JP2002509697A - ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を生成するための方法 - Google Patents
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を生成するための方法Info
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Abstract
Description
号から優先権を得、あらゆる目的で参照によりその全体が組み込まれる。
チドを強制的に分子進化させる技術分野に存する。
めに使用されてきた(1、2)。所与の最適化問題に対する手法の選択は、部分
的に、配列、構造および機能の間の関係の理解の程度に依存する。合理的再設計
は一般に構造と機能の関係についての広範な知識を必要とする。有向進化は構造
と機能の関係に関する特定の知識をほとんどまたは全く必要としない。むしろ、
その本質的特徴は最適化すべき機能を評価する手段である。有向進化は、突然変
異体分子のライブラリの生成と、それに続く望みの機能に対する選択または選別
を含む。望みのその特性または1組の特性に関して改善を示す遺伝子生成物は選
択または選別で同定される。有益な突然変異を集積するために、これらの生成物
を符号化する遺伝子をこのプロセスの追加の周期にかけることができる。この進
化は、どこまで進歩することを望むか、および各世代で典型的に観察される突然
変異の効果に応じて、少数又は多数の世代を要することがある。このような手法
は、新規の機能性核酸(3、4)、ペプチドおよびその他の小分子(3)、抗体
(3)、並びに酵素およびその他の蛋白質(5、6、7)を作成するために使用
されてきた。これらの手順は機能評価において不正確さおよび雑音に対してかな
り寛容である(7)。
公開97/07205号、国際公開98/42727号、米国特許第58077
23号、米国特許第5,721,367号、米国特許第5,776,744号お
よび国際公開98/41645号、米国特許第5,811,238号、国際公開
98/41622号、国際公開98/41623号、および米国特許第5,09
3,257号を参照)。
ロセス[89,90]およびランダム・プライミング組換え[87]からなる。
このような方法は一般に集合/組換え段階中に有意量のDNAを合成し、続いて
最終生成物を増幅するものであり、遺伝子サイズの増大につれて増幅効率が低下
する。
されてきた。ベクターで形質転換され、部分的に挿入断片と重複する細胞は相同
性の領域で挿入断片を接合し、機能的な、共有結合で閉じたプラスミドを復元す
る[91]。この方法は組替えのいかなる段階でもPCR増幅を必要とせず、従
ってこの方法に固有のサイズの問題がない。しかし、1つの組換え事象で導入さ
れるクロスオーバの数は多数の挿入断片を含む1つの細胞の形質転換の効率によ
って制限される。他のin vivo組換え法はタンデム配向における同じプラ
スミドでクローン化された2つの親遺伝子間の組替えを伴うものである。1つの
方法ではキメラ遺伝子を生成するために細菌細胞の相同組換え機構を利用する[
92]。タンデムの第1遺伝子は標的蛋白質のN末端部分を提供し、第2遺伝子
はC末端部分を提供する。しかし、1つのクロスオーバだけがこの手法で発生す
る。別のin vivo組換え法ではベクターにおける基質の同じタンデム組織
化を使用する[93]。E.coli細胞への形質転換の前に、プラスミドは親
配列間のエンドヌクレアーゼ消化で線形化される。組換えは二本鎖切断修復を司
る酵素によりin vivoで行われる。線状分子の末端は5’→3’エキソヌ
クレアーゼ活性により分解され、続いて相補的一本鎖3’末端がアニールされ二
本鎖プラスミドが復元される[94]。この方法は環状プラスミドにおけるタン
デム組換えと同様な利点および欠点を有する。
提供する。この方法はヘテロ二本鎖を含むアニールしたポリヌクレオチドを生成
する条件下で親ポリヌクレオチド変種の集団をインキュベートすることを含んで
いる。ヘテロ二本鎖は次いで細胞DNA修復システムに曝されて親ヌクレオチド
変種または組換えポリヌクレオチド変種に変換される。得られたポリヌクレオチ
ドは次いで望みの特性に関して選別または選択される。
れる。適当な修復システムは細胞抽出物の形で調製できる。
れる。したがってヘテロ二本鎖は宿主細胞のDNA修復システムにin viv
oで曝される。
を含む形質転換細胞に対してヘテロ二本鎖が選択される。これは、例えば、第1
ベクターの成分として第1ポリヌクレオチド変種を提供することにより達成でき
、第2ポリヌクレオチド変種は第2ベクターの成分として提供される。第1およ
び第2ベクターは、第1および第2ポリヌクレオチド変種が反対側の末端に生じ
る、線形化された形に変換される。インキュベート段階で、第1線形化ベクター
の一本鎖形は互いに再アニールされ、線形第1ベクターを形成し、第2線形化ベ
クターの一本鎖形は互いに再アニールされ、線形第2ベクターを形成し、第1お
よび第2ベクターの一本鎖線形化された形は互いにアニールされ、各鎖にニック
を有する環状ヘテロ二本鎖を形成する。したがって生成物を細胞に導入すると線
状の第1および第2ベクターに対して環状ヘテロ二本鎖が選択される。任意選択
で、上記の方法で、第1および第2ベクターをPCRにより線形化された形に変
換することができる。また別法として、第1および第2ベクターを第1および第
2制限酵素による消化で線形化された形に変換することができる。
階の前に一本鎖形に変換される。任意選択で、このような変換は第1ポリヌクレ
オチド変種の第1鎖、および第2ポリヌクレオチド変種の第2鎖を増幅するため
に第1および第2二本鎖ポリヌクレオチド変種の非対称増幅を行うことによる。
第1および第2鎖はヘテロ二本鎖を形成するためにインキュベート段階でアニー
ルする。
団が二本鎖形で与えられ、この方法はさらに第1および第2ベクターの成分とし
て第1および第2ポリヌクレオチドを取込むことを含む。ここで第1および第2
ポリヌクレオチドは第1および第2ベクターの反対側の末端を占める。インキュ
ベート段階で、第1線形化ベクターの一本鎖形は互いに再アニールされ、線形第
1ベクターを形成し、第2線形化ベクターの一本鎖形は互いに再アニールされ、
線形第2ベクターを形成し、第1および第2ベクターの一本鎖線形化された形は
互いにアニールされて各鎖にニックを有する環状ヘテロ二本鎖を形成する。導入
段階で、線形第1および第2ベクターに対して環状ヘテロ二本鎖を含む形質転換
細胞が選択される。
。ある方法では、ポリヌクレオチド変種はポリペプチドの変種を符号化する。あ
る方法では、ポリヌクレチオド変種の集団が少なくとも20の変種を含む。ある
方法では、ポリヌクレオチド変種の集団が少なくとも長さ10kbである。
ヌクレオチド変種は変異原性PCRまたはカセット変異誘発で発生した変種を含
む。ある方法では、ヘテロ二本鎖が導入される宿主細胞が細菌細胞である。ある
方法では、異なるポリヌクレオチド変種の集団が互いに少なくとも90%の配列
同一性を有する少なくとも5個のポリヌクレオチドを含む。
る段階を含む。脱メチル化はPCR増幅によってまたは変種をメチル化欠損宿主
細胞中を通過させることによって達成できる。
つ以上のニックを封じる追加の段階を含む。ニックはDNAリガーゼによる処理
で封じることができる。
。ある方法では、ポリヌクレオチド変種はその変種によって産生が触媒される組
換え蛋白質または二次代謝産物を産生するものが選別される。
物を形成する。
ゼ、カチナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼお
よびフィターゼからなる群から選ばれた酵素を符号化する。他の方法では、ポリ
ヌクレオチド変種は、インシュリン、ACTH、グルカゴン、ソマトスタチン、
ソマトトロピン、チモシン、上皮小体ホルモン、色素ホルモン、ソマトメジン、
エリスロポイエチン、黄体形成ホルモン、胎盤性性腺刺激ホルモン、視床上部(
hyperthalmic)放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、
レラクシン、インターフェロン、トロンボポイエチン(TPO)、およびプロラ
クチンからなる群から選ばれたポリペプチドを符号化する。
路を形成する複数の酵素を符号化する。
を有するか、有しないかを決定する二段階過程である。選択は選別の1つの形で
あって、同定および物理的分離が、ある遺伝的環境では細胞に生存する標識を発
現することを可能にするが、他の細胞は死滅する(逆もまた同じ)選択標識の発
現により同時に達成される。選別構成要素の例にはルシフェラーゼ、β−ガラク
トシダーゼおよび緑蛍光蛋白質が含まれる。選択標識には薬剤および毒物耐性遺
伝子が含まれる。自然選択は自然進化の過程で生じ得るが、この方法では選択は
人により行われる。
同種であるが宿主細胞核酸内のその要素が通常見られない位置にあるものである
。外因性DNAセグメントは発現されると外因性ポリペプチドをもたらす。
指すために広く使用される。したがって、遺伝子は配列の符号化および/または
その発現に必要な規制配列を含む。遺伝子は例えば、他の蛋白質に対する認識配
列を形成する非発現DNAセグメントをも含む。
する。「野性型」蛋白質は、蛋白質が自然に見られる活性の水準で活性であり、
典型的には自然に見られるアミノ酸配列を含む。一面では、用語「野性型」また
は「親配列」を本発明の操作前の出発配列または基準配列を示す。
モル数に基いて、組成物中の他のいかなる高分子種よりも豊富である)、好まし
くは実質的に精製された分画が、目的種が存在する全高分子種の少なくとも約5
0%(モル数に基づいて)を含む組成物であることを意味する。一般に、実質的
