JPH1156363A - タンパクの製造方法 - Google Patents
タンパクの製造方法Info
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- JPH1156363A JPH1156363A JP9222371A JP22237197A JPH1156363A JP H1156363 A JPH1156363 A JP H1156363A JP 9222371 A JP9222371 A JP 9222371A JP 22237197 A JP22237197 A JP 22237197A JP H1156363 A JPH1156363 A JP H1156363A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＰＣＲで得られたＤＮＡから、簡便に十分な
量のタンパクを合成させることのできる、無細胞タンパ
ク合成系を用いたタンパクの製造方法を提供すること。 【解決手段】 無細胞抽出液を含む無細胞タンパク合成
系でタンパクを製造する方法において、プロモーターＤ
ＮＡ配列、リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクを
コードするＤＮＡ配列、及びターミネーターＤＮＡ配列
又は変異ターミネーターＤＮＡ配列を含み、かつ前記４
種のＤＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上であ
る鋳型ＤＮＡを用いてタンパクを製造する方法。
量のタンパクを合成させることのできる、無細胞タンパ
ク合成系を用いたタンパクの製造方法を提供すること。 【解決手段】 無細胞抽出液を含む無細胞タンパク合成
系でタンパクを製造する方法において、プロモーターＤ
ＮＡ配列、リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクを
コードするＤＮＡ配列、及びターミネーターＤＮＡ配列
又は変異ターミネーターＤＮＡ配列を含み、かつ前記４
種のＤＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上であ
る鋳型ＤＮＡを用いてタンパクを製造する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、無細胞タンパク合
成系を用いたタンパクの製造方法に関する。ここで無細
胞タンパク合成系とは、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタ
ンパクやポリペプチドを合成する無細胞翻訳系、並びに
ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無
細胞翻訳系の両者を含む系の何れをも意味するものとす
る。
成系を用いたタンパクの製造方法に関する。ここで無細
胞タンパク合成系とは、ｍＲＮＡの情報を読み取ってタ
ンパクやポリペプチドを合成する無細胞翻訳系、並びに
ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系と無
細胞翻訳系の両者を含む系の何れをも意味するものとす
る。
【０００２】
【従来の技術】無細胞タンパク合成系は、生物や培養細
胞等の生きた細胞を用いる系に比べ、タンパク合成に至
るまでの操作が非常に簡便であることから、近年その需
要が高まっている。一方、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェー
ンリアクション）は大変有効かつ簡便なＤＮＡ遺伝子増
幅方法であり、この両技術を組み合わせ、プラスミドＤ
ＮＡを用いずに、ＰＣＲにより得られたＤＮＡから直接
そのＤＮＡがコードするタンパクを容易かつ大量に合成
できる技術の開発が待たれている。ＰＣＲ産物のＤＮＡ
を用いて無細胞タンパク合成を行わせる系は既に知られ
ている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, 412-4
17, 1997) 。しかしながら、従来、量的に十分なタンパ
クを合成することは難しく、タンパクの合成量を増加さ
せることが重要な課題であった。
胞等の生きた細胞を用いる系に比べ、タンパク合成に至
るまでの操作が非常に簡便であることから、近年その需
要が高まっている。一方、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェー
ンリアクション）は大変有効かつ簡便なＤＮＡ遺伝子増
幅方法であり、この両技術を組み合わせ、プラスミドＤ
ＮＡを用いずに、ＰＣＲにより得られたＤＮＡから直接
そのＤＮＡがコードするタンパクを容易かつ大量に合成
できる技術の開発が待たれている。ＰＣＲ産物のＤＮＡ
を用いて無細胞タンパク合成を行わせる系は既に知られ
