CN110199025B

CN110199025B - 用于无细胞蛋白质合成的启动子构建体

Info

Publication number: CN110199025B
Application number: CN201880007978.7A
Authority: CN
Inventors: 马提亚·邦特魯; 西蒙·沃格尔; 斯蒂芬·席勒伯格
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: CA3049826A1; WO2018138201A1; EP3354736B1; EP3354736A1; EP3574099A1; JP7048643B2; JP2020505951A; AR110908A1; CN110199025A; EP3574099B1; US11371047B2; CA3049826C; EP3574099C0; US20190376068A1

Abstract

本文提供的技术涉及用于提高靶蛋白质产量和/或允许在无细胞蛋白质合成系统中使用较低模板浓度的新型启动子构建体、方法和系统。

Description

用于无细胞蛋白质合成的启动子构建体

技术领域

本技术涉及用于提高靶蛋白质产量和/或允许在无细胞蛋白质合成系统中使用较低模板浓度的启动子构建体、方法和系统。

背景技术

对于新的治疗用蛋白质、技术酶、蛋白质工程和功能基因组学的需求不断增长，需要快速且有效的蛋白质生产和筛选平台。

无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis，CFPS)这一新兴技术可以帮助满足这种需求(Carlson等，2012)。基于粗裂解物的CFPS系统相对于体内系统提供了诸多优势，并在蛋白质工程、生物制药产品开发和后基因组研究中提供广泛应用。

与基于细胞的表达相比，CFPS提供诸如更短处理时间以及直接控制和监测反应条件的优点。PCR产物可以直接用于同时表达多种蛋白质，而无需繁琐的克隆和转化步骤。CFPS平台允许添加促进蛋白质折叠或非天然氨基酸掺入的辅助因子(Albayrak和Swartz，2013；White等，2013)。它们还有利于表达无法在活细胞中产生的细胞毒性蛋白质。

粗裂解物含有用于翻译、蛋白质折叠和能量代谢所必需的组分，因此为它们提供氨基酸、能量底物、核苷酸和盐以允许可以合成由RNA模板编码的几乎任何蛋白质。在额外地补充有适当RNA聚合酶的偶联转录/翻译系统中，也可以使用DNA模板。

如上所述，与传统的基于细胞的表达方法相比，CFPS提供了更短的处理时间、有限的蛋白质水解和表达毒性蛋白质或者在限定位置含有特定化学基团或非天然氨基酸的蛋白质的能力。此外，系统的开放性使得可以直接控制和监测反应。尽管化学合成允许快速且受控地合成长度<40个残基的肽，但这对于较大多肽的生产而言并不是经济上可行的方法。

最广泛使用的无细胞系统基于大肠杆菌提取物(Escherichia coli extract，ECE)、小麦胚芽提取物(wheat germ extract，WGE)、兔网织红细胞裂解物(rabbitreticulocytes lysate，RLL)和昆虫细胞提取物(insect cell extract，ICE)。其含有以不同方式增强蛋白质表达、折叠和修饰的多种细胞组分和辅因子。因此，最适合的系统将取决于靶蛋白的来源和生物化学性质。ECE的制备简单且廉价，并且通常实现最高的蛋白质产量，在间歇(batch)反应中产量为每毫升数百微克至毫克(取决于靶蛋白)。

相反，真核系统的生产力较低并且提取物制备更费力，但可以更有效地生产复杂的蛋白质并支持延长的翻译后修饰。WGE通常每毫升产生数十微克至毫克的重组蛋白质，这取决于蛋白质和反应形式，但提取物制备需要4-5天，并且来自小麦种子的提取物的产量低。RLL系统的产量通常比WGE低两个数量级，并且从草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)制备的ICE可以实现高达50μg/mL的产量。

最近，已经描述了另外两种基于CHO细胞和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的真核系统。CHO提取物产生高达50μg/mL的活性萤火虫萤光素酶，但发酵培养基非常昂贵。相反，酵母提取物的制备是廉价的，但该系统仅产生8μg/mL低靶蛋白水平的活性萤火虫萤光素酶。因此，目前无细胞系统的缺点产生了对于可以大量地快速制备的高产量真核无细胞系统的需求。

基于烟草BY-2细胞的非偶联CFPS系统已在文献中描述(Buntru等，Buntru等，BMCBiotechnology 2014,14:37)。此外，在现有技术中还描述了基于烟草BY-2细胞裂解物(BY-2cell lysate，BYL)的高度有效偶联的无细胞转录-翻译系统(Buntru等，Biotechnologyand Bioengineering,Vol.112,No.5,2015,867-878)。

到目前为止已经描述了多种尝试，以通过优化模板来提高无细胞系统中的靶蛋白产量，例如通过使用不同的启动子和/或5'和3'非翻译区(untranslated region，UTR)。来自烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)(TMV)的ω5'UTR被鉴定为在无细胞小麦胚芽提取物(WGE)中产生高靶蛋白水平，并且在其他无细胞翻译系统如兔网织红细胞裂解物(RLL)和大肠杆菌提取物(ECE)中也起作用(Gallie等，1987；Gallie和Walbot，1992)。此外，Sawasaki等(2002)和US 7981617B2描述了使用特定三联体(GAA)作为ω序列上游的转录起始，这提高了WGE中的靶蛋白产量。然而，仍然需要进一步改进无细胞体外蛋白质合成。

因此，本公开内容的一个目的在于提供用于改进的无细胞体外蛋白质合成的方法和构建体。

发明内容

本公开内容总体上涉及无细胞蛋白质合成领域(也称为体外蛋白质合成或缩写为CFPS)。更具体地，本公开内容涉及用于提高靶蛋白质产量和/或允许在无细胞蛋白质合成系统中使用较低模板浓度的启动子构建体、方法和系统。

