JPH0779782A - シネココッカスｐｃｃ７００２由来ルビスコ（リブロース １，５−ビスホスフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）遺伝子のプロモーター配列 - Google Patents
シネココッカスｐｃｃ７００２由来ルビスコ（リブロース １，５−ビスホスフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）遺伝子のプロモーター配列Info
- Publication number
- JPH0779782A JPH0779782A JP5184304A JP18430493A JPH0779782A JP H0779782 A JPH0779782 A JP H0779782A JP 5184304 A JP5184304 A JP 5184304A JP 18430493 A JP18430493 A JP 18430493A JP H0779782 A JPH0779782 A JP H0779782A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- dna sequence
- dna
- seq
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 シアノバクテリアにおいて他生物由来遺伝子
を発現するのに利用しうるルビスコ遺伝子由来のプロモ
ーター活性ＤＮＡを開発する。 【構成】 シアノバクテリアＰＣＣ７００２のルビスコ
（リブロース １，５−ビスホスフェートカルボキシラ
ーゼ／オキシゲナーゼ）遺伝子を解明し、それから遺伝
子発現に関与するプロモーター領域を取得し、次にこの
プロモーター配列を利用してＤＮＡ発現ベクターを作製
する。この発現ベクターを用いると形質転換体も得られ
る。
を発現するのに利用しうるルビスコ遺伝子由来のプロモ
ーター活性ＤＮＡを開発する。 【構成】 シアノバクテリアＰＣＣ７００２のルビスコ
（リブロース １，５−ビスホスフェートカルボキシラ
ーゼ／オキシゲナーゼ）遺伝子を解明し、それから遺伝
子発現に関与するプロモーター領域を取得し、次にこの
プロモーター配列を利用してＤＮＡ発現ベクターを作製
する。この発現ベクターを用いると形質転換体も得られ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、シアノバクテリア菌の
ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ；リブロース １，５−ビス
ホスフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ｒ
ｉｂｕｌｏｓｅ １，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ））遺伝
子のプロモーター配列に関する。本発明は、特にシアノ
バクテリアＰＣＣ７００２（シネココッカス、アグメネ
ルム クアドルプリカトゥム（Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ
ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍ）ＰＲ−６）のルビスコ
遺伝子のプロモーター配列を利用することおよびそれを
利用して得られる生産物にも関する。
ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ；リブロース １，５−ビス
ホスフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ｒ
ｉｂｕｌｏｓｅ １，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ））遺伝
子のプロモーター配列に関する。本発明は、特にシアノ
バクテリアＰＣＣ７００２（シネココッカス、アグメネ
ルム クアドルプリカトゥム（Ａｇｍｅｎｅｌｌｕｍ
ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｕｍ）ＰＲ−６）のルビスコ
遺伝子のプロモーター配列を利用することおよびそれを
利用して得られる生産物にも関する。
【０００１】
【従来の技術】タンパク質は生命の維持に重要な役割を
はたしており、その機能の利用は人類にとって大きな課
題であると考えられる。このような観点より様々な技術
開発がなされており、特に近年の遺伝子操作技術の進歩
を利用した動物細胞、或いは大腸菌などの微生物を用い
たタンパク質合成は注目されている。しかし、同時にそ
れに伴う様々な問題点、たとえば経済面あるいは効率面
等の問題点も生じてきている。また、ここ数年の地球温
暖化の原因の一つとして大気中の二酸化炭素濃度の上昇
が指摘されている。二酸化炭素を回収する方法の一つと
して、シアノバクテリアのもつ光合成反応、すなわち太
陽エネルギーによって二酸化炭素と水から酸素と糖など
の有機物を合成する反応が注目されている。高等植物と
同様の光合成を行なうシアノバクテリアは原核生物であ
るため生育が早く、しかも微量の金属イオンや硝酸イオ
ン存在下で容易に培養できる利点をもっている。またシ
アノバクテリアの遺伝子翻訳機構は基本的に大腸菌の機
構と類似していると推察されており、大腸菌における遺
伝子操作技術を生かせると考えられている。そのため、
シアノバクテリアは大気中の二酸化炭素を効率よく有機
物に変換できる生物として期待されている。このような
利点が推察されるにもかかわらず、シアノバクテリアに
おける異種タンパク質合成に必要なプロモーター領域に
関する研究がほとんど行われていないのが現状である。
従って、シアノバクテリアあるいはそのシアノバクテリ
アの有する遺伝子を有効利用することには問題があっ
た。
はたしており、その機能の利用は人類にとって大きな課
題であると考えられる。このような観点より様々な技術
開発がなされており、特に近年の遺伝子操作技術の進歩
を利用した動物細胞、或いは大腸菌などの微生物を用い
たタンパク質合成は注目されている。しかし、同時にそ
れに伴う様々な問題点、たとえば経済面あるいは効率面
等の問題点も生じてきている。また、ここ数年の地球温
暖化の原因の一つとして大気中の二酸化炭素濃度の上昇
が指摘されている。二酸化炭素を回収する方法の一つと
して、シアノバクテリアのもつ光合成反応、すなわち太
陽エネルギーによって二酸化炭素と水から酸素と糖など
の有機物を合成する反応が注目されている。高等植物と
同様の光合成を行なうシアノバクテリアは原核生物であ
るため生育が早く、しかも微量の金属イオンや硝酸イオ
ン存在下で容易に培養できる利点をもっている。またシ
アノバクテリアの遺伝子翻訳機構は基本的に大腸菌の機
構と類似していると推察されており、大腸菌における遺
伝子操作技術を生かせると考えられている。そのため、
シアノバクテリアは大気中の二酸化炭素を効率よく有機
物に変換できる生物として期待されている。このような
利点が推察されるにもかかわらず、シアノバクテリアに
おける異種タンパク質合成に必要なプロモーター領域に
関する研究がほとんど行われていないのが現状である。
従って、シアノバクテリアあるいはそのシアノバクテリ
アの有する遺伝子を有効利用することには問題があっ
た。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明はシアノバクテ
リアに他生物遺伝子を容易に発現させるための手段を開
発することを目的としている。特にその目的のためにシ
アノバクテリアＰＣＣ７００２がもつＲｕｂｉｓｃｏ
（ｒｉｂｕｌｏｓｅ １，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺
伝子の塩基配列を解析し、遺伝子操作技術を利用して実
質的にそのプロモーター活性を保持したＤＮＡ配列を
得、そのＤＮＡ配列を含有してなる発現ベクターおよび
その発現ベクターで形質転換せしめられた形質転換体を
開発することにある。
リアに他生物遺伝子を容易に発現させるための手段を開
発することを目的としている。特にその目的のためにシ
アノバクテリアＰＣＣ７００２がもつＲｕｂｉｓｃｏ
（ｒｉｂｕｌｏｓｅ １，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺
伝子の塩基配列を解析し、遺伝子操作技術を利用して実
質的にそのプロモーター活性を保持したＤＮＡ配列を
得、そのＤＮＡ配列を含有してなる発現ベクターおよび
その発現ベクターで形質転換せしめられた形質転換体を
開発することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明により、シアノバ
クテリアＰＣＣ７００２のＲｕｂｉｓｃｏ（ｒｉｂｕｌ
ｏｓｅ １，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂ
ｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子の全塩基
配列並びにその制御配列が決定され、その解析から遺伝
子発現に関与するプロモーター領域を実質的にその活性
を保持したまま有するところのＤＮＡ配列を解明し、さ
らにはそのプロモーター領域を実質的に活性なまま保持
したＤＮＡ配列を得、さらにその実質的にプロモーター
活性を保持したＤＮＡ配列を有する発現ベクターが提供
される。本発明によれば、特に配列表の配列番号２で示
されるＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等の活性を示
すＤＮＡ配列が提供され、そしてその配列番号２で示さ
れるＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等の活性を示す
ＤＮＡ配列を含有することを特徴とする発現ベクターが
開発提供せしめられ、その発現ベクターで広範囲の宿主
を形質転換せしめて得られた形質転換体が提供せられ
る。特に本発明によれば、大腸菌またはシアノバクテリ
アを宿主細胞として用いて遺伝子操作技術を行うに適し
た改良された技術が提供される。
クテリアＰＣＣ７００２のＲｕｂｉｓｃｏ（ｒｉｂｕｌ
ｏｓｅ １，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂ
ｏｘｙｌａｓｅ／ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子の全塩基
配列並びにその制御配列が決定され、その解析から遺伝
子発現に関与するプロモーター領域を実質的にその活性
を保持したまま有するところのＤＮＡ配列を解明し、さ
らにはそのプロモーター領域を実質的に活性なまま保持
したＤＮＡ配列を得、さらにその実質的にプロモーター
活性を保持したＤＮＡ配列を有する発現ベクターが提供
される。本発明によれば、特に配列表の配列番号２で示
されるＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等の活性を示
すＤＮＡ配列が提供され、そしてその配列番号２で示さ
れるＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等の活性を示す
ＤＮＡ配列を含有することを特徴とする発現ベクターが
開発提供せしめられ、その発現ベクターで広範囲の宿主