に純粋な組成物は組成物に存在する全高分子種の約80〜90%以上を含むこと
になる。最も好ましくは、目的種が本質的に均一になる(汚染種が慣用の検出法
で組成物中に検出できない)まで精製され、組成物は本質的に単一高分子種から
なる。溶媒種、小分子(500ドルトン以下)、および元素イオン種は高分子種
と見なされない。
較し、両方の配列で同じ核酸塩基が位置の数を求めて一致する位置の数を得、一
致した位置の数を比較ウィンドウの位置の全数で割って計算する。比較ウィンド
ウを整列するための配列の最適整列はアルゴリズムGAP、BESTFIT、F
ASTA、and TFASTA in the Wisconsin Gen
etics Software Package Release 7.0、G
enetics Computer Group、575 Science D
R.,Madison、WIのコンピュータ化実施により行うことができる。
ることができる対象を記述するために使用される。例えば、生物(ウイルスを含
む)に存在し、自然の起源から分離でき、実験室で人により意図的に修飾されな
かったポリペプチドまたはポリヌクレオチドは自然発生である。一般に、自然発
生の語は、種にとって典型的である、非病理的(病気でない)個体に存在するよ
うな対象を指す。
ば、プロモータまたはエンハンサは、符号化配列の転写を増大させる場合、符号
化する配列に動作可能に結合される。動作可能に結合されるとは、結合されるD
NA配列が通常は隣接し、2つの蛋白質符号化領域を接合する必要がある所では
隣接し、読取り枠にあることを意味する。しかし、エンハンサは一般にプロモー
タから数キロ塩基だけ離れているときに機能し、イントロン配列が可変長のこと
があるので、ある種のポリヌクレオチド要素は動作可能に結合されるが隣接して
はいない。
06M-1の結合親和性を意味する。
る遺伝子配列を指す。例えば、これだけには限らないが、ヒト・ゲノムでは、ヒ
トCD4遺伝子はマウスCD4遺伝子と同族遺伝子である。これら2つの遺伝子
の配列および構造が、それらが高度に同質であり、両方の遺伝子がMHCクラス
II制限抗原認識によりT細胞活性化の信号化で機能する蛋白質を符号化するこ
とを示すからである。
本鎖間の塩基対により生じた対合DNAを指し、「ホモ二本鎖」という用語は、
同じ親二本鎖分子から誘導された相補的一本鎖間の塩基対により生じた二本鎖D
NAを指す。
チド間のリン酸ジエステル結合の欠如を指す。二本鎖DNA中の「ギャップ」と
いう用語は、二本鎖の1つの鎖の1つ以上のヌクレオチドの欠如を指す。二本鎖
DNA中の「ループ」という用語は、1つの鎖中の1つ以上の不対ヌクレオチド
を指す。
なる野性型または基準配列からの実質的変化を示す配列である。
提供する。この方法のための基質は互いに類似の領域を含むが、また相違する点
または領域をも有する少なくとも二種のポリヌクレオチド変種の配列である。基
質は類似の領域でin vitroでアニールされる。アニールは最初の基質を
再生でき、または成分鎖が異なる親を起源とするヘテロ二本鎖を形成できる。ア
ニールの生成物はDNA修復酵素、および任意選択で不適正対形成を修復する複
製システムに曝される。被曝は、アニール生成物が宿主細胞に形質転換され、宿
主DNA修復システムに曝されるときと同様に、in vivoで行うことがで
きる。別法として、被曝は、アニールした生成物が機能性DNA修復システムを
含む細胞抽出物に曝されるときと同様に、in vitroで行うこともできる
。ヘテロ二本鎖をDNA修復システムに曝すと、DNA不適正によりヘテロ二本
鎖のバルツ部分でDNAが修復される。修復過程は鎖間の相違の比相互交換を促
進する相同性組換えとは異なる。DNA修復過程は典型的にはヘテロ二本鎖分子
の両方の成分鎖に生じ、ある特別な不適正で鎖が修復されるように典型的にラン
ダムである。生じる集団はこのように親鎖間の相違点の本質的にランダムな再組
合せを含む組換えポリヌクレオチドを含むことができる。組換えポリヌクレオチ
ドの集団は次いで望みの特性を獲得するために選別される。特性は、蛋白質に結
合するDNA分子の能力のような、本質的にポリヌクレオチドの特性とすること
ができ、mRNAまたは蛋白質のような、その発現生成物の特性とすることもで
きる。
ある領域を示す、基準ポリヌクレオチドの変種である。類似性の領域は安定なヘ
テロ二本鎖が形成されるようなポリヌクレオチドのアニーリングを支持するため
に十分である。変種形はしばしば互いに実質的配列同一性を示す(例えば、少な
くとも50%、75%、90%または99%)。組換えが出発物質があるよりも
より異なる生成物を生じることができる基質間の少なくとも十分な相違があるは
ずである。このように、少なくとも2つの位置で異なる少なくとも2つの基質が
あるはずである。相違の程度は組換えられる基質の長さおよび進化すべき機能的
変化の程度に依存する。0.1〜25%の間の位置の相違が典型的である。非常
に密接に関連した遺伝子からの突然変異の組換えまたはより遠い関係の遺伝子も
しくは遺伝子の組みからの配列の全切片さえも進化の速度および望む新しい特性
の取得を強化できる。キメラまたはモザイク遺伝子を作る組換えは2つ以上の親
の望ましい特徴を単一遺伝子または遺伝子の組に組合わせ、親には見られなかっ
た新規な機能的特徴を作るために有用である。組合わされるべき異なる基質の数
は2から10、100、1000、さらに105、107または109以上の構成 要素までサイズが広く変化する。
られる。突然変異は誤りがちなPCRで作られてもよい。誤りがちなPCRは長
い配列にランダムにわたって点突然変異の低水準を導入する低忠実度重合条件を
用いる。選択的に、突然変異はオリゴヌクレオチド指向突然変異形成によりテン
プレートポリヌクレオチドに導入できる。オリゴヌクレオチド指向突然変異形成
では、ポリヌクレオチドの短い配列が制限酵素消化を用いてポリヌクレオチドか
ら除去され、種々の塩基が本来の配列から変えられた、合成ポリヌクレオチドで
置換される。ポリヌクレオチド配列も化学的突然変異形成により変えることがで
きる。化学的突然変異原は、例えば、酸性亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキ
シルアミン、ヒドラジンまたはぎ酸を含む。ヌクレオチド前駆体の同族である他
の作用物質はニトロソグアニジン、5−ブロモウラシル、2−アミノプリン、ま
たはアクリジンを含む。一般に、これらの作用物質は、それによって配列を突然
変異するヌクレオチド前駆体の代りにPCR反応に加えられる。プロフラビン、
アクリフラビン、キナクリンおよび同類のような挿入剤も使用できる。ポリヌク
レオチド配列のランダム突然変異形成はX線または紫外線による照射でも達成さ
れる。一般に、そのように突然変異されたプラスミドDNAまたはDNA断片は
E.coliに導入され、突然変異体プラスミドのプールまたはライブラリとし
て普及される。
じ遺伝子(すなわち、同族遺伝子)の異なる対立遺伝子の形で見出すことができ
る。選択的に、基質は免疫グロブリン遺伝子のような、非対立遺伝子を除き関連
できる。相違は先行する組換えまたはシャフリングの結果でもある。相違は代替
のコドン使用で天然蛋白質を符号化する再合成遺伝子も生じる。
いまたは改良した特性の進化が望ましい蛋白質の変種形を符号化する。他の方法
では、基質は多重遺伝子経路を構成する複数の遺伝子の変種形を符号化できる。
このような方法では、変化は1つまたはある数の成分遺伝子で生じることができ
る。他の方法では、基質はDNAまたはRNA結合配列として進化すべき変種セ
グメントを含むことができる。出発基質が符号化配列を含む方法では、発現に必
要なプロモータおよびポリアデニル化配列のような、ある本質的規制配列が基質
の成分としても存在してよい。選択的に、このような規制配列は基質をクローン
化するために使用されるベクターの成分として提供される。
ることができる。DNAならば、出発基質はゲノムまたはcDNAである。基質
がRNAならば、基質は典型的にヘテロ二本鎖形成の前にcDNAに逆転写され
る。基質はクローン化断片、化学合成断片またはPCR増幅生成物として提供で
きる。基質は染色体、プラスミドまたはウイルス源から誘導できる。ある方法で
は、基質は鎖状体形である。
ることにより、二本鎖DNA基質から発生される。ヘテロ二本鎖形成のためのハ
イブリッド形成条件は配列依存性で、異なる環境では異なる。より長い配列は高
温で特異的にハイブリッド形成する。一般に、ハイブリッド形成条件は定義され
たイオン強度およびpHで特異的配列に対する熱融解温度(Tm)以下の約25
℃であるように選ばれる。Tmは(定義されたイオン強度、pH、および核酸濃
度で)標的配列の相補的なプローブの50%が標的配列に平衡状態でハイブリッ
ド形成する温度である。
度(約1.0〜5.0nM)の基質が1×SSPE緩衝液(180mM NaC
l、1.0mM EDTA、10mM NaH2PO4、pH7.4)に混合され
る。96℃で10分間加熱後、反応混合物は直ちに0℃で5分間冷却される。混
合物は次いで68℃で2〜6時間インキュベートされる。変性および再アニーリ
ングはNaOHのような変性剤の添加および除去でも行われる。過程は変性段階
が短い配列に対して省略されることを除き、一本鎖DNA基質に対してと同じで
ある。
比較してヘテロ二本鎖に対する選択を達成することができる。ホモ二本鎖は単に
親基質を再構築し、引き続く選別段階で組換え生成物を有効に希釈するだけであ
る。一般に、選択はヘテロ二本鎖が開いた環で形成されるように基質を設計して
達成されるが、ホモ二本鎖は線状分子として形成される。引き続く形質転換段階
は環状ヘテロ二本鎖に対して実質的濃縮(例えば、100倍)を生じる。