在第一方面，本公开内容涉及适用于靶多肽的有效无细胞蛋白质合成的新型DNA启动子构建体，其中所述DNA启动子构建体在5'-3'方向上包含以下各项：

a)RNA聚合酶的启动子元件，

b)包括转录起始位点的至少6个连续核苷酸的增强元件，其中该增强元件包含序列GGGAGA、GCAAGA或GGAAGA，

c)5'UTR序列元件，和

d)翻译启动起始位点。

本公开内容在第二方面涉及用于有效合成无细胞蛋白质合成用mRNA的转录模板，其中该转录模板包含根据本公开内容的启动子构建体，其中目的多核苷酸和/或基因与翻译启动起始位点连接。

在第三方面，本公开内容涉及表达盒，其包括：

a)根据本公开内容的DNA启动子构建体，

b)与所述启动子构建体连接的目的多核苷酸和/或基因，和

c)任选的转录末端位点多腺苷酸化信号。

在第三方面，本公开内容涉及用于无细胞蛋白质合成的方法，所述方法包括通过在无细胞蛋白质合成系统中使用根据本公开内容的转录模板和/或根据本公开内容的表达盒在体外合成蛋白质。

在第四方面，本公开内容涉及核酸载体，其包含根据本公开内容的启动子构建体、根据本公开内容的转录模板或根据本公开内容的表达盒。

在第五方面，本公开内容涉及适用于蛋白质合成的无细胞蛋白质合成系统，其包含：

a)原核或真核细胞裂解物，

b)反应缓冲液，和

c)根据本公开内容的转录模板、和/或表达盒和/或核酸载体。

此外，本公开内容涉及蛋白质筛选和/或生产平台，其包括根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统，和/或根据本公开内容的启动子构建体、和/或转录模板、和/或表达盒、和/或核酸载体。

附图说明

图1显示了根据本公开内容的DNA启动子构建体的一个有利实施方案(SEQ IDNO.3)。A：T7启动子元件，B：包含转录起始位点的增强元件，C：ω5'UTR序列元件，其中最后的3'核苷酸由A改变为C(与天然ω序列相比)以有利于克隆(目的基因的整合)，D：翻译启动起始位点。

图2是显示使用处于八种不同模板浓度的载体pIVEX_ω的不同变体加上非载体对照的Strep-eYFP表达的图表。这些变体在ω5'非翻译区上游的转录起始处含有不同的核苷酸(参见图1中的增强元件和图3中的转录起始位点(tc s))。

图3显示了不同核苷酸变体(增强子元件，tc s)的DNA序列作为在ω5'非翻译区(UTR)上游的转录起始。示出了T7启动子、转录起始位点(tc s)、ω5'UTR和翻译起始(tl s)的位置。

具体实施方式

本公开内容涉及用于无细胞蛋白质合成的新构建体、方法和系统，特别是适用于烟草BY-2细胞裂解物中的蛋白质合成的无细胞蛋白质合成系统，其通过使用DNA启动子构建体来进行，该启动子构建体包含用于提高所表达的目的靶蛋白的产量的新型增强子元件。

本公开内容的有利实施方案涉及适用于靶多肽的有效无细胞蛋白质合成的DNA启动子构建体，其中所述DNA启动子构建体在5'-3'方向上包含以下各项：

a)RNA聚合酶的启动子元件，

c)5'UTR序列元件，和

d)翻译启动起始位点。

归因于该新型DNA启动子构建体，特别是通过在启动子构建体中在5'UTR元件(如来自TMV的ω5'UTR序列)上游添加包含额外核苷酸的增强子元件，目的蛋白质的表达可以极大提高，特别是通过使用无细胞BYL系统。在转录起始位点处不含增强子元件的额外核苷酸的原始ω序列导致几乎没有产生可检测的靶蛋白。

此外，根据本公开内容的新型DNA启动子构建体、无细胞蛋白质合成系统、表达盒、方法和转录模板允许使用非常低的模板浓度，这至少在大规模方法中是重要的成本效率因素。在小规模筛选方法中，例如通过基于微流体的方法，其中仅存在少量DNA量，该新型构建体和系统可以提高蛋白质生产力，从而产生可检测量的靶蛋白质。最可能的是，该新的启动子构建体还导致在不同于BYL的其他无细胞偶联转录-翻译系统中提高靶蛋白产量。

在一些有利的实施方案中，将根据本公开内容的DNA-启动子构建体、载体、表达盒和/或转录模板进行分离和/或纯化。如本文所用的，术语“分离的”是指所述及的材料从其天然环境例如细胞中移出。因此，分离的生物材料可以不含一部分或所有细胞组分，即其中天然材料天然存在的细胞的组分(例如，细胞质或膜组分)。如果材料存在于细胞提取物或上清液中，则应认为该材料是分离的。在核酸分子的情况下，分离的核酸包括PCR产物、分离的mRNA、cDNA或限制性片段。在另一个实施方案中，分离的核酸优选从可以在其中发现它的染色体切除，并且更优选不再与非编码区连接或接近(但可以与其天然调控区或其部分连接)、或者与位于由分离的核酸分子所含基因的上游或下游的其他基因(当在染色体中发现时)连接或接近。在另一个实施方案中，分离的核酸缺少一个或多个内含子。分离的核酸分子包括插入到质粒、黏粒、人工染色体等中的序列(即，当它形成嵌合重组核酸构建体的一部分时)。因此，在一个具体实施方案中，重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白质可以与其他蛋白质或核酸或二者缔合(在细胞中所述分离的蛋白质与它们缔合)，或者如果所述分离的蛋白质是膜相关蛋白则与细胞膜缔合。将分离的细胞器、细胞或组织从其在生物体中被发现的解剖部位移出。分离的材料可以但不需要被纯化。

如本文所用的，术语“纯化的”是指已经在减少或消除不相关材料(即污染物，包括从中获得该材料的天然材料)的存在的条件下经分离的材料。

如上所述，根据本公开内容的DNA启动子构建体适用于有效的无细胞蛋白质合成。无细胞蛋白质合成(也称为体外蛋白质合成或缩写为CFPS)是在没有使用活细胞的情况下使用生物机制(biological machinery)的蛋白质生产。体外蛋白质合成环境不受维持细胞活力所必需的细胞壁或稳态条件限制。因此，CFPS能够直接接近(access)和控制翻译环境，这对于许多应用是有利的，所述应用包括蛋白质生产的优化、蛋白质复合物的优化、研究蛋白质合成、掺入非天然氨基酸、高通量筛选以及合成生物学。

