JPH03280879A - ウロキナーゼ様酵素前駆体の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は糖鎖を有しない可溶性のウロキナーゼ様酵素前
駆体の精製方法に関するものである。

（従来の技術とその課題） ウロキナーゼ前駆体は、血液が凝固して生じる血栓を分
解する酵素の前駆体であるプラスミノーゲンを活性化し
、プラスミンに変換させるウロキナーゼの前駆体である
。

従来、人の尿から得られるウロキナーゼが血栓症の治療
に使用されてきたが、人体に大量に投与すると副作用を
示す恐れがあるため、より安全な薬品としてウロキナー
ゼ前駆体が注目されている。しかしながら、ウロキナー
ゼ前駆体は天然には極めて微量にしか存在していないた
め、これをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドに
て形質転換した大腸菌を培養することで生産する方法が
提案されている（特開昭５９−５１３００号）。

ウロキナーゼ前駆体に限られたことではないが、医薬品
としである種の蛋白質を使用する場合には、当該蛋白質
が高度に純化された標品であることが必要とされる。従
って、例えば大腸菌等で生産された蛋白質を医薬品とし
て使用する場合には当然に菌体由来の蛋白質等を除去し
、当該蛋白質について精製しなければならない。

菌体で生産されたウロキナーゼ前駆体は菌体内に不溶性
の凝集塊として取得されるため、これを回収するには菌
体の破砕の操作を実施し不溶性画分を回収する必要があ
る。当該操作によれば、菌体由来の核酸、細胞壁多糖、
脂質、蛋白質等は菌体断片として目的とするウロキナー
ゼ前駆体蛋白質と共に不溶性画分に存在することになり
、例えば分子量の差を利用したクロマトグラフや膜分離
等を行なうことはできない。

ところで、不溶性凝集塊として菌体内に蓄積されたウロ
キナーゼ前駆体については、その三次構造が本来の活性
を発現し得ない状態に折り畳まれているため、まず例え
ば蛋白質変性剤を使用してその可溶化操作を実施し、続
いて該変性剤の濃度を低下させる等の折り畳み操作を実
施する。従って、当該操作の実施後であれば、前記した
様な分子量の差を利用する精製方法を適用することは可
能であるが、なお夾雑物がゲルや膜に吸着もしくはつま
り、効率が低下したり精製能力が急激に変化するために
安定した標品を得ることができない、という課題を生じ
る。この可溶化操作によりウロキナーゼ前駆体のみが可
溶化されるのであれば、例えば遠心分離等の操作によっ
ても精製は可能であるが、可溶化操作においてはウロキ
ナーゼ前駆体を変性することが必須の条件であるために
菌体に由来する夾雑物も可溶化されているのである。

通常、酵素を精製する場合に、硫安等の塩を加える塩析
法や、エタノール等の有機溶媒を加える溶媒分画法で目
的酵素と夾雑物の溶解度差を利用して粗分側を実施した
後にカラム精製を実施する等の方法を採用することがあ
る。ところが、これら塩析法や溶媒分画法においては、
目的の試料溶液重量の２０〜１２０％という大量の試薬
を使用しなければならず、試料溶液が比較的少量の実験
室で実施する精製であればいざしらず、大量の試料を精
製することが要求される工業規模の施設においては種々
の課題が生じる。例えば大量の試薬にかかるコスト、試
薬の保管と管理等の非技術的な課題のほか、試薬を添加
することで増量する処理後溶液のカラム精製等に要する
時間や設備等の課題もある。更に、大量の塩を添加する
場合に塩が試料溶液中に持ち込む空気により生じる発泡
の課題、溶媒を添加する場合の発熱の課題、防爆設備の
課題、使用後の塩、溶媒の処理課題等もある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、以上のような課題に鑑みてより簡便な操
作によりウロキナーゼ前駆体を精製する方法について研
究を行なった結果、糖鎖を有しない可溶性のウロキナー
ゼ前駆体を含有する試料溶液に多価の金属塩を添加する
ことにより当該前駆体が選択的に沈殿を生じることを知
見し、この沈殿を水相から回収するという極めて簡便な
操作を付加することでこれを精製できることを見出だし
た。