ている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, 412-4
17, 1997) 。しかしながら、従来、量的に十分なタンパ
クを合成することは難しく、タンパクの合成量を増加さ
せることが重要な課題であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的
は、ＰＣＲで得られたＤＮＡから、簡便に十分な量のタ
ンパクを合成させることのできる、無細胞タンパク合成
系を用いたタンパクの製造方法を提供することにある。
は、ＰＣＲで得られたＤＮＡから、簡便に十分な量のタ
ンパクを合成させることのできる、無細胞タンパク合成
系を用いたタンパクの製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】前記の目的を達成するた
めに、本発明者らは鋭意研究を重ね、無細胞タンパク合
成に用いる鋳型ＤＮＡの３’末端側に、ターミネーター
ＤＮＡ配列又は変異ターミネーターＤＮＡ配列を結合す
ることにより、タンパク合成量が顕著に増加することを
見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、無細
胞抽出液を含む無細胞タンパク合成系でタンパクを製造
する方法において、プロモーターＤＮＡ配列、リボソー
ム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクをコードするＤＮＡ配
列、及びターミネーターＤＮＡ配列又は変異ターミネー
ターＤＮＡ配列を含み、かつ前記４種のＤＮＡ配列の合
計が全ＤＮＡ配列の５０％以上である鋳型ＤＮＡを用い
てタンパクを製造する方法である。本発明において、プ
ロモーターＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成時にＲＮＡポリ
メラーゼが最初に結合するＤＮＡ配列であり、リボソー
ム結合ＤＮＡ配列は、タンパク合成の際に、リボソーム
（タンパク合成をつかさどる複合体）が結合する部位の
ＤＮＡ配列であり、ターミネーターＤＮＡ配列又は変異
ターミネーターＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラーゼによ
るｍＲＮＡの合成を停止させる配列（転写終結配列）で
ある。本発明においては、前記４種のＤＮＡ配列をこの
順に結合し、その合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上であ
る鋳型ＤＮＡを用いることが必要である。前記４種のＤ
ＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％未満では、タン
パク合成に必要なＤＮＡ部分以外に、タンパク合成に直
接関係の無いＤＮＡ配列を合成し、結合する必要があ
り、ＤＮＡの製造コストがかかり、タンパクの合成効率
も低下する。本発明に使用する無細胞抽出液としては、
小麦胚芽抽出液、大腸菌細胞抽出液、ウサギ網状赤血球
抽出液等があげられる。
めに、本発明者らは鋭意研究を重ね、無細胞タンパク合
成に用いる鋳型ＤＮＡの３’末端側に、ターミネーター
ＤＮＡ配列又は変異ターミネーターＤＮＡ配列を結合す
ることにより、タンパク合成量が顕著に増加することを
見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は、無細
胞抽出液を含む無細胞タンパク合成系でタンパクを製造
する方法において、プロモーターＤＮＡ配列、リボソー
ム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクをコードするＤＮＡ配
列、及びターミネーターＤＮＡ配列又は変異ターミネー
ターＤＮＡ配列を含み、かつ前記４種のＤＮＡ配列の合
計が全ＤＮＡ配列の５０％以上である鋳型ＤＮＡを用い
てタンパクを製造する方法である。本発明において、プ
ロモーターＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成時にＲＮＡポリ
メラーゼが最初に結合するＤＮＡ配列であり、リボソー
ム結合ＤＮＡ配列は、タンパク合成の際に、リボソーム
（タンパク合成をつかさどる複合体）が結合する部位の
ＤＮＡ配列であり、ターミネーターＤＮＡ配列又は変異
ターミネーターＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラーゼによ
るｍＲＮＡの合成を停止させる配列（転写終結配列）で
ある。本発明においては、前記４種のＤＮＡ配列をこの
順に結合し、その合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上であ
る鋳型ＤＮＡを用いることが必要である。前記４種のＤ
ＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％未満では、タン
