JP2003514572A

JP2003514572A - アミノアシル化活性を有した触媒ＲＮＡｓ

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Publication number: JP2003514572A
Application number: JP2001539923A
Authority: JP
Inventors: ヒロアキ，スガ; ディミトリオス，コーロークリス; ヒロヒデ，サイトー; リー，ニック; ボンザグニ，ニール
Original assignee: Research Foundation of State University of New York
Current assignee: Research Foundation of State University of New York
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 2000-11-22
Publication date: 2003-04-22
Anticipated expiration: 2020-11-22
Also published as: EP1232285A4; CA2391433A1; DE60039120D1; CA2391433C; EP1232285A1; JP4745577B2; EP1232285B1; US7001723B1; ATE397672T1; AU1927601A; WO2001038582A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、シス又はトランスアミノアシル化活性を有した触媒ＲＮＡ分子を提供するものである。このシスアミノアシル化活性を有した触媒ＲＮＡ分子は、触媒ドメインとアミノアシル化ドメインを含む。トランスアミノアシル化活性を有した触媒ＲＮＡ分子は、触媒ドメインしか有していない。これらの分子を構築してスクリーニングするための方法が提供される。これらの分子は、特定のアミノ酸を有したｔＲＮＡに類似する分子をアミノアシル化するのに好適である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、１９９９年１１月２４日提出の米国特許仮出願番号６０／１６７，３
３１および２０００年６月２８日提出の米国特許仮出願番号６０／２１４，３８
２（その開示が本明細書中で参考として援用される）の優先権を主張する。

【０００２】（技術分野）本発明は、一般に、触媒ＲＮＡ分子の分野に関し、より詳細には、ｔＲＮＡ様分
子のシスまたはトランスでのアミノアシル化能力を有する触媒ＲＮＡ分子に関す
るものである。

【０００３】（背景技術）非天然アミノ酸を含むタンパク質は、生物医学用および治療目的効果が期待され
ている。このようなアミノ酸は、特に、たんぱく質の構造および機能の探索、コ
ンビナトリアルケミストリー用のペプチドライブラリーの構築、およびプロテオ
ミクスに有用であり得る。しかし、このようなタンパク質の合成は、これまでの
ところ容易ではなかった。現在自然に起こることが公知の翻訳系では、アミノア
シルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）によって遺伝子暗号化が行われている。これは
２０の異なる形態で存在し、それぞれ１つのアミノ酸のその同族ｔＲＮＡイソ受
容体へのエステル化を特異的に触媒し、それによりアミノ酸をその対応するアン
チコドントリプレットに直接接触する。非同族アミノ酸のｔＲＮＡへの誤アシル
化によりその細胞内活性に重要であり得る細胞タンパク質へのアミノ酸の誤組み
込みが生じるので、ＡＲＳによるアミノアシル化反応の忠実度が非常に高くなけ
ればならない。この重要な課題を達成するために、ＡＲＳは同族アミノ酸および
ｔＲＮＡを選択的に認識する非常に精巧な機構を使用する。ｔＲＮＡの認識決定
要因は、アンチコドンループから受容体−Ｔｉ〜Ｃステムおよびリン酸−リボー
ス骨格まで多種多様な範囲に及ぶ。これらの複雑さのために、非天然ｔＲＮＡお
よびアミノ酸に対して所望の特異性を有するＡＲＳの操作は行われていなかった
。結果として、核酸が注目されている。

【０００４】長年、核酸は情報分子のみであると考えられていた。しかし、Ｃｅｃｈおよび共
働者（Ｃｅｃｈ、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３６、１５３２〜１５３９；Ｍ
ｃＣｏｒｋｌｅら、１９８７、ＣｏｎｃｅｐｔｓＢｉｏｃｈｅｍ．、６４、２
２１〜２２６）の先駆的研究により、触媒として作用することができる天然に存
在するＲＮＡ（リボザイム）の存在が示された。しかし、これらの天然のＲＮＡ
触媒が切断およびスプライシングのためのリボ核酸基質に対して作用することの
みが示されているにもかかわらず、最近のリボザイムの人工的な進化の発展によ
り種々の化学反応に対する触媒のレパートリーが広がっている。例えば、ＲＮＡ
は、ＤＮＡのリン酸ジエステル切断（Ｂｅａｕｄｒｙら、１９９２、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２５７、６３５）、アミノアシルエステルの加水分解（Ｐｉｃｃｉｒｉｌ
ｌｉら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６、１４２０〜１４２４）、自己分解
（Ｐａｎら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、３８８７）、３’Ｏ
Ｈを有するオリゴヌクレオチドと触媒の５’三リン酸塩末端とのライゲーション
（Ｂａｒｔｅｌら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１、１４１１〜１４１８）
、ビフェニルイソメラーゼ活性（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２６４、１９２４〜１９２７）、およびポリヌクレオチドキナーゼ活性（Ｌｏ
ｒｓｃｈｅｔａｌ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７１、３１〜３６）を触
媒することが報告されている。

【０００５】新規の触媒を同定するために、Ｂｒｅｎｎｅｎら（１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、５３８１〜５３８３）は高分子の異種遺
伝子プールを構築し、所望の反応を触媒する分子を単離するためにインビトロ選
択処理過程を使用した。このアプローチの変形形態がＧｏｌｄ．ｅｔａｌ．（
米国特許第５，４７５，０９６号）によって使用されている。指数関数的富化に
よるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）として公知のこの方法により、種々の
標的分子との特異的非共有結合相互作用を形成する能力を有する核酸を同定する
。関連特許（米国特許第５，９９０，１４２号）は、ＳＥＬＥＸ法に基づいてい
るが、標的との共有結合の形成を触媒することができる改変および非改変ＲＮＡ
分子を潜在的に同定することができる。最近、ホスホジエステラーゼ、アミダー
ゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子を同定することができる類似のアプローチが使用
された（Ｊｏｙｃｅに付与された米国特許第６，０６３，５６６号）。

【０００６】さらに、アミノアシル−ＲＮＡ結合の触媒がその（２’）３’末端において可能
であるＲＮＡ分子（Ｉｌｌａｎｇａｋｅｋａｒｅら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ
、２６７、６４３〜６４７）もしくは、ＲＮＡ分子があるＲＮＡ分子から別のＲ
ＮＡ分子にアミノ酸を転移することができる（Ｌｏｈｓｅら、１９９６、Ｎａｔ
ｕｒｅ、３８１、４４２〜４４４）ことが研究により同定されている。

【０００７】しかし、現在のタンパク質翻訳処理過程において生理学的に有意なＲＮＡ分子を
アミノアシル化することができる触媒ｔＲＮＡ様分子はこれまでのところ証明さ
れていない。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、シスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡを提供する。この触媒Ｒ
ＮＡは、ｔＲＮＡ様ドメインおよびリボザイムドメインを含む。リボザイムドメ
インは触媒活性を有するが、アミノアシル化のためのアミノ酸特異性も付与する
。したがって、この触媒ＲＮＡは、特定のアミノ酸を有する３’末端を選択的に
アミノアシル化する能力を有する（以後、シスアミノアシル化ＲＮＡ分子と呼ぶ
）。これらの触媒ＲＮＡを使用して、天然にアミノアシル化されないｔＲＮＡ様
配列をアミノアシル化することができる。