P4)の2つの異なる組を用いてPCR増幅される方法を示す。典型的に、第1
および第2基質は同じベクターの別々のコピーに挿入される。プライマの2つの
異なる対が2つのベクターの異なる点で増幅を開始する。図1はP1/P2プラ
イマ対がベクターの基質との2つの境界の1つで増幅を開始し、P1/P2プラ
イマ対は第2ベクターの他の境界で複製を開始する配列を示す。各プライマ対の
2つのプライマは環状プラスミドの回りの反対方向に増幅を開始する。この増幅
で発生した増幅生成物は、第1および第2基質がベクターの反対末端で生じる、
二本鎖線形化ベクター分子である。増幅生成物は混合され、変成され、アニール
される。混合および変性はいずれかの順序で行われる。再アニーリングは2つの
線状ホモ二本鎖、およびPCR増幅の開始点で各鎖に1個のニックを含む開いた
環状ヘテロ二本鎖を発生する。増幅生成物の宿主細胞への導入は、前者が後者よ
り遥かに有効に形質転換するので、ホモ二本鎖と比較してヘテロ二本鎖を選択す
る。
でない。むしろ、増幅は、増幅がベクター間の異なる点で開始される基質を有す
る2つのベクター上のいずれかの点で開始される。一般の場合に、このような増
幅は、第1および第2基質がそれぞれベクターの残余に対して異なる位置を占め
る2つの線形化ベクターを発生する。ニックがプラスミドと基質の界面における
よりもむしろベクター成分内で生じることを除き、変性および再アニーリングは
図1に示されるものと同様なヘテロ二本鎖を発生する。ベクターの基質成分の外
側の増幅の開始は、ベクターが有する基質に特異的なプライマを設計するために
必要でない利点を有する。
えば、基質を有するベクターの最初の集団は2つのプールに誘導される。1つの
プールは1組のプライマからPCR増幅され、他のプールは別からである。増幅
生成物は以前に変性され、アニールされる。ヘテロ二本鎖は、第1のプールのあ
る基質からの1つの鎖および第2のプールのある基質からの1つの鎖を含んで形
成できる。選択的に、ベクターの多重コピーにクローン化された3個以上の基質
が異なる点で出発する各ベクターの増幅により増幅を受ける。各基質では、この
過程は隣接ベクターDNAが基質の2つの側にいかに分けられるかで変化する増
幅生成物を発生する。例えば、1つの増幅生成物は基質の1つの側にベクターの
大部分を有し、別の増幅生成物は基質の他の側にベクターの大部分を有し、追加
の増幅生成物は基質に隣接するベクター配列の等しい区分を有する。配列アニー
リング段階で、基質の鎖はある他の基質の鎖と環状ヘテロ二本鎖を形成するが、
同じ基質の鎖が線状ホモ二本鎖を形成するためだけに互いに再アニールできる。
さらに追加の変化では、多重基質は図1の案の多重反復を行うことにより行うこ
とができる。第1反復の後、ベクターの組換えポリヌクレオチドはベクターの追
加のコピーに取込まれる第3基質によりヘテロ二本鎖形成を受ける。組換えポリ
ヌクレオチドを有するベクターおよび第3基質を有するベクターは異なるプライ
マ対から別々にPCR増幅される。増幅生成物は次いで変成され、アニールされ
る。過程は追加の基質による組み替えを可能にするために追加の回数繰り返すこ
とができる。
2基質はベクターの別のコピーに取込まれる。2つのコピーは次いでそれぞれ異
なる制限酵素で消化される。図2は、制限酵素が基質とベクターの間の反対境界
で切断するが、必要である全ては異なる場所で切断する2つの異なる制限酵素を
使用することである。消化は第1および第2基質を有する線形化第1および第2
ベクター、残余ベクター配列に関して異なる位置を占める第1および第2基質を
発生する。変性および再アニーリングは開いた環状ヘテロ二本鎖および線状ホモ
二本鎖を発生する。この方法は、図1に関して記載されたものに類似の戦略を用
いる2個以上の基質間の組換えに拡張できる。1つの変化では、基質の2個のプ
ールが形成され、各々は別々にベクターにクローン化される。2個のプールは次
いで異なる酵素に鋭敏であり、アニーリングは2つの基質のように進行する。別
の変化では、3個以上の基質がベクターの3個以上のコピーにクローン化され、
3個以上の生じる分子が3個以上の酵素で切断し、3個以上の部位で切断する。
これはベクター中の基質部分に隣接するベクター配列の区分と異なる3個の異な
る線形化ベクターを発生する。選択的に、ある数の基質が、各回で新鮮な基質と
の組換えアニーリングの1回により反復様式で対として組換えられる。
テロ二本鎖は続いてベクターにクローン化される。このようなことは図3に示し
たように第1および第2基質の非対称増幅により達成できる。非対称または単一
プライマPCRは二本鎖の1つの鎖のみを増幅する。プライマの適当な選択によ
り、反対の鎖は2個の異なる基質から増幅できる。再アニーリング増幅生成物に
関して、ヘテロ二本鎖は2個の基質の反対鎖から形成される。1つの鎖のみが各
基質から増幅されるので、再アニーリングはホモ二本鎖を改良しない(少量の非
増幅基質以外)。過程は図1に関して記載されたものに対する類似の戦略を用い
てある数の基質の組み替えを可能にするために拡張できる。例えば、基質は2個
のプールに分割でき、各プールは、互いにではなく、1つのプールの増幅生成物
が他のプールの増幅生成物とのみアニールできるような、同じ非対称増幅を受け
る。選択的に、シャフリングは反復様式で対として進行し、そこでは第1および
第2基質のヘテロ二本鎖から形成された組換え体が続いて第3基質とのヘテロ二
本鎖形成を受ける。点突然変異もPCR増幅中に望む水準で導入できる。
第2基質は別々のベクターからのPCR増幅により分離される。基質は変成され
、ヘテロ二本鎖および再構築ホモ二本鎖の両方を形成してアニールすることを可
能にする。アニーリングの生成物は制限酵素XおよびYで消化される。Xは第1
基質の部位を有するが、第2基質には有せず、Yはその逆である。酵素Xは第1
基質から再構築ホモ二本鎖を切断し、酵素Yは第2基質から再構築ホモ二本鎖を
切断する。いずれの酵素もヘテロ二本鎖を切断しない。ヘテロ二本鎖は、第1お
よび第2基質の両方に近接した部位を有する酵素AおよびBによる追加の開裂、
およびAおよびBによる消化から生じる末端と両立する相補末端を有するベクタ
ーへの生成物の結合によるホモ二本鎖の制限断片から有効に分離できる。Aおよ
びBで切断したヘテロ二本鎖だけがベクターと結合できる。選択的に、ヘテロ二
本鎖はゲル上のサイズ選択によりホモ二本鎖の制限断片から分離できる。上記過
程はN酵素によるヘテロ二本鎖とホモ二本鎖の混合物の開裂でN基質に一般化で
き、その各々は異なる基質を切断し、他の基質を切断しない。ヘテロ二本鎖は方
向性クローン化で形成できる。ヘテロ二本鎖形成のための2つの基質は染色体D
NAのPCR増幅で得ることができ、線状ベクターの反対末端に接続する。方向
性クローン化は2つの異なる酵素でベクターを消化すること、およびベクターを
切断するために使用した2つの酵素だけの相補末端とそれぞれ両立する第1およ
び第2基質を消化し、適応することで達成できる。第1および第2基質はこのよ
うに線形化ベクター断片の反対末端で結合できる。この案は図1に記載されるも
のに類似の原理を用いてある数の基質に拡張できる。例えば、基質はベクターへ
の結合の前に2つのプールへ分割できる。選択的に、第1および第2基質のヘテ
ロ二本鎖形成により形成された組換え生成物は続いて第3基質とのヘテロ二本鎖
形成を受ける。
る。遺伝子工学で典型的に使用される種々のクローン化ベクターが適当である。
で宿主細胞に移される。例えば、塩化カルシウム形質転換は一般に原核細胞に使
用されるが、リン酸カルシウム処理がある。リポフェクション、またはエレクト
ロポレーションは他の細胞宿主に使用されてもよい。ほ乳類細胞を形質転換する
ために使用される他の方法はポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エ
レクトロポレーション、およびマイクロインジェクションおよびバイオリシチッ
クスの使用を含む(一般に、上記Sambrook他、参照)。ウイルス・ベク
ターもin vitroでパッケージされ、感染で導入される。ベクターの選択
は宿主細胞に依存する。一般に、適当なベクターは望む宿主細胞に認識される複
製の起源、シャッフルされる基質内の遺伝子の発現を支持する意図した宿主細胞
および/または規制配列で発現できる選択メーカーを有する。
る種類の細胞が使用できる。特に関心のある細胞は、細菌、特にE.coli(
16、17)のような、遺伝子工学で通常使用される標準細胞種である。適当な
E.coli系統は、E.coli mutS、mutL、dam’、および/
またはrecA+、E.coli XL−10−Gold([Ter’Δ(mc rA)183Δ(mcrCB−hsdSMR−mrr)173endAl su
pE44 thi−l recAl gyrA96 relAl lac Ht
e][F’proAB lac’ZΔM15 Tn10(Ter’)Amv C
am’])、E.coli ES1301 mutS[遺伝子型:lacZ53
、mutS201::Tn5、thyA36、rha−5、metBl、deo
C、IN(rrnD−rrnE)](20、24、28〜42)を含む。好まし
いE.coli系統はE.coli SCS110[遺伝子型:rpsl、(S
tr’)、thr、leu、enda、thi−l、lacy、galk、ga
lt、ara tona、tsx、dam、dcm、supE44、Δ(lac
−proAB)、[F、traD36、proA-B-lacI’ZΔM15]で
あり、それは正常な細胞不適正修復システムを有する(17)。この系統種は小
さい鎖特異的選好でヘテロ二本鎖における不適正および不同を修復する。さらに
、この系統はdam’およびdcm’であるから、系統から分離されたプラスミ