パク合成に必要なＤＮＡ部分以外に、タンパク合成に直
接関係の無いＤＮＡ配列を合成し、結合する必要があ
り、ＤＮＡの製造コストがかかり、タンパクの合成効率
も低下する。本発明に使用する無細胞抽出液としては、
小麦胚芽抽出液、大腸菌細胞抽出液、ウサギ網状赤血球
抽出液等があげられる。
【０００５】以下本発明に使用する無細胞抽出液の調製
から無細胞タンパク合成系におけるタンパク合成活性の
測定までの各段階について詳細に説明する。 ｉ．無細胞抽出液の調製 無細胞抽出液の調製は、用いる材料に応じて異なるが、
通常のいかなる方法を用いても良い。 ii．無細胞タンパク合成反応 反応液には、無細胞抽出液の他、目的とするタンパクを
コードするＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、タン
パクの構成アミノ酸、緩衝剤、ＡＴＰ、ＧＴＰ等のエネ
ルギー源、クレアチンホスフェート、クレアチンホスフ
ォキナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸、ピルビン
酸キナーゼ等のＡＴＰ再生系、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）、スペルミン、スペルミジン等の安定化剤、ＲＮ
ａｓｅ阻害剤を適量加える。反応は、用いる無細胞抽出
液及び目的とするタンパクの種類等により最適の温度で
行われ、一般に２０〜４０℃が適当である。
から無細胞タンパク合成系におけるタンパク合成活性の
測定までの各段階について詳細に説明する。 ｉ．無細胞抽出液の調製 無細胞抽出液の調製は、用いる材料に応じて異なるが、
通常のいかなる方法を用いても良い。 ii．無細胞タンパク合成反応 反応液には、無細胞抽出液の他、目的とするタンパクを
コードするＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、タン
パクの構成アミノ酸、緩衝剤、ＡＴＰ、ＧＴＰ等のエネ
ルギー源、クレアチンホスフェート、クレアチンホスフ
ォキナーゼ、フォスフォエノールピルビン酸、ピルビン
酸キナーゼ等のＡＴＰ再生系、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）、スペルミン、スペルミジン等の安定化剤、ＲＮ
ａｓｅ阻害剤を適量加える。反応は、用いる無細胞抽出
液及び目的とするタンパクの種類等により最適の温度で
行われ、一般に２０〜４０℃が適当である。
【０００６】タンパク合成に用いられるアミノ酸配列の
情報は、ｍＲＮＡの形でタンパク合成系にもたらされ
る。このｍＲＮＡは鋳型ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼ
による転写反応で合成される。ＲＮＡポリメラーゼは、
まずその種類に特異的なプロモーター配列をＤＮＡ上に
見出しその部分に結合し、続いてＲＮＡの合成を開始す
る。ＲＮＡの合成は、ＤＮＡ配列が無くなった部分で自
然に終了する（ｒｕｎ−ｏｆｆ）か、ＲＮＡポリメラー
ゼの種類に特異的なターミネーター配列が現れた時点で
終了する。従来主として用いられてきたプラスミドＤＮ
Ａを鋳型として用いる方法においては、ｒｕｎ−ｏｆｆ
法とターミネーター配列を用いる方法とで、タンパク合
成の効率に差が無かった。このため、より簡便なｒｕｎ
−ｏｆｆ法が主に用いられてきた。しかし、ＰＣＲ産物
ＤＮＡを鋳型に用いた場合、ｒｕｎ−ｏｆｆ法を用いた
タンパク合成の効率が、プラスミドを用いた時と比較し
て劣るという現象が見られた。このため、その原因を解
析し、タンパク合成の効率を上げるため研究を進めた。
その結果、目的とするタンパクをコードする鋳型ＤＮＡ
の配列の後（３’末端側）にターミネーターＤＮＡ配列
又は変異ターミネーターＤＮＡ配列を連結するととも
に、プロモーターＤＮＡ配列、リボソーム結合ＤＮＡ配
列、目的タンパクをコードするＤＮＡ配列、及びターミ
ネーターＤＮＡ配列又は変異ターミネーターＤＮＡ配列
の合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上である鋳型ＤＮＡを
用いてタンパクを製造することにより、タンパク合成活
性が顕著に高まることが確認された。本発明においてタ
ンパク合成量（タンパク合成活性）が増加する原因はま
だ明らかにされていないが、ＲＮＡポリメラーゼによっ
て作られたｍＲＮＡが安定化している、ｍＲＮＡの合成
量が増加している、ｍＲＮＡの高次構造がタンパク合成
系で有効に機能している、等の原因が推定される。
情報は、ｍＲＮＡの形でタンパク合成系にもたらされ
る。このｍＲＮＡは鋳型ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼ
による転写反応で合成される。ＲＮＡポリメラーゼは、
まずその種類に特異的なプロモーター配列をＤＮＡ上に