を形質転換せしめて得られた形質転換体が提供せられ
る。特に本発明によれば、大腸菌またはシアノバクテリ
アを宿主細胞として用いて遺伝子操作技術を行うに適し
た改良された技術が提供される。
【０００５】本発明におけるシアノバクテリアＰＣＣ７
００２のＲｕｂｉｓｃｏ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ １，５−
ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／
ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子のプロモーター領域の全塩
基配列を決定するにあたっては、まずシアノバクテリア
菌、例えばシアノバクテリアＰＣＣ７００２を、通常の
方法で培養増殖した後、得られた菌体から、慣用される
方法を適用して、例えば密度勾配法などを用いて染色体
ＤＮＡを回収し、次いで通常の方法、例えばエタノール
沈澱処理によって染色体ＤＮＡを精製したのち、適切な
制限酵素、例えば制限酵素Ｓａｕ３ＡＩによる部分分解
して適当な断片とし、得られた断片を用いて遺伝子ライ
ブラリーを作製する。遺伝子ライブラリーを作製するた
めに用いられるベクターとしては、目的に応じて当該分
野で知られた慣用されるものあるいは市販のものの中か
ら選んで適宜用いることができる。また遺伝子ライブラ
リーを作製するに用いられる方法は、当該分野で知られ
た慣用される方法あるいは市販のキットの中から選んで
適宜用いることができる。こうして得られた遺伝子ライ
ブラリーよりＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子を含むクローンの選
別のために、先ず適切な核酸塩基配列を設計しＰＣＲ法
によってＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の一部を増幅し、得られ
るＤＮＡ断片をプローブとしてスクリーニングを複数
回、例えば３回繰り返す。陽性クローンを選別した後Ｄ
ＮＡを回収し、制限酵素切断によって得られるＲｕｂｉ
ｓｃｏ遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドに挿入す
る。大量に調製された組換えプラスミドを適当な制限酵
素で消化した後、当該分野で知られた慣用される方法あ
るいは市販のキットの中から選んだ方法、例えばエキソ
ヌクレアーゼを用いるディレーションミュータント法に
より塩基配列を解析した。以上の操作によってもその塩
基配列を決定できない領域については、プライマーを化
学合成してプライマーエクステンション法も利用し、そ
の塩基配列を決定して解析した。こうして得られたＲｕ
ｂｉｓｃｏ遺伝子を含むＤＮＡ断片の代表的なものの全
塩基配列は、配列番号１で示される。本発明に従えば、
上記と同様な方法あるいは類似の方法を適用して種々の
Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子に関連した遺伝子のＤＮＡ配列を
決定することができ、こうして得られるものも本発明の
思想に従うかぎりその範囲内のものであることは理解さ
れよう。
００２のＲｕｂｉｓｃｏ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ １，５−
ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／
ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子のプロモーター領域の全塩
基配列を決定するにあたっては、まずシアノバクテリア
菌、例えばシアノバクテリアＰＣＣ７００２を、通常の
方法で培養増殖した後、得られた菌体から、慣用される
方法を適用して、例えば密度勾配法などを用いて染色体
ＤＮＡを回収し、次いで通常の方法、例えばエタノール
沈澱処理によって染色体ＤＮＡを精製したのち、適切な
制限酵素、例えば制限酵素Ｓａｕ３ＡＩによる部分分解
して適当な断片とし、得られた断片を用いて遺伝子ライ
ブラリーを作製する。遺伝子ライブラリーを作製するた
めに用いられるベクターとしては、目的に応じて当該分
野で知られた慣用されるものあるいは市販のものの中か
ら選んで適宜用いることができる。また遺伝子ライブラ
リーを作製するに用いられる方法は、当該分野で知られ
た慣用される方法あるいは市販のキットの中から選んで
適宜用いることができる。こうして得られた遺伝子ライ
ブラリーよりＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子を含むクローンの選
別のために、先ず適切な核酸塩基配列を設計しＰＣＲ法
によってＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の一部を増幅し、得られ
るＤＮＡ断片をプローブとしてスクリーニングを複数
回、例えば３回繰り返す。陽性クローンを選別した後Ｄ
ＮＡを回収し、制限酵素切断によって得られるＲｕｂｉ
ｓｃｏ遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドに挿入す
る。大量に調製された組換えプラスミドを適当な制限酵
素で消化した後、当該分野で知られた慣用される方法あ
るいは市販のキットの中から選んだ方法、例えばエキソ
ヌクレアーゼを用いるディレーションミュータント法に
より塩基配列を解析した。以上の操作によってもその塩
基配列を決定できない領域については、プライマーを化
学合成してプライマーエクステンション法も利用し、そ
の塩基配列を決定して解析した。こうして得られたＲｕ
ｂｉｓｃｏ遺伝子を含むＤＮＡ断片の代表的なものの全
塩基配列は、配列番号１で示される。本発明に従えば、
上記と同様な方法あるいは類似の方法を適用して種々の
Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子に関連した遺伝子のＤＮＡ配列を
決定することができ、こうして得られるものも本発明の
思想に従うかぎりその範囲内のものであることは理解さ
れよう。
【０００６】Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子はラージサブユニッ
ト遺伝子とスモールサブユニット遺伝子の２種類の遺伝
子領域を含んでいることが認められる。さらに両サブユ
ニット遺伝子の間にはリーディングフレーム２領域のほ
か、Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子の５’上流および３’下流に
２種類のリーディングフレーム領域、すなわちリーディ
ングフレーム３領域とリーディングフレーム１領域が存
在していることが認められる。これらリーディングフレ
ームがコードしているタンパク質は、サブユニットの複
合体形成、あるいは二酸化炭素輸送系に関与していると
示唆できる。特に、Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子はラージサブ
ユニット遺伝子（配列表の配列番号１で示される第９６
３番目から第２３７８番目の塩基までのオープン リー
ディングフレーム）とスモールサブユニット遺伝子（配
列表の配列番号１で示される第２８８２番目から第３２
１７番目の塩基までのオープン リーディングフレー
ム）の２種類の遺伝子からなる。さらに両サブユニット
遺伝子の間にはリーディングフレーム２（配列表の配列
番号１で示される第２４４７番目から第２８５１番目の
塩基までのリーディングフレーム）のほか、Ｒｕｂｉｓ
ｃｏ遺伝子の５’上流および３’下流に２種類のリーデ
ィングフレーム、すなわちリーディングフレーム３（配
列表の配列番号１で示される第４５番目から第３４４番
目の塩基までのリーディングフレーム）とリーディング
フレーム１（配列表の配列番号１で示される第３３７９
番目から第４００５番目の塩基までのリーディングフレ
ーム）が存在している。また代表的なＲｕｂｉｓｃｏ遺
伝子を含むＤＮＡ断片の全塩基配列の解析の結果、ラー
ジサブユニット遺伝子の５’上流領域とリーディングフ
レーム３との間にはプロモーター領域の存在が予測され
る。そこでさらなるプロモーター領域の解析を目的とし
て、５’上流領域の長さの異なる５種類のＤＮＡ断片を
それぞれ用いてプラスミドを構築し、大腸菌などを用い
てプロモーター領域について検討を加える。この解析の
結果、ラージサブユニットの翻訳開始点の直前−１塩基
（配列表の配列番号１で示されるＤＮＡ配列の第９６２
番目の塩基）から−３０４塩基（配列表の配列番号１で
示される第６５９番目の塩基）のＥｃｏＲＩ部位までの
３０４塩基対のＤＮＡ断片にプロモーター領域が存在す
ることを見出した。本発明に従えば、上記の示唆を利用
し、種々のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子に関連した遺伝子のＤ
ＮＡ配列を利用し、こうして得られるものも本発明の思
想に従うかぎりその範囲内のものであることは理解され
よう。上記解析の結果、特にラージサブユニットの翻訳
開始点の直前−１塩基（配列表の配列番号１で示される
ＤＮＡ配列の第９６２番目の塩基）から−３０４塩基
（配列表の配列番号１で示される第６５９番目の塩基）
のＥｃｏＲＩ部位までの３０４塩基対のＤＮＡ断片にプ
ロモーター領域が存在することを見出した。そこで、こ
のプロモーター領域を実質的に活性のまま保持したＤＮ
Ａ配列を当該分野で知られた慣用される方法あるいは市
販のキットの中から選んだ方法を用いて得、このプロモ
ーター領域を実質的に活性のまま保持したＤＮＡ配列を
有する発現ベクターを構築する。この発現ベクターを構
築するのに使用しうるプラスミドとしては大腸菌、シア
ノバクテリアなどの微生物由来のプラスミドなどが挙げ
らる。この発現ベクターを構築するのに適したプラスミ
ドとしては大腸菌由来のプラスミド、シアノバクテリア
由来のプラスミドなどが挙げられ、たとえば、ｐＵＣ
系、Ｍ１３系，ｐＡＱ系などのプラスミドが挙げられ
る。こうしてシアノバクテリアＰＣＣ７００２のＲｕｂ
ｉｓｃｏ遺伝子のプロモーター領域を実質的にその活性
を保持したまま有するところのＤＮＡ配列を含有する発
現ベクターが構築される。
ト遺伝子とスモールサブユニット遺伝子の２種類の遺伝
子領域を含んでいることが認められる。さらに両サブユ
ニット遺伝子の間にはリーディングフレーム２領域のほ
か、Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子の５’上流および３’下流に
２種類のリーディングフレーム領域、すなわちリーディ
ングフレーム３領域とリーディングフレーム１領域が存
在していることが認められる。これらリーディングフレ
ームがコードしているタンパク質は、サブユニットの複
合体形成、あるいは二酸化炭素輸送系に関与していると
示唆できる。特に、Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子はラージサブ
ユニット遺伝子（配列表の配列番号１で示される第９６
３番目から第２３７８番目の塩基までのオープン リー
ディングフレーム）とスモールサブユニット遺伝子（配
列表の配列番号１で示される第２８８２番目から第３２
１７番目の塩基までのオープン リーディングフレー
ム）の２種類の遺伝子からなる。さらに両サブユニット
