍｇ，０．０４６ｍｍｏｌ）から）、化合物５（６）（２７ｍｇ，５６．９％ｐ（６：４），化合物３（２５ｍｇ，０．０４６ｍｍｏｌ）から）、化合物５（７）（２６ｍｇ，８７．５％ｐ（６：４），化合物３（２６ｍｇ，０．０４８ｍｍｏｌ）から）、及び化合物５（９）（３０ｍｇ，５７．０％ｐ，化合物３（２６ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）から）を得た。これらの化合物を精製することなく次の反応に使用した。選択した物性データを以下に示す。
５（１）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＣＨＣＮ），１．４３（ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ３）３），０．９１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＣＨ３）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；１１９．３５ ａｎｄ １１８．６５（ＣＮ），８０．９９（Ｃ（ＣＨ３）３），２８．２９（Ｃ（ＣＨ３）３），１３．８４（ＣＨ３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３７Ｈ４７Ｎ３Ｏ５：６１３；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６１４（Ｍ＋Ｈ）＋．
５（２）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ＣＨＣＮ），２．２２（ｓ，６Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３７Ｈ４８Ｎ４Ｏ５：６２８；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６２９（Ｍ＋Ｈ）＋．
５（３）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ＣＨＣＮ），１．４３（ｓ，９Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４３Ｈ５９Ｎ３Ｏ５：６９７；Ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ ６９８（Ｍ＋Ｈ）＋，７２０（Ｍ＋Ｎａ）＋，７３６（Ｍ＋Ｋ）＋．
５（４）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．４４（ｓ，９Ｈ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ４３Ｎ３Ｏ６：６０１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６０２（Ｍ＋Ｈ）＋，６２４（Ｍ＋Ｎａ）＋．
５（５）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ＣＨＣＮ），１．４６（ｓ，９Ｈ）：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４３Ｈ５３Ｎ３Ｏ５：６９１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６９２（Ｍ＋Ｈ）＋．
５（６）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；δ３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ＣＨＣＮ），３．３１（ｓ，３Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．
５（７）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨＣＮ），１．４３（ｓ，９Ｈ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３８Ｈ４７Ｎ３Ｏ６：６４１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６４２（Ｍ＋Ｈ）＋．
５（８）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．２６（ｄｔ．Ｊ＝２．５，７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），３．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．４４（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；１１８．５８（ＣＮ），８１．００（Ｃ（ＣＨ３）３），２８．１４（Ｃ（ＣＨ３）３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ４７Ｎ３Ｏ５：６６１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６６２（Ｍ＋Ｈ）＋．
５（９）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．１４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），３．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，ＣＨＣＮ），１．４５（ｓ，９Ｈ）：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３９Ｈ４９Ｎ３Ｏ５：６３９；Ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ ６４０（Ｍ＋Ｈ）＋．
（６）ニトリルのアミノ基への典型的な転換反応：化合物２（８，２）の合成
メタノール（０．８ｍＬ）及び１ＭのＨＣｌ（０．２ｍＬ）に溶解した粗化合物５（８）（８ｍｇ，化合物２（７ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）に対応）の溶液に、触媒量の炭素担持２０％Ｐｄ（ＯＨ）２を添加した。反応混合物をＨ２雰囲気下で室温で４日間攪拌した。触媒及び溶媒を除去した後に得られた粗物質をＨ２Ｏ（１ｍＬ）に溶解して、Ｄｏｗｅｘ １Ｘ８（ＯＨ ｆｏｒｍ）と一緒に室温で３０分間攪拌した。溶媒をろ過及び除去した後、残渣をＨ２Ｏに溶解し、１ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）で前処理したＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓ ＣＭカートリッジに装着した。カートリッジをＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄し、１０％ＮＨ３（１０ｍＬ）で溶出した後、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶフィルターでろ過し、凍結乾燥して化合物２（８，２）（２．３ｍｇ、化合物３から５８％）を得た。平行した反応で、２（１，２）（５１％），２（２，２）（４１％），２（３，２）（８％），２（４，２）（４１％），２（５，２）（３２％），２（６，２）（３１％），２（７，２）（２７％），２（９，２）（１２％）を得た。選択した物性データを以下に示す。
２（１，２）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．９０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，ＣＨ３）．
２（２，２）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ１．９５（ｓ，６Ｈ）；
２（３，２）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ３７Ｎ３Ｏ５：３３１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３３２（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（４，２）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ３．７５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．００（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９Ｈ２１Ｎ３Ｏ４：２３５；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２３６（Ｍ＋Ｈ）＋，２７４（Ｍ＋Ｋ）＋．
２（５，２）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ３１Ｎ３Ｏ３：３２５；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３２６（Ｍ＋Ｈ）．
２（８，２）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ２５Ｎ３Ｏ３：２９５；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２９６（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（９，２）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ２７Ｎ３Ｏ３：２７３；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２７４（Ｍ＋Ｈ）＋，３１２（Ｍ＋Ｋ）＋．
（７）ニトリルのアミド基への典型的な転換反応：化合物２（１，３）の合成
メタノール（０．８ｍＬ）及び６ＭのＫＯＨ（０．２ｍＬ）中の粗化合物５（１）（８ｍｇ，化合物３（１０ｍｇ，０．０１８ｍｍｏｌ）に対応）の溶液に、３０％Ｈ２Ｏ２（１７μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５０℃で２時間攪拌した。冷却後、反応混合物を氷水に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。メタノール（０．８ｍＬ）及び１ＭのＨＣｌ（０．２ｍＬ）に溶解したこの残渣に、触媒量の炭素担持２０％Ｐｄ（ＯＨ）２を添加した。反応混合物をＨ２雰囲気下で室温で３日間攪拌した。触媒及び溶媒を除去した後に得られた粗物質をＨ２Ｏ（１ｍＬ）に溶解して、Ｄｏｗｅｘ １Ｘ８（ＯＨ ｆｏｒｍ）と一緒に室温で３０分間攪拌した。溶媒をろ過及び除去した後、残渣をＨ２Ｏに溶解し、１ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）で前処理したＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓ ＣＭカートリッジに装着した。カートリッジをＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄し、１０％ＮＨ３（１０ｍＬ）で溶出した後、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶフィルターでろ過し、凍結乾燥して化合物２（１，３）（１．４ｍｇ、化合物３から２８％）を得た。平行した反応で、２（２，３）（４２％），２（３，３）（１５％），２（４，３）（３３％），２（５，３）（１７％），２（６，３）（２８％），２（７，３）（１２％），２（８，３）（２７％），２（９，３）（２６％）を得た。選択した物性データを以下に示す。
２（１，３）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ３．３４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），０．９２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ２３Ｎ３Ｏ４：２６１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２６２（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３７Ｈ４９Ｎ３Ｏ６：６３１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６３２（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（２，３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ２４Ｎ４Ｏ４：２７６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２７７（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３７Ｈ５０Ｎ４Ｏ６：６４６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６４７（Ｍ＋Ｈ）＋，６８５（Ｍ＋Ｋ）＋．
２（３，３）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ３５Ｎ３Ｏ４：３４５；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３４６（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（４，３）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ３．００（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９Ｈ１９Ｎ３Ｏ５：２４９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ２５０（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ４５Ｎ３Ｏ７：６１９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６２０（Ｍ＋Ｈ）＋，６４２（Ｍ＋Ｈａ）＋．
２（５，３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ２９Ｎ３Ｏ４：３３９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３４０（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：
ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４３Ｈ５５Ｎ３Ｏ６：７０９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ７１０（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（６，３）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ３．５４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．３５（ｓ，３Ｈ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ２３Ｎ３Ｏ５：２７７；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２７８（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（７，３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ２３Ｎ３Ｏ５：２８９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２９０（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３８Ｈ４９Ｎ３Ｏ７：６５９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６６０（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（８，３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ２３Ｎ３Ｏ４：３０９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３１０（Ｍ＋Ｈ）＋，３２２（Ｍ＋Ｎａ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；δ６．５８，６．４６，５．３９，５．２２（ｂｒ．Ｓ，ＣＯＮＨ２）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７５．２０ ａｎｄ １７４．６８（ＣＯＮＨ２），１５５．３８（ＮＣＯＯ），２８．３８（ＣＨ３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ４９Ｎ３Ｏ６：６７９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６８０（Ｍ＋Ｈ）＋，
２（９，３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ２５Ｎ３Ｏ４：２８７；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２８８（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３９Ｈ５１Ｎ３Ｏ６：６５７：Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６５８（Ｍ＋Ｈ）＋．
（８）グリコシダーゼに対するライブラリーのスクリーニング