見出しその部分に結合し、続いてＲＮＡの合成を開始す
る。ＲＮＡの合成は、ＤＮＡ配列が無くなった部分で自
然に終了する（ｒｕｎ−ｏｆｆ）か、ＲＮＡポリメラー
ゼの種類に特異的なターミネーター配列が現れた時点で
終了する。従来主として用いられてきたプラスミドＤＮ
Ａを鋳型として用いる方法においては、ｒｕｎ−ｏｆｆ
法とターミネーター配列を用いる方法とで、タンパク合
成の効率に差が無かった。このため、より簡便なｒｕｎ
−ｏｆｆ法が主に用いられてきた。しかし、ＰＣＲ産物
ＤＮＡを鋳型に用いた場合、ｒｕｎ−ｏｆｆ法を用いた
タンパク合成の効率が、プラスミドを用いた時と比較し
て劣るという現象が見られた。このため、その原因を解
析し、タンパク合成の効率を上げるため研究を進めた。
その結果、目的とするタンパクをコードする鋳型ＤＮＡ
の配列の後（３’末端側）にターミネーターＤＮＡ配列
又は変異ターミネーターＤＮＡ配列を連結するととも
に、プロモーターＤＮＡ配列、リボソーム結合ＤＮＡ配
列、目的タンパクをコードするＤＮＡ配列、及びターミ
ネーターＤＮＡ配列又は変異ターミネーターＤＮＡ配列
の合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上である鋳型ＤＮＡを
用いてタンパクを製造することにより、タンパク合成活
性が顕著に高まることが確認された。本発明においてタ
ンパク合成量（タンパク合成活性）が増加する原因はま
だ明らかにされていないが、ＲＮＡポリメラーゼによっ
て作られたｍＲＮＡが安定化している、ｍＲＮＡの合成
量が増加している、ｍＲＮＡの高次構造がタンパク合成
系で有効に機能している、等の原因が推定される。
【０００７】本発明に使用されるＲＮＡポリメラーゼ
は、通常用いられるいかなる配列のものでも良い。しか
し、タンパク合成反応液中での活性や、ＲＮＡポリメラ
ーゼ自体の入手のし易さを考慮すると、Ｔ７、Ｔ３、Ｓ
Ｐ６等のウイルス由来のＲＮＡポリメラーゼが望まし
い。また本発明に使用されるターミネーターＤＮＡ配列
又は変異ターミネーターＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラ
ーゼの転写反応を停止させ、合成されたＲＮＡをＤＮＡ
から遊離させる機能を有するものであればいずれのＤＮ
Ａ配列も使用できる。通常は、転写反応に使用するＲＮ
Ａポリメラーゼに固有のターミネーターＤＮＡ配列を使
用することが望ましい。しかし、ＲＮＡポリメラーゼに
固有のターミネーターＤＮＡ配列の一部の塩基を置換、
欠失又は挿入したＤＮＡ配列であって、ＲＮＡポリメラ
ーゼの転写反応を停止させ、合成されたＲＮＡをＤＮＡ
から遊離させる機能を有するものであればいずれのＤＮ
Ａ配列も本発明に使用できることは明らかであり、この
ようなターミネーターＤＮＡ配列をこの明細書において
「変異ターミネーターＤＮＡ配列」という。
は、通常用いられるいかなる配列のものでも良い。しか
し、タンパク合成反応液中での活性や、ＲＮＡポリメラ
ーゼ自体の入手のし易さを考慮すると、Ｔ７、Ｔ３、Ｓ
Ｐ６等のウイルス由来のＲＮＡポリメラーゼが望まし
い。また本発明に使用されるターミネーターＤＮＡ配列
又は変異ターミネーターＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラ
ーゼの転写反応を停止させ、合成されたＲＮＡをＤＮＡ
から遊離させる機能を有するものであればいずれのＤＮ
Ａ配列も使用できる。通常は、転写反応に使用するＲＮ
Ａポリメラーゼに固有のターミネーターＤＮＡ配列を使
用することが望ましい。しかし、ＲＮＡポリメラーゼに
固有のターミネーターＤＮＡ配列の一部の塩基を置換、
欠失又は挿入したＤＮＡ配列であって、ＲＮＡポリメラ
ーゼの転写反応を停止させ、合成されたＲＮＡをＤＮＡ
から遊離させる機能を有するものであればいずれのＤＮ
Ａ配列も本発明に使用できることは明らかであり、この
ようなターミネーターＤＮＡ配列をこの明細書において
「変異ターミネーターＤＮＡ配列」という。
【０００８】以下、比較例及び実施例によって本発明を
具体的に説明する。
具体的に説明する。
【実施例１及び比較例１】 大腸菌抽出液の調製 Ellmanらの方法(Methods Enzymol. 202: 301-336 (199
1))に従って、大腸菌抽出液を調製した。まず、大腸菌A
19 を８Ｌの培養液を含むジャーファーメンターにて37
℃で培養し、450nm の吸光度が1.1 になった時点で培養
を停止した。菌体を遠心分離により集め、バッファーに
懸濁し、フレンチプレスにて8400psi で菌を破砕した。
直ちに遠心分離して30,000xgの遠心上清(S30) を得た。
得られた上清にATP 等のエネルギー源を加えたバッファ
ーを添加し、37℃、80分ゆっくり振とうした。続いてこ
の液を4 ℃、3 時間透析し、さらに4,000xg で遠心した
上清を大腸菌抽出液として得た。