遺伝子の間にはリーディングフレーム２（配列表の配列
番号１で示される第２４４７番目から第２８５１番目の
塩基までのリーディングフレーム）のほか、Ｒｕｂｉｓ
ｃｏ遺伝子の５’上流および３’下流に２種類のリーデ
ィングフレーム、すなわちリーディングフレーム３（配
列表の配列番号１で示される第４５番目から第３４４番
目の塩基までのリーディングフレーム）とリーディング
フレーム１（配列表の配列番号１で示される第３３７９
番目から第４００５番目の塩基までのリーディングフレ
ーム）が存在している。また代表的なＲｕｂｉｓｃｏ遺
伝子を含むＤＮＡ断片の全塩基配列の解析の結果、ラー
ジサブユニット遺伝子の５’上流領域とリーディングフ
レーム３との間にはプロモーター領域の存在が予測され
る。そこでさらなるプロモーター領域の解析を目的とし
て、５’上流領域の長さの異なる５種類のＤＮＡ断片を
それぞれ用いてプラスミドを構築し、大腸菌などを用い
てプロモーター領域について検討を加える。この解析の
結果、ラージサブユニットの翻訳開始点の直前−１塩基
（配列表の配列番号１で示されるＤＮＡ配列の第９６２
番目の塩基）から−３０４塩基（配列表の配列番号１で
示される第６５９番目の塩基）のＥｃｏＲＩ部位までの
３０４塩基対のＤＮＡ断片にプロモーター領域が存在す
ることを見出した。本発明に従えば、上記の示唆を利用
し、種々のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子に関連した遺伝子のＤ
ＮＡ配列を利用し、こうして得られるものも本発明の思
想に従うかぎりその範囲内のものであることは理解され
よう。上記解析の結果、特にラージサブユニットの翻訳
開始点の直前−１塩基（配列表の配列番号１で示される
ＤＮＡ配列の第９６２番目の塩基）から−３０４塩基
（配列表の配列番号１で示される第６５９番目の塩基）
のＥｃｏＲＩ部位までの３０４塩基対のＤＮＡ断片にプ
ロモーター領域が存在することを見出した。そこで、こ
のプロモーター領域を実質的に活性のまま保持したＤＮ
Ａ配列を当該分野で知られた慣用される方法あるいは市
販のキットの中から選んだ方法を用いて得、このプロモ
ーター領域を実質的に活性のまま保持したＤＮＡ配列を
有する発現ベクターを構築する。この発現ベクターを構
築するのに使用しうるプラスミドとしては大腸菌、シア
ノバクテリアなどの微生物由来のプラスミドなどが挙げ
らる。この発現ベクターを構築するのに適したプラスミ
ドとしては大腸菌由来のプラスミド、シアノバクテリア
由来のプラスミドなどが挙げられ、たとえば、ｐＵＣ
系、Ｍ１３系，ｐＡＱ系などのプラスミドが挙げられ
る。こうしてシアノバクテリアＰＣＣ７００２のＲｕｂ
ｉｓｃｏ遺伝子のプロモーター領域を実質的にその活性
を保持したまま有するところのＤＮＡ配列を含有する発
現ベクターが構築される。
【０００７】本発明によれば、上記プロモーター領域を
実質的に活性のまま保持したＤＮＡ配列は二酸化炭素を
効率よく有機物に変換するための系の制御配列として利
用するに適している。本発明によれば、特に配列番号２
で示されるＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等のプロ
モーター活性を示すことのできるＤＮＡ配列を含有する
ことを特徴とする発現ベクターが開発提供せしめられ、
さらにその発現ベクターで形質転換せしめられた形質転
換体が提供せられる。特に、本発明によれば、大腸菌ま
たはシアノバクテリアを宿主細胞として用いて遺伝子操
作技術を行う改良技術が提供される。配列番号２で示さ
れるＤＮＡ配列は、その機能を実質的に有する限りそこ
に含まれる塩基を置換したり、付加したり、あるいは欠
失処理してその配列以外のものに改変することが可能で
ある。このような改変法としては、適当な制限酵素及び
ＤＮＡ合成酵素、リガーゼを用いる方法、オリゴヌクレ
オチド指定変異法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）として知
られた方法、たとえばＭ．Ｓｍｉｔｈ及びＳ．Ｇｉｌｌ
ａｍ「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ｖ
ｏｌ．３，ｐ．１（１９８１）、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ
及びＡ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ ｅｄｓ「Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」，Ｖｏｌ．１５３−１
５５（１９８７），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ
Ａに記載のものあるいはそのうちに引用された文献に記
載のものなど、あるいは化学修飾法などが挙げられる。
そしてこうして得られたＤＮＡ配列は配列番号２で示さ
れるＤＮＡ配列と実質的に同等のプロモーター活性を示
す限り、それを含有する発現ベクターの開発に同様にし
て用いることが可能である。
実質的に活性のまま保持したＤＮＡ配列は二酸化炭素を
効率よく有機物に変換するための系の制御配列として利
用するに適している。本発明によれば、特に配列番号２
で示されるＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等のプロ
モーター活性を示すことのできるＤＮＡ配列を含有する
ことを特徴とする発現ベクターが開発提供せしめられ、
さらにその発現ベクターで形質転換せしめられた形質転
換体が提供せられる。特に、本発明によれば、大腸菌ま
たはシアノバクテリアを宿主細胞として用いて遺伝子操
作技術を行う改良技術が提供される。配列番号２で示さ
れるＤＮＡ配列は、その機能を実質的に有する限りそこ
に含まれる塩基を置換したり、付加したり、あるいは欠
失処理してその配列以外のものに改変することが可能で
ある。このような改変法としては、適当な制限酵素及び
ＤＮＡ合成酵素、リガーゼを用いる方法、オリゴヌクレ
オチド指定変異法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）として知
られた方法、たとえばＭ．Ｓｍｉｔｈ及びＳ．Ｇｉｌｌ
ａｍ「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ｖ
ｏｌ．３，ｐ．１（１９８１）、Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ
及びＡ．Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ ｅｄｓ「Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」，Ｖｏｌ．１５３−１
５５（１９８７），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｃ
Ａに記載のものあるいはそのうちに引用された文献に記
載のものなど、あるいは化学修飾法などが挙げられる。
そしてこうして得られたＤＮＡ配列は配列番号２で示さ
れるＤＮＡ配列と実質的に同等のプロモーター活性を示
す限り、それを含有する発現ベクターの開発に同様にし
て用いることが可能である。
【０００８】本発明のシアノバクテリアＰＣＣ７００２
のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡ配
列またはそれと実質的に同等のプロモーター活性を示さ
れるＤＮＡ配列を含有することを特徴とする発現ベクタ
ーは、そのプロモーター領域を実質的にその活性を保持
したまま有するところのＤＮＡ配列を含有する限り特に
制限がない。この発現ベクターのうちには上記ＤＮＡ配
列に加えて、通常用いられる制御あるいはコントロール
のための配列を有していてよい。このような制御あるい
はコントロールのための配列としては、たとえばターミ
ネーター、エンハンサーなどが挙げられる。この発現ベ
クターのうちには、複製起源、選択マーカーなどを有し
ていてよい。この発現ベクターの選択マーカーとして
は、各種抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン耐性
遺伝子、テトラサイクリン遺伝子、ネイマイシン耐性遺
伝子などが挙げられる。これらのものは、各種バクテリ
ア由来のもの、バクテリオファージ由来のもの、昆虫や
哺乳動物細胞を含む動物ウイルス由来の各種の通常用い
られる制御あるいはコントロールのための配列を有して
いてよい。制御あるいはコントロールのための配列とし
ては、各種ウイルスベクター、各種プラスミドベクタ
ー、コスミドベクター、シャトルベクターなどで用いら
れているものが挙げられる。これらベクターとしては、
大腸菌、特にＥＫ型プラスミドベクター、λｇｔタイプ
ファージベクター、シアノバクテリア由来のベクターな
どが挙げられる。これらの遺伝子制御配列は、適宜それ
らを組み合わせたり、あるいは化学的に修飾したりして
ベクターに組み込んで、外来遺伝子をコードする塩基配
列を含むｃＤＮＡ発現用のベクター構築に用いることが
できる。例えば、本発明のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子のプロ
モーター領域のＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等の
プロモーター活性を示されるＤＮＡ配列を含有すること
を特徴とする発現ベクターとして、シアノバクテリアＰ
ＣＣ７００２の内在性プラスミドｐＡＱ１とｐＵＣ１９
とのシャトルベクターの一つ、内在性プラスミドｐＡＱ
１の複製のＯＲＦ１（２８３２塩基対）を含むＤＮＡ断
片（３１５５塩基対）とｐＵＣ１９とのシャトルベクタ
ーｐＡＱＪ４（５８４１塩基対）などが挙げられる。本
発明のプロモーター領域をＯＲＦ１遺伝子の３’下流の
制限酵素ＥｃｏＲＩ部位（ｐＵＣ１９の番号付けに準じ
ると３９６番目の塩基目）に挿入することによって、外
来遺伝子発現用ベクターが構築できる。更に外来遺伝子
の挿入のための制限酵素部位として、プロモーター領域
の３’下流にｃｌａＩ，ＫｐｎＩ，ｓｍａＩ，ＢａｍＨ
Ｉ，ｐｓｔＩ，ＸｂａＩなどをつくり、外来遺伝子の発
現が好ましくなされるようにデザインすることができ
る。
のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡ配
列またはそれと実質的に同等のプロモーター活性を示さ
れるＤＮＡ配列を含有することを特徴とする発現ベクタ
ーは、そのプロモーター領域を実質的にその活性を保持
したまま有するところのＤＮＡ配列を含有する限り特に
制限がない。この発現ベクターのうちには上記ＤＮＡ配
列に加えて、通常用いられる制御あるいはコントロール
のための配列を有していてよい。このような制御あるい
はコントロールのための配列としては、たとえばターミ
ネーター、エンハンサーなどが挙げられる。この発現ベ
クターのうちには、複製起源、選択マーカーなどを有し
ていてよい。この発現ベクターの選択マーカーとして
は、各種抗生物質耐性遺伝子、例えばアンピシリン耐性
遺伝子、テトラサイクリン遺伝子、ネイマイシン耐性遺
伝子などが挙げられる。これらのものは、各種バクテリ
ア由来のもの、バクテリオファージ由来のもの、昆虫や
哺乳動物細胞を含む動物ウイルス由来の各種の通常用い