即ち本発明は、糖鎖を有しない可溶性のウロキナーゼ様
酵素前駆体を精製する方法であって、当該前駆体を含有
する試料溶液に多価の金属塩を添加する操作と当該操作
により生じる沈殿を水相から回収する操作を含む方法で
あり、もしくはこのような操作に続いて、回収された沈
殿を水性溶媒に懸濁し、更に多価の金属塩と配位結合を
形成し得る可溶性化合物を添加するか又は当該懸濁駅の
ｐＨを２〜６に調整する操作を行なうことを特徴とする
ウロキナーゼ様酵素前駆体の精製方法である。以下、本
発明の詳細な説明する。

本発明でいうウロキナーゼ様酵素前駆体とは、天然のア
ミノ酸配列を有するウロキナーゼ前駆体の他、その一部
が欠損したもの、一部が他のアミノ酸に置換されたもの
、天然のアミノ酸配列に他のアミノ酸が付加されたもの
等、非天然型（変異型）のものであってウロキナーゼの
活性部分を有し、プラスミン等の酵素作用を受けてウロ
キナーゼ活性を発現し得るものをいう。

本発明は、このようなウロキナーゼ様酵素前駆体のうち
、例えば大腸菌等の菌体により生産されたものや、その
遺伝子に変異を加えることにより糖鎖を結合し得るアミ
ノ酸が他のアミノ酸に置換されたもの等の糖鎖を有しな
いものを対象とするものである。本明細書においては、
以下にプロウロキナーゼ様酵素前駆体をコードするプラ
スミドにより軽質転換した大腸菌で生産されたウロキナ
ーゼ様酵素前駆体について説明する。なお、当該前駆体
としては、例えば天然のアミノ酸配列中の第１３５位及
び１５７位のアミノ酸がそれぞれグリシン、アスパラギ
ン酸に置換されたもの等がある（特開昭６２−１４３６
８６号参照）。本明細書中では、このような変異型のも
のを含めて以下、前駆体と略記する。

菌体中に蓄積された前駆体を回収するには、当該菌体を
ホモジナイズ、超音波破砕等の公知の物理的方法により
破砕すれば良い。界面活性剤やリソチウム等の薬品を使
用する菌体破砕法についても公知であるが、このような
化学的方法により菌体を破砕した場合には使用した薬品
を分離する操作を実施する。

続いて回収された沈殿について、可溶化及び折り畳み操
作を実施する。これらの操作は、例えば特開昭５９−１
６１３２１号、特開平１−２２２７８０号等に記載され
たような方法に従えば良い。

以上の操作により、本発明でいう試料溶液を得ることが
できる。ここで、前記可溶化・折り畳み操作によっても
可溶化されない成分が試料溶液中に存在する場合には、
本発明の実施に先立ってこれを水相から分離しておくと
良い。

本発明では、まず試料溶液に多価の金属塩を添加する。

多価の金属塩としては、酸性領域で水に可溶性であり中
性領域で蛋白質と結合性を示す遷移金属又は両性金属の
塩を使用すると好ましい。

また、使用する金属塩は一種類である必要はなく、本発
明で使用可能な塩の二種以上を用いても良い。

このような金属塩として、具体的に塩化亜鉛、硫酸銅、
塩化鉄、塩化アルミニウム又は塩化コバルト等を例示す
ることができる。

この操作により、前駆体には多価の金属塩が結合し析出
して沈殿を生じるから、生じる沈殿を水相から回収する
ことで夾雑物の減少した前駆体分画を得ることができる
のである。

金属塩の添加量は、使用する金属塩Ω種類及び試料溶液
中の前駆体の量により適宜決定すれば良いが、本発明者
らの知見によれば、例えば塩化亜鉛を活性が４００００
ＩＵ／ｍｌであり、比活性が５０００ＩＵ／ｍｇである
試料溶液に添加する場合には約２％が適度であった。