1))に従って、大腸菌抽出液を調製した。まず、大腸菌A
19 を８Ｌの培養液を含むジャーファーメンターにて37
℃で培養し、450nm の吸光度が1.1 になった時点で培養
を停止した。菌体を遠心分離により集め、バッファーに
懸濁し、フレンチプレスにて8400psi で菌を破砕した。
直ちに遠心分離して30,000xgの遠心上清(S30) を得た。
得られた上清にATP 等のエネルギー源を加えたバッファ
ーを添加し、37℃、80分ゆっくり振とうした。続いてこ
の液を4 ℃、3 時間透析し、さらに4,000xg で遠心した
上清を大腸菌抽出液として得た。
【０００９】無細胞タンパク合成反応 遠藤斗志也らにより開発された方法（第69回日本生化学
会大会、発表番号4-P-1209) に従って、無細胞タンパク
合成を行なった。実施例１の反応液は、５6.４ｍＭ Tr
is・HCl buffer pH 7.４、1.２２ｍＭＡＴＰ、それぞれ
0.８５ｍＭのＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、1.７６ｍＭ Ｄ
ＴＴ、４０ｍＭクレアチンリン酸、0.１５mg／mlクレア
チンキナーゼ、１６０μＭアミノ酸、１０ｍ酢酸マグネ
シウム、１５０ｍＭ酢酸カリウム、1.０Ｕ／μ１ ＲＮ
ａｓｅ阻害剤（ヒト胎盤由来）、0.１７mg／ml大腸菌ｔ
ＲＮＡ、0.０２mg／ml鋳型ＤＮＡ、１０μg/mlＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼ、大腸菌抽出液0.２mlの組成からなり、
全量を１mlとした。反応は３７℃で２時間おこなった。
会大会、発表番号4-P-1209) に従って、無細胞タンパク
合成を行なった。実施例１の反応液は、５6.４ｍＭ Tr
is・HCl buffer pH 7.４、1.２２ｍＭＡＴＰ、それぞれ
0.８５ｍＭのＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、1.７６ｍＭ Ｄ
ＴＴ、４０ｍＭクレアチンリン酸、0.１５mg／mlクレア
チンキナーゼ、１６０μＭアミノ酸、１０ｍ酢酸マグネ
シウム、１５０ｍＭ酢酸カリウム、1.０Ｕ／μ１ ＲＮ
ａｓｅ阻害剤（ヒト胎盤由来）、0.１７mg／ml大腸菌ｔ
ＲＮＡ、0.０２mg／ml鋳型ＤＮＡ、１０μg/mlＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼ、大腸菌抽出液0.２mlの組成からなり、
全量を１mlとした。反応は３７℃で２時間おこなった。
【００１０】但し、実施例１で用いた鋳型ＤＮＡは、Ｔ
７プロモーター配列、ＧＦＰ（green fluorescein prot
ein:クラゲタンパク質）遺伝子配列、Ｔ７ターミネータ
ー配列を含むプラスミド pRSET-GFP1 を鋳型とし、Ｔ７
プロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１とＴ７タ
ーミネーター配列の更に後ろの配列をもつアンチセンス
プライマーＰ３を用いてＰＣＲを行って得た。また、プ
ラスミド pRSET-GFP1は、プラスミドpGFP(Clontech 社)
を制限酵素BamHI とEcoRI で処理してＧＦＰ遺伝子を
切り出し、これをプラスミドpRSETB(Invitrogen 社) の
BamHI とEcoRI部位に挿入することより製造した。プラ
スミド pRSET-GFP1 のＤＮＡ配列のうちこの実施例にお
いて鋳型として使用した部分のＤＮＡ配列を図１に示
す。ここで使用したＴ７プロモーター配列及びリボソー
ム結合ＤＮＡ配列は以下のとおりである。 Ｔ７プロモーター配列 TAATACGACTCACTATA ATTATGCTGAGTGATAT リボソーム結合ＤＮＡ配列 AAGGAG TTCCTC
７プロモーター配列、ＧＦＰ（green fluorescein prot
ein:クラゲタンパク質）遺伝子配列、Ｔ７ターミネータ
ー配列を含むプラスミド pRSET-GFP1 を鋳型とし、Ｔ７
プロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１とＴ７タ
ーミネーター配列の更に後ろの配列をもつアンチセンス
プライマーＰ３を用いてＰＣＲを行って得た。また、プ
ラスミド pRSET-GFP1は、プラスミドpGFP(Clontech 社)
を制限酵素BamHI とEcoRI で処理してＧＦＰ遺伝子を
切り出し、これをプラスミドpRSETB(Invitrogen 社) の
BamHI とEcoRI部位に挿入することより製造した。プラ
スミド pRSET-GFP1 のＤＮＡ配列のうちこの実施例にお
いて鋳型として使用した部分のＤＮＡ配列を図１に示
す。ここで使用したＴ７プロモーター配列及びリボソー
ム結合ＤＮＡ配列は以下のとおりである。 Ｔ７プロモーター配列 TAATACGACTCACTATA ATTATGCTGAGTGATAT リボソーム結合ＤＮＡ配列 AAGGAG TTCCTC