られる制御あるいはコントロールのための配列を有して
いてよい。制御あるいはコントロールのための配列とし
ては、各種ウイルスベクター、各種プラスミドベクタ
ー、コスミドベクター、シャトルベクターなどで用いら
れているものが挙げられる。これらベクターとしては、
大腸菌、特にＥＫ型プラスミドベクター、λｇｔタイプ
ファージベクター、シアノバクテリア由来のベクターな
どが挙げられる。これらの遺伝子制御配列は、適宜それ
らを組み合わせたり、あるいは化学的に修飾したりして
ベクターに組み込んで、外来遺伝子をコードする塩基配
列を含むｃＤＮＡ発現用のベクター構築に用いることが
できる。例えば、本発明のＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子のプロ
モーター領域のＤＮＡ配列またはそれと実質的に同等の
プロモーター活性を示されるＤＮＡ配列を含有すること
を特徴とする発現ベクターとして、シアノバクテリアＰ
ＣＣ７００２の内在性プラスミドｐＡＱ１とｐＵＣ１９
とのシャトルベクターの一つ、内在性プラスミドｐＡＱ
１の複製のＯＲＦ１（２８３２塩基対）を含むＤＮＡ断
片（３１５５塩基対）とｐＵＣ１９とのシャトルベクタ
ーｐＡＱＪ４（５８４１塩基対）などが挙げられる。本
発明のプロモーター領域をＯＲＦ１遺伝子の３’下流の
制限酵素ＥｃｏＲＩ部位（ｐＵＣ１９の番号付けに準じ
ると３９６番目の塩基目）に挿入することによって、外
来遺伝子発現用ベクターが構築できる。更に外来遺伝子
の挿入のための制限酵素部位として、プロモーター領域
の３’下流にｃｌａＩ，ＫｐｎＩ，ｓｍａＩ，ＢａｍＨ
Ｉ，ｐｓｔＩ，ＸｂａＩなどをつくり、外来遺伝子の発
現が好ましくなされるようにデザインすることができ
る。
【０００９】本発明のＤＮＡ配列またはそれと実質的に
同等のプロモーター活性を示されるＤＮＡ配列を含有す
ることを特徴とする発現ベクターは、これを適当な宿
主、特に宿主細胞に通常知られた方法に従って導入し、
その宿主細胞を形質転換させ、次にそのようにして形質
転換された宿主細胞を培養等の方法によって増殖させる
ことなどにより、大量に形質転換体と呼ばれる該外来遺
伝子を有し、それがコードするタンパク質産生能を有す
る細胞を得ることができる。ここで使用される宿主、特
に宿主細胞としては、大腸菌、シアノバクテリアなどの
グラム陰性細菌が好適に使用できる。上記宿主への発現
ベクターの導入法としては、通常遺伝子組換え技術の分
野で使用せられている方法を用いることができ、例えば
コンピテント細胞と上記ベクターとを混合したり、細胞
をプロトプラスト化したのち、上記ベクターを担体に結
合させて取り込ませるか、あるいはリン酸カルシウム共
沈法、電気パルス法、ウイルスベクター法、マイクロイ
ンジェクション法などを用いて行うことができる。この
ようにして得られた形質転換体の増殖あるいは培養は、
通常の各種細胞培養用培地を用いておこなうことがで
き、そのようなものとしては、例えば炭素源、窒素源、
ビタミン、アミノ酸、核酸塩基、無機塩などを含有し、
適宜肉汁、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、魚肉エ
キス、バレイショ、麦芽汁、抗生物質などを加えたもの
が挙げられるが、好適な培地は一般に広く市販されてい
るものを使用してそれをそのままあるいは適当に改変し
て用いることができる。上記形質転換体の増殖または培
養にあたっては、該形質転換体の生育に適したｐＨ、温
度、通気、光（照度）、撹拌、二酸化炭素濃度、培地交
換の頻度などの条件は実験などにより適宜決定できる。
同等のプロモーター活性を示されるＤＮＡ配列を含有す
ることを特徴とする発現ベクターは、これを適当な宿
主、特に宿主細胞に通常知られた方法に従って導入し、
その宿主細胞を形質転換させ、次にそのようにして形質
転換された宿主細胞を培養等の方法によって増殖させる
ことなどにより、大量に形質転換体と呼ばれる該外来遺
伝子を有し、それがコードするタンパク質産生能を有す
る細胞を得ることができる。ここで使用される宿主、特
に宿主細胞としては、大腸菌、シアノバクテリアなどの
グラム陰性細菌が好適に使用できる。上記宿主への発現
ベクターの導入法としては、通常遺伝子組換え技術の分
野で使用せられている方法を用いることができ、例えば
コンピテント細胞と上記ベクターとを混合したり、細胞
をプロトプラスト化したのち、上記ベクターを担体に結
合させて取り込ませるか、あるいはリン酸カルシウム共
沈法、電気パルス法、ウイルスベクター法、マイクロイ
ンジェクション法などを用いて行うことができる。この
ようにして得られた形質転換体の増殖あるいは培養は、
通常の各種細胞培養用培地を用いておこなうことがで
き、そのようなものとしては、例えば炭素源、窒素源、
ビタミン、アミノ酸、核酸塩基、無機塩などを含有し、
適宜肉汁、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、魚肉エ
キス、バレイショ、麦芽汁、抗生物質などを加えたもの
が挙げられるが、好適な培地は一般に広く市販されてい
るものを使用してそれをそのままあるいは適当に改変し
て用いることができる。上記形質転換体の増殖または培
養にあたっては、該形質転換体の生育に適したｐＨ、温
度、通気、光（照度）、撹拌、二酸化炭素濃度、培地交
換の頻度などの条件は実験などにより適宜決定できる。
【００１０】上記形質転換体を増殖または培養すること
により、本発明のプロモーター領域による外来遺伝子発
現に基づくタンパク質は、通常の操作により分離採取す
ることができる。この分離採取法としては、例えば細胞
の超音波破砕、機械的破砕、凍結及び融解による方法、
浸透圧ショックなどによる方法のほか、培養上清から、
例えばタンパク質沈澱剤を用いて沈澱処理するなどして
分離する方法が挙げられる。上記の分離方法に加えて、
さらに目的とするタンパク質は、その物理的性質や化学
的性質を利用して、一般に広く採用されている各種分離
精製方法を適用して精製することができる。このような
分離精製方法としては、ホモジナイザー超音波細胞破砕
などによる可溶性処理、各種塩類を含んだ緩衝液による
抽出処理、酸またはアルカリによる可溶化あるいは沈澱
処理、さらには有機溶媒による抽出あるいは沈澱処理、
硫安などのタンパク質沈澱剤を用いる塩析、透析、メン
ブレンフィルターなどを用いた限外濾過、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、向流分
配クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、高速液体クロマトグラフィー、等電点あるいはゲ
ル電気泳動などが挙げられ、それらは単独あるいは適宜
組み合わせて用いられる。さらにまた、上記したような
形質転換体から採取されたタンパク質は、必要に応じ適
当な変性、再生処理など、例えば、グアニジン溶液で処
理後透析するなどの、当該分野で知られた方法で、その
活性なものとすることができる。その変性方法として
は、ジチオスレイトールなどによる還元法を利用し、透
析するなどして行うことができる。上記のようにして精
製分離して得られたタンパク質は、塩酸などの酸、ペプ
シン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼなどの
タンパク質分解酵素などで加水分解した後、得られたペ
プチド断片をイオン交換クロマトグラフィーなどのクロ
マトグラフィーにかけて、そのアミノ酸組成を分析する
とともにそのアミノ酸配列を決定することができる。上
記遺伝子組換え技術に用いられる方法は、Ｔ．Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ」．ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．（１９８
２）に記載された方法あるいはそこに引用された文献に
記載された方法、さらにはそれらを適宜改変した方法に
よって行うことができるが、本発明の目的作用効果を果
たす範囲内で適宜改変して適用することも許容される。
により、本発明のプロモーター領域による外来遺伝子発
現に基づくタンパク質は、通常の操作により分離採取す
ることができる。この分離採取法としては、例えば細胞
の超音波破砕、機械的破砕、凍結及び融解による方法、
浸透圧ショックなどによる方法のほか、培養上清から、
例えばタンパク質沈澱剤を用いて沈澱処理するなどして
分離する方法が挙げられる。上記の分離方法に加えて、
さらに目的とするタンパク質は、その物理的性質や化学
的性質を利用して、一般に広く採用されている各種分離
精製方法を適用して精製することができる。このような
分離精製方法としては、ホモジナイザー超音波細胞破砕
などによる可溶性処理、各種塩類を含んだ緩衝液による
抽出処理、酸またはアルカリによる可溶化あるいは沈澱
処理、さらには有機溶媒による抽出あるいは沈澱処理、
硫安などのタンパク質沈澱剤を用いる塩析、透析、メン
ブレンフィルターなどを用いた限外濾過、ゲル濾過クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、向流分
配クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、高速液体クロマトグラフィー、等電点あるいはゲ
ル電気泳動などが挙げられ、それらは単独あるいは適宜
組み合わせて用いられる。さらにまた、上記したような
形質転換体から採取されたタンパク質は、必要に応じ適
当な変性、再生処理など、例えば、グアニジン溶液で処
理後透析するなどの、当該分野で知られた方法で、その
活性なものとすることができる。その変性方法として
は、ジチオスレイトールなどによる還元法を利用し、透
析するなどして行うことができる。上記のようにして精
製分離して得られたタンパク質は、塩酸などの酸、ペプ
シン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼなどの
タンパク質分解酵素などで加水分解した後、得られたペ
プチド断片をイオン交換クロマトグラフィーなどのクロ
マトグラフィーにかけて、そのアミノ酸組成を分析する
とともにそのアミノ酸配列を決定することができる。上
記遺伝子組換え技術に用いられる方法は、Ｔ．Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ」．ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．（１９８
２）に記載された方法あるいはそこに引用された文献に
記載された方法、さらにはそれらを適宜改変した方法に
よって行うことができるが、本発明の目的作用効果を果
たす範囲内で適宜改変して適用することも許容される。
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００１１】実施例１．シアノバクテリアＰＣＣ７００
２染色体ＤＮＡの調製 シアノバクテリアＰＣＣ７００２湿菌体３ｇを５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０％ グルコース、１０
０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１０ｍｌに懸濁後、凍結融解処理
（−８５℃、３０分放置→３７℃、３０分放置）し、遠
