JPH06178686A - ポリペプチド生産法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 形質転換用のヌクレオチド配列のクローニン
グを共通のプライマーを利用したＰＣＲ法で行うことに
より、形質転換生物の産生する複数のポリペプチドのア
ッセイ又は精製を単独の結合試薬で行えるようにする 【構成】 形質転換生物の培養によって少なくとも１種
類のポリペプチドを生産するに当り、オリゴヌクレオチ
ドプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）で核酸の配列の必要な部分をクローニングすること
によって上記プライマー対によって定まる末端部分を有
するクローン配列を得、次いで上記ポリメラーゼ連鎖反
応で得られた上記クローン配列又はそのコピーで生物を
形質転換し、さらに上記形質転換生物を培養して上記ク
ローン配列にコードされたポリペプチドを発現させ、し
かる後に、上記プライマーの一方にコードされた少なく
とも３個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列
に対して特異的な親和性を示す結合試薬を用いて上記ポ
リペプチドをアッセイ又は精製する。この方法は、抗体
や抗体フラグメント等の生産に特に適している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は組換えＤＮＡ技術による
ポリペプチドの生産に関する。これは次第にその商業的
重要性を増しつつある主題である。より詳細には、本発
明は抗体フラグメントの生産に応用することができる
が、それだけに限定されるわけではない。

【０００２】

【従来の技術】組換えＤＮＡ技術でポリペプチドを生産
する場合、まず最初に、所望のポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列を得る必要がある。次いで、生物（多くの
場合、細菌の一種である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ））に上記外来遺伝物質を導入し、得られ
た形質転換生物を培養して所望のポリペプチドを産生さ
せ、これを培地から回収する。

【０００３】形質転換生物の培養に際しては、所望のポ
リペプチドについてアッセイしなければならないことが
多い。例えば、ｐＨ変化や温度や培地組成等の影響を評
価することが望ましい場合には、形質転換微生物の至適
培養条件を調べるための作業に当たって、ポリペプチド
のアッセイが必要とされる。また、その後の生産段階に
おいても、産生能力をチェックするためにアッセイが望
まれる。

【０００４】既存のアッセイ法にも必要な感度と特異性
を兼ね備えたものはある。慣用技術のうちＥＬＩＳＡ法
とウエスタンブロッティング法の二つが適当なものとし
て挙げられる。

【０００５】しかし、これらのアッセイ法には、所望ポ
リペプチドに対して特異的な結合親和性を示す抗体（又
は抗体フラグメントその他の結合試薬）を入手しておく
必要がある。このようにかかるアッセイ技術に関連して
用いられる抗体は「トレーサー抗体」と呼ぶことができ
る。

【０００６】このように、所望ポリペプチドのアッセイ
が行えるように、所望ポリペプチドに対して特異的結合
親和性を有する抗体（又は抗体フラグメントその他の結
合試薬）を準備しておくことがまず必要となる。

【０００７】所望のポリペプチドに対して特異的結合親
和性を有する抗体又は抗体フラグメントその他の試薬
は、アフィニティークロマトグラフィー等によるペプチ
ドの精製においても必要とされる。かかる目的に用いら
れる抗体は「捕獲抗体」と呼ぶことができる。

【０００８】このように、如何なるポリペプチドを所望
する場合にも、そのポリペプチドに対して特異的結合親
和性を有する抗体等の結合試薬が必要とされることが理
解されるであろう。しかし、かかる結合試薬は入手でき
ない場合がほとんどであり、所望ポリペプチドの生産に
移行するに当たっては結合試薬の調製という余分な作業
を行わなければならない。

【０００９】かかる必要性は、所望とするポリペプチド
の全部又は大部分が抗体フラグメント抗体の可変部で構
成されているような場合に特に高い。これらはその定義
通り非常に変化に富んでおり、既存の抗体を用いるわけ
にはいかない。

【００１０】これに対する一つの方策として、抗体を利
用することができるような追加ペプチドを所望ポリペプ
チドと融合させたものが発現されるように、融合遺伝子
で生物を形質転換することが提案されている。このよう
な「タグ（ｔａｇ）」もしくは「テール（ｔａｉｌ）」
とでも呼び得る追加ペプチドを用いて、精製及び／又は
アッセイを行うことができる。これについては、Ｓａｓ
ｓｅｎｆｅｌｄ，Ｔｉｂｔｅｃｈ，８，８８（１９９
０）で議論されている。ただし、このような「タグ」に
起因する欠点が認められている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、今回、遺
伝子工学における周知技術であるポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）の副次的効果を利用して、所望ポリペプチド
に対する抗体を得ることができることを発見した。ＰＣ
Ｒは所望のヌクレオチド配列を優先的に複製することに
よってその配列を「増幅」するものである。ここで、Ｄ
ＮＡ複製法の概略を記した添付図面の図１〜図６を参照
しながら、ＰＣＲの特徴について述べる。

【００１２】ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子増幅操
作は、まず、所望ポリペプチドをコードする遺伝子（ヌ
クレオチド配列）を含むＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を
用いて始める。その他のヌクレオチド配列も存在する。
例えば、モノクローナル抗体のフラグメントを生産しよ
うとする場合には、ポリメラーゼ連鎖反応の出発点はそ
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
ゲノムである。出発ＤＮＡは、ハイブリドーマ細胞から
回収したｍＲＮＡの逆転写によって人工的に得られるｃ
ＤＮＡであるのがもっと一般的である。

【００１３】ポリメラーゼ連鎖反応には、それぞれ所望
遺伝子の末端付近のＤＮＡ鎖部分にアニールし得る比較
的短いヌクレオチド配列からなる一対の「プライマー」
対が必要とされる。一方のプライマーは所望遺伝子のセ
ンス鎖の一方の末端部分にアニールし得るものであり、
もう一方のプライマーは所望遺伝子のアンチセンス鎖の
反対側末端部分にアニールし得る。ポリメラーゼ連鎖反
応に用いられる各プライマーは、一種類のオリゴヌクレ
オチドでもよいし、何種類かの類似したオリゴヌクレオ
チドの混合物でもよい。このような類似したオリゴヌク
レオチドの混合物は縮重プライマーと呼ばれる。

【００１４】ポリメラーゼ連鎖反応は、数段階からなる
一連の工程を何サイクルか繰り返すことによって行われ
る。特に簡便な態様においては、これらの段階は温度に
よって制御される。まず、出発遺伝子材料、２種類のプ
ライマー、各種ヌクレオチド単量体及びＤＮＡポリメラ
ーゼを含む反応混合物を調製する。

【００１５】図１に示す通り、出発遺伝子材料は、所望
遺伝子（ヌクレオチド配列）とそれに相対するもう一つ
のヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡである。図１に
おいて、Ｓ１は所望ヌクレオチド配列（ＮＳで示す）を
含んだセンス鎖を示しており、ＡＳ１は所望配列の相補
配列（ＮＡＳで示す）を含んだアンチセンス鎖を示して
いる。第一段階では、この二本鎖ＤＮＡを、加熱（例え
ば、約９５℃に１分間ほど）して一本鎖ＤＮＡに変性さ
せる。

【００１６】次に、これをＤＮＡのアニーリングが起こ
るような温度まで冷却（例えば、３０〜６０℃で約１分
間）する。ただし、この段階はプライマー存在下で進行
するので、若干のプライマーが所望ヌクレオチド配列の
一方の末端付近のＤＮＡにアニールする。これを図２に
示すが、ここでは、プライマーＰ１が最初のＤＮＡのセ
ンス鎖にアニールしている。サイクルの第三段階では、
アニールしたＤＮＡを、プライマーからの新たなＤＮＡ
合成に適した温度（例えば、好熱性ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて、７５℃）でインキュベートする。これによ
り、鎖長ははっきりと定まっていないものの、プライマ
ーＰ１と所望のヌクレオチド配列ＮＡＳを含む新たなア
ンチセンスＤＮＡ鎖が合成される。これを図３に示す
が、ここでは新たに合成されたアンチセンス鎖をＡＳ２
で示す。