【００１１】比較例１の反応は、実施例１と同組成の反
応液でおこなった。また鋳型ＤＮＡは実施例１と同じプ
ラスミドを鋳型とし、Ｔ７プロモーター配列を含むセン
スプライマーＰ１と、Ｔ７ターミネーター配列直前のア
ンチセンスプライマーＰ２を用いてＰＣＲを行って得た
短い鋳型ＤＮＡを用いた。反応１時間後に反応液の一部
をとり、ＧＦＰの合成量をＧＦＰの発する蛍光、エクサ
イテーション３９５ｎｍ、エミッション５０９ｎｍにて
測定して求めた。合成されたタンパクの量は、一定時間
後に合成されたＧＦＰタンパクの発する蛍光値から、反
応時間０のバックグラウンド蛍光値を差し引いた値で表
す。
応液でおこなった。また鋳型ＤＮＡは実施例１と同じプ
ラスミドを鋳型とし、Ｔ７プロモーター配列を含むセン
スプライマーＰ１と、Ｔ７ターミネーター配列直前のア
ンチセンスプライマーＰ２を用いてＰＣＲを行って得た
短い鋳型ＤＮＡを用いた。反応１時間後に反応液の一部
をとり、ＧＦＰの合成量をＧＦＰの発する蛍光、エクサ
イテーション３９５ｎｍ、エミッション５０９ｎｍにて
測定して求めた。合成されたタンパクの量は、一定時間
後に合成されたＧＦＰタンパクの発する蛍光値から、反
応時間０のバックグラウンド蛍光値を差し引いた値で表
す。
【００１２】
【実施例２及び３】実施例１で示されたターミネーター
配列の有効性を確認するため、鋳型ＤＮＡの長さをそろ
え、実施例２では、Ｔ７ターミネーター配列をもつ鋳型
ＤＮＡを、実施例３では、Ｔ７ターミネーター配列の一
部（６塩基）を変化させた鋳型ＤＮＡを用いた。 大腸菌抽出液の調製と無細胞タンパク合成反応 実施例１と同様の方法で大腸菌抽出液の調製と無細胞タ
ンパク合成反応をおこなった。但し鋳型ＤＮＡは、実施
例２は実施例１と同じプラスミドを鋳型にして、Ｔ７プ
ロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１と、Ｔ７タ
ーミネーター配列を含むアンチセンスプライマーＰ４で
ＰＣＲを行って得た。実施例３で用いた鋳型ＤＮＡは、
Ｔ７プロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１と、
Ｔ７ターミネーター配列の一部（６塩基）を変化させた
配列を含むアンチセンスプライマーＰ５でＰＣＲを行っ
て得た。ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を以下に
示す。
配列の有効性を確認するため、鋳型ＤＮＡの長さをそろ
え、実施例２では、Ｔ７ターミネーター配列をもつ鋳型
ＤＮＡを、実施例３では、Ｔ７ターミネーター配列の一
部（６塩基）を変化させた鋳型ＤＮＡを用いた。 大腸菌抽出液の調製と無細胞タンパク合成反応 実施例１と同様の方法で大腸菌抽出液の調製と無細胞タ
ンパク合成反応をおこなった。但し鋳型ＤＮＡは、実施
例２は実施例１と同じプラスミドを鋳型にして、Ｔ７プ
ロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１と、Ｔ７タ
ーミネーター配列を含むアンチセンスプライマーＰ４で
ＰＣＲを行って得た。実施例３で用いた鋳型ＤＮＡは、
Ｔ７プロモーター配列を含むセンスプライマーＰ１と、
Ｔ７ターミネーター配列の一部（６塩基）を変化させた
配列を含むアンチセンスプライマーＰ５でＰＣＲを行っ
て得た。ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を以下に
示す。
【００１３】 プライマー 塩基配列 Ｐ１ CCGCGAAATT TAATACGACT C Ｐ２ TTATTGCTCA GCGGTGGCAG Ｐ３ GCCAGATCCG GATATAGTTC CTCC Ｐ４ AGCAAAAAAC CCCTCAAGAC CCGTTTAGAG GCCCCAAGGG GT Ｐ５ AGCAAAAATC GTCTCAACAA GCGTTTAGAG GCCCCAAGGG GT 結果を以下の表１に示す。
【００１４】
【表１】 例 ＧＦＰ合成量（相対値） 実施例１（完全長のT7ターミネーターを連結） １５ 比較例１（ターミネーター連結せず） ２ 実施例２（完全長のT7ターミネーターを連結） １２ 実施例３（完全長のT7ターミネーターの配列の一部変化） ４．５
【００１５】完全長のＴ７ターミネーターＤＮＡ配列を
連結した鋳型ＤＮＡを使用した実施例１のタンパク（Ｇ
ＦＰ）合成量は、Ｔ７ターミネーターＤＮＡ配列を連結
していない鋳型ＤＮＡを使用した比較例１のタンパク合
成量の7.5 倍であることがわかる。また、完全長のＴ７
ターミネーターＤＮＡ配列を連結した鋳型ＤＮＡを使用
した実施例２のタンパク（ＧＦＰ）合成量は、Ｔ７ター
ミネーターＤＮＡ配列を連結していない鋳型ＤＮＡを使
用した比較例１のタンパク合成量の６倍であることがわ
かる。