【０００９】本発明はまた、ｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化できる触媒ＲＮＡ分
子を提供する（以後、トランスアミノアシル化ＲＮＡ分子と呼ぶ）。トランスア
ミノアシル化ＲＮＡは、シスアミノアシル化ＲＮＡのリボザイムドメインに対応
する。これらの触媒ＲＮＡ分子を使用して所望の天然または非天然アミノ酸を有
するｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化することができる。

【００１０】本発明はまた、自己アミノアシル化ＲＮＡ分子の構築法を提供する。この方法は
、配列をｔＲＮＡ様分子の５’末端に結合させる工程を包含し、この配列はリボ
ザイム配列を含む。この方法を使用して、その３’末端のアミノアシル化を触媒
することができる触媒ＲＮＡを作成することができる。これらの触媒分子をＲＮ
アーゼＰで切断して、ｔＲＮＡ様分子をトランスでアミノアシル化する能力を有
する異なる種の触媒ＲＮＡ分子を生成することができる。

【００１１】本発明はまた、アミノアシル化活性を有するＲＮＡ配列の同定法を提供する。こ
の方法は、ｔＲＮＡ様ドメインおよびリボザイムドメインを有するＲＮＡ配列の
プールを提供する工程と、前記プールのＲＮＡ配列と所望の天然または非天然ア
ミノ酸とを接触させる工程と、非アミノアシル化分子からアミノアシル化ＲＮＡ
分子を分離する工程と、前記アミノアシル化ＲＮＡ分子を増幅して配列決定する
工程とを包含する。

【００１２】本発明はまた、本明細書中に記載の自己アミノアシル化触媒分子のアミノアシル
化法を提供する。この方法は、自己アミノアシル化触媒活性を有するＲＮＡ分子
を提供する工程と、ＲＮＡ分子と所望の天然または非天然アミノ酸とを接触させ
る工程と、アミノアシル化ＲＮＡ分子を単離する工程とを包含する。

【００１３】本発明はまた、ｔＲＮＡ様分子のアミノアシル化法を提供する。この方法は、ト
ランスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子を提供する工程と、ＲＮＡ分
子とｔＲＮＡ様分子および所望のアミノ酸とを接触させる工程と、アミノアシル
化ＲＮＡ分子を単離する工程とを包含する。

【００１４】（発明の詳細な説明）明細書および特許請求の範囲の目的のため、本明細書中に記載の語「ｔＲＮＡ様
分子」または「ｔＲＮＡ様ドメイン」または「ｔＲＮＡ様配列」は、ｔＲＮＡに
典型的に関連するクローバー型構造の形成に一致する配列を有するＲＮＡ分子を
意味する。ｔＲＮＡ様分子の具体例は、ｏｔＲＮＡ（配列番号１８）である。他
のｔＲＮＡ様分子は、配列番号５〜１５のｔＲＮＡドメイン（すなわち、配列番
号５のヌクレオチド８６〜１４６、配列番号６のヌクレオチド９０〜１５１、配
列番号７のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号８のヌクレオチド８９〜１５０
、配列番号９のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号１０のヌクレオチド８９〜
１４９、配列番号１１のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１２のヌクレオチ
ド８９〜１４９、配列番号１３のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１４のヌ
クレオチド９０〜１５０、および配列番号１５のヌクレオチド８９〜１４８）で
ある。さらに他のｔＲＮＡ様分子は、配列番号２０〜２２である。

【００１５】明細書および特許請求の範囲のために本明細書中で使用される語「リボザイム」
は、化学反応を触媒することができるＲＮＡ分子を意味する。

【００１６】語「天然のアミノ酸」は、生細胞中でｔＲＮＡを正常にアミノアシル化する２０
アミノ酸のうちの任意のアミノ酸をいう。このようなアミノ酸は、アラニン、バ
リン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン
、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、グルタ
ミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およ
びグルタミン酸である。したがって、語「非天然のアミノ酸」は、天然のアミノ
酸または天然のアミノ酸の改変以外の任意のアミノ酸を意味する。

【００１７】用語「シス」は、同一分子内を意味する。用語「トランス」は、異なる分子上ま
たはそれに対することを意味する。

【００１８】用語「５’リーダードメイン」または「触媒ドメイン」または「５’リーダーリ
ボザイム」は、シスアミノアシル化活性を有する触媒分子の５’領域を意味する
。このような５’リーダードメインの例は、配列番号５のヌクレオチド１〜８５
、配列番号６のヌクレオチド１〜８９、配列番号７のヌクレオチド１〜８９、配
列番号８のヌクレオチド１〜８８、配列番号９のヌクレオチド８９、配列番号１
０のヌクレオチド１〜８８、配列番号１１のヌクレオチド１〜８８、配列番号１
２のヌクレオチド１〜８８、配列番号１３のヌクレオチド１〜８８、配列番号１
４のヌクレオチド１〜８９、および配列番号１５のヌクレオチド１〜８８である
。

【００１９】本発明は、アミノアシル化反応を触媒することができる触媒ＲＮＡ分子に関する
。自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子は２つのドメイン、触媒ドメ
インおよびアミノアシル受容体ドメインを有する。触媒ドメインは、リボザイム
活性を有する配列を含む。このドメインはまた、アミノ酸特性を付与する。

【００２０】自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子を構築するために、無作為に合
成されたＲＮＡプールを選択する。このプールのＲＮＡ分子をｔＲＮＡ様分子の
５’末端へ付着させ、複合体を基質分子（天然または非天然アミノ酸）を接触さ
せることにより、自己アミノアシル化ＲＮＡ分子を同定する。次いで、これらの
分子を選択的に増幅することができる。これらの分子の自己アミノアシル化の性
質を、移動度ゲルシフトアッセイなどの標準的なアッセイによって確認すること
ができる。活性アミノアシル化ＲＮＡ種の単離を容易にするために、ビオチンタ
グを標的分子に付着させることができる。あるいは、水溶性形態のビオチンを使
用してアミノアシル化ＲＮＡを標識し、アミノアシル化ＲＮＡ種を作成すること
ができる。これらのビオチン標識種を、ストレプトアビジン被覆アガロースを使
用して単離することができる。選択的増幅ラウンドの反復により、自己アミノア
シル化活性を有する触媒ＲＮＡの純粋な種が得られる。選択ラウンドは、ｃＤＮ
Ａを作成するために反応のＳＡｖ結合部分から回収された逆転写ＲＮＡを一部含
む。ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、次いでＰＣＲ産物を転
写して、次の選択ラウンドで使用されるＲＮＡを作成する。最終選択ラウンドか
ら得たＲＮＡを移動度ゲルシフトアッセイに供して自己アミノアシル化およびト
ランスアミノアシル化活性を証明する。