【００１７】次いで、上記の変性、アニーリング及びＤ
ＮＡ合成の各段階を繰り返す。もう一つのプライマーＰ
２は、図４に示す通り、アンチセンス鎖ＡＳ２に、所望
遺伝子とは反対側の末端付近でアニールする。その後の
合成段階において、プライマーＰ２からプライマーＰ１
と相補的な末端までの部分に相当する新たなＤＮＡが合
成される。この鎖を図５にＳ３として示す。

【００１８】変性、アニーリング及びＤＮＡ合成という
一連の工程を何度も繰り返す。これ以降の段階において
は、存在するＤＮＡ鎖（Ｓ３鎖など）のいずれかにプラ
イマーがアニールするが、Ｓ３鎖は所望の配列と両プラ
イマーに対応する末端部分しか含んでいない。これを図
６に示す。この結果、それ以降の繰り返しサイクルにお
いては、所望のヌクレオチド配列と両プライマーに対応
する末端部分しか含んでいないＤＮＡの生成が、その他
のＤＮＡの生成をはるかに上回ることになる。数多く繰
り返すと、混合物中に存在するＤＮＡのほとんどが前者
で占められるようになる。

【００１９】反応の各段階を別の方式で行うこともでき
る。例えば、ＤＮＡを一本鎖に変性させるための試薬を
添加してもよく、これは後でアニーリングが起こるよう
に除去すればよい。プライマーを最初から加えずに、必
要なときに適宜添加してもよい。ＤＮＡ合成用の試薬を
加えてもよい。ＲＮＡから直接操作を開始することも可
能である。ＰＣＲ技術の本質は、次の各段階：所望とす
るヌクレオチド配列を一本鎖核酸上に露出させる段階、
所望配列の一方の末端にオリゴヌクレオチドプライマー
をアニーリングさせる段階、及び上記プライマーから伸
長する相補的核酸鎖を合成する段階からなるサイクル
を、一方の核酸鎖に対して所望配列の一方の末端付近で
アニールし得るプライマーと、相補的核酸鎖に対して所
望配列とは反対側の末端付近でアニールし得る第二のプ
ライマーとを用いることによって、所望配列と上記二つ
のプライマーで定まる末端部分を有する核酸のクローン
鎖が得られるように、繰り返して行うことにある。

【００２０】その後、かかる核酸のクローン配列を外来
遺伝物質として生物に導入する。この形質転換生物を用
いて、所望のポリペプチドを発現させる。

【００２１】通常、上記クローン配列は二本鎖核酸とし
て生成し、二本鎖型で生物に導入される。

【００２２】ポリメラーゼ連鎖反応は長年にわたって知
られており、それについての報文も多数存在する。参考
文献としては、Ｓａｉｋｉ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３
０，１３５０−１３５４（１９８５）、Ｓｃｈａｒｆ
他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３，１０７６（１９８６）、
並びにＳａｉｋｉ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７
（１９８８）を挙げることができる。

【００２３】ポリメラーゼ連鎖反応の利用によって生ず
る利点は、必要なヌクレオチド配列以外のものをほとん
ど含まないＤＮＡが大量に得られるということである。
これにより、ＤＮＡを生物に導入したとき、形質転換生
物が他の不必要なＤＮＡに比べ必要なＤＮＡを含む確率
が高くなる。

【００２４】ポリペプチドの発現に用いる生物にクロー
ン配列をそのまま導入すると、そのポリペプチドはＰＣ
Ｒプライマーにコードされた末端アミノ酸配列を有する
であろう。これらを「モチーフ」ペプチドと呼ぶが、こ
れらのモチーフペプチド自体はポリペプチドの機能に関
与することもあれば関与しない場合もある。

【００２５】ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライ
マーは、最初のＤＮＡの必要な部分にアニールし得るも
のでなければならない。しかしながら、そのためには、
必ずしもこれらがＤＮＡのすべて場所に対して完全な相
補性を有している必要はなく、二つのプライマーの間の
ヌクレオチド配列にコードされたある特定の一つのポリ
ペプチドだけに対するものでなくてもよい。

【００２６】特に、抗体のＦｖフラグメントにおいて
は、重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）共にそれぞれ「フレ
ームワーク領域」と呼ばれる抗体間の相同性のかなり高
い（特に同一種の間で）領域と、相補性決定部位（ＣＤ
Ｒ）とも呼ばれる３か所の超可変部とを含んでいる。ポ
リメラーゼ連鎖反応による抗体フラグメントの増幅は、
超可変部に隣接するフレームワーク領域部分に対応する
プライマー対を用いて行うことができる。

【００２７】これは、Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｗｉｎｔｅｒ他
のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
６，３８３３（１９８９）で行われており、この報文に
は、複数の重鎖可変ドメイン及びそれぞれκ型軽鎖可変
ドメインをコードするマウスのヌクレオチド配列の末端
領域にアニールし得るオリゴヌクレオチドプライマー対
が開示されている。この報文に開示されている通り、こ
れらのプライマーは、問題とするモノクローナル抗体の
結合特異性とは無関係に、マウスモノクローナル抗体の
軽鎖及び重鎖抗体フラグメントのクローニングに用いる
ことができる。これらのプライマー並びにその他のプラ
イマーは欧州特許公開第３６８６８４号（Ｗｉｎｔｅｒ
他／Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｓｉ
ｌ）にも開示されている。

【００２８】多数のポリペプチド（例えば、抗体フラグ
メント又はその他の相同な末端領域を有するタンパク
質）に対する遺伝子のクローニングにこの技術を用いた
ときの特徴は、生成するすべてのポリペプチドがプライ
マーにコードされたものに対応する（従って、同一の）
Ｎ末端及びＣ末端（モチーフペプチド）を有している
点、並びにそれらの本来のアミノ酸配列には正確には対
応していないこともある点である。これらのモチーフペ
プチドは必ずしも出発遺伝子にコードされた本来のアミ
ノ酸配列と同一である必要はなく、本来のアミノ酸配列
とある程度類似したものであればよく、従って、完全に
「異質」なものでもない。

【００２９】ポリペプチドの末端部分を構成するモチー
フペプチドは、核酸のクローン配列の末端部分のヌクレ
オチドプライマーのコピーにコードされたアミノ酸配列
とある限度内で異なっていることもある。

【００３０】これは、クローン配列を生物に導入する方
式によって起こり得る。プライマー配列には、クローン
配列を細菌プラスミド等のベクター（後段で生物を形質
転換するために用いられる）に導入したときに制限酵素
部位を用いてクローン配列の末端核酸部分を除去するこ
とができるように、制限酵素部位が組込まれている場合
がある。この場合、ベクターから得られるヌクレオチド
は、クローン配列から切り取られたヌクレオチドを部分
的又は全体的に置換している。これらのベクターから得
られるヌクレオチドは、好ましくは、置換されたクロー
ンのヌクレオチド配列と同一のアミノ酸配列（同一のア
ミノ酸でない場合には、モチーフペプチドが異質のもの
ではなく本来のアミノ酸配列と類似するものになるよう
に、非常に類似した配列）をコードするように予め準備
しておく。プライマーの末端が不完全なコドンで終わる
場合には、ベクターはかかる不完全コドンを完全コドン
で置換したものでなければならない。

【００３１】従って、モチーフペプチドの少なくとも一
部はプライマーからコピーされたヌクレオチド配列によ
って発現されるが、その他のものから（全体的又は部分
的に）得られたヌクレオチドコドンによって発現される
部分がモチーフペプチドに含まれていてもよい。ただ
し、プライマーにコードされたアミノ酸配列とはさほど
相違していないことが望ましい。また、プライマー自体
は、相補配列とのアニーリングが可能なように、存在す
るヌクレオチド配列と類似している必要がある。