“启动子元件”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动序列的转录的DNA调控区域。出于定义本发明的目的，位于cDNA上游的启动子序列在其3'末端由转录启动位点分界，并向上游(5'方向)延伸以包括启动高于背景的可检测水平的转录所需的最少数目的碱基或元件。位于cDNA下游的启动子序列(用于表达(-)RNA)在其5'末端由转录启动位点分界，并向下游(3'方向)延伸以包括启动高于背景的可检测水平的转录所需的最少数目的碱基或元件。

本文中描述的DNA启动子构建体优选是编码链，即其碱基序列对应于所产生的RNA转录物的碱基序列的DNA链(尽管其中胸腺嘧啶被尿嘧啶取代)。正是此链含有密码子，同时非编码链含有反密码子。在转录期间，RNA聚合酶II结合非编码链，读取反密码子，并转录它们的序列以合成具有互补碱基的RNA转录物。按照惯例，编码链是在显示DNA序列时使用的链。它以5'至3'的方向呈现。

本公开内容特别涉及新型DNA启动子构建体，其中该启动子构建体包含RNA聚合酶的启动子元件。启动子或启动子元件是指导结构基因的转录的DNA序列。通常，启动子位于基因的5'区，靠近结构基因(或目的多核苷酸和/或基因)的转录起始位点。

术语“RNA聚合酶”包括DNA-依赖性RNA聚合酶(RNA Pol)，其利用特定DNA序列或元件来鉴定和结合基因中的启动子区域以启动转录。某些RNA Pol仅具有一个亚基(例如，来自噬菌体如T3和T7以及线粒体的那些)，而来自细菌和真核生物的另一些RNA Pol是需要额外蛋白质因子进行有效转录的多亚基酶。

多聚体酶难以从纯化的亚基重构。相比之下，来自噬菌体的较小单体RNA Pol可以进行转录，包括从DNA模板终止和释放转录物，而无需额外的蛋白质因子的辅助。这些特征使得噬菌体RNA Pol成为体外转录反应的优秀工具。

在一些实施方案中，RNA聚合酶的启动子元件是核心启动子元件，即含有表达可操作连接的编码序列的所必需的核苷酸序列的最小启动子或启动子元件，包括例如转录的TATA盒和起点。通过此定义，在没有可以增强活性或赋予组织特异性活性的特定序列存在的情况下，核心启动子可以具有或可以不具有可检测的活性。

例如，具有不同DNA序列特异性的以下不同噬菌体RNA Pol可商购获得用于体外转录：

·T7 RNA聚合酶

(启动子序列：

)；SEQ ID NO.11。

·T3 RNA聚合酶

(启动子序列：

)；SEQ ID NO.12。

·SP6 RNA聚合酶

(启动子序列：

)；SEQ ID NO.13。

上面列出的序列在其3'末端包括转录起始位点(tc s)(以粗体字母标记)。

因此，在有利的实施方案中，本公开内容的DNA启动子构建体包含RNA聚合酶的启动子元件，其中该RNA聚合酶选自以下各项的组：T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶。

特别地，包含的是不含原始转录起始位点的RNA聚合酶的启动子元件。因此，RNA聚合酶的启动子元件例如选自以下各项的组：

-TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO.6)-T7 RNA聚合酶的启动子序列；

-AATTAACCCTCACTAAA(SEQ ID NO.7)-T3 RNA聚合酶的启动子序列；

-AATTTAGGTGACACTATA(SEQ ID NO.8)-SP6 RNA聚合酶的启动子序列；

-AATTAGGGCACACTATA(SEQ ID NO.9)-K11 RNA聚合酶的启动子序列；

-TAATACGACTCACTAAT[SEQ ID NO.10)-BA14 RNA聚合酶的启动子序列。

在一个有利的实施方案中，启动子元件来源于T7 RNA聚合酶，特别地该启动子元件包含SEQ ID NO.13的序列或由其组成。

根据本公开内容的DNA启动子构建体还包含至少6个连续核苷酸的增强元件。在增强元件内将发现转录启动位点(通过用例如核酸酶S1作图而方便地限定)。转录起始位点是其中转录在基因序列的5'末端开始的位置。

“核酸分子”是指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物形式，或其任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯，其为单链形式或双链螺旋。

“多核苷酸”或“核苷酸序列”是DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并且意指两个或更多个核苷酸的任何链。核苷酸序列通常携带遗传信息，包括细胞机制用来制造蛋白质的信息。

所述增强元件位于启动子元件和随后的5'UTR序列元件之间，例如在有利的实施方案中，增强元件的序列在启动子元件的最后一个3'核苷酸之后开始并且在5'UTR序列元件的第一个5'核苷酸之前结束。在一些进一步有利的实施方案中，在所述启动子元件和5'UTR元件之间的所述增强元件的5'末端处的第一个核苷酸是鸟嘌呤(G)并且在所述增强元件的3'末端处的第六个核苷酸是腺嘌呤(A)。

增强元件的有利实施方案由序列GGGAGA、GCAAGA或GGAAGA组成。在进一步有利的实施方案中，增强元件包含序列GAAGAA、GTAAGA或GCAAGA或者由其组成。

如上所述，增强元件位于RNA聚合酶启动子元件和5'UTR序列元件之间。5'非翻译区(5'UTR)(也称为前导序列或前导RNA)是mRNA的区域，其分别位于翻译启动密码子和编码序列的正上游。5'UTR序列元件是经转录的mRNA上编码5'非翻译区的DNA序列。在5'UTR内是由核糖体识别的序列，其允许核糖体结合并启动翻译(由Mignone等，2002综述)。翻译启动的机制在原核生物和真核生物中不同。