ドは非メチル化であり、従ってDNA二本鎖形成/不適正修復の追加の回に特に
従う(以下参照)。他の適当な細菌細胞は、Bacillus、Pseudom
onasおよびSalmonellaのようなグラム陰性およびグラム陽性を含
む。
核細胞の両方の不適正修復システムはDNA複製中の遺伝的忠実性の維持に重要
な役割を演じると考えられる。原核細胞、特にmutSおよびmutLにおいて
不適正修復に重要な役割を演じる遺伝子のあるものは遺伝子組換えの結果で、真
核細胞に同族体を有し、ゲノム安定性を有する。野性型または突然変異体S.c
erevisiaeはCOS−1サル細胞(57)を有するように、ヘテロ二本
鎖(49〜56)の不適正修復を行うことを示した。酵母の好ましい系統はPi
cchiaおよびSaccharomycesである。ほ乳類細胞はショートパ
ッチ機構(38、58〜63)によりG−TからG−C塩基対に修復する能力を
有することを示した。ほ乳類細胞(例えば、マウス、ハムスター、霊長類、ヒト
)両方の細胞系統および一次培養物も使用できる。このような細胞は、胎児幹細
胞、接合体、線維芽細胞、リンパ球、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)
、マウス線維芽細胞(NIH3T3)、腎臓、肝臓、筋肉、および皮膚細胞を含
む、幹細胞を含む。関心のある他の真核細胞はトウモロコシ、コメ、コムギ、ワ
タ、ダイズ、サトウキビ、タバコ、およびシロイヌナズナのような植物細胞;魚
、海藻、かび(aspergillus、podospora、neurosp
ora)、昆虫(例えば、baculo lepidoptera)(Winn
acker、「From Genes to Clones」VCH Publ
ishers、N.Y.、(1987)参照)を含み、それはここで参考文献に
取り込まれる。
細胞の使用は、基質がほ乳類細胞でのみ発現される、またはほ乳類細胞での使用
を意図するポリペプチドを符号化するある応用で有利である。しかし、細菌およ
び酵母細胞はこれらの系統で到達できる高い形質転換頻度による大きいライブラ
リを選別するために有利である。
vitroでDNA修復システムに曝されることができる。DNA修復システ
ムは修復コンピテントE.coli酵母またはいずれかの他の細胞からの抽出物
として得られる(64〜67)。修復コンピテント細胞は適当な緩衝液中に溶菌
され、ヌクレオチドで補足される。DNAはこの細胞抽出物中でインキュベート
され、複製のためのコンピテント細胞に形質転換される。
チドにより符号化された遺伝子に対して、生じる修復および複製を可能にするた
めに典型的におよび選択的に培養される。組換えポリヌクレオチドは、上記のヘ
テロ二本鎖法、または下記の他のシャフリング法を用いる組み替えの追加の回を
受ける。しかし、1回かまたは数回の組換え後に、組換えポリヌクレオチドは望
みの特性に対して選別または選択を受ける。ある例では、選別または選択はDN
A修復に用いられる同じ宿主細胞で行われる。他の例では、組換えポリヌクレオ
チド、その発現生成物または発現生成物により生じた二次代謝物はこのような細
胞から分離され、in vitroで選別される。他の例では、組換えポリヌク
レオチドは、組換えが生じる宿主細胞から分離され、他の宿主細胞中で選別され
、選択される。例えば、ある方法では、細菌宿主細胞中で生じるが、真核細胞中
の組換えポリヌクレオチドの発現生成物を選別するDNA修復を可能にすること
は有利である。選別または選択を生き残る組換えポリヌクレオチドはそれ自体で
しばしば有用な生成物である。他の例ではこのような組換えポリヌクレオチドは
互いにまたは他の基質と追加の組替えを受ける。このような組替えは上記のヘテ
ロ二本鎖法またはいずれかの他のシャフリング法で行うことができる。組替えの
追加の回は反復を基に選別または選択の追加の回が続く。選択的に、選択の厳密
さは各回で増加する。
望ましい特性は高い触媒活性、薬剤への耐性を与える能力、高い安定性、広い(
または狭い)範囲の基質を受容する能力、または有機溶媒のような非自然環境で
機能する能力を含む。蛋白質の他の望ましい特性は選ばれた標的、選択容量、与
えられた標的への免疫応答を発生する能力、免疫原性の欠如および病因性微生物
に対する毒性を含む。DNAまたはRNAポリヌクレオチド配列の望ましい特性
は、与えられた蛋白質標的に特異的に結合する能力、および動作可能に結合した
符号化配列の発現を制御する能力を含む。薬剤耐性のような、上記特性のあるも
のは、薬剤上での平板培養により選択できる。発現に対する制御配列の影響など
他の特性は制御配列に結合したレポーター遺伝子の発現生成物の外見を検出する
ことにより選別できる。分泌される発現蛋白質の容量など他の特性は蛋白質に対
する標識抗体を使って、FACTMによって選別できる。免疫原性またはその欠如
のような、他の特性は個別細胞または細胞のプールからの蛋白質を分離し、in
vitroで、および実験動物で分析することにより、選別できる。
をメチル化する。メチル化の部位は5−メチルシトシン(m5C)、N4−メチ ルシトシン(M4C)、N6−メチルアデニン(m6A)、5−ヒドロキシメチル シトシン(hm5C)および5−ヒドロキシメチルウラシル(hm5U)を含む。
E.coliでは、メチル化はDamおよびDcm酵素で行われる。dam遺伝
子で指定されるメチラーゼは配列GATCのアデニン残基のN6−位をメチル化
し、dcm遺伝子で指定されるメチラーゼは配列CCWGGの内部シトシン残基
のC5位をメチル化する。植物および動物からのDNAはしばしばCGまたはC
NG配列がメチル化されることを意味するCGメチル化を受ける。メチル化の細
胞修復の可能性のある効果は参考文献18〜20で論じられる。
好ましくは後者を少なくとも部分的に脱メチル化される。基質DNAの脱メチル
化はヘテロ二本鎖の有効でランダムな修復を促進する。damメチル化された1
つの鎖および非メチル化の1つの鎖で形成されたヘテロ二本鎖では、修復は修正
のためのテンプレートとして役立つメチル化鎖により、非メチル化鎖に偏る。い
ずれの鎖もメチル化されないと、不適正修復は起こるが、重要でない鎖の優先を
示す(23、24)。
CR増幅で脱メチル化される。ある例では、DNA脱メチル化は上記のヘテロ二
本鎖形成手順のPCR段階の1つで達成される。 他の方法では、追加のPCR
段階が脱メチル化を生じるために行われる。他の方法では、脱メチル化はメチル
化欠損宿主細胞(例えば、E.coli dam’dcm’系統)による基質D
NA通過で生じる。他の方法では、脱メチル化酵素を用いてin vitroで
脱メチル化される。脱メチル化DNAは上記の同じ手順を用いるヘテロ二本鎖形
成のために使用される。ヘテロ二本鎖は続いて非メチル化ヘテロ二本鎖の分解を
防ぐためにDNA修復に熟練しているが制限酵素欠損細胞に導入される。
ヘテロ二本鎖を生じる。これらのニックは宿主細胞にヘテロ二本鎖を導入する前
に封じることができる。シーリングは標準結合条件下でDNAリガーゼによる処
理で得ることができる。結合はDNAの二重ヘリックスの1つの鎖中のニックに
より分離された2つの隣接塩基を結合するリン酸ジエステル結合を形成する。ニ
ックを封じると宿主細胞へのヘテロ二本鎖の導入後組替えの頻度が増加する。
質間の追加の相違を誘起する変異原条件下で行うことができる。
ば、ヘテロ二本鎖シャフリング、選別または選択の一周期を行い、別の方法でシ
ャフリングの周期が続き、選別または選択の追加の周期が続く。他のシャフリン
グ方式は国際公開95/22625号:米国特許第5,605,793号:米国
特許第5,811,238号;国際公開96/19256号;Stemmer、
Science 270、1510(1995);Stemmer他、Gene
、164、49〜53(1995);Stemmer、Bio/Technol
ogy、13、549〜553(1995);Stemmer、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 91、10747〜10751(1994)
;Stemmer、Nature 370、389〜391(1994);Cr
ameri他、Nature Medicine、2(1):1〜3(1996
);Crameri他、Nature Biotechnology 14、3
15〜319(1996);国際公開98/42727号;国際公開98/41
622号;国際公開98/05764号;国際公開98/42728号;国際公
開98/27230号(それぞれあらゆる目的でその全体を参照によって組み込
む)に記載される。
誘導体化合物はアミノ酸の化学修飾または化学構造によるアミノ酸の置換を含む
。同族はリード蛋白質と実質的に同じ方法で示される主要官能基を可能にする安
定化電子配置および分子立体配座を有する。特に、非消化性化合物はポリペプチ
ド結合領域に一致する空間的電子特性を有するが、典型的にはポリペプチドより
はるかに小さい分子であり、しばしば約2CHD以下および好ましくは約1CH
D以下の分子量を有する。このような非消化性化合物の同定は自己無動着場(C
SF)分析、配位相互作用(CHI)分析、および基準モード動的分析のような
いくつかの標準法によって行うことができる。これらの技術を実施するためのコ
ンピュータ・プログラムは既に入手可能である。Rein他、Computer
−Assisted Modeling of Receptor−Ligan
d Interaction(Alan Liss,New York、198
9)参照。
現生成物、および二次代謝物は薬剤組成物として選択的に製剤される。このよう
な組成物は1つ以上の活性剤および薬学的に受容可能な担体を含む。種々の水系
担体、例えば水、緩衝液、リン酸緩衝食塩水(PBS)、0.4%食塩水、0.