連結した鋳型ＤＮＡを使用した実施例１のタンパク（Ｇ
ＦＰ）合成量は、Ｔ７ターミネーターＤＮＡ配列を連結
していない鋳型ＤＮＡを使用した比較例１のタンパク合
成量の7.5 倍であることがわかる。また、完全長のＴ７
ターミネーターＤＮＡ配列を連結した鋳型ＤＮＡを使用
した実施例２のタンパク（ＧＦＰ）合成量は、Ｔ７ター
ミネーターＤＮＡ配列を連結していない鋳型ＤＮＡを使
用した比較例１のタンパク合成量の６倍であることがわ
かる。
【００１６】さらに、実施例２のターミネーターＤＮＡ
配列と同じ長さで、配列の一部を変化させたもの（変異
ターミネーターＤＮＡ配列）を連結した鋳型ＤＮＡを使
用した実施例３のタンパク合成量は、実施例２の場合と
比較して低いが、Ｔ７ターミネーターＤＮＡ配列を連結
していない鋳型ＤＮＡを使用した比較例１のタンパク合
成量の４．５倍であることがわかる。上記結果は、完全
長のターミネーターＤＮＡ配列を連結した鋳型ＤＮＡを
使用することにより、タンパク合成量が顕著に増大する
こと、ターミネーターＤＮＡ配列の一部の配列を変化さ
せた変異ターミネーターＤＮＡ配列を使用するとターミ
ネーターＤＮＡ配列を連結することにより奏される効果
が減少することを示している。
配列と同じ長さで、配列の一部を変化させたもの（変異
ターミネーターＤＮＡ配列）を連結した鋳型ＤＮＡを使
用した実施例３のタンパク合成量は、実施例２の場合と
比較して低いが、Ｔ７ターミネーターＤＮＡ配列を連結
していない鋳型ＤＮＡを使用した比較例１のタンパク合
成量の４．５倍であることがわかる。上記結果は、完全
長のターミネーターＤＮＡ配列を連結した鋳型ＤＮＡを
使用することにより、タンパク合成量が顕著に増大する
こと、ターミネーターＤＮＡ配列の一部の配列を変化さ
せた変異ターミネーターＤＮＡ配列を使用するとターミ
ネーターＤＮＡ配列を連結することにより奏される効果
が減少することを示している。
【００１７】
配列番号：１ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 CCGCGAAATT TAATACGACT C 21 配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 TTATTGCTCA GCGGTGGCAG 20 配列番号：３ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 GCCAGATCCG GATATAGTTC CTCC 24 配列番号：４ 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 AGCAAAAAAC CCCTCAAGAC CCGTTTAGAG GCCCCAAGGG GT 42 配列番号：５ 配列の長さ：42 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ＰＣＲ用プライマー 配列 AGCAAAAATC GTCTCAACAA GCGTTTAGAG GCCCCAAGGG GT 42
【図１】プラスミド pRSET-GFP1 のＤＮＡ配列のうち、
実施例において鋳型として使用した部分のＤＮＡ配列を
示す。
実施例において鋳型として使用した部分のＤＮＡ配列を
示す。
Claims (3)
- 【請求項１】 無細胞抽出液を含む無細胞タンパク合成
系でタンパクを製造する方法において、プロモーターＤ
ＮＡ配列、リボソーム結合ＤＮＡ配列、目的タンパクを
コードするＤＮＡ配列、及びターミネーターＤＮＡ配列
又は変異ターミネーターＤＮＡ配列を含み、かつ前記４
種のＤＮＡ配列の合計が全ＤＮＡ配列の５０％以上であ
る鋳型ＤＮＡを用いてタンパクを製造する方法。 - 【請求項２】 転写に用いるＲＮＡポリメラーゼがＴ７
である、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 無細胞抽出液が大腸菌抽出液である請求
項１又は２記載の方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9222371A JPH1156363A (ja) | 1997-08-19 | 1997-08-19 | タンパクの製造方法 |
| US09/136,411 US6207378B1 (en) | 1997-08-19 | 1998-08-19 | Method for amplifying nucleic acid molecules and method for synthesizing proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9222371A JPH1156363A (ja) | 1997-08-19 | 1997-08-19 | タンパクの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1156363A true JPH1156363A (ja) | 1999-03-02 |