在一些有利的实施方案中，5'UTR序列元件是编码来自烟草花叶病毒(TMV)的ω5'UTR序列的DNA序列。5'UTR序列元件的另一些优选实例是编码烟草蚀刻病毒(Tobacco etchvirus)(TEV)的5'UTR的DNA序列。来自烟草花叶病毒的5'UTR序列的一个实例显示在SEQ IDNO.14中并且来自烟草蚀刻病毒的显示在SEQ ID NO.15中。

在5'UTR序列元件之后，直接设置用于编码翻译起始位点的DNA三联体。翻译起始位点或起始密码子是由核糖体翻译的信使RNA(mRNA)转录物的第一个密码子。起始密码子总是编码真核生物中的甲硫氨酸和原核生物中的经修饰Met(fMet)。最常见的起始密码子是AUG。

在一些有利的实施方案中，适用于靶多肽的有效无细胞蛋白质合成的DNA启动子构建体在5'-3'方向上包含以下各项：

a)RNA聚合酶的T7启动子元件，其特别包含SEQ ID NO.12，

b)包括转录起始位点的至少6个连续核苷酸的增强元件，其特别具有GGGAGA、GCAAGA或GGAAGA，

c)来自烟草花叶病毒(TMV)的ω5'UTR序列，其特别具有SEQ ID NO.14，和

d)翻译启动起始位点。

因此，在有利的实施方案中，根据本公开内容的启动子构建体包含选自以下的序列：

a)SEQ ID NO.3中所示的核酸序列，和

b)与a)具有至少85％序列同一性的核酸序列。

根据本公开内容的启动子构建体的进一步有利的实施方案包含选自以下的序列：

a)SEQ ID NO.4中所示的核酸序列，和

b)与a)具有至少85％序列同一性的核酸序列。

关于两个氨基酸或多核苷酸序列，“百分比序列同一性”是指当序列最佳比对时所述两个序列中相同的残基的百分比。因此，85％氨基酸序列同一性意指两个最佳比对的多肽序列中85％的氨基酸是相同的。例如，通过比对序列而直接比较两个分子之间的序列信息、对两个比对序列之间的确切匹配数计数、除以较短序列的长度并将结果乘以100，可以确定百分比同一性。可以使用易于获得的计算机程序来辅助分析，如ALIGN14,NationalBiomedical Research Foundation,Washington,DC，其将Smith和Waterman的局部同源性算法改编用于肽分析。用于确定核苷酸序列同一性的程序可在Wisconsin SequenceAnalysis Package，第8版(可获自Genetics Computer Group，Madison，WI)中获得，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，其也依赖于Smith和Waterman算法。这些程序很容易以由制造商推荐的默认参数5使用，并在上面提到的Wisconsin Sequence Analysis Package中描述。适用于确定序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其在之前描述过。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(the National Center for BiotechnologyInformation)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。同样，用于确定百分比同源性的计算机程序也是容易获得的。

此外，本公开内容涉及用于有效合成无细胞蛋白质合成用mRNA的转录模板，其中该转录模板包含根据本公开内容的启动子构建体，其中结构基因、目的多核苷酸或基因与翻译启动起始位点连接。

本公开内容中此处描述的转录模板构建体优选是编码链，即其碱基序列对应于所产生的RNA转录物的碱基序列的DNA链(尽管其中胸腺嘧啶被尿嘧啶取代)。正是此链含有密码子，而非编码链含有反密码子。在转录期间，RNA Pol II结合非编码链，读取反密码子，并转录它们的序列以合成具有互补碱基的RNA转录物。按照惯例，编码链是在显示DNA序列时使用的链。它以5'至3'的方向呈现。

然而，与所描述的启动子构建体相反，根据本公开内容的转录模板包含与翻译启动起始位点连接的结构基因和/或目的多核苷酸和/或基因。

结构基因(或者目的多核苷酸和/或基因)是转录成信使RNA(mRNA)的DNA序列，然后将其翻译成特定多肽特有的氨基酸序列。

此外，本公开内容涉及表达盒，其包括：

a)根据本公开内容的DNA启动子构建体，

b)与所述启动子构建体连接的目的多核苷酸和/或基因，和

c)任选的转录末端位点多腺苷酸化信号。

根据本发明，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中有充分说明。参见，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(本文中称为"Sambrook等,1989")；DNACloning:A Practical Approach,卷I和II(D.N.Glover编辑，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑，(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney编辑，(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)。

“表达盒”是指编码可以在限定的限制性位点插入到载体中的表达产物的DNA编码序列或DNA区段。盒限制性位点被设计成确保该盒插入在适当的阅读框中。通常，外来DNA在载体DNA的一个或更多个限制性位点处插入，然后连同可传递的载体DNA一起由载体携带进入宿主细胞中。具有插入或添加的DNA的DNA区段或序列，如表达载体，也可以称为“DNA构建体”。常见类型的载体是“质粒”，其通常是双链DNA的自含分子，通常是细菌来源的，可以容易地接受另外的(外来)DNA并且可以容易地引入到合适的宿主细胞中。质粒载体通常含有编码DNA和启动子DNA，并且具有一个或更多个适于插入外来DNA的限制性位点。编码DNA是编码特定蛋白质或酶的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是启动、调控或者以其他方式介导或控制编码DNA的表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自相同基因或来自不同基因，并且可以来自相同或不同的生物体。重组克隆载体通常将包括一个或更多个用于克隆或表达的复制系统、一个或更多个用于在宿主中选择的标记(例如，抗生素抗性)和一个或更多个表达盒。

术语“靶多肽的合成”或“表达”是指基因产物的生物合成。在结构基因的情况下，表达/合成涉及将该结构基因转录成mRNA，然后将该mRNA翻译成一种或更多种多肽。

术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用以表示通过相邻残基的α-氨基和羧基基团之间的肽键彼此连接的线性系列氨基酸残基。氨基酸残基优选为天然“L”异构形式。然而，“D”异构形式的残基可以取代任何L-氨基酸残基，只要多肽保留所需的功能特性即可。此外，除了20个“标准”氨基酸之外，氨基酸还包括修饰的和不常见的氨基酸。