インキュベーションはマイクロタイタープレートウエル（５０μＬ／ウエル）で行った。反応混合物には、適当な緩衝液（α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼについては４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）、α−マンノシダーゼについては２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）、α−ガラクトサミニダーゼについては４０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４））、１ｍＭのＰＮＰ−グリコシド、所定量の阻害剤（１ｎＭ〜１ｍＭ）、及びグリコシダーゼ（０．４Ｕ／ｍＬのα−グルコシダーゼ、０．２Ｕ／ｍＬのα−ガラクトシダーゼ、１Ｕ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ、０．２Ｕ／ｍＬのα−マンノシダーゼ、０．６Ｕ／ｍＬのα−ガラクトスアミニダーゼ）を含めた。化合物２（３，Ｙ）の場合には、化合物をＤＭＳＯに溶解し、Ｈ２Ｏで希釈することにより（Ｈ２Ｏ：ＤＭＳＯ＝６：１（ｖ／ｖ））、ストック５ｍＭ溶液を先ず調製し、溶液の一部を各反応に使用した。室温で５分間インキュベートした後、０．２Ｍの炭酸ナトリウム５０μＬを添加して反応を停止した。各実験は二重で行った。ライブラリーの一連の化合物の阻害の結果を図６（ＡからＦ）に示す。
（９）α−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅのアッセイ
インキュベーションは反応速度分析のために各時間（１〜１５分間）についてα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下でｐＨ６．５で行った。α−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅに対するイミノ糖の阻害アッセイは、０．５ｍＭのイミノ糖の存在下で５分間、反応速度分析と同一の条件下で行った。これらのイミノ糖は何れもα−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅに対して阻害活性を示さなかった。
電気泳動は、６０ｃｍの融合シリカキャピラリーを用いて１５ｋＶで行った。アクセプター４−ＭＵ−ＬａｃＮＡｃ（６）及び生成物４−ＭＵ−Ｇａｌ−α１−３−Ｇａｌ−β−１−４ＧｌｃＮＡｃ（７）の移動時間は各々、９．３分及び１０．０分であった。Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８後の反応混合物の質量スペクトル分析は満足なデータを与えた。
ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ；
化合物６：Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ３１ＮＯ１３：５４１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ５６４（Ｍ＋Ｎａ）＋，
化合物７：Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ４１ＮＯ１８：７０３；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ７２６（Ｍ＋Ｎａ）＋
（１０）β−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅに対するライブラリーのスクリーニング
インキュベーションは反応速度分析のために各時間（１〜１５分間）についてβ−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅの存在下でｐＨ７．０で行った。イミノ糖の阻害アッセイは、０．５ｍＭのイミノ糖の存在下で５分間、反応速度分析と同一の条件下で行った。阻害の結果を図４（Ｇ）に示す。
電気泳動は、４９ｃｍの融合シリカキャピラリーを用いて２０ｋＶで行った。５０ｍＭのホウ酸ナトリウムを電解質として使用した。アクセプター４−ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ及び生成物４−ＭＵ−ＬａｃＮＡｃ（６）の移動時間は各々、２．４分及び２．６分であった。
（Ｂ）結果および考察
（１）コンビナトリアルライブラリーの合成
本実施例では、ピロリジン環の立体配座に応じてガラクト型（１ａ）又はマンノ型（１ｂ）の何れかとなる、２（Ｓ）、３（Ｒ）、４（Ｓ）、５（Ｒ）−立体配置を有する５員のイミノシクリトールを選択した（図２）。５員環系は６員環系よりも立体配置的に柔軟であり、生理的条件では多様な立体配座の平衡として存在する。従って、両方の立体配座（１ａ及び１ｂ）は糖鎖関連酵素研究の構造上の候補と考えるべきである。５員系の特徴はコンビナトリアルライブラリーのリード構造として有利であると考えられる、この場合にはさらなる特異性や親和性を構造２に官能基を添加することによって引き出すことができる。異なる立体配座は結合特異性に関して対応する酵素ファミリーを目的とするものであり、これらの立体配座（２ａ及び２ｂ）をライブラリー中の「立体配座多様性因子」として処理できると考えた（図３）。
糖鎖関連酵素を目的とした炭水化物関連のライブラリーの報告はほとんど存在しない（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｕ．Ｊ．，他（１９９８）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６，１５６３−１５７５；Ｗｉｓｃｈｎａｔ，Ｒ．，他（１９９８）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８，３３５３−３３５８；Ｌｏｈｓｅ，Ａ．，他（１９９９）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７，１９６５−１９７１；Ｌｏｈｓｅ，Ａ．，他（１９９９）．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４０，３０３３−３０３６；Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｍ．，他（２０００）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５，３８１１−３８１５；及びＭａｌｅｔ，Ｃ．，他（１９９７）．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０３，５１−６５）。遷移状態阻害剤（Ｗｉｓｃｈｎａｔ，Ｒ．，他（１９９８）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８，３３５３−３３５８；Ｌｏｈｓｅ，Ａ．，他（１９９９）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７，１９６５−１９７１；Ｌｏｈｓｅ，Ａ．，他（１９９９）．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４０，３０３３−３０３６；及びＴａｋａｙａｎａｇｉ，Ｍ．，他（２０００）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５，３８１１−３８１５）に基づく試みは特に興味深い。多様性が生成する仕組みについては複数の可能性が存在する。即ち、直線型（二重官能化合成ユニットの反復反応を含む）、足場型（鋳型と複数の官能基との反応を含む）、及びカスケード型（反応産物が次の反応のための別の機能を付与する）である（Ｂａｌｋｅｎｈｏｈｌ，Ｆ．，他（１９９６）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３５，２２８８−２３３７）。対象となる一連の分子は低分子量であること、並びに、関連酵素の結晶写真データによればタンパク質表面の約１００Åを覆う標的酵素の主な触媒部位に合致する必要があることを考慮すれば（Ｍｕｒａｌｉ，Ｒ．，他（１９９４）．Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３９，５７８−５８０；Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．，他（１９９４）．Ｎａｔｕｒｅ．３６９，７６１−７６６；Ｇａｓｔｉｎｅｌ，Ｌ．Ｎ．，他（１９９９）．ＥＭＢＯ Ｊ．１８，３５４６−３５５７；Ｕｉｔｄｅｈａａｇ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．，他（１９９９）．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６，４３２−４３６；及びＶａｌｌｅｅ，Ｆ．，他（２０００）．ＥＭＢＯ．Ｊ．１９，５８１−５８８）、作製した分子に追加される官能基（一般式（Ｉ）中のＲ２、Ｘ及びＹ）は散乱すべきではなく、イミノシクリトールであるコアユニットに隣接して縮合すべきである。
化合物１の多様性を誘導するために、Ｃ１’位のアルデヒド基を使用した。これは、疎水度の増加は細胞膜の通過には有利であるが（Ｆｌｅｅｔ，Ｇ．Ｗ．Ｊ．，他（１９８８）．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２３７，１２８−１３２；Ｋａｒｐａｓ，Ａ．，他（１９８８）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５，９２２９−９２３３；及びＡｓａｎｏ，Ｎ．，他（１９９５）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２３４９−２３５６）、環窒素のＮ−アルキル化により分子レベルでの阻害が減少する場合が多いという知見に基づくものである（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，他（１９９９）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，５２８０−５２９１；及びＳａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）。アルデヒド体３を既報の通り合成し、ライブラリーを作製するために使用した（Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）。先ず、還元アミン化、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ縮合、Ｕｇｉ型反応およびＭａｎｎｉｃｈ反応を含む各種の反応条件のために、化合物３とアミンとの反応によって形成したイミンを利用し、生成物のアシル化によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を導入して多様性を増大し、反応混合物からの縮合生成物のフィッシュアウト処理を容易にした。しかし、そのような反応では、十分な結果を与えない反応があった。この原因は、反応部位周辺のアミンのｔ−ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジル（Ｂｎ）及びＸの立体障害であることが示唆された。適用可能と判明した反応は、アシル化を伴なわない還元アミン化とＳｔｒｅｃｋｅｒ反応であったが、適用可能な反応はこれらに限定されるものではなく、所望の生成物が得られる限り他の反応を使用してもよい。イミノシクリトールに基づいたライブラリーでは大きい多様性は得られなかったが、代わりにニトリル基からアミノ、アミド及びカルボン酸（Ｙ）への転換反応を含めることにした。選択したＸ基およびＹ基を図３に示す。
先ず、幾つかのアミン（Ｘ−Ｈ）を用いて化合物３の還元アミン化反応を行った。イミンの還元は、シアノボロハイドライドナトリウムを用いた標準的条件下で円滑に進行し、化合物４（１−９）が得られ、これを酸性条件下で水素添加により１工程で脱保護し、Ｓｅｐ−ＰａｋＣＭカートリッジを用いて高収率で化合物２（１−９，１）が得られた。還元アミン化反応の個々の転換率は、ＴＬＣプレートの写真濃度分析により求め、化合物３は４２〜９８％の収率で化合物４に転換した。
次に、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ反応を行った。９種のアミンでイミンを形成した後に、トリメチルシリルシアニド（ＴＭＳＣＮ）を触媒ＺｎＣｌ２の存在下で使用した（Ｏｊｉｍａ，Ｉ．，他（１９７５）．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７３７−７４０）（スキーム１、図３）。ルイス酸なしでは反応は進行しなかった。何れの場合も有意な立体選択性は見られなかったことから、ルイス酸はイミン中間体を直接活性化し、副次的影響は見られなかったので他の官能基を介して活性化しているのではないことが示唆された。縮合産物を単離することなく次の反応に付した。アルデヒド体３から化合物５への転換率は写真濃度によれば５７〜９７％の範囲であった。混合物を加水分解及び還元などの各反応条件に付して、ニトリル基を各々カルボキシレート、アミド及びアミンに転換した。化合物５（１−９）を還元してアミン２（１−９，２）に転換する反応は、酸性水素添加条件下で行い、同時にＢｏｃとＢｎを除去した。ニトリル基を加水分解してカルボン酸及びアミド（Ｙ）を得ようとした場合、酸性及び塩基性の水素添加条件により共に複雑な混合物が得られた。そこで、化合物５（１−９）を酸化的にアミドに転換し、これを次に水素添加して化合物２（１−９，３）を生成した。温度の上昇後でもこの条件下では、中間体からカルボキレートに転換することはできなかった。
スキーム１：
化合物２（Ｘ，Ｙ）から成るライブラリーの合成；
アルデヒド体３の還元アミン化及びＳｔｒｅｃｋｅｒ反応により化合物４（Ｘ）及び５（Ｙ）が生成する。化合物５（Ｘ）のニトリル基はさらにＹのアミン−及びアミド−官能基に転換した。これらの化合物の脱保護により化合物２（Ｘ，Ｙ）が生成する。
阻害剤の候補として化合物２（１−９，１）を使用して、試験すべき糖鎖関連酵素を選択した。α−Ｇａｌ−ａｓｅ、β−Ｇａｌ−ａｓｅ及びα−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅをガラクト立体配置の化合物２ａ（Ｘ、Ｙ）（図３）の相手として選んだ（図３）。化合物１は２７μＭのＫ１値を有するＵＤＰ−Ｇａｌに対するβ−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅの阻害剤であるので、２種類のグリコシルトランスフェラーゼ（即ち、β−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅおよびα−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅ）も含めた（Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）。同様に、α−Ｍａｎ−ａｓｅを、マンノ立体配置化合物２ｂ（Ｘ，Ｙ）のために選択した。α−Ｇｌｃ−ａｓｅも追加した。
（２）糖鎮関連酵素に対するライブラリーのスクリーニング
α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼに対するライブラリー化合物の阻害効果をアッセイするために（Ｓｈａｒｍａ，Ａ．，他（１９９６）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，７１９０−７１９５；Ｓｕｊｉｎｏ，Ｋ．，他（１９９８）．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５，４８３−４８９；Ｃｈｅｎ，Ｘ．，他（１９９９）．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３，６５０−６５８；及びＴａｋａｙａｍａ，Ｓ．，他（１９９９）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７，４０１−４０９）、先ず酵素を用いて必要な基質及び生成物を合成した。４−メチルウンベルリフェリル（４−Ｍｅ）ＬａｃＮＡｃ（化合物６）を、既報（Ｋａｎｉｅ，Ｙ．，他（１９９８）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６３，２４０−２４５）の方法に従って合成し、基質として使用した。トランスフェラーゼの存在下での化合物６とＵＤＰ−Ｇａｌとの反応における化合物７の形成は、キャピラリー電気泳動を用いて図４（スキーム２）に示す典型的なエレクトロフェログラム分析として確認した。酵素反応の時間経過分析も行った（図５）。この条件下では、転移反応は１６分後に完結した。化合物７は単離しなかったが、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８後における反応混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析は、化合物６および化合物７の存在を示した。
スキーム２：
キセノトリ炭水化物の合成；
４−ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃから調製した４−ＭＵ−ＬａｃＮＡｃ（６）を、ＵＤＰ−Ｇａｌの存在下でα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの作用によりキセノ抗原トリ炭水化物に転換した。
本発明の方法の有効性を調べ、ライブラリーの構成要素がグルコシダーゼ及びグルコシルトランスフェラーゼの阻害剤となるかどうかを調べるために、阻害剤の濃度を固定して、予備的な阻害スクリーニングアッセイを行った。各酵素反応に適した濃度を、各種濃度のライブラリーの各化合物および／又は既知の酵素阻害剤を用いた初期阻害試験により決定した。阻害は、測定した濃度での百分率で示した。各酵素反応はタイタープレートのウエル中で行い、対応する基質に対する阻害を、グリコシダーゼのアッセイの場合には、ｐ−ニトロフェノールの４０５ｎｍにおける吸収で求めた。通常の阻害剤が入手可能である場合は、結果の標準のために使用した。
グリコシルトランスフェラーゼの阻害アッセイのために、４−Ｍｕ−ＧｌｃＡｃ、化合物６及び７などの対応する４−ＭＵ−グルコシドを使用した。阻害反応はマイクロ遠心チューブ中で５分間行い、阻害活性は、２１４ｎｍでキャピラリー電気泳動を用いてアクセプター基質に対する転換率として測定した。