3%グリシン、ヒト・アルブミン溶液および同類を使用できる。これらの溶液は
滅菌され、一般に粒状物が無い。組成物は、pH調節および緩衝剤、毒性調節剤
、および同類、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウム、のような生理的条件に近づくために必要な薬学的に受容可能な補助
物質を含み、選ばれた投与の特別なモードに従って、ナトリウムは流体体積、粘
度、などに主として基づいて選ばれる。
um Meliloti FlaAの組換えからの新規なRhizobium
Flaa遺伝子 細菌鞭毛は鞭毛モータ(68)による螺旋フィラメント、近位フックおよび基
底小体を有する。この基本設計はE.coliおよびS.ryphimuriu
mで広範に試験され、多くの他の細菌並びにある古細菌に広く適用される。長い
螺旋フィラメントはフラゲリン・サブユニットから組み立てられた重合体で、そ
の分子量範囲は細菌種(69)に依存して、20,000と65,000の間に
ある。プレーンと複合と名づけられた、二種の繊毛フィラメントは、その電子顕
微鏡的に決定された表面構造(70)により識別された。プレーン・フィラメン
トは弱い螺旋の線のある滑らかな表面を有するが、複合フィラメントは交代する
畝と溝の人目に付く螺旋パターンを示す。複合繊毛フィラメントのこれらの特性
は、粘性媒体中(71〜73)で有効に細菌を推進することを可能にする、脆い
および(含意で)硬い構造に対応すると考えられる。プレーン・フィラメントの
繊毛は時計方向と反時計方向回転(68)の間で交代できるが、複合フィラメン
トの全ての既知の繊毛は間欠停止で時計方向のみに回転する(74)。この後者
の航法パターンは細菌および古細菌を通じて見られるので、複合繊毛は古代、基
本的運動性設計(69)の共通の背景を反映することが示唆される。
プレーン細菌繊毛と異なり、フィラメントも熱分解に対して耐性である(72)
。Schmitt他(75)は、バクテリオファージ7−7−1は特にR.lu
pini H13−3の繊毛に特異的に吸着し、その宿主の増殖感染のための運
動性を必要とする。R.melilotiおよびR.lupiniからの繊毛は
全く同様であるが、バクテリオファージ7−7−1はR.melilotiに感
染しない。現在まで複合繊毛は三種の土壌細菌、Pseudomonas rh
odos(73)、R.meliloti(76)、およびR.lupini
H13−3(70、72)のみで観察された。R.lupini H13−3は
5〜10個の周毛的に挿入された複合繊毛を有し、それは高分解能電子顕微鏡お
よび光回折で最初に分離され、分析された(70)。
の含量が複合繊毛の異常な特性に対する主な理由の1つであることを発見した。
単位長さ当たりの質量の測定および電子顕微鏡写真からの三次元再構築を得るこ
とにより、Trachtenberg他(73、78)はR.lupiniの複
合繊毛は機能性2量対からなることを示唆した。図6は推論したR.lupin
i H13−3FlaAのアミノ酸配列と推論したR.melilotiFla
Aのアミノ酸配列の比較を示す。完全な一致は垂直線で示され、保存的交換はコ
ロンで示される。全体の同一性は56%である。R.lupini flaAお
よびR.meliloti flaAはin vitroヘテロ二本鎖形成を受
け、新規なFlaA分子および構造を作るためにin vivo修復が続いた。
meliloti flaA遺伝子を含むpRM40が図6Aおよび6Bに示さ
れる。これらのプラスミドはE.coli SCS110から分離された(da
mおよびdcm型メチル化なし)。 約3.0pgの非メチル化pRL20およびpRM40DNAはそれぞれBam
HIおよびEcoRIで37℃で1時間消化された。アガロース・ゲル分離後
、線形化DNAはWizard PCR Prepキット(Promega、W
I、USA)で精製された。 等モル濃度の(2.5nM)の線形化非メチル化pRL20およびpRM40は
1×SSPE緩衝液(180mM NaCl、1mM EDTA、10mM N
aH2PO4、pH7.4)に混合された。96℃で10分間加熱後、反応混合物
は直ちに0℃で5分間冷却された。混合物は形成するヘテロ二本鎖に対して68
℃で2時間インキュベートされた。
utS、E.coli SCS110およびE.coli JM109コンピテ
ント細胞を形質転換するために使用された。全体の形質転換効率は閉じた、共有
結合および環状pUC19プラスミドによる対象形質転換のものよりも10〜2
00倍低かったが、E.coli JM109コンピテント細胞による形質転換
効率はE.coli SCS110のものより約7倍高く、E.coliES1
301mutSのものより10倍高い。
.coliES1301mutS形質転換体からランダムで選択され、プラスミ
ドDNAが追加のDNA配列分析のためにこれらの4個のクローンから分離され
た。
転換ライブラリから)、(b)SCS02の配列(クローン#2E.coliS
CS110形質転換ライブラリから)、(c)ES01の配列(クローン#1E
.coliES1301形質転換ライブラリから)、および(d)ES02の配
列(クローン#2E.coliES1301形質転換ライブラリから)を示す。
全ての4個の配列は野性型R.lupini flaAおよびR.melilo
ti flaA配列と異なった。クローンSCS02、ES01およびES02
は全て完全な開放読取り枠を含むが、SCS01は切断された。図8は、組換え
が主にループ領域(不適正領域)で生じたことを示す。R.meliloti
flaAおよびR.lupini flaAから発生したflaA突然変異体ラ
イブラリはE.coliSCS110、ES1301、XL10−Goldおよ
びJM109、並びに機能性FlaA組換え体に対して選別された形質転換体に
形質転換できる。
)並びに大量の酵素を生じるその能力により最も重要な工業微生物の中にある。
ここに記載した接近は天然Stoptomyces酵素の有向進化、代謝経路に
おける遺伝子のあるものまたは全部、並びにStreptomycesで発現さ
れる他の異種酵素で使用できる。
び癌化学療法患者の数の大量の増加により緊急に必要である。ある種のAspe
rgillusにより作られるリポペプチド、Echinocandin B(
ECB)は可能性のある抗かび剤として広範に研究された。有意に毒性を減じた
種々の抗かび剤が、A.nidurans echinocadin Bのリノ
ル酸側鎖を異なるアリール側鎖で置換することにより生じた(79〜83)。化
学的アシル化のための環状ヘキサペプチドECB核前駆体がActinopla
nes utahensisECBデアシラーゼを用いるECBの酵素的加水分
解により得られる。そのままの核へのECBの変換を最大にするために、この反
応はECB基質を可溶にするために混合性誘起溶媒の少量とpH5.5で行われ
る。生成物環状ヘキサペプチド核はECBを完全に脱アシル化するために必要な
長期インキュベート中にpH5.5以上で不安定である(84)。しかし、EC
Bデアシラーゼの最適pHは8.0〜8.5であり、その活性はpH5.5でお
よび2.5%以上のエタノールの存在で低下する(84)。ECB核の生産を改
善するために、これらの過程関連条件下でECBデアシラーゼの活性を増加する
ことが必要である。
体であり、その2個のサブユニットは単一前駆体蛋白質の処理で誘導される(8
3)。19.9kDα−サブユニットは15アミノ酸スペーサ・ペプチドにより
60.4kDβ−サブユニットから分離され、天然生物のシグナル・ペプチドお
よび別のスペーサ・ペプチドと共に除去される。ポリペプチドも発現され、組換
えECBデアシラーゼによるECBの大規模転換のために使用される微生物、S
treptomyces lividansの機能性酵素に処理される。酵素の
三次元構造は決定されず、その配列は、ECBデアシラーゼをエンジニアリング
する合理的努力に導くのに十分な信頼性のある構造モデルが構築することが困難
である、ペニシリン・アシラーゼのような他の可能性のある関連酵素に対して低
い類似性を示す。本発明者等は従ってこの重要な活性を改良するために有向進化
(85)を使用することを決定した。
のランダムプライミング組換えに適当なプロトコルは最近記載された(86)。
ここで、本発明者等はさらに強化した特異的活性の新しいECBデアシラーゼを
発生するためにヘテロ二本鎖組換えの使用を説明する。
す、2つのActinoplanes utahensisECBデアシラーゼ
突然変異体、M7−2およびM16はin vitroヘテロ二本鎖形成および
in vivo不適正修復の技術を用いて組換えられた。
プラスミドpM7−2およびpM16の物理的マップを示す。突然変異体M7−
2はプラスミドpSHP150−2*から発現された、野性型ECBデアシラー ゼ遺伝子を含む全Streptomyces lividans細胞で直接行わ
れた変異原性PCRにより得られた。pM7−2を有するStreptomyc
esは野性型ECBデアシラーゼ(86)を発現する細胞の特異的活性を1.5
倍示す。クローンpM16は記載(86、87)されたようにランダムプライミ
ング組換え技術を用いて得られた。野性型ECBデアシラーゼ・クローンの特異
的活性の2.4倍を示す。
)はE.coli SCS110(別々の反応で)から精製された。約5.0μ
gの非メチル化M7−2およびM16DNAは37℃で1時間それぞれXho1
およびPshA1で消化された(図10)。アガロース・ゲル分離後、線形化D
NAはWizard PCR Prepキット(Promega、WI、USA
)を用いて精製された。 等モル濃度(2.0nM)の線形化非メチル化pM7−2およびpM16DNA
は1×SSPE緩衝液(1×SSPE;180mM NaCl、1.0mM E
DTA、10mM NaH2PO4、pH7.4)中に混合された。96℃で10
分間加熱後、反応混合物は直ちに0℃で5分間冷却される。混合物はヘテロ二本
鎖の形成を促進するために68℃で3時間インキュベートされた。
tS、SCS110およびJM109コンピテント細胞を形質転換するために使
用された。E.coli ES1301mutSからの全形質転換体はプールさ