“连接”是指两个或更多个分子之间的非共价或共价键连。连接可以是直接的或间接的。当两个分子通过连接分子(接头)连接时，这两个分子是间接连接的。当两个分子没有中间分子连接它们时，这两个分子是直接连接的。如上所述，目的多核苷酸和/或基因以及所述启动子构建体优选彼此直接连接。

如果启动子、终止子或多腺苷酸化信号靠近基因的起点(例如，第一个密码子)并且远离基因末端(例如终止密码子)，则它是在基因的“上游”。如果启动子、终止子或多腺苷酸化信号靠近基因末端并且远离基因起点，则它是在基因的“下游”。将与基因功能性缔合的本发明质粒中的启动子定向，以促进基因的有义链或反义链的转录。

如上所述，DNA-启动子构建体可以例如包含能够驱动可翻译RNA产物表达的T7RNA聚合酶启动子、T3 RNA聚合酶启动子或SP6 RNA聚合酶启动子。例如，表达盒任选地可以在转录的RNA的3'末端包含多腺苷酸化信号。

本公开内容还涉及核酸载体，其包含根据本公开内容的DNA启动子构建体、转录模板或表达盒。核酸载体可以是克隆载体和/或表达载体。

术语“载体”包括能够转运已与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接另外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。另一些载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“表达系统”。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本公开内容意图包括这样的其他形式表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们用于等同的功能。

本公开内容还涉及适用于蛋白质合成的无细胞蛋白质合成系统，其包含：

a)原核或真核细胞裂解物，

b)反应缓冲液，和

c)根据前述权利要求中任一项的转录模板、和/或表达盒、和/或核酸载体。

在一些有利的实施方案中，真核细胞裂解物是烟草BY-2细胞裂解物。

需要两个基本组分来实现这样的体外蛋白质表达：(1)编码靶蛋白质的遗传模板(mRNA或DNA)和(2)含有必需的转录和翻译分子机制的反应溶液。细胞提取物(或无细胞蛋白质合成(CFPS)系统提供反应溶液的全部或大部分分子，包括：

-用于mRNA转录的RNA聚合酶，

-用于多肽翻译的核糖体，

-tRNA和氨基酸，

-酶促辅因子和能量源，

-用于适当蛋白质折叠所必需的细胞成分。

用于无细胞体外转录的模板DNA可以是线性的、环状的质粒或PCR片段。然而，该DNA必须含有待转录基因上游的启动子序列。

细胞裂解物提供翻译所需的酶和构建单元的正确组成和比例(通常，还必须添加能量源和氨基酸以维持合成)。除去细胞膜以仅留下细胞的胞质和细胞器组分(因此称为“无细胞提取物/裂解物”)。开发用于无细胞蛋白质表达的第一类裂解物来源于原核生物体。最近，已开发出基于昆虫细胞、哺乳动物细胞和人细胞的提取物的系统，并且该系统可商购获得。

根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统包括生物提取物/裂解物，如原核或真核细胞裂解物。用于蛋白质转录/翻译的反应混合物将包含用于产生大分子的模板，例如DNA、mRNA等；用于要合成的大分子的单体，例如氨基酸、核苷酸等，以及这样的合成所需的辅因子、酶和其他试剂，例如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子以及能量再生系统，例如磷酸肌酸/肌酸激酶等。这样的合成反应系统在本领域中是公知的，并且已在文献中描述。用于多肽合成的许多反应化学可以用于本发明的方法中。例如，反应化学描述于2002年1月8日授权的美国专利No.6,337,191和1月2日授权的美国专利No.6,168,931中。

无细胞表达系统可以支持自DNA模板(转录和翻译)或mRNA模板(仅翻译)的蛋白质合成。原则上，无细胞表达系统可以设计为作为两个分别的顺序反应(非偶联)完成转录和翻译步骤，或作为一个反应(偶联)同时地完成转录和翻译步骤。

基于原核大肠杆菌(Escherichia coli)提取物的无细胞系统已经迅速发展(对于综述，参见Carlson,ED等，“Cell-free protein synthesis:Applications come of age”,Biotechnol.Adv.30,1185-1194，(2012))。出于本发明的目的，任何原核或真核细胞裂解物均可用作无细胞蛋白质合成系统。作为无细胞蛋白质合成系统的原核细胞裂解物，Zubay，G.(1973，Ann.Rev.Genet.Vol 7,p.267)描述了大肠杆菌S30无细胞提取物。当将待表达的基因克隆入含有适当的原核调控序列如启动子和核糖体结合位点的载体中时，可以使用这些。

如果在向提取物中添加DNA之后转录和翻译同时发生，则认为无细胞系统是“偶联的”。在一些有利的实施方案中，根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统是偶联的无细胞蛋白质合成系统。

然而，由于许多原因，真核无细胞裂解物是优选的表达系统，至少部分地因为它们保留了多种翻译后加工活性。例如，在向无细胞小麦胚芽提取物中添加犬微粒体膜的情况下，可以检查加工事件如信号肽切割和核心糖基化。真核细胞裂解物还支持广泛种类的病毒和另一些原核RNA以及真核mRNA的体外翻译。