沈殿の水相からの回収は、遠心分離や膜濾過等の公知の
方法に従えば良く、特別の制限はない。

本発明においては、金属塩を添加するに先立って試料溶
液のｐＨを前駆体に影響を与えない範囲で酸性に調整し
ておくことで添加された金属塩の試料溶液への速やかな
分散が実現される。また、このように試料溶液のｐＨを
前駆体に影響を与えない範囲で酸性に調整する操作を実
施すると、夾雑物の一部が析出し、沈殿を生じることも
ある。

この沈殿は容易に除去することが可能である。

以上のように、本発明の実施に先立ち試料溶液調製する
に際しては、そのｐＨを前駆体に影響を与えない範囲で
酸性に調整しておくことが好ましい。具体的には試料溶
液のｐＨを３〜５程度の範囲に調整することが例示でき
る。

更に本発明においては、金属塩を添加した後に、前駆体
の沈殿を促進する目的で試料溶液のｐＨを中性付近に調
整する操作を実施すると良い。

具体的にはそのｐＨを５〜７程度の範囲に調整すること
が例示できる。

本発明においては、以上の操作で得られる精製された前
駆体を再び水溶液の状態で提供するための方法をも提供
する。即ち、以上の操作に続いて、回収された沈殿を水
性溶媒に懸濁し、更に多価の金属塩と配位結合を形成し
得る可溶性化合物を添加するか又は当該懸濁駅のｐＨを
２〜６に調整する操作を行なうことを特徴とするウロキ
ナーゼ様酵素前駆体の精製方法である。

以上の操作からなる本発明においては、まず試料溶液か
ら回収された沈殿を水性溶媒に懸濁する。使用する水性
溶媒としては、前駆体の活性等に影響を与えないもので
あれば制限はない。

続いて、先に使用した多価の金属塩から生じるイオンと
前駆体の結合を開裂させる。これは、以下のいずれかの
操作により実現される。即ち、多価の金属塩と配位結合
を形成し得る可溶性化合物を添加するか又は当該懸濁駅
のｐＨを２〜６１；調整する操作である。

多価の金属塩と配位結合を形成し得る可溶性化合物とし
ては、例えばエチレンジアミン四酢酸等の金属キレート
剤、モノエタノールアミン、トリスヒドロキシメチルア
ミノメタン、イミダゾール等の水溶性窒素化合物、酢酸
ナトリウム等のカルボキシル基を有する化合物が例示で
きる。懸濁液のｐＨを２〜６に調整するには、適当な緩
衝剤を懸濁液に添加するか又は希塩酸や希硫酸等に代表
される酸性物質を添加すればよく、他には制限はない。

例えば、回収された沈殿を懸濁する水性溶媒として、こ
れら多価の金属塩と配位結合を形成し得る可溶性化合物
を含む溶媒やｐＨが調整された緩衝液等を使用しても良
い。

以上の操作により回収された沈殿を可溶化する際、不溶
物が沈殿することがあるが、これら沈殿は遠心分離や膜
濾過等により除去することで、先に説明した方法以上に
前駆体を精製することが可能となる。

このように、本発明により前駆体を沈殿として得た後見
に精製して可溶化した場合には、必要に応じて透析、限
外濾過等の公知の方法に従って金属イオンを除去するこ
とも可能である。

（発明の効果） 本発明によれば、糖鎖を有しない可溶性のウロキナーゼ
様酵素前駆体を簡便な操作により精製することが可能と
なる。例えばウロキナーゼ様酵素前駆体を医薬品として
使用する目的で精製する場合には、本発明の操作を実施
した後に高精度のカラム争クロマトグラフィー等を実施
すれば、カラムの°性能劣化という課題を生じることな
く長期に渡って安定して品質の標品を得ることが可能と
なる。

しかも本発明は多価の金属塩を試料溶液に添加すること
で実施可能であるから、処理しなければならない試料溶
液の量が実質的に増加することがない。このことは、お
おかかすな設備を必要とせず、低い生産コストによりウ
ロキナーゼ様酵素前駆体を精製することが可能であるこ
とを示すものである。

（実施例） 以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載
するが、これら実施例は本発明を限定するものではない
。