【００２１】本発明の触媒分子はまた、ＲＮＡ種をトランスでアミノアシル化することができ
る。このような触媒分子を作成するために、アミノアシル受容体ドメイン（ｔＲ
ＮＡ様ドメイン）を細菌ＲＮアーゼＰ消化によって触媒ドメインから切断するこ
とができる。触媒ドメインは、アミノアシル受容体ドメインまたはｔＲＮＡ様分
子をトランスでアミノアシル化することができる。また、当業者に周知の方法に
よって、対応するＤＮＡテンプレートから適切なＲＮＡポリメラーゼで触媒化し
たインビトロ流出転写により触媒分子を合成することもできる。

【００２２】アミノアシル受容体ドメインは、ｔＲＮＡ様分子である。ｔＲＮＡ様分子の適切
な例は、人工オーソゴナルサプレッサーｔＲＮＡ（ｏｔＲＮＡ、図ＩＢを参照の
こと）である。あるいは、異なる種（ヒトなど）に由来するか単離されたアンバ
ーサプレッサーｔＲＮＡをこの目的で使用することができる。このｔＲＮＡ配列
は、アンバーサプレッサーｔＲＮＡ^Gln2に由来するが、細菌ＡＲＳによって認識
されない。ｏｔＲＮＡを、アミノアシル化活性およびアミノ酸特異性を付与する
固有の触媒ドメインに結合させることができる。

【００２３】一旦アミノアシル化活性を有することが公知の配列が単離されると、この配列を
さらなるアミノアシル化配列の単離に対する足場ベースのアプローチに使用する
ことができる。各塩基が非野生型となる一定の割合を有するように、ＤＮＡ形態
のｐｒｅ−２４^phe 配列領域（５’プライマー配列を除く）を無作為に変異誘発
させる。次いで、このＤＮＡプールをｏｔＲＮＡのアンチセンスＤＮＡにアニー
リングし、アニーリングプールを全長二重鎖ＤＮＡに伸長する。ＰＣＲによって
新規のテンプレートのコピーを作成し、これを転写して先に記載した選択に供す
る。

【００２４】ｐｒｅ−２４^phe の触媒足場を利用して、ほとんどの配列がｐｒｅ−２４^phe の
二次またはさらに三次構造を維持することができる集中した配列空間のスクリー
ニングが可能である。この狭い焦点にかかわらず、足場プールは基質のアミノ酸
成分であるように選択したアミノ酸に依存するアミノ酸特異性の望ましい変化に
十分な無作為変異を有する。したがって、活性配列に出会う可能性は、完全に無
作為なプールを使用した選択よりも高くなり得る。少数のヌクレオチドが無作為
化されるので、足場プールのために非常に複雑なプールを扱う必要はない（変異
速度に依存し、その複雑さは２から３桁低い）。したがって、選択はあまり骨が
折れず、より迅速に結果を得ることができる。

【００２５】これらおよび他の実施形態は、下記の実施形態からより明白になるが、これは例
示であり限定と解釈すべきでない。

【００２６】（実施例１）この実施形態は、アミノアシル化活性のスクリーニング用のＲＮＡ分子のプール
の構築を記載する。この実施形態の例示では、無作為化配列を作成し、ｔＲＮＡ
様分子に結合した。したがって、７０ヌクレオチドのランダムプールを、以下の
ｔＲＮＡ様分子（ｏｔＲＮＡ）の５’末端に結合した。

【００２７】プール構築：４つの合成オリゴヌクレオチドを、プール構築に使用した：ランダ
ムプールＤＮＡテンプレート（５’−ＧＧＡＴＣＧＴＣＡＧＴＧＣＡＴＴＧＡＧ
Ａ−Ｎ７０−ＧＧＴＧＧＴＡＴＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＡ−３’）（配列番号１
）、オーソゴナルｔＲＮＡに相補的なＤＮＡテンプレート（ｏｔＲＮＡ）（配列
番号２）、Ｔ７プロモーター配列を含む５’プライマー（配列番号３）、および
３’プライマー（配列番号４）。熱サイクル条件下（９５℃で１０分、５５℃で
１０分、および７２℃で１０分）で、ＤＮＡテンプレートの大規模ＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ伸長を行った。次いで、全長産物を５’および３’プライマーの
存在下での７サイクルの大規模ＰＣＲによって増幅した。約１０¹⁵の複雑度のプ
ールＤＮＡの４つの等価物をａ−［³²Ｐ］−ＵＴＰの存在下でのＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼによって転写し、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
によって精製した。

【００２８】（実施例２）この実施形態は、実施例１で構築したＲＮＡ分子由来の活性配列の選択を記載す
る。例として、以下の基質を使用してＲＮＡのアミノ鎖アクリル化種を選択した
。

【００２９】（基質）ＣＭＥ基は活性化と加水分解安定性との釣り合いが取れているので、Ｎ−ビオチ
ニル−Ｌ−アミノアシル−シアノメチルエステル（Ｂｉｏｔｉｎ−ａａ−ＣＭＥ
）をアミノアシルドナー基質として選択した。さらに、ＣＭＥは水素結合官能基
を有していないので、基質のアミノ酸側鎖によるＲＮＡとの一次相互作用の確認
の助けとなる。

【００３０】他の基質には、フェニルアラニルアデニレート（Ｐｈｅ−ＡＭＰ）およびフェニ
ルアラニルチオエステル（Ｐｈｅ−ＴＥ）を含んでいた。また、これらの基質を
、上記の理由のためおよび他の基質成分よりもむしろアミノ酸への特異性を示す
ために選択した。ビオチンタグにより、固定ストレプトアビジン（ＳＡｖ）アガ
ロース上のビオチン部分とＳＡｖとの間の相互作用を介した活性（すなわち、ア
ミノアシル化）配列の単離を容易にする。Ｎ−ビオチニル−Ｌ−フェニルアラニ
ル−シアノメチルエステル（Ｂｉｏｔｉｎ−Ｐｈｅ−ＣＭＥ）およびＢｏｃ−Ｐ
ｈｅ−ＣＭＥ（Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）を以前に記載の方法に
よって本質的に合成した（Ｓｕｇａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０
、１１５１〜１１５６、１９９８）。Ｐｈｅ−ＣＭＥの合成を以下のように行っ
た：９：１ＴＦＡ／アニソール溶液（５００ｍＬ）をアルゴン雰囲気下でＢｏ
ｃ−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（３８５ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を室温
で３０分間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、約４Ｍの塩酸のジオキサン溶液（
４ｍＬ）を残渣に添加した。溶液を真空濃縮し、残渣への無水エーテルの添加に
よって沈殿を得た。沈殿を最少量のＭｅＯＨに溶解し、この溶液（無水エーテル
）を添加して生成物を再沈殿させた。生成物の純度を、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を
使用して測定した。