心によって菌体を回収した。次にリゾチーム（１０ｍｇ
／ｍｌ）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１
０％ グルコース、１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液８ｍｌに
懸濁して３７℃で３０分間放置後、１０％ Ｎ−ラウロ
イルサルコシンナトリウム ０．８ｍｌ加えた。３７℃
で１５分間放置後、塩化セシウムを１ｇ／ｍ１になるよ
うに加えセシウム密度勾配遠心した。遠心後染色休ＤＮ
Ａ分画を電気泳動によって確認した後、２−ブタノール
で３回抽出し、さらにＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））２１で２回透析する
ことによって塩化セシウムを除去した。エタノール沈澱
処理によって染色体ＤＮＡを精製し、ＴＥ溶液１．５ｍ
ｌ（約２００μｇ／ｍｌ）に懸濁した。
２染色体ＤＮＡの調製 シアノバクテリアＰＣＣ７００２湿菌体３ｇを５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０％ グルコース、１０
０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１０ｍｌに懸濁後、凍結融解処理
（−８５℃、３０分放置→３７℃、３０分放置）し、遠
心によって菌体を回収した。次にリゾチーム（１０ｍｇ
／ｍｌ）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１
０％ グルコース、１００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液８ｍｌに
懸濁して３７℃で３０分間放置後、１０％ Ｎ−ラウロ
イルサルコシンナトリウム ０．８ｍｌ加えた。３７℃
で１５分間放置後、塩化セシウムを１ｇ／ｍ１になるよ
うに加えセシウム密度勾配遠心した。遠心後染色休ＤＮ
Ａ分画を電気泳動によって確認した後、２−ブタノール
で３回抽出し、さらにＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、
１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））２１で２回透析する
ことによって塩化セシウムを除去した。エタノール沈澱
処理によって染色体ＤＮＡを精製し、ＴＥ溶液１．５ｍ
ｌ（約２００μｇ／ｍｌ）に懸濁した。
【００１２】実施例２．シアノバクテリアＰＣＣ７００
２遺伝子ライブラリーの作製 実施例１．で得られたシアノバクテリアＰＣＣ７００２
の染色体ＤＮＡ ２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝
酒造（株））で１０〜２０キロ塩基対程度の大きさにな
るように部分分解し、エタノール沈澱処理によって精製
した。部分分解した染色休ＤＮＡ １μｇに対し制限酵
素ＢａｍＨＩで切断されたλＤＡＳＨＩＩ（ストラトジ
ーン社） １μｇを加えた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造（株））を用いて４℃、１晩反応させた。１０〜２
０キロ塩基対の挿入断片をもつλＤＡＳＨＩＩが選択的
にパッケージされるキット（Ｇｉｇａｐａｃｋ ＸＬ；
ストラトジーン社）を用いて７．２ｘ１０６ｐｆｕ／μ
ｇのシアノバクテリアＰＣＣ７００２の遺伝子ライブラ
リーを作製した。
２遺伝子ライブラリーの作製 実施例１．で得られたシアノバクテリアＰＣＣ７００２
の染色体ＤＮＡ ２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝
酒造（株））で１０〜２０キロ塩基対程度の大きさにな
るように部分分解し、エタノール沈澱処理によって精製
した。部分分解した染色休ＤＮＡ １μｇに対し制限酵
素ＢａｍＨＩで切断されたλＤＡＳＨＩＩ（ストラトジ
ーン社） １μｇを加えた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造（株））を用いて４℃、１晩反応させた。１０〜２
０キロ塩基対の挿入断片をもつλＤＡＳＨＩＩが選択的
にパッケージされるキット（Ｇｉｇａｐａｃｋ ＸＬ；
ストラトジーン社）を用いて７．２ｘ１０６ｐｆｕ／μ
ｇのシアノバクテリアＰＣＣ７００２の遺伝子ライブラ
リーを作製した。
【００１３】実施例３．オリゴヌクレオチドの作製 ２種類のシアノバクテリア、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ６
３０１（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ・Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０，４０５０
（１９８３））、Ａｎａｂｅｎａ ７１２０（Ｃｕｒｔ
ｉｓ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ Ｒ．Ｈａｓｅｌｋｏｒｎ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０，１８３５
（１９８３））においては、既にそのＲｕｂｉｓｃｏの
ラージサブユニットのアミノ酸配列は決定されている。
このラージサブユニットに存在する共通のアミノ酸配列
を利用して、コドン表にしたがって２種類の混合オリゴ
ヌクレオチドプライマーを設計し、ＤＮＡシンセサイザ
ー３８１Ａ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて
化学合成した。プライマーの配列は次のように設計し
た。
３０１（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏｃ・Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０，４０５０
（１９８３））、Ａｎａｂｅｎａ ７１２０（Ｃｕｒｔ
ｉｓ，Ｓ．Ｅ．ａｎｄ Ｒ．Ｈａｓｅｌｋｏｒｎ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０，１８３５
（１９８３））においては、既にそのＲｕｂｉｓｃｏの
ラージサブユニットのアミノ酸配列は決定されている。
このラージサブユニットに存在する共通のアミノ酸配列
を利用して、コドン表にしたがって２種類の混合オリゴ
ヌクレオチドプライマーを設計し、ＤＮＡシンセサイザ
ー３８１Ａ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて
化学合成した。プライマーの配列は次のように設計し
た。
【００１４】実施例４．ＰＣＲによるプローブＤＮＡの
調製 シアノバクテリアＰＣＣ７００２のＲｕｂｉｓｃｏのラ
ージサブユニット遺伝子の一部を増幅するためＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）法を適用し
た。シアノバクテリアＰＣＣ７００２のＲｕｂｉｓｃｏ
のラージサブユニット遺伝子の一部を以下の方法で調製
した。鋳型として実施例１．で得られた染色体ＤＮＡ
１００ｎｇを用い、プライマーとして実施例３．で得ら
れた２種類の混合オリゴヌクレオチド 各１μＭを用
い、ｄＮＴｐ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ） 各２００μＭ、１ｘＰＣＲ反応液（宝酒造
（株））、アンプリタック ２．５ユニットを含む１０
０μｌの反応液をＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキ
ン・エルマー・シータス社）で変性９４℃−アニーリン
グ５０℃−伸長反応７２℃の条件で３２回反応を繰り返
した。こうして得られた生成物、１０μｌを１％アガロ
ースゲル（シグマ社）で電気泳動し、反応生成物を解析
した。約４００塩基対のＤＮＡ断片が観察され、１％低
融点アガロースゲル（ベゼスタ・リサーチ・ラボラトリ
ー社：ＢＲＬ社）を用いて約４００塩基対のＤＮＡ断片
を既知の方法にしたがって精製した。精製したＤＮＡ断
片をＤＮＡブランティングキット（宝酒造（株））を用
いて平滑末端化した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造（株））を用いて５’末端をリン酸化し、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ Ｋｓ（−）（ストラトジーン
社）のＳｍａＩ部位に挿入した。得られたベクターを用
いて常法にしたがって大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し
た後、約４００塩基対のＤＮＡ断片をもつクローンを選
別し、塩基配列を決定した。コドン表にしたがってアミ
ノ酸に変換した後、既知のＲｕｂｉｓｃｏのラージサブ
ユニットと比較した結果、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ６３
０１、及びＡｎａｂｅｎａ ７１２０のラージサブユニ
ットのアミノ酸配列に対し、ともに約８８％の高い相同
性が得られた。こうしてＰＣＲによって増幅されたＤＮ
Ａ断片は、シアノバクテリアＰＣＣ７００２のＲｕｂｉ
ｓｃｏのラージサブユニット遺伝子の一部であることが
判明した。上記した組換え体より制限酵素ＸｂａＩ及び
ＥｃｏＲＩ切断によって得られるＤＮＡ断片を低融点ア
ガロースゲル（ベゼスタ・リサーチ・ラボラトリー社：
ＢＲＬ社）電気泳動によって精製し、ランダムプライマ
ーＤＮＡラベリングキット（宝酒造（株））を用いて
３２Ｐ標識されたＤＮＡ断片を調製した。
調製 シアノバクテリアＰＣＣ７００２のＲｕｂｉｓｃｏのラ
ージサブユニット遺伝子の一部を増幅するためＰＣＲ
（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）法を適用し
た。シアノバクテリアＰＣＣ７００２のＲｕｂｉｓｃｏ
のラージサブユニット遺伝子の一部を以下の方法で調製
した。鋳型として実施例１．で得られた染色体ＤＮＡ
１００ｎｇを用い、プライマーとして実施例３．で得ら
れた２種類の混合オリゴヌクレオチド 各１μＭを用
い、ｄＮＴｐ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ） 各２００μＭ、１ｘＰＣＲ反応液（宝酒造
（株））、アンプリタック ２．５ユニットを含む１０
０μｌの反応液をＤＮＡサーマル・サイクラー（パーキ
ン・エルマー・シータス社）で変性９４℃−アニーリン
グ５０℃−伸長反応７２℃の条件で３２回反応を繰り返
した。こうして得られた生成物、１０μｌを１％アガロ
ースゲル（シグマ社）で電気泳動し、反応生成物を解析
した。約４００塩基対のＤＮＡ断片が観察され、１％低
融点アガロースゲル（ベゼスタ・リサーチ・ラボラトリ
ー社：ＢＲＬ社）を用いて約４００塩基対のＤＮＡ断片
を既知の方法にしたがって精製した。精製したＤＮＡ断
片をＤＮＡブランティングキット（宝酒造（株））を用
いて平滑末端化した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造（株））を用いて５’末端をリン酸化し、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ Ｋｓ（−）（ストラトジーン