【００３２】広義には、本発明は、結合試薬の標的とし
て働くモチーフペプチドを与える。この試薬は次いでモ
チーフペプチドを組込んだポリペプチドの生産その他の
作業に用いられる。

【００３３】本発明は、第一の態様において、形質転換
生物の培養によって少なくとも１種類のポリペプチドを
生産する方法にして、オリゴヌクレオチドプライマー対
を用いるポリメラーゼ連鎖反応で核酸配列の必要な部分
をクローニングすることによって、上記プライマー対に
よって定まる末端部分を有するクローン配列を得る段
階、上記ポリメラーゼ連鎖反応で得られた上記クローン
配列又はそのコピーで生物を形質転換する段階、及び上
記形質転換生物を培養して、上記クローン配列にコード
されたポリペプチドを発現させる段階を含んでなり、上
記プライマーの一方にコードされた少なくとも３個の連
続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して特異
的な親和性を示す結合試薬を用いて上記ポリペプチドを
アッセイ又は精製することを特徴とする方法を提供す
る。

【００３４】プライマー中のコドンは、無論、アミノ酸
の同一性と配列中でのその位置の双方をコードする。

【００３５】３個の連続するアミノ酸は、結合に際して
の特異的親和性のための最小単位であると信じられてお
り、「認識核（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｋｅｒｎｅ
ｌ）」と呼ばれる。

【００３６】本発明において、通常、結合試薬はアミノ
酸残基数が３個を超える配列に結合するように設計され
るが、この配列はプライマーにコードされたアミノ酸残
基を少なくとも３個含んでいればよい。

【００３７】アミノ酸配列が上記プライマーにコードさ
れた少なくとも３残基のアミノ酸配列を含んでいるとい
う要件により、プライマーにコードされた配列とは僅か
に異なるアミノ酸配列に対しても上記結合試薬が作用す
可能性が残る。このような差異は、特にプライマーが不
完全な末端コドンを含んでいるときに、１又はそれ以上
のアミノ酸を追加することであってもよい。また、１又
はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていて
もよい。

【００３８】縮重プライマーを用いてモチーフペプチド
をコードする場合、結合試薬は、縮重プライマー中の個
々のオリゴヌクレオチド間で差異のみられないヌクレオ
チド配列に対応する少なくとも３個のアミノ酸残基から
なる短い領域に対して親和性を有するように設計するこ
とができる。

【００３９】ポリメラーゼ連鎖反応に用いる各プライマ
ーは、前述の通り、一種類のオリゴヌクレオチドでもよ
いし、何種類かの類似したオリゴヌクレオチドの混合物
であってもよい。

【００４０】好ましくは、結合試薬は、プライマーにコ
ード（同一性及び位置に関して）された４個、５個、６
個もしくはそれ以上のアミノ酸残基からなる配列に対し
て親和性を示す。

【００４１】結合試薬は、少なくとも３個（好ましくは
もっと多く）のアミノ酸残基がプライマーにコードされ
ているようなアミノ酸配列を含んだ、６個以上のアミノ
酸残基からなるアミノ酸配列に対して特異的親和性を示
すことが多いと考えられる。

【００４２】配列全体は好ましくはプライマーにコード
（同一性及び位置に関して）されているアミノ酸残基を
少なくとも６個、或いは少なくとも８個含んでいる。こ
れらのアミノ酸は連続した配列を形成するものであって
もよいし、或いはプライマーにコードされたものとは異
なる幾つかのアミノ酸を含む配列の一部であってもよ
い。好ましくは、結合試薬が親和性を示す配列中に含ま
れるアミノ酸の大多数はプライマーによってコードされ
る。それらがすべてプライマーにコードされていてもよ
い。

【００４３】前述の通り、モチーフペプチドは、プライ
マー以外に由来するヌクレオチドコドンによって発現さ
れるアミノ酸を含んでいてもよい。しかし、かかるヌク
レオチドは発現するアミノ酸配列に実質的な差異が生じ
ないようにして、その結果、少なくとも部分的にはプラ
イマーにコードされたアミノ酸配列に対して親和性を示
す結合試薬がモチーフペプチドに対しても結合するよう
にするのが望ましい。

【００４４】結合試薬は好ましくは抗体又は抗体フラグ
メントである。その他、アンチセンスペプチド、抗体の
結合部位に類似した疑似化合物並びに親和性色素等も使
用することができる。

【００４５】生物を外来核酸で形質転換する技術は既に
周知であり、本発明では形質転換を実施するための生物
の種類及び方法を問わない。導入する核酸配列は、ポリ
メラーゼ連鎖反応の直接の産物たるクローン自体ではな
く、当該クローンからの転写物であってもよい。導入す
る核酸配列は、前述の通り、逆センスの相補コピーであ
ってもよく、プライマー配列の一部をクローン配列の残
りが形質転換生物に組込まれる前に除去してもよい。

【００４６】周知の通り、ＤＮＡの二重らせんを構成す
る二本の鎖には共に情報がコードされているが、タンパ
ク質合成には片方の鎖だけが利用される。ポリメラーゼ
連鎖反応に用いる二つのプライマーの一方は、アンチセ
ンス核酸鎖に対するプライマーでなければならない。従
って、特異的親和性の対象となるアミノ酸配列は、プラ
イマーと同一のものではなく、プライマーと相補的なセ
ンス鎖の一部から発現される配列とすることができる。

【００４７】本発明の利点の一つは、アッセイ又は精製
に「異質な」アミノ酸配列を用いなくて済むことであ
る。本発明は、複数の異なるポリペプチドの生産に応用
する場合（この場合、それぞれの核酸鎖のクローニング
に少なくとも一つのプライマーを共通して用いる）に特
に有用である。従って、この場合、複数の異なるポリペ
プチドのアッセイ又は精製を、すべてのクローニングに
共通して用いた上記プライマーにコードされたアミノ酸
配列に対して親和性をもつ類似抗体又は抗体フラグメン
トを用いて行うことができる。このようにして、共通プ
ライマーにコードされたアミノ酸配列に対して結合する
抗体や抗体フラグメント等の結合試薬を使用すれば、２
以上のポリペプチドに対して同一の結合試薬を用いるこ
とができることになる。各々のポリペプチドに対して、
かかる結合試薬は、形質転換生物の培養過程で産生する
他の如何なるポリペプチドよりも所望ポリペプチドとの
結合に対して十分な特異性を有すると考えられるが、た
だし、かかる結合試薬は１種類のポリペプチドだけに対
するものほど特異的ではない。

【００４８】本発明は、核酸の最初のクローニングをポ
リメラーゼ連鎖反応で行うかぎり、広範な種類のポリペ
プチドの生産に応用できる。ただし、本発明は、ポリペ
プチド群が相同な末端領域を有するタンパク質ファミリ
ーに由来していて、その末端領域をコードするプライマ
ー群を遺伝子ファミリーのクローニングに用いることが
できるような場合に、特に応用し易い。かかるファミリ
ーの重要な具体例は免疫グロブリン可変ドメインであ
り、この場合、フレームワーク領域内のアミノ酸配列に
類似するアミノ酸配列をプライマーがコードするように
することもできれば、ポリペプチドの残りの部分が抗体
の超可変部を含むようにすることもできる。

【００４９】ポリペプチド群が抗体の可変ドメインで、
プライマーがこれら可変ドメインのフレームワーク領域
のアミノ酸配列をコードしている場合には、アッセイ又
は精製に用いる結合試薬によってＣ末端アミノ酸配列が
認識されるようにするのが好ましいと考えられる。Ｎ末
端とは異なり、Ｃ末端は比較的露出されていてしかも重
鎖可変ドメインの結合部位から離れている。従って、Ｃ
末端はＮ末端よりも接近し易く、捕獲試薬が可変ドメイ
ンに結合し易くなる。