【００３１】以前に記載のように（Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２５３、６０８〜６１
１、１９５８）フェニルアラニルアデニレート（Ｐｈｅ−ＡＭＰ）の合成を行っ
た。生成物の³²ＰＮＭＲ分析により、Ｐｈｅ−ＡＭＰの純度は約５０％であり
、残りの副産物は未反応のＡＭＰであることが示された。生成物を水中に溶解し
、さらに精製することなくアミノアシル化に使用した。

【００３２】フェニルアラニルチオエステル（Ｐｈｅ−ＴＥ）の合成を以下に示す：Ｎ，Ｎ−
ビス［２−オキソ−３−オキソゾリジイルホスホロジアミンクロリド］（２３８
ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（３０７ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ
）およびトリエチルアミン（１７５ｍＬ、２．２６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（
１０ｍＬ）溶液に添加した。この混合物に、エチル２−メルカプトアセテート（
１００ｍＬ、０．９１ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応混合物を室温で５時間
激しく撹拌した。２０％ＮａＨＣＯ₃ 水溶液の添加によって反応を停止させた。
標準的な水溶液の操作後、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＴＥをカラムクロマトグラフィーで
単離した。９：１ＴＦＡ／アニソール溶液（５００ｍＬ）をアルゴン雰囲気下
でＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＴＥ（２００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を
室温で３０分間撹拌した。真空下で溶媒を除去し、約４Ｍ塩酸のジオキサン溶液
（４ｍＬ）を添加して、塩酸塩を形成した。溶液を真空濃縮し、残渣をエーテル
に溶解した。この溶液に石油エーテルを添加することにより沈殿物が形成され、
これをエーテルでリンスし、濾過してＰｈｅ−ＴＥを得た。

【００３３】（活性配列の選択）以下の条件で選択反応を行った：１０μＭ（第１ラウンドのみ）または１μＭＲ
ＮＡプール、１ｍＭビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥのＥＫ緩衝液（５０ｍＭＥＰＰ
Ｓ、５００ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．５）、１００ＭＭＭｇＣｌ₂ 、およびエタ
ノール（全体積の２５％）の混合物。プールＲＮＡをＥＫ緩衝液中でプレインキ
ュベートし、９５℃で５分間加熱し、２５℃で５分間冷却した。次いで、ＭｇＣ
ｌ₂ を添加後、５分間平衡化した。基質のエタノール溶液の添加によって反応を
開始し、２５℃で３時間インキュベートした（１５〜１７ラウンドは３０分間）
。２体積の冷エタノールの添加によって反応を停止させ、ＲＮＡを２回エタノー
ル沈殿した。ＲＮＡペレットをＥＫＥ緩衝液（５０ｍＭＥＰＰＳ、５００ｍＭ
ＫＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）に溶解し、２００μＬ（第１ラウン
ドは１ｍＬ）のストレプトアビジンアガロースと室温で３０分間インキュベート
した。未結合のＲＮＡを２０樹脂体積のＥＫＥ緩衝液、４０樹脂体積の４Ｍ尿素
、その後１０樹脂体積の水で溶出した。樹脂結合ＲＮＡを１０ｍＭビオチン（ｐ
Ｈ７）の存在下での９５℃で１０分間の加熱によって溶出した。回収したＲＮＡ
を１μＭ３’プライマー（配列番号４）、１２５μＭｄＮＴＰ、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、７５ｍＭＫＣｌ、３ＭＭＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭＤＴＴ
（ｐＨ８．３）の存在下、４２℃で１時間（１〜１４ラウンド）または１０分間
（１５〜１７ラウンド）１００単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｇａ（商
標））を使用して逆転写した。ｃＤＮＡをＰＣＲに供し、その後標準的な条件下
で転写した。

【００３４】プール中の自己アミノアシル化ＲＮＡ分子の１５ラウンドの選択的増幅により、
ＳＡｖ依存性移動度ゲルシフトアッセイ（図２、レーン１〜３）で確認したとこ
ろ、活性配列が富化した。ラウンド１５由来の全投入ＲＮＡ分子の約１０％で３
時間後にアミノアシル化が認められた（レーン３）。より短いインキュベーショ
ン時間での２ラウンドの選択を使用して、プール中の活性をさらに増加させた（
レーン４〜６）。ＳＡｖまたは基質の欠損により遅延するバンドが消失すること
から、これはビオチン−Ｐｈｅ基を有する活性ＲＮＡの自己アシル化が起こって
いることが示される。３’末端ジオールの過ヨウ素酸酸化または３’アデノシン
の欠失により、アミノアシル化がほぼ完全に阻害され（レーン９、１０）、これ
は、３’末端ヒドロキシル基がアミノアシル化部位であることが強く示唆される
。

【００３５】ラウンド１７のプール由来の３６個の各クローンを自己アミノアシル化（実施例
Ｂに記載の自己アミノアシル化アッセイ）についてスクリーニングし、１１個の
クローン（配列番号５〜１５）が明らかな活性を示した。これらの配列のアライ
ンメントにより、５’リーダードメイン中約９５％が同一であることが明らかと
なった（図３の上）。ｐｒｅ−２４またはｒｔＲＮＡ（配列番号９）と呼ばれる
クローンの代表を自己アミノアシル化活性の確認のために選択した。

【００３６】（実施例３）ビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥの存在下でのｐｒｅ−２４の自己アミノアシル化活性
を、１２．５ｍＭＫＣｌおよび５％エタノールを使用する以外は選択に使用し
たものと類似の条件下でアッセイした。各測定点で、反応アリコートを２回エタ
ノール沈殿させ、ペレットを７μＬのＭＥＵＳ緩衝液（２５ｍＭＭＯＰＳ、５
ｍＭＥＤＴＡ、８Ｍ尿素、１０μＭストレプトアビジン、ｐＨ６．５）に溶解
した。１μＭＲＮＡおよび１ｍＭビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（図４、レーン１
、２、４、および５）または１ｍＭビオチン−ａａ−ＣＭＥ（レーン６〜１０）
の存在下または基質の非存在下で反応を行った（レーン３）。過ヨウ素酸酸化の
ため（レーン４）に、ｐｒｅ−２４を１０ｍＭＮａＯＨで０℃で１時間処理し
、アミノアシル化反応前にエタノール沈殿した。反応物を３０分間（レーン１〜
４）または２時間（レーン５〜１０）インキュベートした。得られた溶液を、ゲ
ルの温度を２０℃未満に維持するために低温室で１０％ＰＡＧＥによって分析し
た。基質濃度に対する初期速度のプロットにより、ｋ_cat ＝０．１０＋０．０１
／ｍｉｎ^-1およびＫｍ＝６．３±１．２ｍＭの速度パラメータのミカエリス−メ
ンテン挙動が明らかとなる一方で、基質の溶解限度により５ｍＭ未満までに実際
の作用濃度が制限される。バックグラウンド速度を、上記と同一の反応緩衝液中
で１ｍＭビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥとｏｔＲＮＡを３時間インキュベーションす
ることによって測定し、０．０１％のアミノアシル−ｏｔＲＮＡが得られた（レ
ーン１１）。したがって、バックグラウンド速度は、約５．５×１０^-7／ｍｉｎ ^-1 と評価される。認められたリボザイムの加速は、バックグラウンドよりも約１
０⁵ 倍高い。