れ、E.coliSCS110はプールされた。プラスミド・プールは各プール
・ライブラリから分離され、このプールはデアシラーゼ活性選別のための突然変
異体ライブラリを形成するためにS.lovidansTK23原形質体を形質
転換するために使用された。S.lividansTK23ライブラリからの形
質転換はそのプレート試験でin situでECBデアシラーゼ活性に対して
選別された。形質転換原形質体は24時間30℃でR2YE寒天プレート上で再
生し、48時間チオストレプトンの存在で展開させた。コロニーが適当なサイズ
に成長すると、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中に0.5mg/
mlECBを含む6mlの0.7%アガロース溶液がそれぞれR2YE寒天プレ
ート上に注がれ、30℃で18〜24時間展開することを可能にした。野性型プ
ラスミドpSHP150−2*を含む対照コロニーのものより大きい清澄帯で囲 まれたコロニーは追加のキャラクタリゼーションのために選択された。
30℃で48時間好気的に成長させられ、その点でそれらはHPLCを用いてE
CBデアシラーゼ活性を分析された。100μLの全ブロスが10%(v/v)
MeOHおよび200μg/mlのECB基質を含む0.1MNaAc緩衝液(
pH5.5)中で30℃で30分間反応に使用された。反応は2.5体積のメタ
ノール添加で停止され、20μlの各試料は、50:50のA:B(A=93%
アセトニトリル、0.1%リン酸;B=70%アセトニトリル、0.1%リン酸
)で開始し、30:70のA:Bで2.2ml/分の流速で22分で終結する線
形アセトニトリル勾配を用いて室温で100×4.6mmポリヒドロキシエチル
アスパルトアミド・カラム(PolyLC Inc.、Columbia、MD
.USA)上のHPLCで分析された。ECBおよびECB核ピークの面積が計
算され、ECBデアシラーゼ活性を評価するためにpIJ702*を含むS.l ividansの試料培養物からの対応するピークの面積から差し引かれた。
用され、30℃で96時間成長を可能にされた。上澄みはさらに10kDの分子
量カットオフでAmiconろ過ユニット(Beverly、MA、USA)を
用いてその原体積の1/30まで濃縮された。生じる酵素試料は同体積の50m
M KH2PO4(pH6.0)緩衝液で希釈され、Hi−Trapイオン交換カ
ラム(Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ、U
SA)にかけられた。結合緩衝液は50mM KH2PO4(pH6.0)であり
、溶出緩衝液は1.0M NaClを含む50mM KH2PO4(pH6.0)
であった。0から1.0M NaClまでの線形勾配が2.7ml/分の流速で
8カラム体積で適用された。0.3M NaClで溶出するECBデアシラーゼ
分画は濃縮され、緩衝液はCentricon−10ユニットを用いる50mM
KH2PO4(pH6.0)で交換された。酵素純度はCoomassie B
lue染色剤を用いるSDS−PAGEで検証され、濃度はBio−Rad P
rotein Assay Reagent(Hercules、CA,USA
)を用いて決定された。
活性を決定するために使用された。4μgの各精製ECBデアシラーゼ突然変異
体が10%(v/v)MeOHおよび異なる濃度のECB基質を含む0.1M
NaAc緩衝液(pH5.5)中で30℃で30分間活性試験反応に対して使用
された。試験は重複で行われた。反応は2.5体積のメタノールを加えて停止さ
れ、HPLC試験が上記のように行われた。吸収値は記録され、初期比は時間伸
展曲線の最少二乗回帰で計算され、それからKmおよびkcatが計算された。
1Mアセテート緩衝液);7、7.5、8および8.5(0.1Mリン酸緩衝液
);9および10(0.1M炭酸緩衝液)でHPLC試験を用いて精製したEC
Bデアシラーゼに対して測定された。精製ECBデアシラーゼの安定性は10%
メタノールを含む0.1M NaAc緩衝液(pH5.5)中30℃で決定され
た。試料は異なる時間間隔で引き出され、残留活性は上記のHPLC試験で同じ
緩衝液で測定された。
を適用の1回の後、約500の原形質転換体からの1つの突然変異体(M15)
が野性型の特異的活性の3.1倍を有することが分かった。野性型および進化し
たM15ECBデアシラーゼは精製され、ECBの脱アシル化のためのその動力
学パラメータはHPLCで決定された。進化したデアシラーゼM15は205%
まで増加した触媒速度定数、kcatを有する。M20の触媒有効性(kcat/Km )は野性型酵素にわたって2.9の係数で強化される。
200μg/mlのECBで決定された。組換えM15はpH5〜8で野性型よ
り活性である。この試験の酵素活性のpH依存性は強くないが、野性型と比較し
て、低いpHに最適で1.0〜1.5単位の一定のシフトがある。
1M NaAc(pH5.5)中30℃で測定された。野性型と突然変異体M1
5の間で安定性の有意差は観察されなかった。
7−2、M16およびM15中のアミノ酸置換の位置が図12に要約される。
る。M7−2およびM16遺伝子の組換えはM15を生じ、その活性はその親の
いずれよりも高い(図13)。M15の6個の塩基置換で、5個(α50、α1
71、β57、β129およびβ340の位置で)はM7−2から継承し、他の
1つ(β30)はM16から来た。
は完全なオペロンの組み替えに有用である。この方法はその特性を改良するため
および構造−機能関係を研究するために組換え蛋白質を作るために使用できる。
isin E変種 この実施例はBacillus subtilis subtilisin
Eの熱安定性を改良するために2つの異なる配列からの配列情報を組合わせてi
n vivo修復が続く、in vitroヘテロ二本鎖形成の使用を示す。
sin E変種(88)を符号化する。Asn218/Ser(N218S)お
よびAsn181/Asp(N181ID)アミノ酸置換を生じる、RC1の1
107およびRC2の995の塩基位置における突然変異(図14)はsubl
tilisin E熱安定性の向上をもたらし;類似および非類似の両方の残り
の突然変異は熱安定性に検出可能な効果を有しない。65℃で、単一変種N18
1DおよびN218Sは野性subtilisin Eよりそれぞれ約3倍およ
び2倍長い半減期を有し、両方の突然変異体を含む変種は8倍長い半減期を有す
る(88)。subtilisin E変種の集団における異なる半減期は従っ
てそれによって配列情報が組合わされる効率を評価するために使用される。特に
、これら2つの突然変異(熱安定性に影響する点突然変異の欠如で)の間の組替
えは、集団の25%が二重突然変異体の熱安定性を示すライブラリを発生するは
ずである。同様に、N181DおよびN218Sが等しい頻度で除かれると、集
団の25%が野性型様安定性を示すはずである。本発明者等は診断方法として組
換え集団の分画を用いた。
subtilitin Eプロ配列の45nt、完全成熟配列および停止コドン
後の113ntを含む986bp断片である。遺伝子はそれぞれpBE3−1お
よびpBE3−2を生じる、E.coli/B.subtilisシャトル・ベ
クターpBE3中のBam HIとNde1の間でクローン化された。プラスミ
ドDNApBE3−1およびpBE3−2はE.coli SCS110から分
離された。
1時間それぞれBam HIおよびNde Iと共に消化された。アガロース・
ゲル分離後、等モル濃度(2.0nM)の線形化非メチル化pBE3−1および
pBE3−2が1×SSPE緩衝液(180mM NaCl、1.0mM ED
TA、10mM NaH2PO4、pH7.4)に混合された。96℃で10分間
加熱後、反応混合物は直ちに0℃で5分間冷却された。混合物は形成するヘテロ
二本鎖に対して68℃で2時間インキュベートされた。
tS、E.coli SCS110およびE.coli HB101コンピテン
ト細胞を形質転換するために使用された。
i SCS110のものより約10倍高く、E.coli ES1301 mu
tSのものより15倍高かった。しかし全ての場合に、形質転換効率は閉じた、
共有結合および環状制御pUC19プラスミドによる形質転換のものより10〜
250倍低かった。
びE.coli ES1301 mutSライブラリからの5個がランダムに選
ばれ、プラスミドDNAが追加のDNA配列分析のためにQIAprepスピン
・プラスミド・ミニプレプキットを用いて分離された。
ム・クローンがプールされ、全プラスミドDNAがQIAGEN−100カラム
を用いて分離され、0.5〜4.0μgの分離したプラスミドが既に述べたよう
に(88)Bacillus subtilis DB428を形質転換するた
めに使用された。
個の形質転換体が選別を受けた。選別は既に記載した(88)試験を用いて、こ
はく酸−Ala−Ala−Pro−Phe−p−ニトロアニリド上で行われた。
プラスミド・ライブラリを含むB.subtilis DB428はカナマイシ
ン(20μg/ml)板を含むLB板上で成長した。37℃で18時間後、単一
コロニーはウェル当たり200μlSG/カナマイシン培地を含む96ウェル板
に採られた。これらの板は細胞を飽和まで成長させるため振とうしながら37℃
で24時間インキュベートされた。細胞は遠心沈澱され、上澄みは熱安定性試験
のために試料採取された。
各成長板に対して用意された。subtilisin活性は次いで100μlの
活性試験溶液(0.2mMこはく酸−Ala−Ala−Pro−Phe−p−ニ
トロアニリド、100mM Tris−HCl、10mM CaCl2、pH8 .0、37℃)を加えて測定された。反応速度はThermoMaxマイクロプ
レート・リーダー(Molecular Devices、Sunnyvale
CA)中で1.0分にわたって405nmで測定された。室温で測定された活
性は活性クローン(野性型のものの10%以下の活性のクローンは不活性として
記録された)の分率を計算するために使用された。初期活性(Ai)は各ウェル へ予め温めた(37℃)試験溶液(0.2mM こはく酸−Ala−Ala−P
ro−Phe−p−ニトロアニリド、100mM Tris−HCl、pH8.
