JP2020505951A - 無細胞タンパク質合成のためのプロモーター構築物 - Google Patents
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Abstract
Description
a)RNAポリメラーゼのプロモーターエレメント、
b)転写開始部位(transcription start site)を含む少なくとも6つ連続するヌクレオチドの増強エレメント(enhancing element)であって、配列GGGAGA、GCAAGAまたはGGAAGAを含む、増強エレメント、
c)5’UTR配列エレメント、および
d)翻訳開始部位(translation initiation start site)
を含む、プロモーター構築物に関する。
a)本開示に従うDNAプロモーター構築物、
b)前記プロモーター構築物に連結された目的のポリヌクレオチドおよび/または遺伝子、ならびに
c)任意選択で、転写終結部位ポリアデニル化シグナル
を含む、発現カセットに関する。
a)原核細胞溶解物または真核細胞溶解物、
b)反応緩衝液、ならびに
c)本開示に従う転写鋳型および/または発現カセットおよび/または核酸ベクター
を含む、無細胞タンパク質合成系に関する。
a)RNAポリメラーゼのプロモーターエレメント、
b)転写開始部位を含む少なくとも6つ連続するヌクレオチドの増強エレメントであって、配列GGGAGA、GCAAGAまたはGGAAGAを含む、増強エレメント、
c)5’UTR配列エレメント、および
d)翻訳開始部位
を含む、プロモーター構築物に関する。
・TAATACGACTCACTATA(配列番号6)−T7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列
・AATTAACCCTCACTAAA(配列番号7)−T3 RNAポリメラーゼのプロモーター配列
・AATTTAGGTGACACTATA(配列番号8)−SP6 RNAポリメラーゼのプロモーター配列
・AATTAGGGCACACTATA(配列番号9)−K11 RNAポリメラーゼのプロモーター配列
・TAATACGACTCACTAAT(配列番号10)−BA14 RNAポリメラーゼのプロモーター配列
の群から選択される。
a)特に、配列番号12を含む、RNAポリメラーゼのT7プロモーターエレメント、
b)特に、GGGAGA、GCAAGAまたはGGAAGAを有する、転写開始部位を含む少なくとも6つ連続するヌクレオチドの増強エレメント、
c)特に、配列番号14を有する、タバコモザイクウイルス(Tobacco mosaic virus)(TMV)由来のオメガ5’UTR配列、および
d)翻訳開始部位
を含む。
a)配列番号3に示される核酸配列、および
b)a)と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される配列を含む。
a)配列番号4に示される核酸配列、および
b)a)と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される配列を含む。
a)本開示に従うDNAプロモーター構築物、
b)前記プロモーター構築物に連結された目的のポリヌクレオチドおよび/または遺伝子、ならびに
c)任意選択で、転写終結部位ポリアデニル化シグナル
を含む、発現カセットに関する。
a)原核細胞溶解物または真核細胞溶解物、
b)反応緩衝液、ならびに
c)前記請求項のいずれか一項に記載の転写鋳型および/または発現カセットおよび/または核酸ベクター
を含む、無細胞タンパク質合成系にも関する。
・mRNA転写のためのRNAポリメラーゼ、
・ポリペプチド翻訳のためのリボソーム、
・tRNAおよびアミノ酸、
・酵素補因子およびエネルギー源、
・適切なタンパク質フォールディングに必須の細胞成分
を含む、反応溶液の分子の全てまたはほとんどを供給する。
脱液胞化(evacuolated)BY−2プロトプラストからの溶解物の調製を、顕著な改変を伴って、Komoda et al. (2004)およびGursinsky et al. (2009)に記載されたとおりに実施した。プロトプラストを、細胞を発酵培地中で3.5%(v/v)Rohament CLおよび0.2%(v/v)Rohapect UF(共にAB Enzymes、Darmstadt、Germanyから)で直接処理することによって、連続発酵の指数増殖期にある細胞から調製した。培地のモル浸透圧濃度を、360mMマンニトールの添加によって調整した。得られたプロトプラストを、0.7Mマンニトール、20mM MgCl2および5mM PIPES−KOH(pH7.0)中(下から上に)70%(v/v、3ml)、40%(v/v、5ml)、30%(v/v、3ml)、15%(v/v、3ml)および0%(3ml)のPercoll(GE Healthcare、Munich、Germany)を含む不連続Percoll勾配上に層状化した。スウィングバケットローター中で25℃で1時間の6,800gでの遠心分離後、脱液胞化プロトプラストを、40〜70%(v/v)のPercoll溶液界面から回収した。脱液胞化プロトプラストを、50mlのComplete EDTA−free Protease Inhibitor Mixture(Roche Diagnostics、Mannheim、Germany)当たり1錠を補充した3容積のTR緩衝液(30mM HEPES−KOH(pH7.4)、60mMグルタミン酸カリウム、0.5mMグルタミン酸マグネシウム、2mM DTT)中に懸濁し、Dounce組織グラインダー(Sigma−Aldrich、St.Louis、Missouri、USA)を30ストロークで使用して破壊した。核および非破壊細胞を、4℃で10分間の500gでの遠心分離によって除去した。次いで、上清を、−80℃で1mLアリコート中で凍結した。