【００５０】本発明者らは、幾つかのＦｖ抗体フラグメ
ントについて、可変ドメインのＣ末端への接近し易さが
その周囲の条件によって若干変動し、微量滴定プレート
（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）上への吸着又は
温和な電解質（１Ｍ塩化ナトリウム等）の存在によって
促進されることを発見した。これらの条件は、タンパク
質を変性させずに、抗体フラグメントのコンホメーショ
ンを若干変化させる。

【００５１】ポリペプチドのＣ末端に結合させたときの
利点は、抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン
の双方でみられる。さらに、その他の多数のタンパク質
も比較的露出されたＣ末端部分を有しており、従って、
同じ効果を得ることが可能である。

【００５２】ポリペプチドが抗体フラグメントの場合、
所望する軽鎖もしくは重鎖フラグメントの片方だけでな
く、もう一方の鎖の対応フラグメントも含めた両者が発
現されるように、生物を形質転換するのが望ましい。こ
れら二つのフラグメントはアッセイ又は精製段階を実施
する前に自発的に会合するが、これらの段階は会合した
二つの鎖のいずれか一方のモチーフペプチドを用いて行
うこともできる。

【００５３】本発明は、第二の態様において、ポリメラ
ーゼ連鎖反応に用いられるオリゴヌクレオチドプライマ
ーと、そのプライマーにコードされた少なくとも３個の
連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して特
異的な結合親和性を有する結合試薬とを含んでなるキッ
トを提供する。

【００５４】本発明は、別の態様において、以降に示す
ある種のアミノ酸配列に対して特異的結合親和性を有す
る抗体、抗体フラグメントその他の結合試薬を提供す
る。

【００５５】抗体や抗体フラグメント等の試薬がポリペ
プチドに結合する際、結合は次の式で表される平衡反応
に従う。

【００５６】Ａ＋Ｐ＝ＡＰ ここで、Ａは試薬を表し、Ｐはポリペプチドを表し、Ａ
Ｐはポリペプチドと試薬との複合体を表す。各成分の濃
度は次の関係を有する。

【００５７】［ＡＰ］／［Ａ］［Ｐ］＝Ｋ_ａ ここで、Ｋ_ａは親和定数と呼ばれる定数である。特異的
結合親和性を有する場合、Ｋ_ａの値は一般に１０⁴ 以上
であり、これをはるかに上回ることも多い。抗体の場
合、Ｋ_ａ値は一般に１０⁷ 〜１０⁹ であると考えられ
る。アンチセンスペプチドの場合、この値は一般に１０
⁵ 程度である。

【００５８】ポリメラーゼ連鎖反応に用いるプライマー
は１５〜４５個のヌクレオチドを含んでいて、５〜１５
残基のアミノ酸配列をコードするようなものが一般的で
ある。

【００５９】モチーフペプチド（アミノ酸配列）に対し
て特異的結合親和性を有する抗体は、モチーフアミノ酸
配列自体又はそれに類似するものを化学合成することを
出発点とする手順によって得ることができる。１５残基
程度のアミノ酸からなるペプチド化学合成法は周知であ
る（実際にはこれより若干多いアミノ酸残基を含むペプ
チドの化学合成も可能である）。

【００６０】次に、かかるアミノ酸配列をキャリアタン
パク質に共有結合させて複合体を得る。このような共有
結合複合体を得る方法も周知である。次に、適当な宿主
動物を上記複合体で免疫して、それに対する免疫反応を
誘起させる。適当な期間をおいた後、宿主動物から血清
を採取する。

【００６１】上記アミノ酸配列に対して特異的結合親和
性を有するポリクローナル抗体は、上記アミノ酸配列を
固定化したクロマトグラフィーカラムを用いるアフィニ
ティークロマトグラフィーによって抽出することができ
る。このようにして得られるポリクローナル抗体は、一
般に、本発明を実験室規模で実施するような場合、そこ
での使用に十分に適している。しかし、所望により、常
法を用いて得られるモノクローナル抗体やポリクローナ
ル抗体から得られる抗体フラグメントを使用することも
できる。このことは、作業を生産規模で行う場合には、
ポリクローナル抗体を大量に供給するのに都合がよいの
で、一般に望ましい。

【００６２】モチーフペプチドの化学合成に代る別法と
しては、ポリペプチドの生産にポリメラーゼ連鎖反応を
既に用いていれば、そのポリペプチド自体を用いて、オ
リゴヌクレオチドプライマーによって少なくとも部分的
にコードされているモチーフアミノ酸配列に結合する抗
体等を含めた抗体を産生させることができる。モチーフ
ペプチドに特異的に結合するような抗体は、モチーフ配
列を固定化したアフィニティーカラムを用いて回収する
ことができる。これらの抗体は、次に、本発明に従って
同じ２つのプライマー対又はそれらのうちの少なくとも
一方を用いての別のポリペプチドの生産に用いることが
できる。

【００６３】

【実施例】本発明を以下の実施例により説明するが、こ
れらの実施例は上述のポリメラーゼ連鎖反応を用いてク
ローニングした可変部を有する抗体フラグメントの生産
に関する。

【００６４】以下の実施例において、使用した物質を以
下の略語で示す。

【００６５】ＰＢＳ＝生理的リン酸緩衝液（０．０１Ｍ
・ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ／Ｎａ₂ ＨＰＯ₄，ｐＨ７，０．１５
Ｍ・ＮａＣｌ） ＰＢＳＡ＝ＰＢＳ＋アジ化ナトリウム ＰＢＳＴ＝ＰＢＳ＋０．１５重量％Ｔｗｅｅｎ２０ ＰＰＤ＝精製タンパク質誘導体（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅ
ｒｕｍｉｎｓｔｉｔｕｔ（オランダ国コペンハーゲン）
から入手） ＢＣＩＰ／ＮＢＴ＝５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドイルリン酸及びｐ−ニロトブルーテトラゾリウムクロ
リド（アルカリ性ホスファターゼに対する基質系，Ｐｒ
ｏｍｅｇａ社から市販） ＰＮＰＰ＝ｐ−ニトロフェニルリン酸（アルカリ性ホス
ファターゼに対する別の基質系，Ｓｉｇｍａ社から市
販） Ｔｗｅｅｎ２０＝Ｓｉｇｉｍａ社から市販の非イオン性
界面活性剤

【００６６】重鎖遺伝子の増幅用プライマー プライマーＶＨ１ ＦＯＲ２は欧州特許公開第３９８９
８４号に開示されている。これは、本明細書中に開示し
た配列表の配列番号：１に示す配列を有している。

【００６７】３′末端に２つの追加ヌクレオチドを有す
る関連プライマーが欧州特許公開第３９８９８４号にＶ
Ｈ１ ＦＯＲとして開示されている。これは、Ｏｒｌａ
ｎｄｉ，Ｗｉｎｔｅｒ他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，３８３３（１９８９）にも
開示されている。

【００６８】ＶＨ１ ＦＯＲ２は、前方プライマー（ｆ
ｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）といわれ、それ自体はア
ンチセンスである。これは、マウス重鎖可変ドメインを
コードするヌクレオチド配列のセンス鎖の３′末端にア
ニールするように設計されたものである。これはＣ末端
アミノ酸配列（ペプチド）を（間接的に）コードしてお
り、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号：２にＣ末端
を右側にして示してある。このプライマーに相補的なセ
ンス鎖は同一のアミノ酸配列配列を直接コードしてい
る。このセンス鎖も配列番号：２に示してあり、Ｂｓｔ
ＥII認識部位が組込まれているが、その切断部位を矢印
で示す。