0、10mM CaCl2、pH8.0)の100μlを直ちに加えることによ り10分間65℃で1つの試験板をインキュベート後に測定された。残留活性(
Ar)は、40分間培養した後測定された。
行われた。E.coli SCS110突然変異体ライブラリからの5個のクロ
ーンおよびE.coli ES1301mutSライブラリからの5個がランダ
ムで選択され、配列された。図14は、10個のクローンからの4個が親遺伝子
と異なることを示した。生じる遺伝子中の親RC1またはRC2からの特別な点
突然変異の発生の頻度は0%〜50%の範囲で、ヘテロ二本鎖中の10点突然変
異が強い鎖特異性選好なしで修復された。
般にE.coli long−patch不適正修復システムにより行われると
思われる。システムは、修復される鎖を決定するための主要機構としてGATC
配列におけるアデニンのN6−メチル化の状態を用いる鎖特異性方式で異なる不
適正を修復する。1つだけのDNA鎖上のGATC配列でメチル化したヘテロ二
本鎖で、修正用テンプレートとして役立つメチル化鎖で、修復は非メチル化鎖に
高度に偏ることを示した。いずれの鎖もメチル化されないならば、不適正修復が
生じるが、小さい鎖選好性を示した(23、24)。これらの結果は、二本鎖の
有効でランダムな修復を促進するために組換えられるDNAを脱メチル化するこ
とは好ましいことを示す。
ubtilis DB428ライブラリからの400個のランダム・クローンを
分析することにより評価された。96ウェル板から得られた熱安定性は下降順で
プロットされて、図16に示される。約12.9%のクローンはN181Dおよ
びN218S二重突然変異による突然変異体に匹敵する熱安定性を示した。この
速度はこれら2つの標識のランダム組換えに対して期待されるものの半分だけで
あるので、ヘテロ二本鎖内の995および1107位における2つの不適正はよ
り低い位置のランダムさで修復された。
個の形質転換体中の最高熱安定性を示すクローンの配列分析はN181Dおよび
N218Sの両方の突然変異の存在を確認した。選別されたB.sublili
s DB428ライブラリからの400個の形質転換体のうち、約91%のクロ
ーンはN181D−および/またはN218S−型酵素安定性を発現したが、形
質転換体の約8.0%は野性型だけのsubtilisin E安定性を示した
。
然変異が導入されなかったことを示した。これは、新しい点突然変異が10個の
配列化遺伝子中に確認されないという事実に一致する(図14)。点突然変異は
in vitro進化応用のあるものに有用な相違を提供するが、それらは特に
突然変異速度が高いとき、有益な突然変異の組換えに対して疑問でもある。
ことが分かった[17、57]。この実施例では、本発明者等は組換え効率を改
良する種々のパラメータを研究し最適化する。この実施例で用いられたDNA基
質はAequorea victoriaからの緑蛍光蛋白質の部位指向性突然
変異体であった。GFP突然変異体はその蛍光を廃止する配列に沿って異なる位
置で導入された停止コドンを有した。蛍光野性型蛋白質は2つ以上の突然変異間
の組換えでのみ回復できる。蛍光コロニーの分画は組換え効率の尺度として使用
された。
ラスミドはPstIエンドヌクレアーゼで消化され、別の親はEcoRIで消化
された。線形化プラスミドは共に混合され、20×SSPE緩衝液は最終濃度1
×(180mM NaCl、1mM EDTA、10mM NaH2PO4、pH
7.4)まで加えられた。反応混合物は96℃で4分間加熱され、直ちに氷上に
4分間移され、インキュベートが68℃で2時間続けられた。
CR反応で増幅された。前進プライマ;5’−CCGACTGGAAAGCGG
GCAGTG−3’、逆プライマ5’−CGGGGCTGGCTTAACTAT
GCGG−3’、PCR生成物は共に混合されQiagenPCR精製キットを
用いて精製された。精製した生成物は20×SSPE緩衝液と混合され、上記の
ように対合された。アニール生成物はエタノールで沈澱され、またはQiage
nカラムで精製され、EcoRIおよびPstI酵素で消化された。消化生成物
はPstIおよびEcoRI消化pGFPベクターに結合された。
MでPCR反応に加えられた。PCR反応とそれに続くクローン化手順は上記と
同様に行った。
転換された。細胞はLB寒天板含有アンピシリン上に塗布され、37℃で一夜成
長され、蛍光が発生するまで室温または4℃でのインキュベートが続いた。
験が行われた。1つの実験では、ヘテロ二本鎖プラスミドは全ての現存の一本鎖
破断を閉じるためにDNAリガーゼで処理され、非結合試料と同じ条件で形質転
換された(表1参照)。結合試料は非結合試料より組換え効率で7倍までの改良
を示す。
復でDNAに追加の破断を導入するPCR反応に加えられた。表2はdUMP取
込みが組替えを抑制し、抑制の程度がdUTP濃度の増加で増加することを示す
。
ミドpGFP(3.3kb)およびBacillusシャトル・ベクターpCT
I(約9kb)が伝統的ヘテロ二本鎖プロトコルに続く環状ヘテロ二本鎖様プラ
スミドの準備で使用された。この実験の目的のために(二本鎖形成へのプラスミ
ド・サイズの効果を研究するために)両方の親が同じ配列を有した。pGFPが
環状プラスミドの30〜40%を形成すると、シャトル・ベクターはこの形の1
0%以下を生じた。
ある非常に長い(>0.8kb)末端のアニーリングをより困難にする。この困
難は図3に示される手順で避けられ、そこではヘテロ二本鎖形成はベクターの無
い形の基質間で生じ、ヘテロ二本鎖は続いてベクターに挿入される。
に対で組換えられた。親遺伝子はPCRで増幅され、アニールされ、pGFPベ
クターに結合された。ヘテロ二本鎖はXL10 E.coli系統に形質転換さ
れた。
換え効率の依存性を示す。期待したように組み替えは非常に近い突然変異では少
なく、効果的でなくなる。
ことができたことは顕著である。
。野性型GFPは99bpだけの距離で生じる各個別クロスオーバによる二重ク
ロスオーバの事象でのみ回復でき、多重で、近い間隔の突然変異を組換えるこの
方法の能力を示す。
ーリングに関してサイズの利益を提供するが、宿主への形質転換により単にホモ
二本鎖に関してヘテロ二本鎖に対する選択を可能にしない。既に増幅され、精製
された遺伝子断片の適当な量で播種した各親に対する1つだけのプライマによる
非対称PCR反応が100周期継続し、別の鎖より1つの鎖の100倍の過剰を
保証する。これらの非対称反応の生成物は混合され、共にアニールされ、少量の
非組換え二本鎖のみを生じる。表3の最後の列はこれらの富化ヘテロ二本鎖から
得られた組換え効率を示す。最初の三列と第四列との比較は親鎖の非対称合成に
より達成された改良を示す。
脱せずに形態および細部に種々の変更を加えることができることが、この開示を
読めば当分野の技術者には明らかであろう。本出願に引用した全ての刊行物およ
び特許文書は、個々の各刊行物および特許文書が個別に表されるのと同程度にあ
らゆる目的でその全体が参照により取り込まれる。
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occurs by assimilation of a single s
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l mismatch correction.)」Proc.Natl.Ac
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MSH2.a mispaired base recongnition
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的PMS遺伝子を必要とする(Heteroduplex DNA corre
ction in Saccharomyces cerevisiae is
mismatch specific and requires func
tional PMS genes)」 Mol.Cell.Biol.9:4
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s efficient mismatch−specific,mechan
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rmediates in Chinese hamster ovary c
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ium malilotiは右向きの鞭毛らせんの一方向の断続的回転によって
遊泳する(Rhizobium maliloti swims by uni
directional intermittent rotation of
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dsorbs to the complex flagella of Rh
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lilotiの複合鞭毛繊維の構造(Structure of comple
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的脱アシル化および化学的再アシル化によるエキノカンジンBの新規類似体の合
成:抗菌剤シロフンジンの合成(Synthesis of new anal
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eacylation and chemical reacylation
of the echinocandin B peptide:synthe
sis of the antifungal agent cilofung
in(LY121019).)」J.Antibiotics 42(3):3
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)の半合成的化学修飾:ECBのポリアリル化アシル類似体の親油性パラメータ
および幾何パラメータの構造活性研究(Semisynthetic chem
ical modification of the antifungal
lipopeptide echinocandin B(ECB):stru
cture−activity studies of the lipoph
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pus leavis卵母細胞に注入したDNAからの組み換え中間体の特徴付
け:同種組み換えの非保存的機構の証拠(Characterization
of recombination intermediates from
DNA injected into Xenopus leavis ooc
ytes:evidence for a nonconservative
mechanism of homologous recombinatio
n.)」Mol.Cell.Biol.11:3278〜3287.