社）のＳｍａＩ部位に挿入した。得られたベクターを用
いて常法にしたがって大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し
た後、約４００塩基対のＤＮＡ断片をもつクローンを選
別し、塩基配列を決定した。コドン表にしたがってアミ
ノ酸に変換した後、既知のＲｕｂｉｓｃｏのラージサブ
ユニットと比較した結果、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ６３
０１、及びＡｎａｂｅｎａ ７１２０のラージサブユニ
ットのアミノ酸配列に対し、ともに約８８％の高い相同
性が得られた。こうしてＰＣＲによって増幅されたＤＮ
Ａ断片は、シアノバクテリアＰＣＣ７００２のＲｕｂｉ
ｓｃｏのラージサブユニット遺伝子の一部であることが
判明した。上記した組換え体より制限酵素ＸｂａＩ及び
ＥｃｏＲＩ切断によって得られるＤＮＡ断片を低融点ア
ガロースゲル（ベゼスタ・リサーチ・ラボラトリー社：
ＢＲＬ社）電気泳動によって精製し、ランダムプライマ
ーＤＮＡラベリングキット（宝酒造（株））を用いて
３２Ｐ標識されたＤＮＡ断片を調製した。
【００１５】実施例５．プラークハイブリダイゼーショ
ン法による遺伝子ライブラリーのスクリーニング 実施例２．で得られたシアノバクテリアＰＣＣ７００２
の遺伝子ライブラリー、合計２万個のプラークを既知の
方法にしたがってナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−
Ｎ：アマシャム）に固定化し、実施例４．で得られたプ
ローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを行っ
た。実施例２．で得られたシアノバクテリアＰＣＣ７０
０２の遺伝子ライブラリー、合計２万個のプラークを
０．０５Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．４）、０．
７５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ 牛血
清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニ
ルプロリドン、１００μｇ／ｍｌ 鮭精子ＤＮＡ、０．
５％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中で６０℃、
４時間プレハイブリダイゼーションを行った後、実施例
４．で得られた標識プローブを加えてプラークハイブリ
ダイゼーションを行った。６０℃で一晩保温した後、２
ｘＳＳＣ（０．０３Ｍ クエン酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ）を用いて室温で１０分間、４回洗浄を繰り返
し、さらに６５℃で１０分間洗浄した。風乾後、Ｘ−Ｏ
ＭＡＴＴＭＡＲフィルム（コダック社）を用いて−７０
℃で一晩オートラジオグラフィーを行った結果、約５０
０個の陽性クローンを得た。得られた５００個の陽性ク
ローンについて同様な操作を２回繰り返した結果、最終
的に３個の陽性クローン（Ｎｏ．２７，２８，３２）を
得ることができた。得られた３種類の陽性クローンより
既知の方法にしたがってファージＤＮＡを調製した。
ン法による遺伝子ライブラリーのスクリーニング 実施例２．で得られたシアノバクテリアＰＣＣ７００２
の遺伝子ライブラリー、合計２万個のプラークを既知の
方法にしたがってナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−
Ｎ：アマシャム）に固定化し、実施例４．で得られたプ
ローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを行っ
た。実施例２．で得られたシアノバクテリアＰＣＣ７０
０２の遺伝子ライブラリー、合計２万個のプラークを
０．０５Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ ７．４）、０．
７５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ 牛血
清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニ
ルプロリドン、１００μｇ／ｍｌ 鮭精子ＤＮＡ、０．
５％ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中で６０℃、
４時間プレハイブリダイゼーションを行った後、実施例
４．で得られた標識プローブを加えてプラークハイブリ
ダイゼーションを行った。６０℃で一晩保温した後、２
ｘＳＳＣ（０．０３Ｍ クエン酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ）を用いて室温で１０分間、４回洗浄を繰り返
し、さらに６５℃で１０分間洗浄した。風乾後、Ｘ−Ｏ
ＭＡＴＴＭＡＲフィルム（コダック社）を用いて−７０
℃で一晩オートラジオグラフィーを行った結果、約５０
０個の陽性クローンを得た。得られた５００個の陽性ク
ローンについて同様な操作を２回繰り返した結果、最終
的に３個の陽性クローン（Ｎｏ．２７，２８，３２）を
得ることができた。得られた３種類の陽性クローンより
既知の方法にしたがってファージＤＮＡを調製した。
【００１６】実施例６．遺伝子ライブラリー解析（１） Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を
解析するため、実施例５．で調製した陽性クローンＮ
ｏ．２８のファージＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造
（株））で切断した。５種類のＤＮＡ断片が観察され、
低融点アガロースゲル電気泳動を用いて各ＤＮＡ断片を
既知の方法にしたがって単離、精製した。実施例２．で
得られたオリゴヌクレオチドをプライマーとして各ＤＮ
Ａ断片についてＰＣＲをおこなった結果、約４キロ塩基
対のＤＮＡ断片にＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子が存在している
ことが明らかとなった。Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子が含まれ
ていると推定される約４キロ塩基対のＤＮＡ断片をｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）（ストラトジーン
社）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を
用いて挿入した後、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ベゼス
タ・リサーチ・ラボラトリー社：ＢＲＬ社）を用いたデ
ィレーションミュータント法およびプライマーイクステ
ンション法を用いて相補鎖確認を含めて全塩基配列を決
定した。
解析するため、実施例５．で調製した陽性クローンＮ
ｏ．２８のファージＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造
（株））で切断した。５種類のＤＮＡ断片が観察され、
低融点アガロースゲル電気泳動を用いて各ＤＮＡ断片を
既知の方法にしたがって単離、精製した。実施例２．で
得られたオリゴヌクレオチドをプライマーとして各ＤＮ
Ａ断片についてＰＣＲをおこなった結果、約４キロ塩基
対のＤＮＡ断片にＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子が存在している
ことが明らかとなった。Ｒｕｂｉｓｃｏ遺伝子が含まれ
ていると推定される約４キロ塩基対のＤＮＡ断片をｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（−）（ストラトジーン
社）にＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株））を
用いて挿入した後、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ベゼス
タ・リサーチ・ラボラトリー社：ＢＲＬ社）を用いたデ
ィレーションミュータント法およびプライマーイクステ
ンション法を用いて相補鎖確認を含めて全塩基配列を決
定した。
【００１７】実施例７．遺伝子ライブラリー解析（２） 全塩基配列を決定した結果、Ｒｕｂｉｓｃｏのラージサ
ブユニット遺伝子のオープンリーディングフレームは、
配列表の配列番号１で示される第９６３番目から第２３
７８番目の塩基までであり、全塩基配列および全アミノ
酸配列はそれぞれ配列番号５、及び６で示される。また
スモールサブユニット遺伝子のオープンリーディングフ
レームは、配列表の配列番号１で示される第２８８２番
目から第３２１７番目の塩基までであり、全塩基配列お
よび全アミノ酸配列はそれぞれ配列番号９、及び１０で
示される。既知のアミノ酸配列（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ
６３０１、Ａｎａｂｅｎａ ７１２０）と比較した結
果、ラージサブユニットに関して約８８％の高い相同性
が得られたが、スモールサブユニットに関しては約６６
％の低い相同性しか得られなかった。さらに両サブユニ
ット遺伝子の間にはリーディングフレーム２（配列表の
配列番号１で示される第２４４７番目から第２８５１番
目の塩基までのリーディングフレーム）のほか、Ｒｕｂ
ｉｓｃｏ遺伝子の５’上流および３’下流に２種類のリ
ーディングフレーム、すなわちリーディングフレーム３
（配列表の配列番号１で示される第４５番目から第３４
４番目の塩基までのリーディングフレーム）とリーディ
ングフレーム１（配列表の配列番号１で示される第３３
７９番目から第４００５番目の塩基までのリーディング
フレーム）が存在している。これらのＤＮＡ塩基配列お
よびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３、４（リーデ
ィングフレーム１）、配列番号７、８（リーディングフ
レーム２）、配列番号１１、及び１２（リーディングフ
レーム３）で示され、データベース（ＤＮＡＳＩＳ、日
立）を用いて検索した結果、３種類のリーディングフレ
ームはすべて新規のタンパク質をコードしていた。これ
ら３種類のリーディングフレームがコードしているタン
パク質は、ラージサブユニットとスモールサブユニット
との複合体形成、あるいは二酸化炭素輸送系に関与して
いると示唆しうる。
ブユニット遺伝子のオープンリーディングフレームは、
配列表の配列番号１で示される第９６３番目から第２３
７８番目の塩基までであり、全塩基配列および全アミノ
酸配列はそれぞれ配列番号５、及び６で示される。また
スモールサブユニット遺伝子のオープンリーディングフ
レームは、配列表の配列番号１で示される第２８８２番
目から第３２１７番目の塩基までであり、全塩基配列お
よび全アミノ酸配列はそれぞれ配列番号９、及び１０で
示される。既知のアミノ酸配列（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ
６３０１、Ａｎａｂｅｎａ ７１２０）と比較した結
果、ラージサブユニットに関して約８８％の高い相同性