【００６９】プライマーＶＨ１ ＢＡＣＫは、上述の欧
州特許公開第３９８９８４号並びにＯｒｌａｎｄｉ他の
報文に開示されている。これは、実際には、若干のヌク
レオチドが異なっている非常に類似したプライマーの混
合物である。これは、配列表の配列番号：３に示す配列
を有する。これはセンス鎖であり、マウス重鎖可変ドメ
インをコードするヌクレオチド配列のアンチセンス鎖の
３′末端にアニールするように設計されたものである。
これは５′末端に不完全コドンを有する。このコドンを
適当に補って完全なものにすれば、そのヌクレオチド配
列は、配列番号：３に付記した２通りのＮ末端アミノ酸
配列のいずれかをコードするようになる。このプライマ
ーは、ＰｓｔＩ認識部位を含んでおり、その場所を示
す。

【００７０】軽鎖遺伝子の増幅用プライマー 好適な前方プライマーは、配列表の配列番号：５に示す
配列を有している。

【００７１】このプライマー自体はアンチセンスであ
り、マウスのκ型軽鎖可変ドメインをコードするヌクレ
オチド配列のセンス鎖の３′末端にアニールするように
設計されている。

【００７２】相補的なセンス鎖を配列番号：６に示す。
このセンス鎖には、図示した通り、ＸｈｏＩ認識部位が
組込まれている。

【００７３】好適な後方プライマー（ｂａｃｋ ｐｒｉ
ｍｅｒ）であるＶＫ１ ＢＡＣＫは、上述の欧州特許公
開第３９８９８４号に開示されている。

【００７４】実施例１ 抗体の調製 配列番号：４に示す配列を有するＭｏｔ１と名付けたア
ミノ酸配列を化学合成した。その配列から分かる通り、
このアミノ酸配列は、ＶＨ１ ＦＯＲ２プライマーにコ
ードされた配列番号：２の配列に２残基のリシン残基が
結合したものからなる。これらの追加リシン残基は、そ
のペプチド全体の溶解性を高め、その後のアフィニティ
ーカラム上への固定化を容易にするためのものである。
Ｍｏｔ１と名付けたこのペプチドをキャリアタンパク質
ＰＰＤに共有結合させ、得られた複合体をＭｏｔ１−Ｐ
ＰＤと名付けた。このＭｏｔ１−ＰＰＤをウサギに接種
して免疫した。

【００７５】モチーフペプチドＭｏｔ１に対して特異的
結合親和性を有する抗体を次のアフィニティー精製法で
単離した。即ち、５ｍｇのＭｏｔ１ペプチドを、湿潤容
積３ｍｌのＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社製）に製造業者の指示通りに固定化した。
得られた固定化ゲルを液体クロマトグラフィーカラムに
充填した。

【００７６】上述の免疫操作で得たウサギ血清（５ｍ
ｌ）を上記カラムにかけた後、ＰＢＳＡで洗浄して未結
合物質を除去し、しかる後に、カラムに残ったＭｏｔ１
ペプチドを４ＭのＭｇＣｌ₂ 水溶液で溶離して、ＰＢＳ
Ａに対して一晩透析した。

【００７７】最初の血清とそのアフィニティー精製画分
をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析したところ、
上記操作で純粋な免疫グロブリンが単離されたことが確
認できた。

【００７８】抗体溶液が、ＥＬＩＳＡアッセイでＭｏｔ
１ペプチドに結合するか否かを次のように試験した。

【００７９】微量滴定プレートにＭｏｔ１−ＰＰＤ複合
体溶液（炭酸緩衝液中、０．１μｇ／ｌ）を加えて３７
℃で一晩インキュベートし、上記複合体を上記プレート
に固定化した。次に、プレートを洗浄した後、プレート
のウェルを試験溶液（上記ポリクローナル抗体を含有す
る）に１時間暴露してウサギ抗体を上記固定化ペプチド
に結合させた。プレートを再度洗浄して、ヤギの抗ウサ
ギ抗体−アルカリ性ホスファターゼ複合体（Ｓｉｇｍａ
社から入手可能）の溶液に暴露した。このヤギの抗ウサ
ギ抗体は、Ｍｏｔ１ペプチドに結合したウサギ抗体に結
合する。最後に、上記プレートをさらに洗浄した後、プ
レートをアルカリ性ホスファターゼに対するＰＮＰＰ基
質（上記酵素の作用によって着色生成物に変換される）
に暴露した。４０５ｎｍにおける光学密度を３０分後に
測定して、Ｍｏｔ１−ＰＰＤ複合体に対する結合度の指
標とした。

【００８０】結合の特異的を調べるために、最初のＭｏ
ｔ１−ＰＰＤ複合体溶液をＰＰＤ自体の溶液に置き換え
て同様のアッセイを行った。このアッセイでは、従っ
て、ＰＰＤに対する結合度の指標を与える。

【００８１】これらのアッセイでＰＰＤ自体に対する結
合よりもＭｏｔ１−ＰＰＤに対する結合のほうが多けれ
ば、Ｍｏｔ１ペプチドに対する結合が存在していること
になる。

【００８２】免疫したウサギから得た血清を様々な濃度
に稀釈して、これらのアッセイに使用した。その結果を
図７のグラフに示す。図７において、丸印はＭｏｔ１−
ＰＰＤに対する結合試験の結果を示しており、ＰＰＤ自
体に対する結合試験の結果は三角印で示してある。

【００８３】これらの結果から、血清は、Ｍｏｔ１ペプ
チドに対して特異的に結合する抗体だけでなく、ＰＰＤ
タンパク質に対する抗体をも含んでいることが分かる。

【００８４】アフィニティー精製した画分を稀釈して同
様の試験を行った。その結果を図８に示す。

【００８５】これから、アフィニティー精製により、Ｍ
ｏｔ１ペプチドに対する抗体のみを単離できることが分
かる。

【００８６】実施例２ 抗リゾチーム抗体フラグメント 欧州特許公開第３９８９８４号の実施例５において、Ｗ
ｉｎｔｅｒ他は、「Ｄ１．３」と呼ばれる公知のモノク
ローナル抗リゾチーム抗体由来のＦｖフラグメントの生
産について記載している。

【００８７】実施例１で得られたアフィニティー精製抗
体を用いて、この種の抗リゾチーム抗体Ｆｖフラグメン
トの捕獲ＥＬＩＳＡアッセイを行った。これらのＦｖフ
ラグメントは重鎖のＣ末端に配列番号：２で示すアミノ
酸配列を有する。

【００８８】微量滴定プレートに炭酸緩衝液中の１μｇ
／ｍｌリゾチームを入れて３７℃で一晩インキュベート
し、プレートのウェルにリゾチームを固定化した。

【００８９】次に、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、プレ
ートのウェルを、ＰＢＳＴ中に稀釈した上記Ｆｖフラグ
メントを含む試験溶液に室温で１時間暴露して、これら
のフラグメントをリゾチームに結合させた。

【００９０】上記プレートを再度洗浄し、実施例１のア
フィニティー精製抗体溶液に暴露して、それらを上記Ｆ
ｖフラグメントの重鎖Ｃ末端のモチーフ配列に結合させ
た。

【００９１】プレートを再度洗浄した後、ヤギの抗ウサ
ギ抗体−アルカリ性ホスファターゼ複合体（Ｓｉｇｍａ
社）の溶液に暴露し、しかる後に、さらに洗浄し、プレ
ートをアルカリ性ホスファターゼに対するＰＮＰＰ基質
に暴露した。

【００９２】４０５ｎｍにおける光学密度を３０分後に
測定して、プレートに対する結合度の指標とした。この
結合はＦｖフラグメントの存在に依存しており、試験溶
液中におけるＦｖフラグメントの濃度の指標を与えるは
ずである。