【００３７】自己アミノアシル化活性を、ＳＡｖ依存性移動度ゲルシフトアッセイによって確
認された（図４Ａ、レーン１〜３）。過ヨウ素酸酸化により活性が完全に消失し
、これにより、アミノアシル化部位が３’末端であることが強く示唆される（レ
ーン４）。炭酸カリウムでのアミノアシル−ｐｒｅ−２４の穏やかな塩基の加水
分解により、遅延するバンドが消失した（すなわち、ｐｒｅ−２４からビオチン
−Ｐｈｅが加水分解された）。アミノアシル基質に再暴露した場合、この脱アシ
ル化ｐｒｅ−２４は依然として自己アミノアシル化活性を示した（図６を参照の
こと）。これにより、３’または２’エステル結合はアミノアシル−ｐｒｅ−２
４の唯一可能性のある結合であることが示唆される。

【００３８】触媒ＲＮＡのアミノ酸特異性を、５つの異なるビオチン−アミノアシル−ＣＭＥ
を使用して調査した（図４、レーン６〜１０）。Ｐｈｅ−ＣＭＥ、Ｐｈｅ−ＡＭ
Ｐ、およびＰｈｅ−ＴＥの基質について、アミノアシル−ＲＮＡペレットを酸性
ＥＰＰＳ緩衝液（０．３Ｍ、ｐＨ５．５）に再懸濁する以外は上記と同一の手順
を使用して自己アミノアシル化反応を行った。次いで、０．３ＭＥＰＰＳ−Ｋ
ＯＨをこの溶液に添加してｐＨ８．０とした。これらのアミノ酸の反応速度はフ
ェニルアラニンと比較すると劇的に減少し、これは、リボザイムドメインがビオ
チン−Ｐｈｅ−ＣＭＥに対して顕著な特異性を有することを示す。

【００３９】基質中の主な認識エレメントをさらに明らかにするために、３つの合成フェニル
アラニンエステル（図１Ｃ）を活性について試験した（図４Ｂ）（１６）。０．
５μＭｐｒｅ２４触媒ＲＮＡおよび５ｍＭＰｈｅ−ＣＭＥ（レーン１）、５
ｍＭＰｈｅ−ＡＭＰ（レーン２）、または１０ｍＭＰｈｅ−ＴＥ（レーン３
）の存在下、２５℃（レーン１及び３）または０℃（レーン２）で３０分間反応
を行った。ビオチン化（レーン４）またはＰｈｅ−ＣＭＥの基質（レーン５）の
非存在により遅延バンドが消失し、これは、アミノアシル化は遅延バンドに必要
であることを示す。バックグラウンドアミノアシル化を、５ｍＭＰｈｅ−ＣＭ
Ｅの存在下でｏｔＲＮＡを使用してモニターした（レーン６）。Ｐｈｅ−ＡＭＰ
およびＰｈｅ−ＴＥについて同一対照実験も行った（図７を参照のこと）。ａ−
アミノ基からのビオチンの省略（すなわち、Ｐｈｅ−ＣＭＥ）により、Ｐｈｅ−
ＣＭＥ濃度が５倍に増加した場合にビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥ（図４Ｂ、レーン
１）で認められたものとほとんど同一の触媒速度が得られた。これは、ビオチニ
ル基（おそらく、ａ−アミノ基に対するアミド官能基）はリボザイムと相互作用
するが、必須の基質認識エレメントではないことを例示している。リボザイムは
また、ＣＭＥ遊離基の代わりにアデニレート（Ｐｈｅ−ＡＭＰ）およびチオエス
テル（Ｐｈｅ−ＴＥ）に適応した（レーン２および３）。これは、基質の重要な
認識エレメントはフェニルアラニル側鎖であり、遊離基ではないことを示してい
た。

【００４０】（実施例４）この実施形態は、触媒ＲＮＡ分子の調製およびトランスアミノアセチル化活性を
示す。実施例１および２由来のｐｒｅ−２４触媒ＲＮＡを本実施例で使用した。
最初に、ｐｒｅ−２４ｏｔＲＮＡをＲＮアーゼＰ切断（図５Ａ）に供し、３’ｔ
ＲＮＡドメインから５’触媒ドメインを遊離させた。［³²Ｐ］−ボディ標識ｐｒ
ｅ−２４^otRNA をＲＮアーゼＰＲＮＡで２時間処理して約２３％のｐｒｅ−２
４^otRNA を切断した（レーン１）。ＲＮアーゼＰが存在しないと切断生成物は得
られなかった（レーン２）。マーカーＲＮＡ（レーン３の５’リーダーセグメン
ト及びレーン４のｏｔＲＮＡ）を、対応するＤＮＡセグメントを使用したインビ
トロ転写によって調製した。以前に記載のようにｐＤＷ２７プラスミドのＭ１遺
伝子由来のＰＣＲ増幅ＤＮＡテンプレートを使用して大腸菌ＲＮアーゼＰＲＮ
Ａをインビトロで転写し（Ｚｉｅｈｌｅｒら、１９９６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ、２０、６２２〜６２４）、６％ＰＡＧＥで精製した。３７℃の１ＭＮ
Ｈ₄ ＯＡｃ、５０ｍＭＭｇＣｌ₂ および０．１％ＳＤＳ中でＲＮアーゼＰＲ
ＮＡ（１μＭ）によるｐｒｅ−２４^otRNA （１μＭ）の切断を行った。反応後、
溶液を２回エタノール沈殿し、得られた溶液を１０％ＰＡＧＥで分析した。

【００４１】大腸菌ＲＮアーゼＰＲＮＡでのｐｒｅ−２４^otRNA の処理により、５’リーダ
ーセグメントおよびｏｔＲＮＡに対応する長さの２つのフラグメントが作成され
た（図５Ａ、レーン３および４の各フラグメントのインビトロ転写と比較したレ
ーン１および２）。これは、ｐｒｅ−２４^otRNA がＲＮアーゼＰＲＮＡ加水分
解に影響されやすいことを示す。従って、触媒活性ｐｒｅ−ｔＲＮＡをｔＲＮＡ
様分子および５’リーダーセグメントに断片化することができる。