先前开发的主要真核CFPS平台包括由小麦胚芽提取物(WGE)制成的系统(Goshima,N.等，"Human protein factory for converting the transcriptome into anin vitro-expressed proteome,"Nat.Methods 5,1011-1017(2008)；Hoffmann,M.等，Biotechnol Annu Rev Vol.10,1-30中(Elsevier,2004)；Takai等，(2010))、兔网织红细胞裂解物(RRL)(Jackson,R.J.等，Methods Enzymol Vol.Vol.96中(编辑，Becca Fleischer,Sidney Fleischer)Ch.4,50-74(Academic Press,1983))；昆虫细胞提取物(ICE)(Ezure,T等，"A cell-free protein synthesis system from insect cells,"MethodsMol.Biol.607,31-42(2010)；Kubick,S等，Current Topics in Membranes中,Vol.63(编辑Larry DeLucas)25-49(Academic Press,2009)；Tarui,H.等，"Establishment andcharacterization of cell-free translation/glycosylation in insect cell[Spodoptera frugiperda 21)extract prepared with high pressure treatment,"Appl.Microbiol.Biotechnol.55,446-453(2001))；利什曼原虫(Leishmania tarentolae)提取物(Kovtun,O.等，"Towards the construction of expressed proteomes using aLeishmania tarentolae based cell-free expression system,"PLoS One 5,el4388(2010)；Mureev,S.等，"Species-independent translational leaders facilitatecell-free expression,"Nat.Biotechnol.27,747-752(2009))；以及HeLa和杂交瘤细胞提取物(Mikami,S.等，Cell-Free Protein Production Vol.607Methods in MolecularBiology中(编辑Yaeta Endo,Kazuyuki Takai,&Takuya Ueda)Ch.5,43-52(Humana Press,2010))。所有这些真核裂解物都受到研究人员的欢迎，并且是广泛可用的。

根据本公开内容，用作无细胞蛋白质合成系统的细胞提取物可以通过包括以下顺序步骤的方法制备：细胞裂解、高速离心(30,000RCF)、预孵育、透析和低速离心(4,000RCF)。在本公开内容中使用的细胞优选选自：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、小麦胚芽、稻胚、大麦胚芽、CHO细胞、杂交瘤细胞和网织红细胞，但不限于此。

在本公开内容的一个有利实施方案中，烟草BY-2细胞裂解物是优选的。这种烟草BY-2细胞裂解物可以例如通过由Buntru等，BMC Biotechnology 2014,14:37和Buntru等，Biotechnology and Bioengineering,Vol.112,No.5,2015,867-878(参见实施例)描述的方法制备。

在表1中，列出了包含在根据本公开内容的DNA启动子构建体中的增强元件的一些有利实施方案(参见图3)。增强子元件V9是现有技术(Buntru等，2015)的已知增强子元件。与现有技术中已知的增强子元件相反，特别是包含增强子元件V4、V5和V8的启动子构建体令人惊讶地可以以非常低的浓度使用，这对于它们在筛选测定和/或蛋白质筛选和/或生产平台中的应用是重要的。因此，在本公开内容的一些有利实施方案中，根据本公开内容的启动子构建体和/或用于蛋白质表达的模板以0.025至0.5μg的浓度用于无细胞蛋白质合成系统或者方法和/或蛋白质筛选和/或生产平台中。

表1

在表2中，显示了根据本公开内容的DNA启动子构建体的一个有利实施方案(SEQID NO.3)。SEQ ID NO.4是启动子构建体的另一个实施方案，SEQ ID NO.5是现有技术中公开的一种启动子构建体。SEQ ID NO.1是在T7启动子元件和5'UTR序列元件之间没有增强元件的启动子构建体的核酸序列，SEQ ID NO.2是在T7启动子元件和5'UTR序列元件之间仅具有三个核酸的启动子构建体的核酸序列。SEQ ID NO.6至10是没有原始转录起始位点的RNA聚合酶的启动子元件的实例。SEQ ID NO.11至13是没有原始转录起始位点的RNA聚合酶的启动子元件的实例。SEQ ID NO.14是来自烟草花叶病毒(TMV)的ω5'UTR序列的一个实例，SEQ ID NO.15是来自烟草蚀刻病毒的ω5'UTR序列的一个实例。

表2

如本文所用的，“表达模板”或“核酸模板”是指用作用于转录至少一种可被翻译成多肽或蛋白质的RNA的底物的核酸。表达模板包括由DNA或RNA组成的核酸。用于表达模板的核酸的合适DNA来源包括可以转化成cDNA的基因组DNA、cDNA和RNA。基因组DNA、cDNA和RNA可以来自任何生物来源，例如组织样品、活组织检查物、拭子、痰、血液样品、粪便样品、尿液样品、刮擦物等。基因组DNA、cDNA和RNA可以来自宿主细胞或病毒来源以及来自任何物种，包括现存和灭绝的生物。如本文所用的，“表达模板”、“核酸模板”和“转录模板”具有相同的含义并可互换使用。

如本文所用的，“翻译模板”是指来自表达模板的RNA转录产物，其可被核糖体用于合成多肽或蛋白质。如本文所用的，术语“核酸”和“寡核苷酸”是指多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)，并且是指任何其他类型的作为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的多核苷酸。在术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”之间的长度方面没有意图的区别，并且这些术语可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。为了用于本发明，寡核苷酸还可以包含其中碱基、糖或磷酸酯骨架被修饰的核苷酸类似物以及非嘌呤或非嘧啶核苷酸类似物。

在一些有利的实施方案中，在根据本公开内容的无细胞蛋白质合成系统和方法中，蛋白质合成在反应缓冲液的存在下实现。如本文所用的，术语“反应缓冲液”或“反应混合物”是指含有进行无细胞蛋白质合成/表达所必需的试剂的溶液。

用于促进自DNA转录模板(或RNA翻译模板)的无细胞蛋白质合成的反应缓冲液可以包括另外的NTP，并且还可以包括二价阳离子辅因子。如果反应混合物含有能够实现无细胞蛋白质合成所必需的所有试剂，则将该反应混合物称为是完全的。

本领域普通技术人员将理解，为了方便、储存稳定或者允许对组分浓度进行应用依赖性调整，反应组分常规地作为单独的溶液储存，每种溶液含有全部组分的子集，并且反应组分在反应前合并以形成完全的反应混合物。此外，本领域普通技术人员将理解，将反应组分分开包装用于商业化，并且有用的商业试剂盒可包含本发明反应组分的任何子集。