BYLの性能を、プラスミドpIVEX_GAAAGA_Omega_Strep−eYFPを鋳型として使用してレポータータンパク質eYFPを産生することによって調査した。カップリングされた転写−翻訳反応を、インキュベーターシェーカー(Kuehner、Basel、Switzerland)中で25℃および500rpmで16時間、50μlアリコート中で実施した。標準的な反応は、40%(v/v)BYL、40mM HEPES−KOH(pH7.8)、8.5mMグルタミン酸マグネシウム、3mM ATP、1.2mM GTP、1.2mM CTP、1.2mM UTP、30mMクレアチンリン酸、0.1μg/μLクレアチンキナーゼ、80ng/μlベクターDNAおよび50ng/μl自家製T7 RNAポリメラーゼを含んだ。
ベクターpIVEX_Omega_Strep−eYFP中の転写開始部位(tc s)を、オメガ5’UTR配列の上流の異なるヌクレオチドの付加によって改変した。合計で9つの異なるバリアントを設計し、pIVEX_Omega_Strep−eYFPベクター中に取り込んだ。ここで、バリアント1(V1)は、転写開始部位にさらなるヌクレオチドを有さない元の配列に対応し、V2〜V9は、8つの改変された配列を示す(図3)。
図2は、8つの異なる鋳型濃度(50μlの反応容積当たり0.0625、0.0125、0.025、0.5、1、2、4および8μgのベクター(V1〜V9))で異なるバリアントのベクターpIVEX_Omegaを使用した、Strep−eYFPの発現を示す。これらのバリアントは、オメガ5’非翻訳領域の上流の転写開始点において異なるヌクレオチドを含む。反応を、25℃および500rpmで16時間、50μlスケールで実施した。eYFPからの蛍光シグナルを、485/20nm励起フィルターおよび528/20nm発光フィルターを備えた蛍光リーダーを使用して定量化した。eYFPの量を、DNA鋳型なしのBYL転写−翻訳反応における異なる濃度のeYFPに基づく検量線を生成することによって決定した。eYFP標準を、BYL転写−翻訳系を使用して産生し、Strep−Tactin(登録商標)Sepharose(登録商標)によって精製した。精製されたeYFPの濃度を、比色アッセイを使用して決定した。データは、各々3つの独立した転写−翻訳実験の平均および標準偏差を示す。
Claims (11)
- 標的ポリペプチドの効率的な無細胞タンパク質合成に適したDNAプロモーター構築物であって、5’−3’方向で、
a)RNAポリメラーゼのプロモーターエレメント、
b)転写開始部位を含む少なくとも6つ連続するヌクレオチドの増強エレメントであって、配列GGGAGA、GCAAGAまたはGGAAGAを含む、増強エレメント、
c)5’UTR配列エレメント、および
d)翻訳開始部位
を含む、プロモーター構築物。 - 前記5’UTR配列エレメントが、タバコモザイクウイルス(Tobacco mosaic virus)(TMV)由来のオメガ5’UTR配列である、請求項1に記載のプロモーター構築物。
- RNAポリメラーゼの前記プロモーターエレメントが、T7プロモーターエレメントである、請求項1または2のいずれか一項に記載のプロモーター構築物。
- 前記DNAプロモーター構築物が、
a)配列番号3に示される核酸配列、および
b)a)と少なくとも85%の配列同一性を有する核酸配列
からなる群から選択される配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプロモーター構築物。 - 無細胞タンパク質合成のためのmRNAを効率的に合成するための転写鋳型であって、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプロモーター構築物を含み、目的のポリヌクレオチドおよび/または遺伝子が、前記翻訳開始部位に連結されている、転写鋳型。
- a)請求項1〜4のいずれか一項に記載のDNAプロモーター構築物、
b)前記プロモーター構築物に連結された目的のポリヌクレオチドおよび/または遺伝子、ならびに
c)任意選択で、転写終結部位ポリアデニル化シグナル
を含む、発現カセット。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載のDNAプロモーター構築物を含む核酸ベクター。
- クローニングベクターおよび/または発現ベクターである、請求項7に記載の核酸ベクター。
- タンパク質合成に適した無細胞タンパク質合成系であって、
a)原核細胞溶解物または真核細胞溶解物、
b)反応緩衝液、ならびに
c)請求項5〜8のいずれか一項に記載の転写鋳型および/または発現カセットおよび/または核酸ベクター
を含み、前記真核細胞溶解物がタバコBY−2細胞溶解物である、無細胞タンパク質合成系。 - 無細胞タンパク質合成のための方法であって、請求項9に記載の無細胞タンパク質合成系を使用することによって、タンパク質をin vitroで合成するステップを含む、方法。
- 請求項9に記載の無細胞タンパク質合成系を含む、タンパク質スクリーニングおよび/または産生プラットホーム。
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