図６に示す通り、阻害が見られなかったのでグラフを省略したα−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅを除いて、ライブラリーの一連の化合物は、試験した酵素について広い阻害スペクトルを示した。酵素に依存して、ある化合物は親化合物１と比較して阻害活性の劇的な増大を示した。そのような例は、α−Ｇｌｃ−ａｓｅ（Ａ）、α−Ｍａｎ−ａｓｅ（Ｂ）、α−Ｇａｌ−ａｓｅ（Ｃ）、α−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅ（Ｄ）及びβ−Ｇａｌ−ａｓｅ（Ｅ，Ｆ）について見られた。１００μＭの阻害濃度を有するα−Ｇｌｃ−ａｓｅの阻害については、ある化合物は化合物１の２倍の効力を示したが、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）に匹敵する阻害を示す化合物はなかった。イミノ糖から遠い疎水性はα−Ｍａｎ−ａｓｅの場合には好ましく、Ｃ１０アルキルを有する化合物２（３，１）は化合物１（Ｋｉ＝２７μＭ）（Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）及びデオキシマンノジリマイシン（ＤＭＮ、Ｋｉ＝４３μＭ）（Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）に対して各々、１０μＭでの阻害について２７６及び１１２０％の増大を示した。α−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅの阻害については、シアスタチンＢアナログのみがμＭ範囲のＩＣ５０値を有する阻害剤として報告されている（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．，他（１９９６）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４，９１−９６）。８種のうちの５種の化合物は、ｎＭのオーダーで親化合物（１）と比較して２倍以上効力が高いことが判明した。これらの中でも、フェネチル基を有する化合物２（８，１）は４６７％強い活性を示した。β−Ｇａｌ−ａｓｅの場合、試験した化合物は全てが、化合物１（Ｋｉ＝１．０ｍＭ）と比較して、酵素の非常に有効な阻害剤であったが（Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）、（Ｆ）に示すようにμＭ範囲の弱い阻害を示した。また、化合物間で活性に有意な相違はなかったので、Ｃ−１’位の置換は結合には重要ではないことが示唆された。β−ＧａｌＴ−ａｓｅ（Ｇ）及びα−ＧａｌＴ−ａｓｅの２つの酵素はＵＤＰ−Ｇａｌをドナー基質として共有するにも拘わらず、ある化合物はβ−ＧａｌＴ−ａｓｅに対して阻害を示し、α−ＧａｌＴ−ａｓｅに対して阻害を示す化合物がなかったことは注目すべきで、本発明の化合物は、ドナー遷移状態に類似している可能性がある。
化合物２（３，１）及び２（８，１）等の強い阻害効果を有することが分かった化合物を次の評価用のリード化合物として選択し、Ｙ基の効果を調べた（図７）。化合物２（３，２）及び２（３，３）は、この濃度ではα−Ｍａｎ−ａｓｅに対する阻害活性をほぼ喪失した。化合物２（８，２）及び２（８，３）はその条件下で、化合物２（８，１）の阻害作用の各々５２．８％及び５０．５％でα−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅを阻害した。
試験した酵素については全く異なる阻害スペクトルが観察され、これはコアユニットを同一に維持しつつ、選択性がＣ−１’位の置換基によって制御できることを示している。また、これらの化合物は、基質特異性がガラクト系統及びマンノ系統の両方の酵素に対して阻害を示した。この結果は、ピロリジン環のライブラリーを異なる立体配座を有する混合物として処理できることを意味し、当該化合物は非常に有用である。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規なアザ糖化合物が提供される。本発明のアザ糖化合物はグリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼなどの糖鎖関連酵素の特異的阻害剤として有用であり、例えば、糖鎖関連酵素が関与する疾患の治療又は予防のための医薬として有用であり、より具体的には、抗ウイルス剤、抗がん剤又は免疫賦活剤として有用である。
また、糖鎖関連酵素の効果的なデザイン合成は困難な問題が多く残されているが、コンビナトリアルライブラリー合成法はハイスループットスクリーニング法と合わせて迅速に活性の高い化合物を見出す有効な手段として医薬品開発分野において注目されている。一方、酵素内ペプチド鎖の立体配座の再配列による誘導適合（ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｔ）に基づく認識現象に着目することにより、新規な酵素阻害剤を見い出すことができる可能性がある。誘導適合には、酵素がその構造を変化させる場合と、基質あるいは阻害物質が酵素活性部位の構造に合うように構造変化する場合がある。五員環化合物は遷移状態の半椅子型立体配座を模倣するのみならず、環構造は自由度に富み、特定立体配置の水酸基を有する五員環アザ糖は、立体配座変化に伴い異なる糖を模倣する可能性がある。即ち、五員環アザ糖では、誘導適合により与えられた酵素により適当な配座が選択される可能性がある。従って、本発明の化合物は、立体配座の多様性による利用価値が付加された化合物ライブラリーとして提供することができ、医薬品開発において有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、グリコシドの酵素加水分解反応の遷移状態を示す図である。加水分解反応は、遷移状態として屈曲した半イス様立体配座を包含する。
図２は、５員イミノ糖１、並びに２種類の可能な異性体を示す。化合物１はガラクトース類似体又はマンノース類似体の何れかである。異性体の間には平衡が存在する。即ち、「１化合物」は異なる立体特異性を有する異なる一連の酵素に対する標的化合物の候補となる。従って、５員イミノシクリトール類は薬物分子設計上の母核として有利な構造であると考えられる。
図３は、コンビナトリアルライブラリーの図を示す。Ｃ−１’位で、多様性を導入し（Ｘ、Ｙ）、その構造を示す。一連の化合物２（Ｘ，Ｙ）は、ガラクト異性体２ａ及びマンノ異性体２ｂの平衡状態にある５員イミノ糖を共有している。
図４は、キャピラリー電気泳動によるα−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅのモニタリングを示す。アクセプター及びドナー基質として化合物６及びＵＤＰ−Ｇａｌを各々使用した酵素反応の典型的なエレクトロフェログラムを示す。
図５は、α−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅ反応の時間経過を示す。時間経過実験はα−ガラクトシル転位反応について行った。反応は１６分で完結した。
図６は、各種の糖鎖関連酵素に対する化合物２（Ｘ、１）の阻害活性を示す。
Ａ：１×１０−４Ｍの阻害剤濃度でのα−Ｇｌｃ−ａｓｅの阻害；
Ｂ：１×１０−５Ｍの阻害剤濃度でのα−Ｍａｎ−ａｓｅの阻害；
Ｃ：１×１０−５Ｍの阻害剤濃度でのα−Ｇａｌ−ａｓｅの阻害；
Ｄ：１×１０−７Ｍの阻害剤濃度でのα−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅの阻害；
Ｅ及びＦ：各々１×１０−３Ｍ及び１×１０−５Ｍの阻害剤濃度でのβ−Ｇａｌ−ａｓｅの阻害；及び
Ｇ：５×１０−４Ｍの阻害剤濃度でのβ−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅの阻害；
化合物１及び８の合成は、Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１に報告されている。
図７は、α−Ｍａｎ−ａｓｅ及びα−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅに対する化合物２（３，Ｙ）及び２（８，Ｙ）の阻害活性を示す。２系統の化合物２（３，Ｙ）及び２（８，Ｙ）を選択してＹ基の効果を評価した。
Ａ：１×１０−５Ｍでのα−Ｍａｎ−ａｓｅの阻害；
Ｂ：１×１０−７Ｍでのα−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅの阻害；
本発明は、新規なアザ糖化合物、より詳細には糖鎖関連酵素阻害活性を有するアザ糖化合物に関する。本発明は上記アザ糖化合物を用いた医薬にも関する。
背景技術
グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼなどの糖鎖関連酵素（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）は、タンパク質（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．，他（１９８５）．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４，６３１−６６４；及びＢｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，Ｉ．，他（１９９９）．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４７３，６７−９５）及びスフィンゴ脂質（Ｂｕｔｔｅｒｓ，Ｔ．Ｄ．，他（２０００）．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００．４６８３−４６９６）上の特定のオリゴ糖構造の合成に関与する重要な分子群である。そのような酵素の特異的阻害剤を使用することにより細胞機能を調節できるため、これらの阻害剤は興味深い。グリコシド結合の酵素加水分解は一般的には、２つの必須残基（即ち、プロトンドナーとヌクレオフィル）を必要とする通常の酸及び塩基触媒を介して行われる（Ｓｉｎｎｏｔｔ，Ｍ．Ｌ．，他（１９９０）．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０，１１７１−１２０２；Ｒｙｅ，Ｃ．Ｓ．，他（２０００）．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４，５７３−５８０；及びＵｎｌｉｇｉｌ，Ｕ．Ｍ．，他（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０，５１０−５１７）。カルボキソニウムイオンを生じる屈曲した半イス様遷移状態がこの反応に関与していると考えられる（図１）。反応性糖成分の遷移状態の形状と電荷に類似するように特定の方向に水酸基を有する５員のイミノシクリトールは、そのような酵素の阻害剤となる可能性が示されている（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｂ．，他（１９９３）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９０，７４３−７４９；Ｆｌｅｅｔ，Ｇ．Ｗ．Ｊ．，他（１９８５）．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６，３１２７−３１３０；Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．−Ｃ．，他（１９９１）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６，６２８０−６２８９；Ｋａｔｏ，Ａ．，他（１９９９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３１６−９５−１０３；Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，他（１９９９）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，５２８０−５２９１；及びＳａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）。カチオン様遷移状態は、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼに触媒される両反応に関与することが予想されるため、５員及び６員のイミノシクリトールは両酵素の遷移状態アナログ阻害剤の開発のための中心成分として使用できる（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，Ｂ．，他（１９９３）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９０，７４３−７４９；Ｆｌｅｅｔ，Ｇ．Ｗ．Ｊ．，他（１９８５）．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２６，３１２７−３１３０；Ｌｉｕ，Ｋ．Ｋ．−Ｃ．，他（１９９１）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６，６２８０−６２８９；Ｋａｔｏ，Ａ．，他（１９９９）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ，Ｒｅｓ．３１６−９５−１０３；Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，他（１９９９）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，５２８０−５２９１；Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１；Ｋａｊｉｍｏｔｏ，Ｔ．，他（１９９１）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３，６１８７−６１９６；Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｙ．，他（１９９８）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，３００７−３０１８；Ｌｅｇｌｅｒ，Ｇ．，他（１９８６）．Ｃａｒｏｂｙｄｒ．Ｒｅｓ．１５５，１１９−１２９；Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．，他（１９９５）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，４１２−４３２；Ｗｏｎｇ，Ｃ．−Ｈ．，他（１９９５）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，５２１−５４６；Ｈｕｇｈｅｓ，Ａ．Ｂ．，他（１９９４）．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．１３５−１６２；及びＱｉａｎ，Ｘ．，他（２０００）．Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｒｎｓｔ，Ｂ．，Ｈａｒｔ，Ｇ．Ｗ．＆ Ｓｉｎａｙ，Ｐ．，ｅｄ．）ｖｏｌ．３，ｐｐ．２９３−３１２，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｈｎｈｅｉｍ）。
発明の開示
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼなどの糖鎖関連酵素の特異的阻害活性を有する化合物を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記した糖鎖関連酵素の特異的阻害剤を利用した医薬を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために検討してきた結果、一群の５員のイミノシクリトールを合成し、そのうちの幾つかの化合物がグリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼに対する強力で興味深い阻害活性を有することを示した（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，他（１９９９）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，５２８０−５２９１；及びＳａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）。本発明者らは、所望の阻害を付与する合理的な設計及び合成は、活性部位の構造に関する情報が限られているために困難であったため、５員のイミノシクリトールから誘導したコンビナトリアルライブラリーを用いる方法で所望の阻害活性を示す化合物をスクリーニングできないかどうかを検討した。本発明者らは、先ず多様性が小さいライブラリーを作製し、これらが糖鎖関連酵素の阻害剤となるかどうかを評価した。即ち、５員のイミノシクリトールに属する一連の化合物を合成し、各種のグリコシルヒドロラーゼ及びグリコシルトランスフェラーゼに対する阻害作用を評価することにより、本発明は完成するに至った。
即ち、本発明によれば、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩が提供される。
好ましくは、一般式（Ｉ）の立体構造は以下の一般式（Ｉａ）である。
さらに好ましくは、一般式（Ｉ）の立体構造は以下の一般式（Ｉｂ）である。
特に好ましくは、一般式（Ｉ）の立体構造は以下の一般式（Ｉｃ）である。
好ましくは、Ｒ２は−ＣＨ２ＯＲ１２（ただし、Ｒ１２は水素原子又は水酸基の保護基を示す）である。
本発明の別の側面によれば、上記した一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含む糖鎖関連酵素阻害剤、並びに上記した一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を有効成分として含む医薬が提供される。本発明の医薬は、例えば、糖鎖関連酵素が関与する疾患の治療又は予防のための医薬として使用でき、具体的には、抗ウイルス剤、抗がん剤又は免疫賦活剤として使用することができる。
本発明のさらに別の側面によれば、薬学的に有効量の一般式（Ｉ）の化合物又はその塩をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、糖鎖関連酵素を阻害する方法；並びに、薬学的に有効量の一般式（Ｉ）の化合物又はその塩をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、糖鎖関連酵素が関与する疾患を治療又は予防する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、糖鎖関連酵素阻害剤の製造における一般式（Ｉ）の化合物又はその塩の使用；並びに、医薬（具体的には、糖鎮関連酵素が関与する疾患の治療又は予防のための医薬であり、例えば、抗ウイルス剤、抗がん剤又は免疫賦活剤など）の製造における一般式（Ｉ）の化合物又はその塩の使用が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、一般式（ＩＩ）で示される化合物：