以下描述了通过使用所述无细胞蛋白质合成系统在体外合成蛋白质的典型设置。将裂解物等分试样从-80℃储存取出并在室温下解冻。为了开始蛋白质表达，将核酸模板添加至裂解物—在偶联转录-翻译反应的情况下为DNA并且在非偶联转录-翻译反应的情况下为mRNA—并且加入由HEPES缓冲液、谷氨酸镁、谷氨酸钾、NTP(用于偶联转录-翻译反应的ATP、GTP、CTP和UTP，用于非偶联转录-翻译反应的ATP和GTP)、磷酸肌酸、肌酸激酶和T7 RNA聚合酶(仅用于偶联转录-翻译反应)构成的反应混合物。偶联和非偶联的转录-翻译反应均在热混合器中在25℃和700rpm下进行18h。基于靶蛋白的性质，可以通过不同方法例如荧光测量、酶测定和SDS PAGE来分析所合成的蛋白质。

实施例

烟草BY-2裂解物(BYL)的制备

根据Komoda等(2004)和Gursinsky等(2009)的描述，在有重大改进的情况下，由脱液泡的BY-2原生质体制备裂解物。在发酵培养基中，直接通过用3.5％(v/v)Rohament CL和0.2％(v/v)Rohapect UF(均来自AB Enzymes，Darmstadt，Germany)处理细胞，由处于连续发酵的指数生长期的细胞制备原生质体。通过加入360mM甘露糖醇来调节培养基的渗透压。将得到的原生质体分层到在0.7M甘露糖醇、20mM MgCl₂和5mM PIPES-KOH(pH7.0)中的不连续Percoll梯度上，该梯度含有(从下至上)70％(v/v，3ml)、40％(v/v，5ml)、30％(v/v，3ml)、15％(v/v，3ml)和0％(3ml)Percoll(GE Healthcare，Munich，Germany)。在浮桶式转头中在25℃下以6,800g离心1小时后，从40-70％(v/v)Percoll溶液界面回收脱液泡的原生质体。将脱液泡的原生质体悬浮在三体积的TR缓冲液(30mM HEPES-KOH(pH7.4)，60mM谷氨酸钾，0.5mM谷氨酸镁，2mM DTT)中，其中每50ml的完全无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnostics，Mannheim，Germany)补充一片并使用利用Dounce组织研磨机(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)的30次冲击进行破碎。通过在4℃下以500g离心10分钟来除去细胞核和未破碎的细胞。然后将上清液在1mL等分试样中在-80℃冷冻。

BYL在间歇反应中的体外翻译活性

通过使用质粒pIVEX_GAAAGA_ω_Strep-eYFP作为模板产生报告蛋白eYFP来研究BYL的性能。偶联的转录-翻译反应在培养箱摇床(Kuehner，Basel，Switzerland)中在25℃和500rpm下在50μl等分试样中进行16小时。标准反应包含40％(v/v)BYL、40mM HEPES-KOH(pH 7.8)、8.5mM谷氨酸镁、3mM ATP、1.2mM GTP、1.2mM CTP、1.2mM UTP、30mM磷酸肌酸、0.1μg/μL肌酸激酶、80ng/μl载体DNA和50ng/μl自制T7 RNA聚合酶。

使用具有485/20nm激发和528/20nm发射滤光器的Synergy HT多模式微板读数器(Biotek，Bad Friedrichshall，Germany)定量来自eYFP的荧光信号。通过在没有DNA模板的BYL转录-翻译反应中，基于不同浓度的eYFP产生标准曲线来确定eYFP的量。eYFP标准使用BYL转录-翻译系统产生并通过

纯化。使用比色测定法(Bradford，1976)测定纯化的eYFP的浓度。

模板载体设计和测试

通过在ω5'UTR序列上游插入不同核苷酸来修饰载体pIVEX_ω_Strep-eYFP中的转录起始位点(tc s)。总共设计了9种不同的变体并将其整合到pIVEX_ω_Strep-eYFP载体中，其中变体1(V1)对应于在转录起始位点处没有额外核苷酸的原始序列，并且V2至V9代表8种经修饰的序列(图3)。

使用由烟草BY2细胞制备的无细胞BY-2裂解物(BYL)，在偶联的转录-翻译系统中比较不同的载体变体(V1-V9)(Buntru等，2015)。为了生产含有N末端Strep-标签的模型蛋白质eYFP(Strep-eYFP)，使用8个不同的模板浓度0.0625、0.0125、0.025、0.5、1、2、4和8μg载体(V1-V9)/50μl反应体积，并且每个样品各制备三个独立的反应(图2)。在转录起始位点处没有额外核苷酸的原始ω序列(V1)导致在所有模板浓度下几乎没有eYFP积累。具有额外的GAA三联体的ω序列(V2)仅在高模板浓度4或8μg质粒/50μl反应下导致eYFP积累。相反，变体V4、V5和V8在低模板浓度0.25μg/50μl IVTT反应下产生最高的eYFP产量。使用变体V4和V7实现了总体最高的eYFP产量。使用变体V4实现了最低模板浓度下的最高eYFP产量。低至0.0625μg模板质粒/50μl反应导致了约1μg eYFP/mL裂解物的可检测eYFP信号。

结果

图2显示了使用在8个不同模板浓度(0.0625、0.0125、0.025、0.5、1、2、4和8μg载体(V1-V9)/50μl反应体积)下的载体pIVEX_ω的不同变体的Strep-eYFP的表达。这些变体在ω5'非翻译区上游的转录起始处含有不同的核苷酸。反应以50μl规模在25℃和500rpm下进行16小时。使用具有485/20nm激发和528/20nm发射滤光器的荧光读数器定量来自eYFP的荧光信号。通过在没有DNA模板的BYL转录-翻译反应中，基于不同浓度的eYFP产生标准曲线来确定eYFP的量。eYFP标准使用BYL转录-翻译系统产生并通过

纯化。使用比色测定法测定纯化的eYFP的浓度。数据代表各自三次独立转录-翻译实验的平均值和标准偏差。

与现有技术中已知的增强子元件相反，特别是包含增强子元件V4、V5和V8的启动子构建体令人惊讶地可以以非常低的浓度使用，这对于它们在筛选测定和/或蛋白质筛选和/或生产平台中的应用是重要的。

文献

Bradford MM.1976.A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding.Anal Biochem 72：248-54.