【００４２】次に、５’リーダーフラグメントがｏｔＲＮＡフラグメントをトランスでアミノ
アシル化することができるかどうかを試験した（図１Ａ右）。トランスアミノア
シル化活性の分析のために（図５Ｂ）、非標識ｐｒｅ−２４^otRNA を切断し、ｏ
ｔＲＮＡおよび５’リーダードメインの各セグメントを１０％ＰＡＧＥで精製し
た。ｔＲＮＡセグメントをウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、［³²Ｐ］−
ａ−ＡＴＰの存在下でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。
ｐｒｅ−２４^otRNA に対するＲＮアーゼＰＲＮＡ作用によって作成した５’リ
ーダーおよびｏｔＲＮＡフラグメントを、ビオチン−Ｐｈｅ−ＣＭＥで処理した
（図５Ｂ）。５’リーダーフラグメントは、ｐｒｅ−２４^otRNA のシス反応と類
似の速度でｏｔＲＮＡをトランスアミノアシル化した。インビトロ転写５’リー
ダーフラグメントはまた、上記と類似のトランス活性を示した。したがって、Ｒ
ＮアーゼＰＲＮＡ消化５’リーダーフラグメントを、その機能的構造に独立し
て折りたたんで、トランス活性化アミノアシル化酵素として作用することができ
る。

【００４３】ｏｔＲＮＡの受容体Ｔステム−ループ領域からなるミニヘリックスＲＮＡ（図５
Ｃ）の基質特性も試験した。５’リーダーリボザイムおよびミニヘリックスＲＮ
Ａをインビトロ転写し、その後ＰＡＧＥで精製した。反応前に、各ＲＮＡ（４μ
Ｍの５’リーダーリボザイムおよび３μＭのミニヘリックスＲＮＡ）を、それぞ
れ折りたたんだ。残りの手順は、方法の節に記載のものと同一であった。ミニヘ
リックスＲＮＡは依然として５’リーダーリボザイムによってアミノアシル化さ
れることから、アンチコドンループは活性に必須ではないことが示される。しか
し、ｏｔＲＮＡと比較して認められた速度の約４倍が減少していることにより、
５’リーダーリボザイムが全長ｏｔＲＮＡ中に存在するさらなるエレメントと相
互作用することが示唆される。

【００４４】さらに、５’リーダーフラグメントは、ｐｒｅ−２４^otRNA のシス反応と同様の
速度でｏｔＲＮＡをアミノアシル化した。インビトロ転写５’リーダーフラグメ
ントはまた、上記と類似のトランス活性を示した。さらに、このフラグメントは
、それぞれのシス反応に類似の速度でｒｔＲＮＡおよびその変異型に対する活性
を示した（図８）。

【００４５】結論として、本発明は、その３’末端のアミノアシル化を触媒する能力を有する
改変ｔＲＮＡを提供する。５’リーダー配列は、独立して３’ｔＲＮＡドメイン
に存在し、その触媒特性を依然として保持することができる。

【００４６】（実施例５）１５％変異誘発足場プールを使用したＬｅｕ特異性リボザイムの選択に足場スト
ラテジーを使用した。１５％変異誘発足場ＲＮＡプールを以下のように合成した
：ｔＲＮＡの５’プライマー領域および５’重複領域以外のリボザイムの各ヌク
レオチドの位置を、自動化ＤＮＡ合成機の使用によって対応するＤＮＡテンプレ
ートを変異誘発する。合成前に、各ホスホラミダイトを他の３つの塩基と８５：
５：５：５の反応比で混合した。リボザイム配列にしたがってＤＮＡテンプレー
トを合成した。標準的な方法としてオリゴヌクレチドの脱保護および精製を使用
した。２００μＬスケールでＰＣＲを行う以外は実施例１と同一の方法によって
ＤＮＡを増幅した。このＤＮＡテンプレートのインビトロ転写およびその後のＰ
ＡＧＥによる精製によって、足場ＲＮＡプールが１５％変異誘発された。５ラウ
ンドのみの選択後にプール中に活性配列が認められた（一方、完全に無作為のプ
ール由来のｐｒｅ−２４^Phe の選択には１５ラウンドを必要とする）。なお、オ
ーソゴナルｔＲＮＡ（ｏｔＲＮＡ）に対して認められた活性は、本来のｐｒｅ−
２４^Phe のものよりも高く、このストラテジーは特異性を切り換えるだけでなく
、ｏｔＲＮＡに対する活性を最適にする。

【００４７】このアプローチの使用によって、ロイシン特異性シスアミノアシル化ＲＮＡが得
られた。２つの具体例は、配列番号１７と配列番号１８として示される。

【００４８】本発明の好ましい実施形態を本明細書中に記載および例示したが、本発明はこの
ような好ましい実施形態に制限されない。本発明の精神を逸脱することなく、種
々の変更形態を得ることができることが当業者に認識される。

【００４９】

【配列表フリーテキスト】

<210> １ <213> 人工配列 <223> ７０ヌクレオチドのランダムプールを含む合成オリゴヌクレオチド <210> ２ <213> 人工配列 <223> ｏｔＲＮＡ^Gln に対して相補的な完全に合成されたプライマー <210> ３ <213> 人工配列 <223> Ｔ７プロモーター配列を含む５’プライマー <210> ４ <213> 人工配列 <223> ３’完全に合成されたプライマー <210> ５ <213> 人工配列 <223> プレ‐１２触媒ＲＮＡ <210> ６ <213> 人工配列 <223> プレ‐３８触媒ＲＮＡ <210> ７ <213> 人工配列 <223> プレ‐２９触媒ＲＮＡ <210> ８ <213> 人工配列 <223> プレ‐３６触媒ＲＮＡ <210> ９ <213> 人工配列 <223> プレ‐２４触媒ＲＮＡ <210> １０ <213> 人工配列 <223> プレ‐２５触媒ＲＮＡ <210> １１ <213> 人工配列 <223> プレ‐２２触媒ＲＮＡ <210> １２ <213> 人工配列 <223> プレ‐５触媒ＲＮＡ <210> １３ <213> 人工配列 <223> プレ‐１９触媒ＲＮＡ <210> １４ <213> 人工配列 <223> プレ‐８触媒ＲＮＡ <210> １５ <213> 人工配列 <223> プレ‐２３触媒ＲＮＡ <210> １６ <213> 大腸菌 <223> ｏｔＲＮＡ <210> １７ <213> 人工配列 <223> Ｈ２Ｌｅｕ触媒ＲＮＡ <210> １８ <213> 人工配列 <223> Ｄ１‐Ｌｅｕ触媒ＲＮＡ <210> １９ <213> 人工配列 <223> ミニヘリックスを形成するＲＮＡ <210> ２０ <213> 人工配列 <223> ｏｔＲＮＡのＶ１突然変異体 <210> ２１ <213> 人工配列 <223> ｏｔＲＮＡのＶ２突然変異体 <210> ２２ <213> 人工配列 <223> ｏｔＲＮＡのＶ３突然変異体