が得られたが、スモールサブユニットに関しては約６６
％の低い相同性しか得られなかった。さらに両サブユニ
ット遺伝子の間にはリーディングフレーム２（配列表の
配列番号１で示される第２４４７番目から第２８５１番
目の塩基までのリーディングフレーム）のほか、Ｒｕｂ
ｉｓｃｏ遺伝子の５’上流および３’下流に２種類のリ
ーディングフレーム、すなわちリーディングフレーム３
（配列表の配列番号１で示される第４５番目から第３４
４番目の塩基までのリーディングフレーム）とリーディ
ングフレーム１（配列表の配列番号１で示される第３３
７９番目から第４００５番目の塩基までのリーディング
フレーム）が存在している。これらのＤＮＡ塩基配列お
よびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３、４（リーデ
ィングフレーム１）、配列番号７、８（リーディングフ
レーム２）、配列番号１１、及び１２（リーディングフ
レーム３）で示され、データベース（ＤＮＡＳＩＳ、日
立）を用いて検索した結果、３種類のリーディングフレ
ームはすべて新規のタンパク質をコードしていた。これ
ら３種類のリーディングフレームがコードしているタン
パク質は、ラージサブユニットとスモールサブユニット
との複合体形成、あるいは二酸化炭素輸送系に関与して
いると示唆しうる。
【００１８】実施例８．Ｒｕｂｉｓｃｏのプロモーター
領域の決定（１） プロモーター領域を決定するため、ｐＫＫ２３２−８
（ファルマシア ＬＫＢバイオテクノロジー社）を用い
たＣＡＴアッセイを行った。Ｒｕｂｉｓｃｏのラージサ
ブユニット遺伝子の翻訳開始点より５’上流領域にプロ
モーター領域が存在することが解析結果より明らかとな
ったため、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ベゼスタ・リサ
ーチ・ラボラトリー社：ＢＲＬ社）を用いて５’上流領
域の長さが異なる４種類のＤＮＡ断片、Ａ（配列表の配
列番号１で示される第１番目から第８２６番目の塩基ま
でのＤＮＡ断片）、Ｂ（配列表の配列番号１で示される
第１番目から第７８９番目の塩基までのＤＮＡ断片）、
Ｃ（配列表の配列番号１で示される第１番目から第５４
１番目の塩基までのＤＮＡ断片）、Ｄ（配列表の配列番
号１で示される第１番目から第１７５番目の塩基までの
ＤＮＡ断片）を調製した。調製した各ＤＮＡ断片をｐＫ
Ｋ２３２−８に挿入し、得られた組換え体をクロラムフ
ェニコールが添加されたプレート上でプロモーター活性
を測定した。プロモーター領域を含んだＤＮＡ断片が挿
入された組換え体はクロラムフェニコール分解酵素が発
現するため、クロラムフェニコールを含む寒天プレート
上でコロニーを形成することができる。一方プロモータ
ー領域を含まないＤＮＡ断片が挿入された組換え体はク
ロラムフェニコール分解酵素が発現しないため、クロラ
ムフェニコールを含む寒天プレート上でコロニーを形成
することができない。クロラムフェニコール濃度の異な
る４種類のプレート（１．３６μｇ／ｍｌ、６．８μｇ
／ｍｌ、３４μｇ／ｍｌ、１７０μｇ／ｍｌ）を用いて
プロモーター活性を測定した結果、約８３０塩基対の長
さをもつＤＮＡ断片（Ａ）にプロモーター領域が含まれ
ていることが明らかとなった。
領域の決定（１） プロモーター領域を決定するため、ｐＫＫ２３２−８
（ファルマシア ＬＫＢバイオテクノロジー社）を用い
たＣＡＴアッセイを行った。Ｒｕｂｉｓｃｏのラージサ
ブユニット遺伝子の翻訳開始点より５’上流領域にプロ
モーター領域が存在することが解析結果より明らかとな
ったため、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ベゼスタ・リサ
ーチ・ラボラトリー社：ＢＲＬ社）を用いて５’上流領
域の長さが異なる４種類のＤＮＡ断片、Ａ（配列表の配
列番号１で示される第１番目から第８２６番目の塩基ま
でのＤＮＡ断片）、Ｂ（配列表の配列番号１で示される
第１番目から第７８９番目の塩基までのＤＮＡ断片）、
Ｃ（配列表の配列番号１で示される第１番目から第５４
１番目の塩基までのＤＮＡ断片）、Ｄ（配列表の配列番
号１で示される第１番目から第１７５番目の塩基までの
ＤＮＡ断片）を調製した。調製した各ＤＮＡ断片をｐＫ
Ｋ２３２−８に挿入し、得られた組換え体をクロラムフ
ェニコールが添加されたプレート上でプロモーター活性
を測定した。プロモーター領域を含んだＤＮＡ断片が挿
入された組換え体はクロラムフェニコール分解酵素が発
現するため、クロラムフェニコールを含む寒天プレート
上でコロニーを形成することができる。一方プロモータ
ー領域を含まないＤＮＡ断片が挿入された組換え体はク
ロラムフェニコール分解酵素が発現しないため、クロラ
ムフェニコールを含む寒天プレート上でコロニーを形成
することができない。クロラムフェニコール濃度の異な
る４種類のプレート（１．３６μｇ／ｍｌ、６．８μｇ
／ｍｌ、３４μｇ／ｍｌ、１７０μｇ／ｍｌ）を用いて
プロモーター活性を測定した結果、約８３０塩基対の長
さをもつＤＮＡ断片（Ａ）にプロモーター領域が含まれ
ていることが明らかとなった。
【００１９】実施例９．Ｒｕｂｉｓｃｏのプロモーター
領域の決定（２） 制限酵素切断によってＲｕｂｉｓｃｏのラージサブユニ
ット遺伝子の翻訳開始点の直前−１塩基（配列表の配列
番号１で示されるＤＮＡ配列の第９６２番目の塩基）か
ら−３０４塩基（配列表の配列番号１で示される第６５
９番目の塩基）のＥＣｏＲＩ部位までの３０４塩基対の
ＤＮＡ断片を調製し、ｐＫＫ２３２−８に挿入した。得
られた組換え体と実施例８．で得られた組換え体を用い
てクロラムフェニコール濃度の異なる４種類（１．３６
μｇ／ｍｌ、６．８μｇ／ｍｌ、３４μｇ／ｍｌ、１７
０μｇ／ｍｌ）のプレート上でそれぞれのプロモーター
活性を測定した。今回調製した組換え体は高濃度のクロ
ラムフェニコール（１７０μｇ／ｍｌ）存在下でも容易
にコロニーを形成できることから、挿入した３０４塩基
対のＤＮＡ断片にプロモーター領域が存在することが明
らかとなった。
領域の決定（２） 制限酵素切断によってＲｕｂｉｓｃｏのラージサブユニ
ット遺伝子の翻訳開始点の直前−１塩基（配列表の配列
番号１で示されるＤＮＡ配列の第９６２番目の塩基）か
ら−３０４塩基（配列表の配列番号１で示される第６５
９番目の塩基）のＥＣｏＲＩ部位までの３０４塩基対の
ＤＮＡ断片を調製し、ｐＫＫ２３２−８に挿入した。得
られた組換え体と実施例８．で得られた組換え体を用い
てクロラムフェニコール濃度の異なる４種類（１．３６
μｇ／ｍｌ、６．８μｇ／ｍｌ、３４μｇ／ｍｌ、１７
０μｇ／ｍｌ）のプレート上でそれぞれのプロモーター
活性を測定した。今回調製した組換え体は高濃度のクロ
ラムフェニコール（１７０μｇ／ｍｌ）存在下でも容易
にコロニーを形成できることから、挿入した３０４塩基
対のＤＮＡ断片にプロモーター領域が存在することが明
らかとなった。
【００２０】実施例９．Ｒｕｂｉｓｃｏのプロモーター
領域の決定（３） 実施例７．で得られた４種類の形質転換体及び実施例
８．で得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培
地で３７℃、一晩培養した後、遠心によって菌体（７．
５ｘ１０８細胞）を回収した。抽出溶液（９．５ｍｌ
Ｈ２Ｏ、０．５ｍｌ １Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．
０）、３μｌ ０．１Ｍ ジチオスレイトール）５００
μｌに懸濁した後超音波破砕し、遠心によって可溶性タ
ンパク質画分を調製した。プロモーター領域を含んだＤ
ＮＡ断片が挿入されたＤＮＡをもつ形質転換体はクロラ
ムフェニコール分解酵素を産生するため、可溶性タンパ
ク質画分の酵素活性を測定することによってプロモータ
ー活性を測定できる。５種類の形質転換体の酵素活性を
測定した結果、約８３０塩基対のＤＮＡ断片（Ａ）及び
３０４塩基対のＤＮＡ断片にプロモーター領域が存在す
ることが明らかとなった。それぞれの酵素活性は約２０
ユニット／１０８細胞、約７０ユニット／１０８細胞と
なり、特に３０４塩基対のＤＮＡ断片に非常に高い活姓
をもつプロモーター領域が存在し、その発現は大腸菌内
でも作用することが明らかとなった。また得られた３０
４塩基対のＤＮＡ断片はシアノバクテリアＰＣＣ７００
２の内在性プラスミドｐＡＱ１とｐＵＣ１９とのシャト
ルベクターの一つ、内在性プラスミドｐＡＱ１の複製の
ＯＲＦ１（２８３２塩基対）を含むＤＮＡ断片（３１５
５塩基対）とｐＵＣ１９とのシャトルベクターｐＡＱＪ
４（５８４１塩基対）に挿入して外来遺伝子発現用ベク
ターなどを作成するに用いることができよう。特にこの
得られた３０４塩基対のＤＮＡ断片をＯＲＦ１遺伝子の
３’下流の制限酵素ＥｃｏＲＩ部位（ｐＵＣ１９の番号
付けに準じると３９６番目の塩基目）に挿入することに
よって、外来遺伝子発現用ベクターが構築できる。更に
好ましくこの得られた３０４塩基対のＤＮＡ断片をもつ
外来遺伝子発現用ベクターは、外来遺伝子の挿入のため
の制限酵素部位として、プロモーター領域の３，下流に
ｃｌａＩ，ＫｐｎＩ，ＳｍａＩ，ＢａｍＨＩ，Ｐｓｔ
Ｉ，ＸｂａＩなどをつくり、外来遺伝子の発現が好まし
くなされるようにデザインすることができる。
領域の決定（３） 実施例７．で得られた４種類の形質転換体及び実施例
８．で得られた形質転換体をアンピシリンを含むＬＢ培
地で３７℃、一晩培養した後、遠心によって菌体（７．
５ｘ１０８細胞）を回収した。抽出溶液（９．５ｍｌ
Ｈ２Ｏ、０．５ｍｌ １Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．
０）、３μｌ ０．１Ｍ ジチオスレイトール）５００
μｌに懸濁した後超音波破砕し、遠心によって可溶性タ
ンパク質画分を調製した。プロモーター領域を含んだＤ
ＮＡ断片が挿入されたＤＮＡをもつ形質転換体はクロラ
ムフェニコール分解酵素を産生するため、可溶性タンパ
ク質画分の酵素活性を測定することによってプロモータ
ー活性を測定できる。５種類の形質転換体の酵素活性を
測定した結果、約８３０塩基対のＤＮＡ断片（Ａ）及び
３０４塩基対のＤＮＡ断片にプロモーター領域が存在す
ることが明らかとなった。それぞれの酵素活性は約２０
ユニット／１０８細胞、約７０ユニット／１０８細胞と
なり、特に３０４塩基対のＤＮＡ断片に非常に高い活姓
をもつプロモーター領域が存在し、その発現は大腸菌内
でも作用することが明らかとなった。また得られた３０
４塩基対のＤＮＡ断片はシアノバクテリアＰＣＣ７００
２の内在性プラスミドｐＡＱ１とｐＵＣ１９とのシャト
ルベクターの一つ、内在性プラスミドｐＡＱ１の複製の
ＯＲＦ１（２８３２塩基対）を含むＤＮＡ断片（３１５
５塩基対）とｐＵＣ１９とのシャトルベクターｐＡＱＪ
４（５８４１塩基対）に挿入して外来遺伝子発現用ベク
ターなどを作成するに用いることができよう。特にこの
得られた３０４塩基対のＤＮＡ断片をＯＲＦ１遺伝子の
３’下流の制限酵素ＥｃｏＲＩ部位（ｐＵＣ１９の番号
付けに準じると３９６番目の塩基目）に挿入することに
よって、外来遺伝子発現用ベクターが構築できる。更に
好ましくこの得られた３０４塩基対のＤＮＡ断片をもつ
外来遺伝子発現用ベクターは、外来遺伝子の挿入のため
の制限酵素部位として、プロモーター領域の３，下流に
ｃｌａＩ，ＫｐｎＩ，ＳｍａＩ，ＢａｍＨＩ，Ｐｓｔ
Ｉ，ＸｂａＩなどをつくり、外来遺伝子の発現が好まし
くなされるようにデザインすることができる。