なお、これら実施例中、ウロキナーゼ様酵素前駆体とは
具体的には大腸菌により生産された、天然のアミノ酸配
列中の第１３５位及び１５７位のアミノ酸がそれぞれグ
リシン、アスパラギン酸に置換されたものである。また
、このウロキナーゼ様酵素前駆体の活性は、プラスミン
（第一化学薬品（株）製）を作用させて活性化し、Ｐｙ
ｒＧｌｙＡｒｇ−ｐＮＡ　（Ｐｙｒはピログルタミル基
を示す、第一化学薬品（株）製）の加水分解活性を測定
して市販のウロキナーゼ（緑十字（株）製）と比較して
決定し、その蛋白質濃度は２８０ｎｍの吸光度を測定す
ることで決定した。

なお、本実施例で示すウロキナーゼ様酵素前駆体の純度
は単位蛋白質当たりのウロキナーゼ活性で示されており
、この値が高いほど高純度の標品であることを意味する
ものである。

実施例　１ ウロキナーゼ様酵素前駆体を菌体内に有する組み換え大
腸菌菌体（湿重量１ｇ）をホモジナイザーを使用して破
砕した後、破砕物に２Ｍの尿素を含む１６０ｍ１の５％
トリエチルテトラミンを加えてウロキナーゼ様酵素前駆
体を可溶化して抽出した。

抽出液に濃塩酸を添加してそのｐＨを９に調整し、可溶
化されたウロキナーゼ様酵素前駆体について折り畳みを
行った。なお、この操作を完了したの試料溶液は、大腸
菌に由来する夾雑物の共存のため、乳白色を呈しており
、ウロキナーゼ活性は４３０００ＩＵ／ｍｌであった。

この溶液に濃塩酸を添加してｐＨを４に調整し、生じた
沈殿を濾過して除去したところ、濾過液はほぼ白色を呈
するものとなったが、そのウロキナーゼ活性は４０００
０１Ｕ／ｍｌであり比活性は４５００　ＩＵ／’Ａ２８
０　（２８０ｎｍでの吸光度当たりの活性）であった。

以上のようにして調製された試料溶液に、２ｎｃ１□を
３．２ｇ添加し、ＩＯＮの水酸基ナトリウムを添加して
ｐＨを６に調整した。この操作の後、生じた沈殿を遠心
分離により回収したが、遠心分離の際の上清に残余した
ウロキナーゼ活性は７００ＩＵ／ｍｌであり、活性から
の計算によると約９９％のウロキナーゼ様酵素前駆体が
沈殿として回収されたこととなる。

回収した沈殿を、４７ｍ１の０．　１Ｍの酢酸緩衝液（
ｐＨ５，０）に懸濁したところ、はぼ完全に可溶化した
。この可溶化液についてウロキナーゼ活性を測定したと
ころ、９４０００１Ｕ／ｍｌの活性が認められ、比活性
は２９０００ＩＵ／Ａ２８０であった。

以上の操作により回収されたウロキナーゼ様酵素前駆体
は約６８％であり、その純度は約５倍となった。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）糖鎖を有しない可溶性のウロキナーゼ様酵素前駆
   体を精製する方法であって、当該前駆体を含有する試料
   溶液に多価の金属塩を添加する操作と当該操作により生
   じる沈殿を水相から回収する操作を含む方法。
2. （２）多価の金属塩が、酸性領域で水に可溶性であり中
   性領域で蛋白質と結合性を示す遷移金属又は両性金属の
   塩であることを特徴とする請求項第（１）項記載の方法
   。
3. （３）前記金属塩が、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化鉄、塩化
   アルミニウム又は塩化コバルトから選ばれる一種以上の
   多価の金属の塩であることを特徴とする請求項第（２）
   項記載の方法。
4. （４）糖鎖を有しない可溶性のウロキナーゼ様酵素前駆
   体を精製する方法であって、当該前駆体を含有する試料
   溶液に多価の金属塩を添加して生じる沈殿を水相から回
   収し、続いて回収された沈殿を水性溶媒に懸濁した後更
   に多価の金属塩と配位結合を形成し得る可溶性化合物を
   添加するか又は当該懸濁駅のｐＨを２〜６に調整する操
   作を行なうことを特徴とするウロキナーゼ様酵素前駆体
   の精製方法。