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】自己アミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ（左）およびトランスアミノアシル
化活性を有する触媒ＲＮＡ（右）を示す略図である。アミノ酸基質（アミノ酸側
鎖および遊離基をそれぞれａａおよびＸで示す）は、５’リーダーリボザイムド
メインに結合し、ｔＲＮＡ３’−ヒドロキシルの求核攻撃（曲がった矢印で示す
）を促進する。ＲＮアーゼＰＲＮＡの切断部位をまっすぐな矢印で示す。

【図１Ｂ】ｏｔＲＮＡの二次構造を示す図である。

【図１Ｃ】基質シアノメチルエステル（ＣＭＥ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）（アデニ
レート）、およびチオエステル（ＴＥ）のそれぞれの化学構造を示す図である。

【図２】選択サイクル機能としての自己アミノアシル化活性を示すオートラジオグラムを
示す図である。ａ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ＲＮＡ、ｂ．ＲＮＡ
プール。

【図３】ラウンド１７のＲＮＡから単離した活性クローンの配列アラインメントを示す図
である。ｔＲＮＡドメインのアラインメントのために、野生型ｏｔＲＮＡを、選
択したｒｔＲＮＡ配列と共に示す。ｔＲＮＡドメインに認められるコンセンサス
欠失および変異をボックスで強調している。ｔＲＮＡループの略称を以下に示す
：ＡＣ、アンチコドン；Ｖ、可変；Ｔ、ＴＣ。

【図４】図４Ａは、ｐｒｅ−２４の自己アミノアシル化活性およびアミノ酸特異性を示す
図である。ａ．ＳＡｖと複合化したビオチン−アミノアシル−ｐｒｅ−２４；ｂ
．ｐｒｅ−２４；ｃ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ｏｔＲＮＡ；ｄ．
ｏｔＲＮＡ。図４Ｂは、３つの異なるエステルを使用したｐｒｅ−２４の自己アミノアシル化
活性の比較を示す図である。ａ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ｐｒｅ
−２４；ｂ．ｐｒｅ−２４；ｃ．ＳＡｖと複合化したビオチン−Ｐｈｅ−ｏｔＲ
ＮＡ；ｄ．ｏｔＲＮＡ。０．５μＭｐｒｅ２４および５ｍＭＰｈｅ−ＣＭＥ
（レーン１）、５ｍＭＰｈｅ−ＡＭＰ（レーン２）、または１０ｍＭＰｈｅ−
ＴＥ（レーン３）の存在下、２５℃（レーン１および３）または０℃（レーン２
）で３０分間反応を行った。図４Ｃは、ｐｒｅ−２４およびｔＲＮＡドメインに異なる程度の変異および欠失
を有するその変異体の自己アミノアシル化活性の比較を示す図である。野生型ｐ
ｒｅ−２４（レーン１）およびｐｒｅ−２４^otRNA （レーン５）は、それぞれｔ
ＲＮＡドメインのｒｔＲＮＡおよびｏｔＲＮＡを含む。

【図５】図５Ａは、５’リーダーリボザイムのトランスアミノアシル化活性を示す図であ
る。ＲＮアーゼＰＲＮＡによるｐｒｅ−２４ｏｔＲＮＡの切断。ａ．ｐｒｅ
−２４ｏｔＲＮＡ；ｂ．５’リーダーセグメント；ｃ．ｏｔＲＮＡ。図５Ｂは、ｏｔＲＮＡの５’リーダーリボザイム触媒アミノアシル化の経過時間
を示すオートラジオグラムを示す図である。ａ．ＳＡｖで複合化されたビオチン
−Ｐｈｅ−ｏｔＲＮＡ；ｂ．ｏｔＲＮＡ、ｐｒｅ−２４^otRNA のＲＮアーゼＰ消
化ＲＮＡフラグメントをアミノアシル化に使用した（ｋ．ｂ．＝１．０×１０^-3 ｍｉｎ^-1）。図５Ｃは、ミニヘリックスＲＮＡの５’リーダーリボザイム触媒アミノアシル化
の経過時間を示す図である。ａ．ＳＡｖで複合化されたビオチン−Ｐｈｅ−ミニ
ヘリックスＲＮＡ；ｂ．ミニヘリックスＲＮＡ（配列番号１９）（ｏｔＲＮＡの
受容体−Ｔステム−ループ領域からなる）。

【図６】炭酸カリウムでのアミノアシル−ｐｒｅ−２４の穏やかな塩基の加水分解前後の
アミノアシル化状態を示す図である。レーン１〜３：図４Ａのレーン１〜３と同
じ、レーン４：ビオチン−Ｐｈｅ−ｐｒｅ−２４ＲＮＡ（レーン１のＲＮＡと
同じ）を５０ｍＭＫ₂ ＣＯ₃ と３７℃で１５分間処理した。レーン５：レーン
４から回収したＲＮＡをレーン１と同一の条件下でのアミノアシル化に使用した
。

【図７】Ｐｈｅ−ＡＭＰおよびＰｈｅ−ＴＥの存在下でのｐｒｅ−２４およびｏｔＲＮＡ
のアミノアシル化を示す図である。レーン１：５ｍＭＰｈｅ−ＡＭＰの存在下
でのｐｒｅ−２４のアミノアシル化およびその後のビオチン処理。レーン２：ア
ミノアシル化のみ。レーン３：５ｍＭＰｈｅ−ＡＭＰでのｏｔＲＮＡのアミノ
アシル化およびその後のビオチン処理。レーン４：１０ｍＭＰｈｅ−ＴＥの存
在下でのｐｒｅ−２４のアミノアシル化およびその後のビオチン処理。レーン５
：アミノアシル化のみ。レーン６：ビオチン処理のみ。レーン７：１０ｍＭＯ
ｈｅ−ＴＥでのｏｔＲＮＡのアミノアシル化およびその後のビオチン処理。

【図８】ｔＲＮＡ変異型に対するトランスでのリボザイム触媒アミノアシル化を示す図で
ある。３時間反応を行った。ｖ１およびｖ３（レーン２および３）は、図４Ｃに
記載のｔＲＮＡドメインのフラグメントである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１２月３１日（２００１．１２．３１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１２】ａ．トランスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子を提
供する工程と、ｂ．ｔＲＮＡ様分子を提供する工程と、ｃ．前記触媒ＲＮＡ分子およびｔＲＮＡ様分子と所望の天然または非天然アミノ
酸とを接触させる工程と、ｄ．アミノアシル化ｔＲＮＡ様分子を単離する工程とを包含することを特徴とす
るｔＲＮＡ様分子のトランスアミノアシル化方法。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年８月１日（２００２．８．１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の名称】アミノアシル化活性を有した触媒ＲＮＡｓ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヒロアキ，スガアメリカ合衆国、ニューヨーク州 14221、ウィリアムズヴィル、フェニックロード 41 (72)発明者ディミトリオス，コーロークリスアメリカ合衆国、ニューヨーク州 14221、ウィリアムズヴィル、アムハーストマナードライブ 1525、アパートメント 209 (72)発明者ヒロヒデ，サイトーアメリカ合衆国、ニューヨーク州 14261、バッファロー、ユービー、サウスレイクヴィリジ 209エイチビー (72)発明者リー，ニックアメリカ合衆国、ニューヨーク州 14226、スナイダー、キャンパスドライブ 200、アパートメント１ (72)発明者ボンザグニ，ニールアメリカ合衆国、ニューヨーク州 14261、バッファロー、ユービー、サウスレイクヴィリジ 209エイチエイＦターム(参考） 4B024 AA03 AA20 CA01 CA11 HA12 4B050 CC01 CC10 DD11 LL05 4B063 QA01 QA18 QQ21 QR35 QR49 QS24