を還元剤の存在下で、
式：Ｘ−Ｈ
（式中、Ｘは、一Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、又はアミノ酸若しくはペプチドのアミノ基由来の残基を示し、Ｒ５及びＲ６は各々独立に水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ１０のアルキル基、又は置換基を有していてもよいＣ３−Ｃ１２のシクロアルキル基を示す）
で示される化合物と反応させて一般式（ＩＩＩ）で示される化合物：
を製造する工程を含む、上記一般式（Ｉ）で示される化合物の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、一般式（ＩＩ）で示される化合物：
をルイス酸の存在下で、
式：Ｘ−Ｈ
（式中、Ｘは、−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、又はアミノ酸若しくはペプチドのアミノ基由来の残基を示し、Ｒ５及びＲ６は各々独立に水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−Ｃ１０のアルキル基、又は置換基を有していてもよいＣ３−Ｃ１２のシクロアルキル基を示す）
で示される化合物及びシアノ化剤と反応させて一般式（ＩＶ）で示される化合物：
を製造する工程を含む、上記一般式（Ｉ）で示される化合物の製造方法が提供される。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書において、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基としては、例えば、直鎖状、分岐状、環状、又はそれらの組み合わせから成る炭素数１から１０のアルキル基が挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ペンチル基、ヘキシル基などを挙げることができる。
本明細書において、Ｃ２〜Ｃ１０のアルケニル基としては、例えば、直鎖状、分岐状、環状、又はそれらの組み合わせから成る炭素数２から１０のアルケニル基が挙げられ、具体的には、上記したアルキル基の中の炭素間結合の１以上が二重結合になっている基が挙げられ、例えば、アリル基、ブテニル基、オクテニル基などが挙げられる。
本明細書において、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基などが挙げられる。
上記したアルキル基、アルケニル基並びにシクロアルキル基は所望により１又はそれ以上の置換基を有していてもよい。このような置換基の種類は特に限定されないが、例えば、水酸基、オキソ基（＝Ｏ）、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい）、低級アルコキシル基（メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基など）、置換若しくは無置換のアリールオキシ基（フェノキシ基など）、アミノ基、モノアルキルアミノ基（メチルアミノ基、エチルアミノ基など）、ジアルキルアミノ基（ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基など）、メルカプト基、アルキルチオ基（メチルチオ基、エチルチオ基など）、アミジノ基、グアニジノ基、ウレイド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、アリール基（置換若しくは無置換のフェニル基など）、シクロアルキル基（シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基など）、ヘテロ環基などを挙げることができる。ここで言うヘテロ環基の具体例としては、Ｎ、ＯまたはＳ原子の少なくとも一つを含む３ないし１０員の飽和もしくは不飽和のヘテロ環基が挙げられ、これらは単環であってもよいし、さらに他の環と縮合環を形成してもよい。ヘテロ環の具体例としては、例えばテトラヒドロフラン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルフォリン、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、トリアゾール、トリアジン、インドール、インダゾール、プリン、チアジアゾール、オキサジアゾール、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、アクリジン、フェナントロリン、フェナジン、テトラゾール、チアゾール、オキサゾール、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズチアゾール、ベンズセレナゾール、インドレニン、テトラザインデンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記した置換基のうち、酵素特異性を付与したり、酵素とのアフィニティーを増強するために好ましい置換基は、上記式中のＸまたはＲ２の置換基として、酵素活性部位近傍のアミノ酸側鎖と疎水的相互作用するもの、水素結合を形成するもの、電荷の相互作用をするもの等、またこれらの総体としてある種のアグリコン、例えば、核酸塩基やアミノ酸等を挙げることができる。さらに、電子吸引性の異なる置換基（Ｙ）は、ピロリジン環イミノ基の電子の局在性に影響し、阻害活性を調整する。
本明細書で言うＮの保護基の種類は特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。Ｎの保護基の具体例を以下に列挙するが、これらに限定されるものではない。
ｔ−ブトキシカルボニル基、メチルカルボニル基、９−フルオレニルメチルカルボニル基、２，２，２−トリクロロエチルカルボニル基、２−トリメチルシリルエチルカルボニル基、ビニルカルボニル基、アリルカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、トルエンスルフォニル基、ベンゼンスルフォニル基、トリクロロメチルスルフォニル基、またはそれらの末端がレジンに結合したもの；
本明細書で言う水酸基の保護基の種類は特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。水酸基の保護基の具体例を以下に列挙するが、これらに限定されるものではない。
（エーテル型）
メチル基、メトキシメチル基、メチルチオメチル基、ベンジルオキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基、２−メトキシエトキシメチル基、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル基、テトラヒドロピラニル基、３−ブロモテトラヒドロピラニル基、テトラヒドロチオピラニル基、４−メトキシテトラヒドロピラニル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド基、テトラヒドロフラニル基、テトラヒドロチオフラニル基；
１−エトキシエチル基、１−メチル−１−メトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、２−（フェニルセレニル）エチル基、ｔ−ブチル基、アリル基、シンナミル基、ｐ−クロロフェニル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｏ−ニトロベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−ハロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド基、ジフェニルメチル基、５−ジベンゾスベリル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル基、ｐ−（ｐ’−ブロモフェナシルオキシ）フェニルジフェニルメチル基、９−アントリル基、９−（９−フェニル）キサンテニル基、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル基、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド基、；
トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＭＤＭＳ基）、（トリフェニルメチル）ジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリベンジルシリル基、トリ−ｐ−キシリルシリル基、トリイソプロピルシリル基、トリフェニルシリル基；
（エステル型）
ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、ｐ−Ｐ−フェニルアセテート、３−フェニルプロピオネート、３−ベンゾイルプロピオネート、イソブチレート、モノスクシノエート、４−オキソペンタノエート、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ベンゾエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、ｐ−Ｐ−ベンゾエート、α−ナフトエート；
（カーボネート型）
メチルカーボネート、エチルカーボネート、２，２，２−トリクロロエチルカーボネート、イソブチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネート、シンナミルカーボネート、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、ベンジルカーボネート、ｐ−メトキシベンジルカーボネート、３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、ｏ−ニトロベンジルカーボネート、ｐ−ニトロベンジルカーボネート、Ｓ−ベンジルチオカーボネート；
（その他）
Ｎ−フェニルカルバメート、Ｎ−イミダゾリルカルバメート、ボレート、ニトレート、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダート、２，４−ジニトロフェニルスルフェネート：
なお、上記したような保護基の導入法及び脱保護法は当業者に公知であり、例えば、Ｔｅｏｄｏｒａ，Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９８１）などに記載されている。
本発明において、Ｘは−Ｎ（Ｒ５）Ｒ６、又はアミノ酸若しくはペプチドのアミノ基由来の残基を示す。
本明細書で言うアミノ酸の種類は特に限定されず、天然型アミノ酸残基、非天然型アミノ酸残基、又はそれらの誘導体の何れでもよい。即ち、アミノ酸としてはＬ−アミノ酸であってもよいし、Ｄ−アミノ酸であってもよいし、これらの混合物でもよい。また、アミノ酸の種類としては、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸の何れでもよいが、天然型アミノ酸であるα−アミノ酸が好ましい。本明細書で言う非天然型アミノ酸とは、天然型蛋白質を構成する天然型アミノ酸２０種類（グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン）以外の全てのアミノ酸を意味し、具体的には、（１）天然型アミノ酸中の原子を他の物質で置換した非天然型アミノ酸、（２）天然型アミノ酸の側鎖の光学異性体、（３）天然型アミノ酸の側鎖に置換基を導入した非天然型アミノ酸、並びに（４）天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能などを変化させた非天然型アミノ酸などが挙げられる。
また、本明細書で言うペプチドとは、複数のアミノ酸がペプチド結合で結合して成るものであり、その長さは特に限定されないが、一般的には２〜２０アミノ酸残基であり、好ましくは２〜１０アミノ酸残基であり、さらに好ましくは２〜５アミノ酸残基である。
このような本発明の化合物としては、Ｒ１は水素原子が好ましく、Ｒ２は−ＣＨ２ＯＨ、Ｒ３およびＲ４は水素原子が好ましい。また、Ｘはブチルアミノ基、２，２−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミノ基、ドデシルアミノ基、エタノールアミノ基（２−ヒドロキシエチルアミノ基）、アダマンタンアミノ基、メトキシプロピルアミノ基（３−メトキシプロピルアミノ基）、テトラヒドロフルフリルアミノ基、フェネチルアミノ基、又はシクロヘキシルアミノ基が好ましく、Ｙは水素原子、アミノメチル基、又はカルボキソアミド基が好ましい。さらに、Ｘとしては、ドデシルアミノ基又はフェネチルアミノ基が最も好ましく、Ｙとしては水素原子が最も好ましい。
一般式（Ｉ）の化合物は、置換基の種類によっては塩の形態で存在することができる場合があるが、一般式（Ｉ）の化合物の生理学的に許容される塩を本発明の医薬において使用することもできる。
塩の種類は特に限定されないが、例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、又は有機アミン付加塩等が包含される。酸付加塩としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、又はクエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、又は亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、アンモニウム又はテトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、モルホリン又はピペリジン等の付加塩が挙げられる。
一般式（Ｉ）の化合物には、位置異性体、幾何異性体、互変異性体、又は立体異性体（立体配座異性体を含む）、光学異性体のような異性体が存在するが、全ての可能な異性体、並びに２種類以上の該異性体を任意の比率で含む混合物も本発明の医薬において使用することができる。一般式（Ｉ）の化合物の立体異性体の具体例を本明細書中に一般式（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）として示す。なお、Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ，Ｍ他、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，６４，５２８０−５２９１には、ジオールの立体配置の異なるピロリジン化合物の研究において、当該位置の立体異性体２種を合成し、Ｒの立体の化合物群が、Ｓ体と比較して、Ｄ型糖関連加水分解酵素に対して良好な阻害能を発揮することが示されている。
一般式（Ｉ）の化合物の塩を取得したい場合、一般式（Ｉ）の化合物が塩の形態で得られる場合にはそのまま精製すればよく、また、遊離の形態で得られる場合には適当な溶媒に溶解又は懸濁させ、酸又は塩基を加えて塩を形成させ単離、精製すればよい。
また、一般式（Ｉ）の化合物及びその塩は、水あるいは各種溶媒との付加物（水和物又は溶媒和物）の形で存在することもあるが、これらの付加物も本発明の医薬において使用することができる。
また、一般式（Ｉ）の化合物及びその塩の任意の結晶形も本発明の医薬において使用することができる。
次に、一般式（Ｉ）の化合物の製造方法について説明する。一般式（Ｉ）の化合物は、以下の実施例に記載したスキーム１に記載した通り、アルデヒド体３から出発して、以下の２種類の経路の何れかにより合成することができる。以下で用いる化合物２、化合物３、化合物４及び化合物５は、スキーム１に示した化合物と同義である。
本発明で出発物質として用いるアルデヒド体３は公知化合物であり、Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１に記載の方法により合成することができる。また、一般式（Ｉ）において、Ｒ１が置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基である場合、Ｒ２が各種の置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基、又は各種の置換基を有していてもよいＣ２〜Ｃ１０のアルケニル基を示す場合についても、適当な出発物質を選択し、また当業者に公知の官能基変換反応を用いて、Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１に記載の方法に準じて、所望の置換基を有するアルデヒド体３を合成することができる。
第１の方法は、一般式（Ｉ）（一般式（Ｉａ）、一般式（Ｉｂ）、及び一般式（Ｉｃ）を含む。以下同様）においてＹが水素原子である化合物を製造する方法である。先ず、化合物３を還元アミノ化して化合物４を製造し、次に、所望により保護基を脱保護することにより、一般式（Ｉ）においてＹが水素原子である化合物に相当する化合物２を合成することができる。
化合物３あるいはその立体異性体を還元アミノ化して化合物４を製造する反応は、例えば、適当な不活性溶媒（例えば、トルエン等）中の化合物３の溶液に式Ｘ−Ｈで示されるアミン化合物（該アミン化合物としては、アミノ酸またはペプチドを使用することもできる）を添加し、攪拌した後、適当な不活性溶媒（例えば、ＴＨＦ等）中の還元剤溶液を添加することにより行うことができる。反応温度は反応が進行する限り特に限定されず、通常は０℃から５０℃程度、好ましくは室温で行うことができる。反応時間も特に限定されず、数時間から数日間行うことができる。ここで用いることができる還元剤としては、アルデヒドを還元することなくイミンを選択的に還元する試薬が用いられるが、具体的には、例えば、ＮａＢＨ３ＣＮなどが挙げられる。反応後の反応混合物は、常法により洗浄及び乾燥などの後処理を施して、所望により脱保護反応に使用することができる。脱保護反応は、保護基の種類に応じて適宜選択することができる。
第２の方法は、一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＨ２ＮＨ２、又は−ＣＯＮＨ２である化合物を製造する方法である。先ず、化合物３をＳｔｒｅｃｋｅｒ反応に付して化合物５を製造し、次に、ニトリル基をアミノ基又はアミド基に変換することにより、一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＨ２ＮＨ２、又は−ＣＯＮＨ２である化合物に相当する化合物２を合成することができる。
化合物３をＳｔｒｅｃｋｅｒ反応に付して化合物５を製造する反応は、例えば、適当な不活性溶媒（例えば、トルエンなど）中のアルデヒド体３の溶液に式Ｘ−Ｈで示されるアミン化合物（該アミン化合物としては、アミノ酸またはペプチドを使用することもできる）を添加し、攪拌した後、シアノ化剤及びルイス酸を添加することにより行うことができる。反応温度は反応が進行する限り特に限定されず、通常は０℃から５０℃程度、好ましくは室温で行うことができる。反応時間も特に限定されず、数時間から数日間行うことができる。