る1組のプライマによるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いたヘテロ二本鎖
形成の過程を示す図である。
本鎖形成の過程を示す図である。
る1組のプライマによる非対称または単一プライマ・ポリメラーゼ連鎖反応(P
CR)を用いたヘテロ二本鎖形成過程を示す図である。
いたヘテロ二本鎖組換えを示す図である。
iloti(SEQ ID NO:2)からのFlaAのアミノ酸配列を示す図
である。
の制限部位の配置を示す図である。
a)はSEQ ID NO:3、(b)はSEQ ID NO:4、(c)はS
EQ ID NO:5、(d)はSEQ ID NO:6)で作成された4種の
モザイクflaA遺伝子のDNA配列を示す図である。
ザイクflaA遺伝子がどのようにして作成されたかを示す図である。
tahensis ECBデアシラーゼ突然変異体の物理マップを示す図である
(突然変異体7−2に対するpM7−2)
tahensis ECBデアシラーゼ突然変異体の物理マップを示す図である
(突然変異体16に対するpM16)。
換えてより強化された特異的活性を有するECBデアシラーゼ組換え体を得るた
めに実施例2で使用される過程を示す図である。
変異体16および組換え突然変異体15の特異的活性を示す図である。
えECBデアシラーゼ突然変異体15におけるDNA塩基の変化およびアミノ酸
の置換の位置を示す図である。
ID NO:7)によって作成されたA.utahensis ECBデアシ
ラーゼ遺伝子突然変異体M−15遺伝子のDNA配列を示す図である。
ブチリシンEを得るために実施例3で使用される過程を示す図である。
生成物の形質転換体からランダムに採られた10個のクローンの配列を示す図で
ある。xはRC1とRC2の間で異なる塩基位置に対応する。995における突
然変異は181におけるアミノ酸置換に対応するが、1107における突然変異
はスブチリシン蛋白質配列の218におけるアミノ酸置換に対応する。
の400個のクローンを初期活性(Ai)および残留活性(Ar)について選別し
た結果を示す図である。比Ai/Arは酵素の熱安定性を評価するために使用され
た。活性変種からのデータは降順に分類し、プロットしてある。約12.9%の
クローンがN181DおよびN218S突然変異を含む二重突然変異体に対応す
る表現型を示す図である。
Claims (34)
- 【請求項1】 (a)ヘテロ二本鎖を含むアニールしたポリヌクレオチドを
発生する条件下で親ポリヌクレオチド変種の集団をインキュベートすること、 (b)ヘテロ二本鎖を親ポリヌクレオチド変種または組換えポリヌクレオチド
変種に転換するためにヘテロ二本鎖を細胞DNA修復システムに曝すこと、およ
び (c)望みの特性をもつ組換えポリヌクレオチド変種を選別または選択するこ
とを含む、 望みの特性の獲得に向かってポリヌクレオチドを進化させる方法。 - 【請求項2】 ヘテロ二本鎖がin vitroで細胞DNA修復システム
に曝される請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 細胞DNA修復システムが細胞抽出物を含む請求項2に記載
の方法。 - 【請求項4】 ヘテロ二本鎖を細胞に導入し、それによってヘテロ二本鎖を
in vivoで細胞のDNA修復システムに曝すことをさらに含む請求項1に
記載の方法。 - 【請求項5】 アニールしたポリヌクレオチドがさらにホモ二本鎖を含み、
導入段階でホモ二本鎖を含む形質転換細胞に対してヘテロ二本鎖を含む形質転換
細胞を選択する請求項4に記載の方法。 - 【請求項6】 第1ポリヌクレオチド変種が第1ベクターの成分として提供
され、第2ポリヌクレオチド変種が第2ベクターの成分として与えられ、方法が
さらに第1および第2ベクターを、第1および第2ポリヌクレオチド変種が反対
側末端で生じる線形化された形に変換することを含み、それによってインキュベ
ート段階で第1線形化ベクターの一本鎖形が互いに再アニールされ、線形第1ベ
クターを形成し、第2線形化ベクターの一本鎖形が互いに再アニールされ、線形
第2ベクターを形成し、第1および第2ベクターの一本鎖線形化された形が互い
にアニールされ、各鎖にニックを有する環状ヘテロ二本鎖を形成し、導入段階が
線形第1および第2ベクターに対して環状ヘテロ二本鎖を含む形質転換細胞を選
択する請求項4に記載の方法。 - 【請求項7】 第1および第2ベクターがPCRにより線形化された形に変
換される請求項6に記載の方法。 - 【請求項8】 第1および第2ベクターが第1および第2制限酵素での消化
により線形化された形に変換される請求項6に記載の方法。 - 【請求項9】 ポリヌクレオチド変種の集団が二本鎖形で与えられ、方法が
さらにアニール段階の前に二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖ポリヌクレオチドに
変換することを含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】 変換段階が、第1ポリヌクレオチド変種の第1鎖、および
第2ポリヌクレオチド変種の第2鎖を増幅するために、第1および第2二本鎖ポ
リヌクレオチド変種の非対称増幅を行うことを含み、それによって第1および第
2鎖がインキュベート段階でアニールされてヘテロ二本鎖を形成する請求項1に
記載の方法。 - 【請求項11】 第1および第2二本鎖ポリヌクレオチド変種がベクターな
しの形で与えられ、方法がさらにベクターにヘテロ二本鎖を取り込むことを含む
請求項10に記載の方法。 - 【請求項12】 ポリヌクレオチドの集団が、二本鎖形で与えられる第1お
よび第2ポリヌクレオチドを含み、方法がさらに第1および第2ベクターの成分
として第1および第2ポリヌクレオチドを取り込むことを含み、それによって第
1および第2ポリヌクレオチドは第1および第2ベクターの反対側の末端を占め
、それによってインキュベート段階で第1線形化ベクターの一本鎖形が互いに再
アニールされて線形第1ベクター形成し、第2線形化ベクターの一本鎖形が互い
に再アニールされて線形第2ベクターを形成し、第1および第2ベクターの一本
鎖線形化された形が互いにアニールされ、各鎖にニックを有する環状ヘテロ二本
鎖を形成し、導入段階が線形第1および第2ベクターに対して環状ヘテロ二本鎖
を含む形質転換細胞を選択する請求項4に記載の方法。 - 【請求項13】 導入段階の前に共有結合で閉じた環状ヘテロ二本鎖を形成
するためにヘテロ二本鎖中のニックを封じることをさらに含む請求項4に記載の
方法。 - 【請求項14】 第1および第2ポリヌクレオチドが染色体DNAから得ら
れる請求項11に記載の方法。 - 【請求項15】 後続の周期のインキュベート段階が以前の周期からの組換
え変種に対して行われる、反復段階(a)〜(c)をさらに含む請求項1に記載
の方法。 - 【請求項16】 ポリヌクレオチド変種がポリペプチドを符号化する請求項
1に記載の方法。 - 【請求項17】 ポリヌクレオチド変種の集団が少なくとも20の変種を含
む請求項1に記載の方法。 - 【請求項18】 ポリヌクレオチド変種の集団が少なくとも長さ10kbで
ある請求項1に記載の方法。 - 【請求項19】 ポリヌクレオチド変種の集団が天然変種を含む請求項1に
記載の方法。 - 【請求項20】 ポリヌクレオチドの集団が変異原PCRにより生成された
変種を含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項21】 ポリヌクレチド変種の集団が部位指向変異形成により生成
された変種を含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項22】 細胞が細菌細胞である請求項1に記載の方法。
- 【請求項23】 変種ポリヌクレオチドの集団を少なくとも部分的に脱メチ
ル化することをさらに含む請求項1に記載の方法。 - 【請求項24】 少なくとも部分的に脱メチル化する段階が変種ポリヌクレ
オチドの集団のPCR増幅により実行される請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 少なくとも部分的に脱メチルする段階が宿主細胞の変種ポ
リヌクレオチドの集団の増幅により実行される請求項23に記載の方法。 - 【請求項26】 宿主細胞がメチラーゼ酵素を符号化する遺伝子に欠陥があ
る請求項25に記載の方法。 - 【請求項27】 変種ポリヌクレオチド変種の集団が互いに少なくとも90
%の配列同一性を有する少なくとも5つのポリヌクレオチドを含む請求項1に記
載の方法。 - 【請求項28】 選別した組換え変種を分離することをさらに含む請求項1
に記載の方法。 - 【請求項29】 組換え蛋白質を生成するために選別した組換え変種を発現
することをさらに含む請求項28に記載の方法。 - 【請求項30】 薬剤組成物を形成するために組換え蛋白質を担体と調合す
ることをさらに含む請求項29に記載の方法。 - 【請求項31】 ポリヌクレオチド変種がプロテアーゼ、リパーゼ、アミラ
ーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ
、およびフィターゼからなる群から選ばれた酵素を符号化する請求項1に記載の
方法。 - 【請求項32】 ポリヌクレオチド変種がインシュリン、ACTH、グルカ
ゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホ
ルモン、ソマトメジン、エリスロポイエチン、黄体形成ホルモン、じゅう毛性性
腺刺激ホルモン、視床上部放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、レ
ラクシン、インターフェロン、トロンボポイエチン(TPO)およびプロラクチ
ンからなる群から選ばれたポリペプチドを符号化する請求項1に記載の方法。 - 【請求項33】 ポリヌクレオチド変種が代謝経路を形成する複数の酵素を
符号化する請求項1に記載の方法。 - 【請求項34】 ポリヌクレオチド変種が鎖状体形である請求項1に記載の
方法。
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