【００９３】事実その通りであることが判明した。試験
溶液中のＦｖフラグメント濃度に対する光学密度のプロ
ットを図９に示す。このプロットは、図に示す通り、シ
グモイド曲線にフィットする。

【００９４】この結果は、１２残基のアミノ酸配列Ｍｏ
ｔ１に対する抗体が、そのうちの１０アミノ酸残基から
なるモチーフペプチドの組込まれたポリペプチドに対し
て特異的結合親和性を有することを示している。

【００９５】実施例１で得たアフィニティー精製抗体を
用いて、Ｆｖ抗リゾチームフラグメントを検出するため
のウエスタンブロッティングを以下の通り行った。

【００９６】まず、かかるフラグメントを含有する試験
試料をポリアクリルゲル電気泳動にかけた。ゲルを０．
２μｍのニトロセルロース膜に電気泳動的にブロッティ
ング（エレクトロブロッティング）した。このニトロセ
ルロース膜を、以下の材料と順次インキュベートした： （１）アフィニティー精製抗体溶液（ＰＢＳＡ＋０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液中，２μｇ／ｍｌ）； （２）ヤギの抗ウサギ抗体−アルカリ性ホスファターゼ
複合体の溶液（Ｓｉｇｍａ社製，ＰＢＳＡ＋０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０溶液中，２０００／１に稀釈）；次いで （３）アルカリ性ホスファターゼに対する基質（上記ニ
トロセルロース膜にアルカリ性ホスファターゼが結合し
ていれば発色する）。

【００９７】この技術を、Ｆｖフラグメントを発現する
大腸菌の培養液から得た上清を試験試料として用いて実
証した。その電気泳動の一つのレーンを銀染色で染色し
たところ、大腸菌の各種タンパク質に対応する多数のバ
ンドが見出だされた。もう一つのレーンを用いて上記の
ウエスタンブロッティング法を行ったところ、Ｖ_Ｈフラ
グメントと一致する分子量の一本の着色バンドだけが観
察された（Ｆｖフラグメントを構成するＶ_Ｈ鎖とＶ_Ｌ鎖
は、上記分析操作の間は、共有結合しておらず、別々の
鎖として存在する）。このように、モチーフ抗体は、そ
の他各種のタンパク質の存在下でもＦｖフラグメントを
選択的に検出する。

【００９８】実施例３ 抗ホルモン抗体フラグメント Ｗｉｎｔｅｒ他の欧州特許公開第３９８９８４号に記載
された方法と同様の方法で、ヒトホルモン（ｈＣＧ）に
対して結合親和性を有するマウスモノクローナル抗体か
ら、Ｆｖ抗体フラグメントを得た。

【００９９】重鎖可変部をコードするヌクレオチド配列
を、前記のＶＨ１ ＦＯＲ２及びＶＨ１ ＢＡＣＫから
なるプライマー対を用いるＰＣＲ反応で増幅した。得ら
れたクローン化ＤＮＡ配列は上記プライマー対に対応す
る末端部分を有していた。これをプラスミドに導入した
が、その操作の間に、ＤＮＡクローン鎖の両方の末端部
分をそれぞれＢｓｔＥII部位及びＰｓｔＩ部位において
制限酵素で除去した。このプラスミドには、ＢｓｔＥII
認識部位とクローン鎖の末端（発現ポリペプチドのＣ末
端に対応するセンス鎖の３′末端）との間が正確に置換
されたヌクレオチド配列を与えた。プラスミドによって
停止コドンが与えられている。このプラスミドには、Ｐ
ｓｔＩ認識部位とＤＮＡクローン鎖のもう一方の末端と
の間が置換されたヌクレオチド配列（ただし、ＶＨ１
ＢＡＣＫプライマー中の若干の重複部分が除かれてお
り、このプライマーの５′末端の不完全コドンが完全な
ものに補充されている）も与えられている。

【０１００】同様にして、軽鎖可変部をコードするヌク
レオチド配列を、配列番号：６に示す前方プライマーと
欧州特許公開第３９８９８４号に記載されたＶＨ１ Ｂ
ＡＣＫプライマーとを用いるＰＣＲ反応で増幅した。得
られたクローン化ＤＮＡ配列はこれらのプライマーに対
応した末端部分を有していた。

【０１０１】このクローン化ＤＮＡを上記のプラスミド
に導入した。この操作の間に、ＸｈｏＩ認識部位から末
端部分を制限酵素で除去し、プラスミド由来のヌクレオ
チド配列で置換した。これにより、図１０に示す通り、
センス鎖の３′末端のコドンが完全なものになり、停止
コドンが加わる。

【０１０２】このようにして構築したプラスミド（両方
のクローン化ＤＮＡ配列を含む）を用いて大腸菌を形質
転換し、この大腸菌で軽鎖及び重鎖を発現させた。これ
らの鎖は自発的に会合して、重鎖Ｃ末端に配列番号：２
で示すモチーフペプチドと軽鎖Ｃ末端に配列番号：６で
示すモチーフペプチドを有するＦｖフラグメントを形成
した。

【０１０３】これらの両フラグメントを発現する大腸菌
培養液から採取した試料を、溶菌条件に付し、実施例２
に記載したウエスタンブロッティング法で試験した。Ｖ
_Ｈフラグメントに対応する分子量のバンドが一本だけ着
色するのが観察され、所望のＦｖフラグメントが存在し
ていることが分かった。

【０１０４】この結果は、ポリメラーゼ連鎖反応で同一
のプライマーを用いるクローニング段階を経て複数の異
なるポリペプチドを得た場合、かかる複数の異なるポリ
ペプチドのアッセイに抗モチーフ抗体を用いることがで
きることを示している。

【０１０５】配列番号：６に示すペプチドは合成するこ
とができ、それを用いて、実施例１に示す方法により、
それに対する抗体を得た。こうして得た抗体は、発現し
たＦｖフラグメントのアッセイ又は軽鎖可変ドメインの
アッセイに、実施例２及び３に示す通りの方法で、用い
ることができた。

【０１０６】実施例４ 実施例１で得たアフィニティー精製抗体を、３種類のＦ
ｖフラグメントのＥＬＩＳＡアッセイに直接使用した。
これら３種類のＦｖフラグメントは、実施例２の抗リゾ
チーム抗体Ｆｖフラグメント、実施例３の抗ｈＣＧＦｖ
フラグメント、並びに実施例３と同様の操作で作成した
グルコースオキシダーゼに対して結合親和性を有する抗
体Ｆｖフラグメントであった。

【０１０７】各Ｆｖフラグメントについて、微量滴定プ
レートを、Ｆｖの稀釈物（感作緩衝液中で調製）からな
る試験溶液と３７℃で１時間インキュベートして感作し
た。プレートを、次に、アフィニティー精製ウサギ抗モ
チーフ抗体の１μｇ／ｍｌ溶液（ＰＢＳＴ中で調製）と
室温で１時間インキュベートした。プレートを、次に、
ヤギ抗ウサギ抗体−アルカリ性ホスファターゼ複合体
（Ｓｉｇｍａ）の１／１０００稀釈溶液と室温で１時間
インキュベートした。最後に、プレートを基質としての
ＰＮＮＰ（Ｓｉｇｍａ）で発色させた。前記それぞれの
インキュベートの間、プレートは十分に洗浄した。

【０１０８】実施例２及び実施例３に記載した通り、４
０５ｎｍの光学密度をプレートとの結合度の指標とし
た。従って、試験溶液中のＦｖ濃度の指標ともなる。

【０１０９】濃度に対する光学密度のプロットを図１１
に示す。このアッセイ法により、３種類すべての抗体を
５０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で検出することができた。

【０１１０】実施例５ 実施例１で作成したウサギ抗体を用いて、培養器中での
抗ｈＣＧ抗体Ｆｖフラグメントの生産をモニターした。
これらのフラグメントは、実施例３記載の形質転換大腸
菌によって発現された。この大腸菌を５リットル培養器
に入れた。培地の組成は以下の通りであった。