ここで用いることができるシアノ化剤としては、例えば、ＴＭＳＣＮ（ＴＭＳシアニド）、ＨＣＮ（青酸）などが挙げられる。
また、ここで用いることができるルイス酸としては、例えば、三塩化亜鉛、三塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素、四塩化スズ、四塩化チタン、イットリビウムトリフラートなどが挙げられる。
反応後の反応混合物は、常法により洗浄及び乾燥などの後処理を施した後に、以後の反応に使用することができる。
次に、上記のＳｔｒｅｃｋｅｒ反応により得られた化合物５を以下の２種類の反応の何れかに付することにより、一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＨ２ＮＨ２、又は−ＣＯＮＨ２である化合物に相当する化合物２が得られる。
一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＨ２ＮＨ２である化合物を製造するためには、化合物５中のニトリルをアミノ基へ転換すればよい。この反応は、例えば、化合物５をメタノール及び塩酸に溶解し、炭素担持Ｐｄ（ＯＨ）２を添加して、Ｈ２雰囲気下で攪拌することにより行うことができる。反応温度は反応が進行する限り特に限定されず、通常は０℃から５０℃程度、好ましくは室温で行うことができる。反応時間も特に限定されず、数時間から数日間行うことができる。得られた反応混合物は、常法により後処理及び精製することにより、一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＨ２ＮＨ２である化合物に相当する化合物２を得ることができる。
一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＯＮＨ２である化合物を製造するためには、化合物５中のニトリルをアミド基へ転換すればよい。この反応は、例えば、化合物５をメタノール及びＫＯＨに溶解した後、過酸化水素を添加して攪拌する。得られた反応混合物を抽出し、乾燥した後、メタノール及びＫＯＨに再度溶解し、炭素担持Ｐｄ（ＯＨ）２を添加する。反応混合物をＨ２雰囲気下で攪拌することにより目的化合物を製造することができる。反応温度は反応が進行する限り特に限定されず、通常は０℃から５０℃程度、好ましくは室温で行うことができる。反応時間も特に限定されず、数時間から数日間行うことができる。得られた反応混合物は、常法により後処理及び精製することにより、一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＯＮＨ２である化合物に相当する化合物２を得ることができる。
一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＯＯＨである化合物を製造するためには、化合物５中のニトリルを加水分解することによりカルボキシル基に転換すればよい。具体的には、化合物５を塩酸およびジオキサンに溶解し、これを還流することにより一般式（Ｉ）においてＹが−ＣＯＯＨである化合物を製造することができる。反応時間は特に限定されず、数十分から数日間行うことができる。
本発明はさらに、一般式（Ｉ）（一般式（Ｉａ）、一般式（Ｉｂ）、及び一般式（Ｉｃ）を含む。以下同様）の化合物又はその塩を含む糖鎖関連酵素阻害剤並びに一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含む医薬にも関する（本明細書中ではこれらを総称して本発明の医薬とも称する）。
本発明の医薬は、糖鎖関連酵素が関与する疾患の治療又は予防のために有用であり、例えば、抗ウイルス剤、抗がん剤又は免疫賦活剤として使用することができる。
本発明の化合物を糖鎖関連酵素阻害剤として使用する場合、対象となる糖鎖関連酵素としては、糖分解酵素（糖加水分解酵素など）、糖転移酵素などが挙げられる。
本発明の医薬を抗ウイルス剤として使用する場合、投与対象となるウイルス疾患の種類は特に限定されない。ウイルスの感染によって起こる疾患には、日本脳炎、デング熱、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、インフルエンザ、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、黄熱病、出血熱、髄膜炎、小児性下痢症、狂犬病、エボラ出血熱、ラッサ熱、ポリオ、セントルイス脳炎、成人Ｔ細胞白血病、エイズ等があり、さらにウイルス感染が原因と推定されている難治性疾患としては、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、亜急性硬化性全脳炎、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、クローン病、川崎病、糖尿病等があることが知られている。本発明の抗ウイルス剤はこれら疾患の治療や予防のために有用である。
本発明の医薬を抗がん剤として使用する場合、投与対象となる腫瘍または癌の種類は特に限定されず、悪性腫瘍および良性腫瘍の全てを包含し、癌腫（上皮性の悪性腫瘍）、肉腫（非上皮性の悪性腫瘍）、並びにこれらの混合型の全てを包含する。
癌の種類はその発生部位によっても分類することもでき、例えば、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、脳腫瘍、咽頭癌、喉頭癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣（睾丸）腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、乳癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症、皮膚癌、軟部肉腫、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、形質細胞性腫瘍、褐色リンパ腫および膵内分泌腫瘍などが挙げられるが、上記具体例は癌の具体例を例示したものにすぎず、これらに限定されるわけではない。
本発明の化合物はマクロファージ活性化因子の不活性化因子（α−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅ）を阻害することが判明したことから、免疫賦活剤として有用である。本発明の医薬を免疫賦活剤として使用する場合としては、例えば、感染やストレスなどによる生体の免疫能力の低下に基づくと考えられる各種疾患を予防する場合が挙げられる。具体的には、例えば、病原性細菌やウイルスの感染防御や癌の予防などを目的として使用することができる。
本発明の医薬においては、一般式（Ｉ）で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩、並びにそれらの水和物及び溶媒和物からなる群から選ばれる物質の１種又は２種以上を有効成分として用いることができる。異性体の任意の混合物又は純粋な形態の異性体を用いてもよい。
本発明の医薬は、１又は２以上の製剤学的に許容される製剤用添加物と有効成分である上記物質とを含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。
本発明の医薬は経口的又は非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与など）に投与することができる。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明の医薬の剤形はこれらに限定されることはない。
本発明の医薬の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。
経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤を用いることができる。
注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
本発明の医薬はヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の医薬の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたりの有効成分の量として１μｇ／ｋｇから１，０００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲であり、好ましくは１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ程度の範囲である。上記投与量の医薬は一日一回に投与してもよいし、数回（例えば、２〜４回程度）に分けて投与することもできる。
本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願２００１−１７３８５５号の明細書に開示した内容は全て引用により本明細書に開示したものとする。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
実施例
（Ａ）材料及び方法
（１）材料
以下の酵素は下記の通り購入した：Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ．Ｓｐ．由来α−グルコシダーゼ（α−Ｇｌｃ−ａｓｅ；α−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２０）（ＴｏＹｏＢｏ）；Ｊａｃｋ Ｂｅａｎ由来α−マンノシダーゼ（α−Ｍａｎ−ａｓｅ；α−Ｄ−マンノシドマンノヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２４）（Ｓｉｇｍａ）；Ｇｒｅｅｎ Ｃｏｆｆｅｅ Ｂｅａｎ由来α−ガラクトシダーゼ（α−Ｇａｌ−ａｓｅ；α−Ｄ−ガラクトシドガラクトヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２２）（Ｓｉｇｍａ）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ−ａｓｅ；β−Ｄ−ガラクトシドガラクトヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．２３）（Ｓｉｇｍａ）；Ｃｈｉｃｋｅｎ ｌｉｖｅｒ由来α−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅ（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトシドアセトアミドデオキシガラクトヒドロラーゼ；ＥＣ３．２．１．４９）（Ｓｉｇｍａ）；Ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ由来β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（β−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅ；ＥＣ２．４．１．２２）（Ｓｉｇｍａ）；Ｐｉｇ由来、Ｅ．ｃｏｌｉ組み換え体α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（α−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅ；ＥＣ２．４．１．９０）（Ｃａｒｂｉｏｃｈｅｍ）。
４−メチルウンベルリフェリル２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ）は和光純薬から購入した。ＵＤＰガラクトース及び５’−ジホスホネート（ＵＤＰ）はＳｉｇｍａから購入した。カコジル酸ナトリウム塩、ＨＥＰＥＳ［２−｛４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル｝エタンスルホン酸］、ＭＥＳ［２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸］、ＭｎＣｌ２、テトラホウ酸ナトリウム、及び水酸化カリウムはナカライテスク社から購入した。二重脱イオン水はＭｉｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）で調製した。Ｓｅｐ−ＰａｋカートリッジはＷａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．から購入した。Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶシリンジフィルター（０．２２ｍｍ×４ｍｍ、ｉ．ｄ．）は日本ミリポアから購入した。
（２）化学合成の一般的方法
全ての反応に乾燥溶媒を使用した。溶液は減圧下で浴温度が５０℃を越えないようにして蒸発させた。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０）又はＩａｔｒｏ Ｂｅａｄｓ（６０μｌ）（Ｄｉａ−Ｉａｔｒｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で行った。ゲルろ過クロマトグラフィーは、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−２を用いて行った。ＴＬＣスポットはエタノール中の７％１２モリブド（ＶＩ）リン酸ｎ−ハイドレートを用いて可視化した。ＪＥＯＬ ＥＸ−２７０分光光度計を使用して２５℃でＮＭＲスペクトルを取得した。１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ）は、内部標準としてＭｅ４Ｓｉ（δ０．００）又はＤＯＨ（δ４．８０）を使用してＣＤＣｌ３又はＤ２Ｏ中で記録した。１３Ｃ ＮＭＲ（６７．５ＭＨｚ）は、内部標準としてＭｅ４Ｓｉ（δ０．０）、ＣＤＣｌ３（δ７７．０）又はＣＤ３ＣＮ（δ１１８．２）を使用してＣＤＣｌ３又はＤ２Ｏ中で記録した。部分割当てのみを報告する。ＭＡＬＤＩＴＯＦ質量スペクトルは、マトリックスとして２，５−ジヒドロキシ安息香酸を用いてＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｙａｇｅｒ上で記録した。ＴＬＣの発色はＡＴＴＯ写真濃度ソフトウエアライブラリーレーンアナライザー（ＡＴＴＯ Ｃｏｒｐ．）を用いて測定した。
（３）グリコシル転移反応および分析の一般的方法
酵素反応は全量２５０μｌのマイクロチューブ中で行った。反応混合物には、０．１Ｍのカコジル酸塩緩衝液（ｐＨ７）、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、０．１ｍＭのＵＤＰ−Ｇａｌ、０．２ｍＭの４−Ｍｕ−グリコシド、０．５ｍＭの阻害剤、及び２０ｍＵ／ｍＬのガラクトシルトランスフェラーゼを含めた。３７℃で５分間インキュベーションした後、０．１Ｍのホウ酸溶液を５０μｌ添加して８０℃で１０分間加熱することによって反応を停止した。得られた混合物をＭｉｌｌｅｘ ＧＶフィルターを用いてろ過し、沈殿物を除去した。
反応速度分析を、ｉ．ｄ．７５μｍの融合シリカキャピラリーを備えたＷａｔｅｒｓ Ｑｕａｎｔａ ４０００Ｅキャピラリー電気泳動システムで行った。試料を１０ｃｍ高い所で１０秒間静水力学的圧力により充填した。検出は、カソードから７．５ｃｍのところで２１４ｎｍでＵＶ吸収をカラム上で測定することにより行った。フェログラムはＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ ２０１０システム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）上に記録した。
（４）化合物３の還元アミン化の典型的方法
トルエン（３００μｌ）中のアルデヒド体３（９ｍｇ，０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液にフェネチルアミン（４．４μＬ，０．０３５ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で２時間攪拌し、ＴＨＦ（５１．０μＬ，３当量）のＮａＢＨ３ＣＮの１Ｍ溶液を０℃で添加し、室温で一晩攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。還元アミン化の転換率をＴＬＣの写真濃度分析で求めた。スポットはモリブドホスフェート試薬で可視化した。保護されたイミノシクリトールに対応するＵＶ腸性スポットのみを分析した。Ｙｉｅｌｄｓ（％）；４（１），９８．１；４（２），４２．４；４（３），８０．３；４（４）．５７．５；４（５），８０．９；４（６），６１．０；４（７），５４．９；４（８），７９．４；４（９），８０．３．
溶媒の除去後、残渣をメタノール（０．８ｍＬ）及び１ＭのＨＣｌ（０．２ｍＬ）に溶解し、Ｈ２雰囲気下で室温で２日間、触媒量の２０％Ｐｄ（ＯＨ）２と一緒に攪拌した。触媒及び溶媒を除去した後に得られた粗物質をＨ２Ｏ（１ｍＬ）に溶解して、Ｄｏｗｅｘ １Ｘ８（ＯＨ ｆｏｒｍ）と一緒に室温で３０分間攪拌した。溶媒をろ過及び除去した後、残渣をＨ２Ｏに溶解し、１ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）で前処理したＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓ ＣＭカートリッジに装着した。カートリッジをＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄し、１０％ＮＨ３（１０ｍＬ）で溶出した後、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶフィルターでろ過し、凍結乾燥して化合物２（８，１）（２．５ｍｇ、化合物３から５３％）を得た。平行した反応で、２（１，１）（５５％），２（２，１）（６５％），２（３，１）（１０％），２（４，１）（８０％），２（５，１）（３６％），２（６，１）（７４％），２（７，１）（６３％），２（９，１）（２９％）を得た。これらの化合物の選択した物性データを以下に示す。