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ．配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号７、配列番
号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３
、配列番号１４、および配列番号１５の配列ならびにその相補配列を有するＲＮ
Ａと、ｂ．ｔがｕに置換されているａ）の配列を有するＤＮＡからなる群から選択され
るポリヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項２】前記ＲＮＡ配列が配列番号９の配列を有することを特徴とする請
求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】ａ）配列番号５のヌクレオチド１〜８５、配列番号６のヌクレオ
チド１〜８９、配列番号７のヌクレオチド１〜８９、配列番号８のヌクレオチド
１〜８８、配列番号９のヌクレオチド８９、配列番号１０のヌクレオチド１〜８
８、配列番号１１のヌクレオチド１〜８８、配列番号１２のヌクレオチド１〜８
８、配列番号１３のヌクレオチド１〜８８、配列番号１４のヌクレオチド１〜８
９、および配列番号１５のヌクレオチド１〜８８の配列ならびにその相補配列を
有するＲＮＡと、ｂ）ｔがｕに置換されているａ）の配列を有するＤＮＡからなる群から選択され
るポリヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸分子。【請求項３】ａ）配列番号５のヌクレオチド８６〜１４６、配列番号６のヌク
レオチド９０〜１５１、配列番号７のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号８の
ヌクレオチド８９〜１５０、配列番号９のヌクレオチド９０〜１５０、配列番号
１０のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１１のヌクレオチド８９〜１４９、
配列番号１２のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１３のヌクレオチド８９〜
１４９、配列番号１４のヌクレオチド９０〜１５０、および配列番号１５のヌク
レオチド８９〜１４８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２の配列およ
びその相補配列を有するＲＮＡと、ｂ）ｔがｕに置換されているａ）の配列を有するＤＮＡからなる群から選択され
るポリヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項４】前記ＲＮＡ配列が配列番号９のヌクレオチド９０〜１５０の配列
を有することを特徴とする請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】ｔＲＮＡ様分子を提供する工程と、リボザイム配列を前記ｔＲＮ
Ａ様分子の５’末端に結合させる工程を包含し、前記リボザイム配列が配列番号
５のヌクレオチド１〜８５、配列番号６のヌクレオチド１〜８９、配列番号７の
ヌクレオチド１〜８９、配列番号８のヌクレオチド１〜８８、配列番号９のヌク
レオチド８９、配列番号１０のヌクレオチド１〜８８、配列番号１１のヌクレオ
チド１〜８８、配列番号１２のヌクレオチド１〜８８、配列番号１３のヌクレオ
チド１〜８８、配列番号１４のヌクレオチド１〜８９、および配列番号１５のヌ
クレオチド１〜８８からなる群から選択されることを特徴とするシス−アミノア
シル化触媒ＲＮＡ分子の構築方法。
【請求項６】ａ．ｔＲＮＡ様分子を提供する工程と、ｂ．リボザイムドメイン分子を提供する工程と、ｃ．前記リボザイムドメイン分子を前記ｔＲＮＡ様分子の５’末端に結合してリ
ボザイム−ｔＲＮＡ分子のプールを得る工程と、ｄ．前記リボザイム−ｔＲＮＡ分子とアミノ酸基質とを接触させる工程と、ｅ．前記リボザイム−ｔＲＮＡ分子の残存物からアミノアシル化リボザイム−ｔ
ＲＮＡ分子を分離してシス−アミノアシル化触媒ＲＮＡ分子を得る工程とを包含
することを特徴とするシス−アミノアシル化触媒ＲＮＡ分子の同定方法。
【請求項７】前記ｔＲＮＡ様分子が、配列番号５のヌクレオチド８６〜１４６
、配列番号６のヌクレオチド９０〜１５１、配列番号７のヌクレオチド９０〜１
５０、配列番号８のヌクレオチド８９〜１５０、配列番号９のヌクレオチド９０
〜１５０、配列番号１０のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１１のヌクレオ
チド８９〜１４９、配列番号１２のヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１３の
ヌクレオチド８９〜１４９、配列番号１４のヌクレオチド９０〜１５０、および
配列番号１５のヌクレオチド８９〜１４８、配列番号２０、配列番号２１、配列
番号２２からなる群から選択される配列およびその相補配列を有することを特徴
とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記リボザイムドメイン分子が、配列番号５のヌクレオチド１〜
８５、配列番号６のヌクレオチド１〜８９、配列番号７のヌクレオチド１〜８９
、配列番号８のヌクレオチド１〜８８、配列番号９のヌクレオチド８９、配列番
号１０のヌクレオチド１〜８８、配列番号１１のヌクレオチド１〜８８、配列番
号１２のヌクレオチド１〜８８、配列番号１３のヌクレオチド１〜８８、配列番
号１４のヌクレオチド１〜８９、および配列番号１５のヌクレオチド１〜８８か
らなる群から選択される配列を有することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】ａ．配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番
号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１
４、および配列番号１５からなる群から選択される配列を有するＲＮＡ分子を提
供する工程と、ｂ．前記ＲＮＡ分子をＲＮアーゼＰで切断して、トランス−アミノアシル化触媒
ＲＮＡ分子およびアミノアシル受容体ドメインを得る工程とを包含することを特
徴とするトランスアミノアシル化触媒ＲＮＡ分子の獲得方法。
【請求項１０】ａ．シスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子を提供す
る工程と、ｂ．前記ＲＮＡ分子と所望の天然又は非天然アミノ酸とを接触させる工程と、ｃ．アミノアシル化ＲＮＡ分子を単離する工程とを包含することを特徴とする触
媒ＲＮＡ分子のシスアミノアシル化方法。
【請求項１１】ａ．トランスアミノアシル化活性を有する触媒ＲＮＡ分子を提
供する工程と、ｂ．ｔＲＮＡ様分子を提供する工程と、ｃ．前記触媒ＲＮＡ分子およびｔＲＮＡ様分子と所望の天然または非天然アミノ
酸とを接触させる工程と、ｄ．アミノアシル化ｔＲＮＡ様分子を単離する工程とを包含することを特徴とす
るｔＲＮＡ様分子のトランスアミノアシル化方法。