【０１１１】 Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ １２．０ｇ／ｌ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ６．０ｇ／ｌ ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ ＮＨ₄ Ｃｌ ５．０ｇ／ｌ L-プロリン ６０ｍｇ／ｌ グリセロール ３０ｇ／ｌ ＭｇＳＯ₄ ・６Ｈ₂ Ｏ ０．４９ｇ／ｌ ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ １５ｍｇ／ｌ 塩酸チアミン １ｍｇ／ｌ 酵母エキス（Ｂｅｔａ Ｌａｂｓ社） １０ｇ／ｌ

【０１１２】培養温度は２５℃又は３０℃であり、４０
％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨの自動添加装置を用いてｐＨを
６．８に維持した。撹拌翼速度は５００ｒｐｍであり、
通気速度は０．１ｖ／ｖ／ｍであった。種菌（１％ｖ／
ｖ）は、２５℃の振盪培養器中において、酵母エキス
（５ｇ／ｌ）添加Ｍ９Ｐ培地中で一晩増殖させておいた
ものである。最初の１５時間の培養の間に、撹拌翼速度
及び通気速度をそれぞれ最大６５０ｒｐｍ及び０．３ｖ
／ｖ／ｍまで徐々に上昇させた。

【０１１３】後期増殖期（種菌接種して１２〜１５時間
後）に、濾過滅菌したイソプロピル−β−D-チオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧと略す，０．５Ｍ；１ｍｌ／
ｌ）を添加して、抗ｈＣＧ抗体Ｆｖフラグメントの産生
を誘導した。所定の間隔をおいて分析用試料を採取し
て、３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。その上清を
０．２μｍミクロフィルターで濾過した。振盪圧ショッ
ク及び酵素処理を組合わせて菌体を溶解し、溶解物を
０．２μｍミクロフィルターに通した。得られた上清及
び溶菌画分を、前述の実施例で記載した通り、抗モチー
フ抗体を用いる直接ＥＬＩＳＡアッセイ法でアッセイし
た。

【０１１４】このアッセイは一群の保存溶液を用いて較
正した。この保存溶液は、ｈＣＧ−セファロース上で均
一に精製してその濃度を決定（消光係数として、配列を
基に算出した値であるＡ₂₈₀ ＝１．９を使用）しておい
たものである。

【０１１５】２５℃及び３０℃で培養したときのアッセ
イの結果を、それぞれ図１２及び図１３に示す。これら
の図は、培養時間に対してタンパク質濃度をプロットし
たものである。培地上清のタンパク質は四角印で示し、
菌体溶解物中のタンパク質は丸印で示す。

【０１１６】図１２と図１３を比較すると、抗ｈＣ抗体
Ｆｖフラグメント産生量は２５℃で培養したとき（最終
収量６２ｍｇ／ｌ）のほうが３０℃で培養したとき（最
終収１５ｍｇ／ｌ）よりも格段に高いことが分かる。さ
らに、低温で培養するとＦｖのほとんど（９０％以上）
が上清中に観察される（Ｆｖの回収が容易になる）のに
対し、高温で培養するとＦｖの大部分は菌体溶解物中に
見出だされる。

【０１１７】実施例６ この実施例では、モチーフペプチドの組込まれたＦｖフ
ラグメントの培養液模擬原料からの回収に、モチーフペ
プチドに対する抗体を使用した例を示す。

【０１１８】実施例１に記載の手順で、ウサギ抗モチー
フ抗体を調製し、アフィニティークロマトグラフィーで
単離した。このモチーフ特異性抗体の保存標品が６ｍｇ
となるまで同じ操作を繰り返した。この標品を、分子量
カットオフ８０００ダルトンのメンブランフィルター
（Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ８）を装着した限外濾過セル（Ａ
ｍｉｃｏｎ社製）で１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮抗体
標品を同容積のｐＨ８．３の緩衝液（混合物が０．１Ｍ
・ＮａＨＣＯ₃ 及び０．５Ｍ・ＮａＣｌを含むように選
択した）と混合し、化学的に活性化したアガロース（Ｃ
ＮＢｒセファロース４Ｂ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）２
ｇに製造業者の指示通り結合させた。未反応ＣＮＢｒ基
は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の指示通り、過剰量の０．１
Ｍ・Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）で洗浄してブロックした。

【０１１９】このようにして調製したモチーフ特異的免
疫吸着剤をガラス製カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）
に充填して、これを標準的な液体クロマトグラフィー用
セット一式（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に組込んだ。６
μｇ／ｍｌの抗リゾチーム抗体Ｆｖフラグメント及び１
ｍｇ／ｍｌウシアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含有する原
料１００ｍｌを上記カラムにかけた。この原料は培養液
を模したものである。未結合タンパク質はＰＢＳ洗浄で
除去した。結合Ｆｖを４Ｍ・ＭｇＣｌ₂ 水溶液で溶離し
てＰＢＳに対して透析した。

【０１２０】実施例７ 抗リゾチームモノクローナル抗体の可変ドメインに、６
位のバリンがロイシンで置換されていること以外は配列
番号：２に示すアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を組
込んだ。

【０１２１】上記抗リゾチーム抗体を微量滴定プレート
に結合させた。このプレートを次に、実施例１のポリク
ローナル抗体の溶液に暴露した。実施例１で説明したＥ
ＬＩＳＡアッセイで、このポリクローナル抗体が上記抗
リゾチーム抗体に結合していることを確認した。

【０１２２】この結果は、アミノ酸配列が変化したにも
かかわらず、特異的結合親和性が存在していることを示
している。

【０１２３】さらに実験を行って、上記抗体が別の部位
に結合しているのではなく、適切なアミノ酸配列に結合
していることを確認した。リゾチームを微量滴定プレー
トに結合した。次に、抗リゾチームモノクローナル抗体
をリゾチームに結合させた。実施例１の抗体はこれらの
抗リゾチーム複合体には結合しなかったが、これは、抗
体の可変ドメイン全体がリゾチームでブロックされてい
るためである。

【０１２４】

【配列表】配列番号：１ 配列の種類：ヌクレオチドプライマー 配列の長さ：32塩基対 特徴：VH1 FOR 2 primer；一本鎖アンチセンス DNA．対
応ペプチド産物は V_H 鎖の C末端モチーフ． 配列 5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC 配列番号：２ 配列の種類：ヌクレオチドプライマー及び対応 C末端ペ
プチド 配列の長さ：32塩基対；10アミノ酸残基 特徴：一本鎖センス DNA．VH1 FOR2 primer と相補的．
対応ペプチド産物は V_H鎖の C末端モチーフ． 配列番号：３ 配列の種類：ヌクレオチドプライマー及び対応ペプチド 配列の長さ：22塩基対 特徴：VH1 BACK primer ；一本鎖センス DNA．対応ペプ
チド産物は V_H 鎖の N末端モチーフ． 配列番号：４ 配列の種類： C末端ペプチド 配列の長さ：12アミノ酸残基 配列 Lys Lys Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 配列番号：５ 配列の種類：ヌクレオチドプライマー 配列の長さ：22塩基対 特徴：一本鎖アンチセンス DNA．対応ペプチド産物は V
_L 鎖の C末端モチーフ．配列 5' G TTT GAT CTC GAG CTT GGT CCC 配列番号：６ 配列の種類：センス鎖及び対応 C末端ペプチド 配列の長さ：22塩基対；8 アミノ酸残基 特徴：一本鎖センス DNA．配列番号：５と相補的．対応
ペプチド産物は V_L 鎖のC末端モチーフ．