２（１，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．２０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），３．９８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０，８．４Ｈｚ），３．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，１１．２Ｈｚ），３．６９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．７，１１．２Ｈｚ），３．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５，６．６Ｈｚ），０．９６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ２２Ｎ２Ｏ３：２１８；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２１９（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（２，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ），３．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．６Ｈｚ），３．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５，１０．９Ｈｚ），３．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，１１．２Ｈｚ），２．６６（ｓ，６Ｈ，Ｎ（ＣＨ３）２）．
２（３，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），３．９７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９，７．８Ｈｚ），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，ＣＨ３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１６Ｈ３４Ｎ２Ｏ３：３０２；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３０３（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（４，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），３．９６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．３，８．５Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ８Ｈ１８Ｎ２Ｏ４：２０６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２０７（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（５，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ），４．１９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５，８．６Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１６Ｈ２８Ｎ２Ｏ３：２９６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２９７（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（６，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．８Ｈｚ），３．９４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２，８．３Ｈｚ），３．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８，１１．３Ｈｚ），３．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．２，１１．３Ｈｚ），３．５８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．３８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），２．９３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．７，１２．２Ｈｚ），２．８１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．８５（ｑｕｉｎｔｅｒ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ，Ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ２２Ｎ２Ｏ４：２３４：Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２３５（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（７，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），４．１９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ），４．０３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．１，８．６Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ２２Ｎ２Ｏ４：２４６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２４７（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（８，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ７．４３−７．３５（ｍ，５Ｈ），４．１６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ），３．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９，８．２Ｈｚ），３．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．９，１１．１Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１４Ｈ２２Ｎ２Ｏ３：２６６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２６７（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（９，１）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ４．１８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．４Ｈｚ），３．９６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４，８．３Ｈｚ），３．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，１０．８Ｈｚ），３．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６，１０．５Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ２４Ｎ２Ｏ３：２４４；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２４５（Ｍ＋Ｈ）＋．
（５）化合物３のＳｔｒｅｃｋｅｒ反応の典型的方法
トルエン（７００μｌ）のアルデヒド体３（２４ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）の溶液にフェネチルアミン（６．９μＬ，０．０５４ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で２時間攪拌し、ＴＭＳＣＮ（１８．１μＬ，０．１４ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（９．０μＬ，０．１当量）中の塩化亜鉛の０．５Ｍ溶液を０℃で添加し、室温で一晩攪拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を除去した後、ニトリル化合物５（８）の粗物質（２９ｍｇ，９６．０％ｐ（６：４））を得た。ここで％ｐは、ＴＬＣの写真濃度分析で求めた粗混合物中の生成物の純度を意味し、後ろの括弧内の数字はジアステレオアイソマーの比率を示す。これらのうちで比率がないものは立体異性体が同一のＲｆを有していたことを示す。スポットはモリブドホスフェート試薬で可視化した。保護されたイミノシクリトールに対応するＵＶ陽性スポットのみを分析した。平行した反応で、化合物５（１）（４３ｍｇ，８１．９％ｐ（１：１），化合物３（３９ｍｇ，０．０７４ｍｍｏｌ）から）、化合物５（２）（２６ｍｇ，５８．２％ｐ，化合物３（２７ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）から）、化合物５（３）（２７ｍｇ，９１．２％ｐ（６：４），化合物３（２８ｍｇ，０．０５３ｍｍｏｌ）から）、化合物５（４）（２９ｍｇ，６７．８％ｐ，化合物３（２７ｍｇ，０．０５１ｍｍｏｌ）から）、化合物５（５）（３０ｍｇ，７０．６％ｐ，化合物３（２４ｍｇ，０．０４６ｍｍｏｌ）から）、化合物５（６）（２７ｍｇ，５６．９％ｐ（６：４），化合物３（２５ｍｇ，０．０４６ｍｍｏｌ）から）、化合物５（７）（２６ｍｇ，８７．５％ｐ（６：４），化合物３（２６ｍｇ，０．０４８ｍｍｏｌ）から）、及び化合物５（９）（３０ｍｇ，５７．０％ｐ，化合物３（２６ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）から）を得た。これらの化合物を精製することなく次の反応に使用した。選択した物性データを以下に示す。
５（１）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＣＨＣＮ），１．４３（ｓ，９Ｈ，Ｃ（ＣＨ３）３），０．９１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＣＨ３）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；１１９．３５ ａｎｄ １１８．６５（ＣＮ），８０．９９（Ｃ（ＣＨ３）３），２８．２９（Ｃ（ＣＨ３）３），１３．８４（ＣＨ３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３７Ｈ４７Ｎ３Ｏ５：６１３；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６１４（Ｍ＋Ｈ）＋．
５（２）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，ＣＨＣＮ），２．２２（ｓ，６Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３７Ｈ４８Ｎ４Ｏ５：６２８；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６２９（Ｍ＋Ｈ）＋．
５（３）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ＣＨＣＮ），１．４３（ｓ，９Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４３Ｈ５９Ｎ３Ｏ５：６９７；Ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ ６９８（Ｍ＋Ｈ）＋，７２０（Ｍ＋Ｎａ）＋，７３６（Ｍ＋Ｋ）＋．
５（４）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．４４（ｓ，９Ｈ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ４３Ｎ３Ｏ６：６０１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６０２（Ｍ＋Ｈ）＋，６２４（Ｍ＋Ｎａ）＋．
５（５）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ＣＨＣＮ），１．４６（ｓ，９Ｈ）：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４３Ｈ５３Ｎ３Ｏ５：６９１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６９２（Ｍ＋Ｈ）＋．
５（６）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；δ３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ＣＨＣＮ），３．３１（ｓ，３Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．
５（７）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，ＣＨＣＮ），１．４３（ｓ，９Ｈ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３８Ｈ４７Ｎ３Ｏ６：６４１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６４２（Ｍ＋Ｈ）＋．
５（８）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．２６（ｄｔ．Ｊ＝２．５，７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），３．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．４４（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；１１８．５８（ＣＮ），８１．００（Ｃ（ＣＨ３）３），２８．１４（Ｃ（ＣＨ３）３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ４７Ｎ３Ｏ５：６６１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６６２（Ｍ＋Ｈ）＋．
５（９）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ４．１４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），３．９８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），３．６３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，ＣＨＣＮ），１．４５（ｓ，９Ｈ）：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３９Ｈ４９Ｎ３Ｏ５：６３９；Ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ ６４０（Ｍ＋Ｈ）＋．
（６）ニトリルのアミノ基への典型的な転換反応：化合物２（８，２）の合成
メタノール（０．８ｍＬ）及び１ＭのＨＣｌ（０．２ｍＬ）に溶解した粗化合物５（８）（８ｍｇ，化合物２（７ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）に対応）の溶液に、触媒量の炭素担持２０％Ｐｄ（ＯＨ）２を添加した。反応混合物をＨ２雰囲気下で室温で４日間攪拌した。触媒及び溶媒を除去した後に得られた粗物質をＨ２Ｏ（１ｍＬ）に溶解して、Ｄｏｗｅｘ １Ｘ８（ＯＨ ｆｏｒｍ）と一緒に室温で３０分間攪拌した。溶媒をろ過及び除去した後、残渣をＨ２Ｏに溶解し、１ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）で前処理したＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓ ＣＭカートリッジに装着した。カートリッジをＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄し、１０％ＮＨ３（１０ｍＬ）で溶出した後、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶフィルターでろ過し、凍結乾燥して化合物２（８，２）（２．３ｍｇ、化合物３から５８％）を得た。平行した反応で、２（１，２）（５１％），２（２，２）（４１％），２（３，２）（８％），２（４，２）（４１％），２（５，２）（３２％），２（６，２）（３１％），２（７，２）（２７％），２（９，２）（１２％）を得た。選択した物性データを以下に示す。
２（１，２）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．９０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，ＣＨ３）．
２（２，２）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ１．９５（ｓ，６Ｈ）；
２（３，２）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ３７Ｎ３Ｏ５：３３１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３３２（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（４，２）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ３．７５（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．００（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９Ｈ２１Ｎ３Ｏ４：２３５；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２３６（Ｍ＋Ｈ）＋，２７４（Ｍ＋Ｋ）＋．
２（５，２）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ３１Ｎ３Ｏ３：３２５；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３２６（Ｍ＋Ｈ）．