Family
ID=16781312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9222371A Pending JPH1156363A (ja) | 1997-08-19 | 1997-08-19 | タンパクの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1156363A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002018586A1 (fr) * | 2000-08-30 | 2002-03-07 | Wakenyaku Co Ltd | Conception et construction d'un modele de transcription de synthese d'une proteine acellulaire, et methode de dilution de type discontinue utilisee dans la synthese d'une proteine de germe de ble acellulaire |
| WO2010147111A1 (ja) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | トヨタ自動車株式会社 | 無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法 |
| EP3354736A1 (en) * | 2017-01-25 | 2018-08-01 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Promoter construct for cell-free protein synthesis |
-
1997
- 1997-08-19 JP JP9222371A patent/JPH1156363A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002018586A1 (fr) * | 2000-08-30 | 2002-03-07 | Wakenyaku Co Ltd | Conception et construction d'un modele de transcription de synthese d'une proteine acellulaire, et methode de dilution de type discontinue utilisee dans la synthese d'une proteine de germe de ble acellulaire |
| WO2010147111A1 (ja) | 2009-06-15 | 2010-12-23 | トヨタ自動車株式会社 | 無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法 |
| US9005920B2 (en) | 2009-06-15 | 2015-04-14 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Solution for cell-free protein synthesis, kit for cell-free protein synthesis, and method of protein synthesis |
| EP3354736A1 (en) * | 2017-01-25 | 2018-08-01 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Promoter construct for cell-free protein synthesis |
| WO2018138201A1 (en) * | 2017-01-25 | 2018-08-02 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Promoter construct for cell-free protein synthesis |
| US11371047B2 (en) | 2017-01-25 | 2022-06-28 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. | Promoter construct for cell-free protein synthesis |
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|---|---|---|---|
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