【図面の簡単な説明】

【図１】ポリメラーゼ連鎖反応における、出発遺伝子物
質を示す図図Ｓ１は所望ヌクレオチド配列（ＮＳで示
す）を含んだセンス鎖ＡＳ１は所望配列の相補配列（Ｎ
ＡＳで示す）を含んだアンチセンス鎖

【図２】ポリメラーゼ連鎖反応の第１サイクルにおけ
る、解離ＤＮＡセンス鎖（Ｓ１）へのプライマーＰ１の
アニーリング段階を示す図

【図３】ポリメラーゼ連鎖反応の第１サイクルにおけ
る、プライマーＰ１からの新たなアンチセンスＤＮＡ鎖
（ＡＳ２）の合成段階を示す図

【図４】ポリメラーゼ連鎖反応の第２サイクルにおけ
る、アンチセンス鎖ＡＳ２へのプライマーＰ２のアニー
リング段階を示す図

【図５】ポリメラーゼ連鎖反応の第２サイクルにおけ
る、プライマーＰ２からの新たなアンチセンスＤＮＡ鎖
（Ｓ３）の合成段階を示す図

【図６】ポリメラーゼ連鎖反応の第３サイクル以降にお
ける、プライマーのアニーリング段階を示す図

【図７】ウサギ抗Ｍｏｔ１−ＰＰＤ抗血清の、Ｍｏｔ１
−ＰＰＤ複合体及びモチーフペプチドＭｏｔ１に対す
る、ＥＬＩＳＡアッセイでの結合活性を示す図

【図８】アフィニティー精製で単離したウサギ抗Ｍｏｔ
１抗体画分の、Ｍｏｔ１−ＰＰＤ複合体及びモチーフペ
プチドＭｏｔ１に対する、ＥＬＩＳＡアッセイでの結合
活性を示す図

【図９】アフィニティー精製で単離したウサギ抗Ｍｏｔ
１抗体画分の、抗リゾチームＦｖフラグメントに対す
る、ＥＬＩＳＡアッセイでの結合活性を示す図

【図１０】ＰＣＲプライマーによるＰＣＲで得られたＤ
ＮＡクローン配列とプラスミドＤＮＡ配列との間の融合
を示す図

【図１１】アフィニティー精製で単離したウサギ抗Ｍｏ
ｔ１抗体画分の、３種類のＦｖフラグメント（抗リゾチ
ーム抗体Ｆｖフラグメント、抗ｈＣＧＦｖフラグメント
及び抗体グルコースオキシダーゼ抗体Ｆｖフラグメン
ト）に対する、ＥＬＩＳＡアッセイでの結合活性を示す
図

【図１２】２５℃で培養した大腸菌の培地上清及び菌体
溶解物中に存在する抗ｈＣＧ抗体Ｆｖフラグメントの、
アフィニティー精製ウサギ抗Ｍｏｔ１抗体画分によるＥ
ＬＩＳＡアッセイを示す図

【図１３】３０℃で培養した大腸菌の培地上清及び菌体
溶解物中に存在する抗ｈＣＧ抗体Ｆｖフラグメントの、
アフィニティー精製ウサギ抗Ｍｏｔ１抗体画分によるＥ
ＬＩＳＡアッセイを示す図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 形質転換生物の培養によって少なくとも
   １種類のポリペプチドを生産する方法にして、 オリゴヌクレオチドプライマー対を用いるポリメラーゼ
   連鎖反応（ＰＣＲ）で核酸配列の必要な部分をクローニ
   ングすることによって、上記プライマー対によって定ま
   る末端部分を有するクローン配列を得る段階、 上記ポリメラーゼ連鎖反応で得られた上記クローン配列
   又はそのコピーで生物を形質転換する段階、及び上記形
   質転換生物を培養して、上記クローン配列にコードされ
   たポリペプチドを発現させる段階を含んでなり、 上記プライマーの一方にコードされた少なくとも３個の
   連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して特
   異的な親和性を示す結合試薬を用いて上記ポリペプチド
   をアッセイ又は精製することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 複数の異なるポリペプチドの生産に適用
   される請求項１記載の方法において、当該方法が、 各々のポリペプチドについて、オリゴヌクレオチドプラ
   イマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応によりそれぞれ
   の核酸の部分をクローニングする段階（ただし、これら
   のプライマー対の少なくとも一方のプライマーは上記複
   数のポリペプチドのすべてに共通して用いられる）、 各々のポリペプチドについて、生物を形質転換する前記
   段階、 各々のポリペプチドについて、それぞれの形質転換生物
   を培養して各ポリペプチドを発現させる段階、並びに上
   記複数のポリペプチドのすべてに共通して用いられる上
   記プライマーにコードされた少なくとも３個の連続する
   アミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して特異的な親
   和性を示す同一の結合試薬を用いて各々のポリペプチド
   をアッセイ又は精製する段階、 を含んでなることを特徴とする方法。
3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２記載の方法におい
   て、前記アミノ酸配列が少なくとも６個のアミノ酸残基
   を含んでいることを特徴とする方法。
4. 【請求項４】 請求項１又は請求項２記載の方法におい
   て、前記アミノ酸配列が、前記プライマーにコードされ
   た少なくとも６個のアミノ酸残基を含んでいることを特
   徴とする方法。
5. 【請求項５】 請求項１乃至請求項３のいずれか１項記
   載の方法において、前記クローニング段階で用いるプラ
   イマーがオリゴヌクレオチド混合物であることを特徴と
   する方法。
6. 【請求項６】 請求項２記載の方法において、前記ポリ
   ペプチドの各々が抗体の可変ドメインであることを特徴
   とする方法。
7. 【請求項７】 請求項２記載の方法において、前記ポリ
   ペプチドの各々が抗体の可変ドメインであり、しかも前
   記結合試薬が当該可変ドメインのＣ末端のアミノ酸配列
   に対して特異的親和性を示すことを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 請求項７記載の方法において、前記ポリ
   ペプチドの各々が抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変ドメインであ
   ることを特徴とする方法。
9. 【請求項９】 請求項７記載の方法において、前記ポリ
   ペプチドの各々が抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変ドメインであ
   ることを特徴とする方法。
10. 【請求項１０】 請求項１乃至請求項９のいずれか１項
    記載の方法において、 前記核酸が抗体フラグメントの一つの鎖をコードするも
    のであり、 前記生物を、上記核酸だけでなく、抗体フラグメントの
    第二の鎖をコードする核酸によっても形質転換し、 これらの生物を培養して、抗体フラグメントの二つの鎖
    を両方ともに発現させ、しかも前記アッセイ又は精製段
    階の前に上記二つの鎖を会合させることを特徴とする方
    法。
11. 【請求項１１】 請求項１乃至請求項１０のいずれか１
    項記載の方法において、前記結合試薬が抗体又は抗体フ
    ラグメントであることを特徴とする方法。
12. 【請求項１２】 請求項１乃至請求項１１のいずれか１
    項記載の方法において、前記結合試薬が、配列番号：２
    又は配列番号：６に示すアミノ酸配列に対して特異的親
    和性を有することを特徴とする方法。
13. 【請求項１３】 ポリメラーゼ連鎖反応に用いられるオ
    リゴヌクレオチドプライマーと、そのプライマーにコー
    ドされた少なくとも３個の連続するアミノ酸残基からな
    るアミノ酸配列に対して特異的な親和性を有する結合試
    薬とを含んでなるキット。
14. 【請求項１４】 請求項１３記載のキットにおいて、前
    記プライマーが抗体の可変ドメインのフレームワーク領
    域に対応することを特徴とするキット。
15. 【請求項１５】 請求項１３記載のキットにおいて、上
    記プライマーが配列番号：１又は配列番号：５に示した
    ものであることを特徴とするキット。
16. 【請求項１６】 配列番号：２又は配列番号：６に示す
    アミノ酸配列に対して特異的親和性を有する結合試薬。