２（８，２）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ２５Ｎ３Ｏ３：２９５；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２９６（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（９，２）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ２７Ｎ３Ｏ３：２７３；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２７４（Ｍ＋Ｈ）＋，３１２（Ｍ＋Ｋ）＋．
（７）ニトリルのアミド基への典型的な転換反応：化合物２（１，３）の合成
メタノール（０．８ｍＬ）及び６ＭのＫＯＨ（０．２ｍＬ）中の粗化合物５（１）（８ｍｇ，化合物３（１０ｍｇ，０．０１８ｍｍｏｌ）に対応）の溶液に、３０％Ｈ２Ｏ２（１７μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５０℃で２時間攪拌した。冷却後、反応混合物を氷水に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥した。メタノール（０．８ｍＬ）及び１ＭのＨＣｌ（０．２ｍＬ）に溶解したこの残渣に、触媒量の炭素担持２０％Ｐｄ（ＯＨ）２を添加した。反応混合物をＨ２雰囲気下で室温で３日間攪拌した。触媒及び溶媒を除去した後に得られた粗物質をＨ２Ｏ（１ｍＬ）に溶解して、Ｄｏｗｅｘ １Ｘ８（ＯＨ ｆｏｒｍ）と一緒に室温で３０分間攪拌した。溶媒をろ過及び除去した後、残渣をＨ２Ｏに溶解し、１ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）で前処理したＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｐｌｕｓ ＣＭカートリッジに装着した。カートリッジをＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄し、１０％ＮＨ３（１０ｍＬ）で溶出した後、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶフィルターでろ過し、凍結乾燥して化合物２（１，３）（１．４ｍｇ、化合物３から２８％）を得た。平行した反応で、２（２，３）（４２％），２（３，３）（１５％），２（４，３）（３３％），２（５，３）（１７％），２（６，３）（２８％），２（７，３）（１２％），２（８，３）（２７％），２（９，３）（２６％）を得た。選択した物性データを以下に示す。
２（１，３）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ３．３４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），０．９２（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ２３Ｎ３Ｏ４：２６１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２６２（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３７Ｈ４９Ｎ３Ｏ６：６３１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６３２（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（２，３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ２４Ｎ４Ｏ４：２７６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２７７（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３７Ｈ５０Ｎ４Ｏ６：６４６；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６４７（Ｍ＋Ｈ）＋，６８５（Ｍ＋Ｋ）＋．
２（３，３）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ３５Ｎ３Ｏ４：３４５；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３４６（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（４，３）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ３．００（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９Ｈ１９Ｎ３Ｏ５：２４９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ２５０（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ４５Ｎ３Ｏ７：６１９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６２０（Ｍ＋Ｈ）＋，６４２（Ｍ＋Ｈａ）＋．
２（５，３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ２９Ｎ３Ｏ４：３３９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３４０（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：
ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４３Ｈ５５Ｎ３Ｏ６：７０９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ７１０（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（６，３）；１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ３．５４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．３５（ｓ，３Ｈ）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ２３Ｎ３Ｏ５：２７７；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２７８（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（７，３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１２Ｈ２３Ｎ３Ｏ５：２８９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２９０（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３８Ｈ４９Ｎ３Ｏ７：６５９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６６０（Ｍ＋Ｈ）＋．
２（８，３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ２３Ｎ３Ｏ４：３０９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ３１０（Ｍ＋Ｈ）＋，３２２（Ｍ＋Ｎａ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）；δ６．５８，６．４６，５．３９，５．２２（ｂｒ．Ｓ，ＣＯＮＨ２）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１７５．２０ ａｎｄ １７４．６８（ＣＯＮＨ２），１５５．３８（ＮＣＯＯ），２８．３８（ＣＨ３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ４９Ｎ３Ｏ６：６７９；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６８０（Ｍ＋Ｈ）＋，
２（９，３）；ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ２５Ｎ３Ｏ４：２８７；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ２８８（Ｍ＋Ｈ）＋；Ｂｅｆｏｒｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ：ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３９Ｈ５１Ｎ３Ｏ６：６５７：Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ６５８（Ｍ＋Ｈ）＋．
（８）グリコシダーゼに対するライブラリーのスクリーニング
インキュベーションはマイクロタイタープレートウエル（５０μＬ／ウエル）で行った。反応混合物には、適当な緩衝液（α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼについては４０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）、α−マンノシダーゼについては２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５）、α−ガラクトサミニダーゼについては４０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４））、１ｍＭのＰＮＰ−グリコシド、所定量の阻害剤（１ｎＭ〜１ｍＭ）、及びグリコシダーゼ（０．４Ｕ／ｍＬのα−グルコシダーゼ、０．２Ｕ／ｍＬのα−ガラクトシダーゼ、１Ｕ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ、０．２Ｕ／ｍＬのα−マンノシダーゼ、０．６Ｕ／ｍＬのα−ガラクトスアミニダーゼ）を含めた。化合物２（３，Ｙ）の場合には、化合物をＤＭＳＯに溶解し、Ｈ２Ｏで希釈することにより（Ｈ２Ｏ：ＤＭＳＯ＝６：１（ｖ／ｖ））、ストック５ｍＭ溶液を先ず調製し、溶液の一部を各反応に使用した。室温で５分間インキュベートした後、０．２Ｍの炭酸ナトリウム５０μＬを添加して反応を停止した。各実験は二重で行った。ライブラリーの一連の化合物の阻害の結果を図６（ＡからＦ）に示す。
（９）α−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅのアッセイ
インキュベーションは反応速度分析のために各時間（１〜１５分間）についてα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下でｐＨ６．５で行った。α−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅに対するイミノ糖の阻害アッセイは、０．５ｍＭのイミノ糖の存在下で５分間、反応速度分析と同一の条件下で行った。これらのイミノ糖は何れもα−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅに対して阻害活性を示さなかった。
電気泳動は、６０ｃｍの融合シリカキャピラリーを用いて１５ｋＶで行った。アクセプター４−ＭＵ−ＬａｃＮＡｃ（６）及び生成物４−ＭＵ−Ｇａｌ−α１−３−Ｇａｌ−β−１−４ＧｌｃＮＡｃ（７）の移動時間は各々、９．３分及び１０．０分であった。Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８後の反応混合物の質量スペクトル分析は満足なデータを与えた。
ＭＡＬＤＩＴＯＦ ＭＳ；
化合物６：Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ３１ＮＯ１３：５４１；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ５６４（Ｍ＋Ｎａ）＋，
化合物７：Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ４１ＮＯ１８：７０３；Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ ７２６（Ｍ＋Ｎａ）＋
（１０）β−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅに対するライブラリーのスクリーニング
インキュベーションは反応速度分析のために各時間（１〜１５分間）についてβ−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅの存在下でｐＨ７．０で行った。イミノ糖の阻害アッセイは、０．５ｍＭのイミノ糖の存在下で５分間、反応速度分析と同一の条件下で行った。阻害の結果を図４（Ｇ）に示す。
電気泳動は、４９ｃｍの融合シリカキャピラリーを用いて２０ｋＶで行った。５０ｍＭのホウ酸ナトリウムを電解質として使用した。アクセプター４−ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃ及び生成物４−ＭＵ−ＬａｃＮＡｃ（６）の移動時間は各々、２．４分及び２．６分であった。
（Ｂ）結果および考察
（１）コンビナトリアルライブラリーの合成
本実施例では、ピロリジン環の立体配座に応じてガラクト型（１ａ）又はマンノ型（１ｂ）の何れかとなる、２（Ｓ）、３（Ｒ）、４（Ｓ）、５（Ｒ）−立体配置を有する５員のイミノシクリトールを選択した（図２）。５員環系は６員環系よりも立体配置的に柔軟であり、生理的条件では多様な立体配座の平衡として存在する。従って、両方の立体配座（１ａ及び１ｂ）は糖鎖関連酵素研究の構造上の候補と考えるべきである。５員系の特徴はコンビナトリアルライブラリーのリード構造として有利であると考えられる、この場合にはさらなる特異性や親和性を構造２に官能基を添加することによって引き出すことができる。異なる立体配座は結合特異性に関して対応する酵素ファミリーを目的とするものであり、これらの立体配座（２ａ及び２ｂ）をライブラリー中の「立体配座多様性因子」として処理できると考えた（図３）。
糖鎖関連酵素を目的とした炭水化物関連のライブラリーの報告はほとんど存在しない（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｕ．Ｊ．，他（１９９８）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６，１５６３−１５７５；Ｗｉｓｃｈｎａｔ，Ｒ．，他（１９９８）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８，３３５３−３３５８；Ｌｏｈｓｅ，Ａ．，他（１９９９）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７，１９６５−１９７１；Ｌｏｈｓｅ，Ａ．，他（１９９９）．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４０，３０３３−３０３６；Ｔａｋａｙａｎａｇｉ，Ｍ．，他（２０００）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５，３８１１−３８１５；及びＭａｌｅｔ，Ｃ．，他（１９９７）．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０３，５１−６５）。遷移状態阻害剤（Ｗｉｓｃｈｎａｔ，Ｒ．，他（１９９８）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８，３３５３−３３５８；Ｌｏｈｓｅ，Ａ．，他（１９９９）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７，１９６５−１９７１；Ｌｏｈｓｅ，Ａ．，他（１９９９）．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．４０，３０３３−３０３６；及びＴａｋａｙａｎａｇｉ，Ｍ．，他（２０００）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６５，３８１１−３８１５）に基づく試みは特に興味深い。多様性が生成する仕組みについては複数の可能性が存在する。即ち、直線型（二重官能化合成ユニットの反復反応を含む）、足場型（鋳型と複数の官能基との反応を含む）、及びカスケード型（反応産物が次の反応のための別の機能を付与する）である（Ｂａｌｋｅｎｈｏｈｌ，Ｆ．，他（１９９６）．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３５，２２８８−２３３７）。対象となる一連の分子は低分子量であること、並びに、関連酵素の結晶写真データによればタンパク質表面の約１００Åを覆う標的酵素の主な触媒部位に合致する必要があることを考慮すれば（Ｍｕｒａｌｉ，Ｒ．，他（１９９４）．Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３９，５７８−５８０；Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．，他（１９９４）．Ｎａｔｕｒｅ．３６９，７６１−７６６；Ｇａｓｔｉｎｅｌ，Ｌ．Ｎ．，他（１９９９）．ＥＭＢＯ Ｊ．１８，３５４６−３５５７；Ｕｉｔｄｅｈａａｇ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．，他（１９９９）．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６，４３２−４３６；及びＶａｌｌｅｅ，Ｆ．，他（２０００）．ＥＭＢＯ．Ｊ．１９，５８１−５８８）、作製した分子に追加される官能基（一般式（Ｉ）中のＲ２、Ｘ及びＹ）は散乱すべきではなく、イミノシクリトールであるコアユニットに隣接して縮合すべきである。