【発明の効果】シアノバクテリアにおける他生物遺伝子
の発現をより確実に且つより容易に行なわしめると共
に、大気中に過剰に存在する二酸化炭素を有効に利用す
ることを可能とする。
の発現をより確実に且つより容易に行なわしめると共
に、大気中に過剰に存在する二酸化炭素を有効に利用す
ることを可能とする。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 杉本 正昭 兵庫県尼崎市若王子３丁目11番20号 関西 電力株式会社総合技術研究所環境技術研究 センター内 (72)発明者 秋山 英雄 神奈川県鎌倉市手広1111番地 株式会社東 レリサーチセンター生物科学研究部内 (72)発明者 金井 正三 神奈川県鎌倉市手広1111番地 株式会社東 レリサーチセンター生物科学研究部内
Claims (14)
- 【請求項１】 配列番号２で示されるＤＮＡ配列または
それと実質的に同等のプロモーター活性を示すＤＮＡ配
列。 - 【請求項２】 配列番号２で示されるＤＮＡ配列または
それと実質的に同等のプロモーター活性を示すＤＮＡ配
列を含有することを特徴とする発現ベクター。 - 【請求項３】 配列番号２で示されるＤＮＡ配列または
それと実質的に同等のプロモーター活性を示すＤＮＡ配
列を含有する発現ベクターで形質転換せしめられた形質
転換体。 - 【請求項４】 該形質転換体が、大腸菌またはシアノバ
クテリア菌を形質転換して得られたものである請求項３
記載の形質転換体。 - 【請求項５】 配列番号３で示されるＤＮＡ配列または
それと実質的に同等の二酸化炭素固定に関与する遺伝子
領域の活性を示すＤＮＡ配列。 - 【請求項６】 配列番号４で示されるアミノ酸配列また
はそれと実質的に同等の二酸化炭素固定に関与する活性
を示すアミノ酸配列。 - 【請求項７】 配列番号５で示されるＤＮＡ配列または
それと実質的に同等の二酸化炭素固定に関与する遺伝子
領域の活性を示すＤＮＡ配列。 - 【請求項８】 配列番号６で示されるアミノ酸配列また
はそれと実質的に同等の二酸化炭素固定に関与する活性
を示すアミノ酸配列。 - 【請求項９】 配列番号７で示されるＤＮＡ配列または
それと実質的に同等の二酸化炭素固定に関与する遺伝子
領域の活性を示すＤＮＡ配列。 - 【請求項１０】 配列番号８で示されるアミノ酸配列ま
たはそれと実質的に同等の二酸化炭素固定に関与する活
性を示すアミノ酸配列。 - 【請求項１１】 配列番号９で示されるＤＮＡ配列また
はそれと実質的に同等の二酸化炭素固定に関与する遺伝
子領域の活性を示すＤＮＡ配列。 - 【請求項１２】 配列番号１０で示されるアミノ酸配列
またはそれと実質的に同等の二酸化炭素固定に関与する
活性を示すアミノ酸配列。 - 【請求項１３】 配列番号１１で示されるＤＮＡ配列ま
たはそれと実質的に同等の二酸化炭素固定に関与する遺
伝子領域の活性を示すＤＮＡ配列。 - 【請求項１４】 配列番号１２で示されるアミノ酸配列
またはそれと実質的に同等の二酸化炭素固定に関与する
活性を示すアミノ酸配列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5184304A JPH0779782A (ja) | 1993-06-18 | 1993-06-18 | シネココッカスｐｃｃ７００２由来ルビスコ（リブロース １，５−ビスホスフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）遺伝子のプロモーター配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5184304A JPH0779782A (ja) | 1993-06-18 | 1993-06-18 | シネココッカスｐｃｃ７００２由来ルビスコ（リブロース １，５−ビスホスフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）遺伝子のプロモーター配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0779782A true JPH0779782A (ja) | 1995-03-28 |
Family
ID=16150998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5184304A Pending JPH0779782A (ja) | 1993-06-18 | 1993-06-18 | シネココッカスｐｃｃ７００２由来ルビスコ（リブロース １，５−ビスホスフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）遺伝子のプロモーター配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0779782A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998039457A1 (en) * | 1997-02-19 | 1998-09-11 | Enol Energy Inc. | Genetically modified cyanobacteria for the production of ethanol |
| WO2002061098A3 (en) * | 2001-01-30 | 2003-11-06 | Du Pont | Promoters from cyanobacteria allowing high expression levels |
-
1993
- 1993-06-18 JP JP5184304A patent/JPH0779782A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998039457A1 (en) * | 1997-02-19 | 1998-09-11 | Enol Energy Inc. | Genetically modified cyanobacteria for the production of ethanol |
| US6699696B2 (en) | 1997-02-19 | 2004-03-02 | Enol Energy Inc. | Genetically modified cyanobacteria for the production of ethanol, the constructs and method thereof |
| EP1854889A1 (en) * | 1997-02-19 | 2007-11-14 | Enol Energy Inc. | Genetically modified cyanobacteria for the production of ethanol |
| WO2002061098A3 (en) * | 2001-01-30 | 2003-11-06 | Du Pont | Promoters from cyanobacteria allowing high expression levels |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH07502647A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
| KR20200003903A (ko) | 조작된 리가제 변이체 | |
| JPH05503000A (ja) | 新規の遺伝子及びポリペチドの無細胞合成並びに単離 | |
| CN111154739B (zh) | 一种新型重组酶依赖型扩增方法及试剂盒 | |
| KR20190025615A (ko) | 박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도 | |
| KR20190025916A (ko) | 글루코오스 투과 효소 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도 | |
| Santosa | Rapid extraction and purification of environmental DNA for molecular cloning applications and molecular diversity studies | |
| CN118222537A (zh) | 性能提升的Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用 | |
| US4725535A (en) | Promoter probe vectors | |
| CN114645033B (zh) | 一种三磷酸核苷水解酶及其纯化方法和应用 | |
| EP0877084B1 (en) | Thermostable diaphorase gene | |
| MacFerrin et al. | [7] Overproduction of proteins using expression-cassette polymerase chain reaction | |
| CN106834252A (zh) | 一种高稳定型MazF突变体及其应用 | |
| US8017356B2 (en) | Endoribonuclease | |
| JPH0779782A (ja) | シネココッカスｐｃｃ７００２由来ルビスコ（リブロース １，５−ビスホスフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ）遺伝子のプロモーター配列 | |
| US7989184B2 (en) | Endoribonuclease | |
| CN113832127A (zh) | 一种限制性内切酶BamHⅠ的突变体及其应用 | |
| CN113528563A (zh) | 一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用 | |
| Manch-Citron et al. | The translational hop junction and the 5′ transcriptional start site for the Prevotella loescheii adhesin encoded by plaA | |
| CN115161306B (zh) | 绿盲蝽rna降解酶、其编码基因、载体、菌株及其应用 | |
| Day et al. | Isolation and characterization of ribosomes and translation initiation factors from the gram-positive soil bacterium Streptomyces lividans | |
| WO2023098036A1 (zh) | Taq酶突变体、其制备方法和应用 | |
| WO2024138074A1 (en) | Engineered rnase inhibitor variants | |
| JP2004512009A5 (ja) | ||
| Gholizadeh et al. | Induced expression of Eco RI endonuclease as an active maltose-binding fusion protein in Escherichia coli |