Buntru M，Vogel S，Spiegel H，Schillberg S.2014.Tobacco BY-2cell-freelysate：an alternative and highly-productive plant-based in vitro translationsystem.BMC Biotechnol.14：37.doi：10.1186/1472-6750-14-37.

Buntru M，Vogel S，Stoff K，Spiegel H，Schillberg S.2015.A VersatileCoupled Cell-Free Transcription-Translation System Based on Tobacco BY-2 CellLysate.Biotechnol.Bioeng.112(5)：867-78.doi：10.1002/bit.25502.

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Swartz JR.2012.Transforming Biochemical Engineering with Cell-FreeBiology.Aiche Journal 58(1)：5-13.

序列表

<110> 弗劳恩霍夫应用研究促进协会

<120> 用于无细胞蛋白质合成的启动子构建体

<130> FRA-PA29-EP

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7启动子元件和5'UTR序列元件之间无增强元件的启动子构建体

<400> 1

taatacgact cactatagta tttttacaac aattaccaac aacaacaaca aacaacaaca 60

acattacatt ttacattcta caactaccat g 91

<210> 2

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7启动子元件和5'UTR序列元件之间仅有三个核苷酸的启动子构建体

<400> 2

taatacgact cactatagaa gtatttttac aacaattacc aacaacaaca acaaacaaca 60

acaacattac attttacatt ctacaactac catg 94

<210> 3

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据本公开内容的DNA启动子构建体

<400> 3

taatacgact cactataggg agagtatttt tacaacaatt accaacaaca acaacaaaca 60

acaacaacat tacattttac attctacaac taccatg 97

<210> 4

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根据本公开内容的DNA启动子构建体

<400> 4

taatacgact cactatagca agagtatttt tacaacaatt accaacaaca acaacaaaca 60

acaacaacat tacattttac attctacaac taccatg 97

<210> 5

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 现有技术的启动子构建体

<400> 5

taatacgact cactatagaa agagtatttt tacaacaatt accaacaaca acaacaaaca 60

acaacaacat tacattttac attctacaac taccatg 97

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 无原始转录起始位点的T7 RNA聚合酶的启动子序列

<400> 6

taatacgact cactata 17

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 无原始转录起始位点的T3 RNA聚合酶的启动子序列

<400> 7

aattaaccct cactaaa 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 无原始转录起始位点的SP6 RNA聚合酶的启动子序列

<400> 8

aatttaggtg acactata 18

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 无原始转录起始位点的K11 RNA聚合酶的启动子序列

<400> 9

aattagggca cactata 17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 无原始转录起始位点的BA14 RNA聚合酶的启动子序列

<400> 10

taatacgact cactaat 17

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7 RNA聚合酶的启动子序列

<400> 11

taatacgact cactataggg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T3 RNA聚合酶的启动子序列

<400> 12

aattaaccct cactaaaggg 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SP6 RNA聚合酶的启动子序列

<400> 13

aatttaggtg acactataga a 21

<210> 14

<211> 71

<212> DNA

<213> 烟草花叶病毒

<400> 14

gtatttttac aacaattacc aacaacaaca acaaacaaca acaacattac attttacatt 60

ctacaactac a 71

<210> 15

<211> 143

<212> DNA

<213> 烟草蚀刻病毒

<400> 15

aaataacaaa tctcaacaca acatatacaa aacaaacgaa tctcaagcaa tcaagcattc 60

tacttctatt gcagcaattt aaatcatttc ttttaaagca aaagcaattt tctgaaaatt 120

ttcaccattt acgaacgata gca 143

Claims

1.一种DNA启动子构建体，其适用于靶多肽的有效无细胞蛋白质合成，其中所述DNA启动子构建体在5' - 3'方向上包含以下各项：

a）RNA聚合酶的启动子元件，

b）包括转录起始位点的至少6个连续核苷酸的增强元件，其中所述增强元件包含序列GGGAGA、GCAAGA或GGAAGA，

c）5'UTR序列元件，和

d）翻译启动起始位点；

其中所述DNA启动子构建体包含选自以下的序列：

a）SEQ ID NO. 3中所示的核酸序列，和

b）与a）具有至少85%序列同一性的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的启动子构建体，其中所述5'UTR序列元件是来自烟草花叶病毒（TMV）的ω 5'UTR序列。

3.根据权利要求1所述的启动子构建体，其中所述RNA聚合酶的启动子元件是T7启动子元件。

4.一种用于有效合成无细胞蛋白质合成用mRNA的转录模板，其中所述转录模板包含根据前述权利要求1至3中任一项的所述DNA启动子构建体，其中目的多核苷酸和/或基因与所述翻译启动起始位点连接。

5.一种表达盒，其包括：

a）根据前述权利要求1至3中任一项的所述DNA启动子构建体，

b）与所述启动子构建体连接的目的多核苷酸和/或基因，和

c）任选的转录末端位点多腺苷酸化信号。

6.一种核酸载体，其包含根据权利要求1至3中任一项的所述DNA启动子构建体。

7.权利要求6所述的核酸载体，其中所述载体是克隆载体和/或表达载体。

8.一种适用于蛋白质合成的无细胞蛋白质合成系统，其包括：

a）真核细胞裂解物，

b）反应缓冲液，和

c）根据前述权利要求4中的所述转录模板、和/或权利要求5中的所述表达盒、和/或权利要求6中的所述核酸载体，

其中所述真核细胞裂解物是烟草BY-2细胞裂解物。

9.一种用于无细胞蛋白质合成的方法，所述方法包括通过使用根据权利要求8的所述无细胞蛋白质合成系统在体外合成蛋白质。

10.一种蛋白质筛选和/或生产平台，其包括根据权利要求8的所述无细胞蛋白质合成系统。