化合物１の多様性を誘導するために、Ｃ１’位のアルデヒド基を使用した。これは、疎水度の増加は細胞膜の通過には有利であるが（Ｆｌｅｅｔ，Ｇ．Ｗ．Ｊ．，他（１９８８）．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２３７，１２８−１３２；Ｋａｒｐａｓ，Ａ．，他（１９８８）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５，９２２９−９２３３；及びＡｓａｎｏ，Ｎ．，他（１９９５）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８，２３４９−２３５６）、環窒素のＮ−アルキル化により分子レベルでの阻害が減少する場合が多いという知見に基づくものである（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，他（１９９９）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，５２８０−５２９１；及びＳａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）。アルデヒド体３を既報の通り合成し、ライブラリーを作製するために使用した（Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）。先ず、還元アミン化、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ縮合、Ｕｇｉ型反応およびＭａｎｎｉｃｈ反応を含む各種の反応条件のために、化合物３とアミンとの反応によって形成したイミンを利用し、生成物のアシル化によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を導入して多様性を増大し、反応混合物からの縮合生成物のフィッシュアウト処理を容易にした。しかし、そのような反応では、十分な結果を与えない反応があった。この原因は、反応部位周辺のアミンのｔ−ブチルカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジル（Ｂｎ）及びＸの立体障害であることが示唆された。適用可能と判明した反応は、アシル化を伴なわない還元アミン化とＳｔｒｅｃｋｅｒ反応であったが、適用可能な反応はこれらに限定されるものではなく、所望の生成物が得られる限り他の反応を使用してもよい。イミノシクリトールに基づいたライブラリーでは大きい多様性は得られなかったが、代わりにニトリル基からアミノ、アミド及びカルボン酸（Ｙ）への転換反応を含めることにした。選択したＸ基およびＹ基を図３に示す。
先ず、幾つかのアミン（Ｘ−Ｈ）を用いて化合物３の還元アミン化反応を行った。イミンの還元は、シアノボロハイドライドナトリウムを用いた標準的条件下で円滑に進行し、化合物４（１−９）が得られ、これを酸性条件下で水素添加により１工程で脱保護し、Ｓｅｐ−ＰａｋＣＭカートリッジを用いて高収率で化合物２（１−９，１）が得られた。還元アミン化反応の個々の転換率は、ＴＬＣプレートの写真濃度分析により求め、化合物３は４２〜９８％の収率で化合物４に転換した。
次に、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ反応を行った。９種のアミンでイミンを形成した後に、トリメチルシリルシアニド（ＴＭＳＣＮ）を触媒ＺｎＣｌ２の存在下で使用した（Ｏｊｉｍａ，Ｉ．，他（１９７５）．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７３７−７４０）（スキーム１、図３）。ルイス酸なしでは反応は進行しなかった。何れの場合も有意な立体選択性は見られなかったことから、ルイス酸はイミン中間体を直接活性化し、副次的影響は見られなかったので他の官能基を介して活性化しているのではないことが示唆された。縮合産物を単離することなく次の反応に付した。アルデヒド体３から化合物５への転換率は写真濃度によれば５７〜９７％の範囲であった。混合物を加水分解及び還元などの各反応条件に付して、ニトリル基を各々カルボキシレート、アミド及びアミンに転換した。化合物５（１−９）を還元してアミン２（１−９，２）に転換する反応は、酸性水素添加条件下で行い、同時にＢｏｃとＢｎを除去した。ニトリル基を加水分解してカルボン酸及びアミド（Ｙ）を得ようとした場合、酸性及び塩基性の水素添加条件により共に複雑な混合物が得られた。そこで、化合物５（１−９）を酸化的にアミドに転換し、これを次に水素添加して化合物２（１−９，３）を生成した。温度の上昇後でもこの条件下では、中間体からカルボキレートに転換することはできなかった。
スキーム１：
アルデヒド体３の還元アミン化及びＳｔｒｅｃｋｅｒ反応により化合物４（Ｘ）及び５（Ｙ）が生成する。化合物５（Ｘ）のニトリル基はさらにＹのアミン−及びアミド−官能基に転換した。これらの化合物の脱保護により化合物２（Ｘ，Ｙ）が生成する。
阻害剤の候補として化合物２（１−９，１）を使用して、試験すべき糖鎖関連酵素を選択した。α−Ｇａｌ−ａｓｅ、β−Ｇａｌ−ａｓｅ及びα−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅをガラクト立体配置の化合物２ａ（Ｘ、Ｙ）（図３）の相手として選んだ（図３）。化合物１は２７μＭのＫ１値を有するＵＤＰ−Ｇａｌに対するβ−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅの阻害剤であるので、２種類のグリコシルトランスフェラーゼ（即ち、β−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅおよびα−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅ）も含めた（Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）。同様に、α−Ｍａｎ−ａｓｅを、マンノ立体配置化合物２ｂ（Ｘ，Ｙ）のために選択した。α−Ｇｌｃ−ａｓｅも追加した。
（２）糖鎮関連酵素に対するライブラリーのスクリーニング
α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼに対するライブラリー化合物の阻害効果をアッセイするために（Ｓｈａｒｍａ，Ａ．，他（１９９６）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，７１９０−７１９５；Ｓｕｊｉｎｏ，Ｋ．，他（１９９８）．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５，４８３−４８９；Ｃｈｅｎ，Ｘ．，他（１９９９）．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３，６５０−６５８；及びＴａｋａｙａｍａ，Ｓ．，他（１９９９）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７，４０１−４０９）、先ず酵素を用いて必要な基質及び生成物を合成した。４−メチルウンベルリフェリル（４−Ｍｅ）ＬａｃＮＡｃ（化合物６）を、既報（Ｋａｎｉｅ，Ｙ．，他（１９９８）．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６３，２４０−２４５）の方法に従って合成し、基質として使用した。トランスフェラーゼの存在下での化合物６とＵＤＰ−Ｇａｌとの反応における化合物７の形成は、キャピラリー電気泳動を用いて図４（スキーム２）に示す典型的なエレクトロフェログラム分析として確認した。酵素反応の時間経過分析も行った（図５）。この条件下では、転移反応は１６分後に完結した。化合物７は単離しなかったが、Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８後における反応混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析は、化合物６および化合物７の存在を示した。
スキーム２：
４−ＭＵ−ＧｌｃＮＡｃから調製した４−ＭＵ−ＬａｃＮＡｃ（６）を、ＵＤＰ−Ｇａｌの存在下でα−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの作用によりキセノ抗原トリ炭水化物に転換した。
本発明の方法の有効性を調べ、ライブラリーの構成要素がグルコシダーゼ及びグルコシルトランスフェラーゼの阻害剤となるかどうかを調べるために、阻害剤の濃度を固定して、予備的な阻害スクリーニングアッセイを行った。各酵素反応に適した濃度を、各種濃度のライブラリーの各化合物および／又は既知の酵素阻害剤を用いた初期阻害試験により決定した。阻害は、測定した濃度での百分率で示した。各酵素反応はタイタープレートのウエル中で行い、対応する基質に対する阻害を、グリコシダーゼのアッセイの場合には、ｐ−ニトロフェノールの４０５ｎｍにおける吸収で求めた。通常の阻害剤が入手可能である場合は、結果の標準のために使用した。
グリコシルトランスフェラーゼの阻害アッセイのために、４−Ｍｕ−ＧｌｃＡｃ、化合物６及び７などの対応する４−ＭＵ−グルコシドを使用した。阻害反応はマイクロ遠心チューブ中で５分間行い、阻害活性は、２１４ｎｍでキャピラリー電気泳動を用いてアクセプター基質に対する転換率として測定した。
図６に示す通り、阻害が見られなかったのでグラフを省略したα−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅを除いて、ライブラリーの一連の化合物は、試験した酵素について広い阻害スペクトルを示した。酵素に依存して、ある化合物は親化合物１と比較して阻害活性の劇的な増大を示した。そのような例は、α−Ｇｌｃ−ａｓｅ（Ａ）、α−Ｍａｎ−ａｓｅ（Ｂ）、α−Ｇａｌ−ａｓｅ（Ｃ）、α−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅ（Ｄ）及びβ−Ｇａｌ−ａｓｅ（Ｅ，Ｆ）について見られた。１００μＭの阻害濃度を有するα−Ｇｌｃ−ａｓｅの阻害については、ある化合物は化合物１の２倍の効力を示したが、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）に匹敵する阻害を示す化合物はなかった。イミノ糖から遠い疎水性はα−Ｍａｎ−ａｓｅの場合には好ましく、Ｃ１０アルキルを有する化合物２（３，１）は化合物１（Ｋｉ＝２７μＭ）（Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）及びデオキシマンノジリマイシン（ＤＭＮ、Ｋｉ＝４３μＭ）（Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）に対して各々、１０μＭでの阻害について２７６及び１１２０％の増大を示した。α−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅの阻害については、シアスタチンＢアナログのみがμＭ範囲のＩＣ５０値を有する阻害剤として報告されている（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．，他（１９９６）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４，９１−９６）。８種のうちの５種の化合物は、ｎＭのオーダーで親化合物（１）と比較して２倍以上効力が高いことが判明した。これらの中でも、フェネチル基を有する化合物２（８，１）は４６７％強い活性を示した。β−Ｇａｌ−ａｓｅの場合、試験した化合物は全てが、化合物１（Ｋｉ＝１．０ｍＭ）と比較して、酵素の非常に有効な阻害剤であったが（Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１）、（Ｆ）に示すようにμＭ範囲の弱い阻害を示した。また、化合物間で活性に有意な相違はなかったので、Ｃ−１’位の置換は結合には重要ではないことが示唆された。β−ＧａｌＴ−ａｓｅ（Ｇ）及びα−ＧａｌＴ−ａｓｅの２つの酵素はＵＤＰ−Ｇａｌをドナー基質として共有するにも拘わらず、ある化合物はβ−ＧａｌＴ−ａｓｅに対して阻害を示し、α−ＧａｌＴ−ａｓｅに対して阻害を示す化合物がなかったことは注目すべきで、本発明の化合物は、ドナー遷移状態に類似している可能性がある。
化合物２（３，１）及び２（８，１）等の強い阻害効果を有することが分かった化合物を次の評価用のリード化合物として選択し、Ｙ基の効果を調べた（図７）。化合物２（３，２）及び２（３，３）は、この濃度ではα−Ｍａｎ−ａｓｅに対する阻害活性をほぼ喪失した。化合物２（８，２）及び２（８，３）はその条件下で、化合物２（８，１）の阻害作用の各々５２．８％及び５０．５％でα−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅを阻害した。
試験した酵素については全く異なる阻害スペクトルが観察され、これはコアユニットを同一に維持しつつ、選択性がＣ−１’位の置換基によって制御できることを示している。また、これらの化合物は、基質特異性がガラクト系統及びマンノ系統の両方の酵素に対して阻害を示した。この結果は、ピロリジン環のライブラリーを異なる立体配座を有する混合物として処理できることを意味し、当該化合物は非常に有用である。
産業上の利用の可能性
本発明により、新規なアザ糖化合物が提供される。本発明のアザ糖化合物はグリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼなどの糖鎖関連酵素の特異的阻害剤として有用であり、例えば、糖鎖関連酵素が関与する疾患の治療又は予防のための医薬として有用であり、より具体的には、抗ウイルス剤、抗がん剤又は免疫賦活剤として有用である。
また、糖鎖関連酵素の効果的なデザイン合成は困難な問題が多く残されているが、コンビナトリアルライブラリー合成法はハイスループットスクリーニング法と合わせて迅速に活性の高い化合物を見出す有効な手段として医薬品開発分野において注目されている。一方、酵素内ペプチド鎖の立体配座の再配列による誘導適合（ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｔ）に基づく認識現象に着目することにより、新規な酵素阻害剤を見い出すことができる可能性がある。誘導適合には、酵素がその構造を変化させる場合と、基質あるいは阻害物質が酵素活性部位の構造に合うように構造変化する場合がある。五員環化合物は遷移状態の半椅子型立体配座を模倣するのみならず、環構造は自由度に富み、特定立体配置の水酸基を有する五員環アザ糖は、立体配座変化に伴い異なる糖を模倣する可能性がある。即ち、五員環アザ糖では、誘導適合により与えられた酵素により適当な配座が選択される可能性がある。従って、本発明の化合物は、立体配座の多様性による利用価値が付加された化合物ライブラリーとして提供することができ、医薬品開発において有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、グリコシドの酵素加水分解反応の遷移状態を示す図である。加水分解反応は、遷移状態として屈曲した半イス様立体配座を包含する。
図２は、５員イミノ糖１、並びに２種類の可能な異性体を示す。化合物１はガラクトース類似体又はマンノース類似体の何れかである。異性体の間には平衡が存在する。即ち、「１化合物」は異なる立体特異性を有する異なる一連の酵素に対する標的化合物の候補となる。従って、５員イミノシクリトール類は薬物分子設計上の母核として有利な構造であると考えられる。
図３は、コンビナトリアルライブラリーの図を示す。Ｃ−１’位で、多様性を導入し（Ｘ、Ｙ）、その構造を示す。一連の化合物２（Ｘ，Ｙ）は、ガラクト異性体２ａ及びマンノ異性体２ｂの平衡状態にある５員イミノ糖を共有している。
図４は、キャピラリー電気泳動によるα−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅのモニタリングを示す。アクセプター及びドナー基質として化合物６及びＵＤＰ−Ｇａｌを各々使用した酵素反応の典型的なエレクトロフェログラムを示す。
図５は、α−１，３−ＧａｌＴ−ａｓｅ反応の時間経過を示す。時間経過実験はα−ガラクトシル転位反応について行った。反応は１６分で完結した。
図６は、各種の糖鎖関連酵素に対する化合物２（Ｘ、１）の阻害活性を示す。
Ａ：１×１０−４Ｍの阻害剤濃度でのα−Ｇｌｃ−ａｓｅの阻害；
Ｂ：１×１０−５Ｍの阻害剤濃度でのα−Ｍａｎ−ａｓｅの阻害；
Ｃ：１×１０−５Ｍの阻害剤濃度でのα−Ｇａｌ−ａｓｅの阻害；
Ｄ：１×１０−７Ｍの阻害剤濃度でのα−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅの阻害；
Ｅ及びＦ：各々１×１０−３Ｍ及び１×１０−５Ｍの阻害剤濃度でのβ−Ｇａｌ−ａｓｅの阻害；及び
Ｇ：５×１０−４Ｍの阻害剤濃度でのβ−１，４−ＧａｌＴ−ａｓｅの阻害；
化合物１及び８の合成は、Ｓａｏｔｏｍｅ，Ｃ．，他（２０００）．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．８，２２４９−２２６１に報告されている。
図７は、α−Ｍａｎ−ａｓｅ及びα−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅに対する化合物２（３，Ｙ）及び２（８，Ｙ）の阻害活性を示す。２系統の化合物２（３，Ｙ）及び２（８，Ｙ）を選択してＹ基の効果を評価した。
Ａ：１×１０−５Ｍでのα−Ｍａｎ−ａｓｅの阻害；
Ｂ：１×１０−７Ｍでのα−ＧａｌＮＡｃ−ａｓｅの阻害；
Claims (7)
- 一般式（Ｉａ）で示される化合物又はその塩を含む、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ又はα−ガラクトサミニダーゼの阻害剤。
- 一般式（Ｉａ）の立体構造が以下の一般式（Ｉｂ）であることを特徴とする、請求項１に記載のα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ又はα−ガラクトサミニダーゼの阻害剤。
- 一般式（Ｉａ）の立体構造が以下の一般式（Ｉｃ）であることを特徴とする、請求項１に記載のα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ又はα−ガラクトサミニダーゼの阻害剤。
- Ｒ２が−ＣＨ２ＯＲ１２（ただし、Ｒ１２は水素原子を示す）である、請求項１から３の何れかに記載のα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ又はα−ガラクトサミニダーゼの阻害剤。
- 請求項１から４の何れかに記載のα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−マンノシダーゼ又はα−ガラクトサミニダーゼの阻害剤を有効成分として含む医薬。
- 糖鎖関連酵素が関与する疾患の治療又は予防のための医薬である、請求項５に記載の医薬。
- 抗ウイルス剤、抗がん剤又は免疫賦活剤として使用する、請求項５又は６に記載の医薬。
Applications Claiming Priority (3)
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