KR102471639B1 - 3-알파-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제 돌연변이체 및 우르소데옥시콜산의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 3α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제 돌연변이체, 이러한 효소 돌연변이체를 코딩하는 서열, 이러한 효소 돌연변이체의 제조 방법, 및 콜산(cholic acid) 화합물의 효소적 반응, 상세하게는 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)의 제조에서의 이러한 효소 돌연변이체의 용도에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 효소 돌연변이체를 사용한 UDCA의 신규 합성 방법; 및 다중 변형된 재조합 미생물을 사용한 UDCA의 신규 제조 방법에 관한 것이다.

Description

3-알파-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제 돌연변이체 및 우르소데옥시콜산의 제조 방법{3-ALPHA-HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE MUTANTS AND PROCESS FOR THE PREPARATION OF URSODEOXYCHOLIC ACID}

본 발명은 신규 3α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(3α-HSDH) 돌연변이체, 특히, 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni)(이전에는 슈도모 나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni)로 지칭됨)의 3α-HSDH, 이러한 효소 돌연변이체를 코드하는 서열, 이러한 효소 돌연변이체의 제조 방법, 및 콜산(cholic acid) 화합물의 효소적 전환, 상세하게는 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)의 제조에서의 이러한 효소 돌연변이체의 용도에 관한 것이며; 본 발명의 주제는 또한, 효소 돌연변이체를 사용한 UDCA의 신규 합성 방법; 및 다중 변형된 재조합 미생물을 사용한 UDCA의 신규 제조 방법에 관한 것이다.

담즙산은 지방, 지방산 및 소수성 비타민의 소화 및 흡수에 필요한 생체분자이다. 인간에서 단지 소량으로만 발견되는 담즙산은 우르소데옥시콜산(UDCA로 지칭됨)이다. 이는 최근에, 콜레스테롤-포함 담석의 용해에 있어서 큰 치료적 중요성을 얻었다. 이러한 화합물은 화학적 단계 또는 효소적 단계에서 톤 단위의 양(tonne quantity)으로 공업적으로 생산된다. UDCA의 합성에 대한 중요한 전구체는 12-케토우르소데옥시콜산이며, 이는 볼프-키슈너 환원(Wolff-Kishner reduction)에 의해 UDCA로 전환될 수 있다. 문헌에 기술된 12-케토우르소데옥시콜산의 합성 경로는 콜산(3α,7α,12α-트리하이드록시-5β-콜란산)으로 시작하며, 이는 7α-HSDH 및 12α-HSDH에 의해 촉매화되는 2개의 산화 단계, 및 7β-HSDH에 의해 촉매화되는 1개의 환원 단계에 의해 제조될 수 있다(문헌[Bovara R et al. (1996) A new enzymatic route to the synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid. Biotechnol. Lett. 18:305-308; Monti D et al. (2009) One-pot multienzymatic synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid: Subtle cofactor specificities rule the reaction equilibria of five biocatalysts working in a row. Adv. Synth. Catal. 351:1303-1311]). 추가적인 경로는 7-케토리토콜산으로 시작하며, 이는 7-케토기를 입체선택적으로 환원시킴으로써 UDCA로 전환될 수 있으며; 이러한 단계는 또한, 7β-HSDH에 의해 촉매화되는 효소적 촉매 작용을 이용하여 유리하게 수행된다(문헌[Higashi S et al. (1979) Conversion of 7-ketolithocholic acid to ursodeoxycholic acid by human intestinal anaerobic microorganisms: Interchangeability of chenodeoxycholic acid and ursodeoxycholic acid. Gastroenterologia Japonica 14:417-424; Liu L et al. (2011) Identification, cloning, heterologous expression, and characterization of a NADPH-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenase from Collinsella aerofaciens. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90:127-135]). 추가적인 유리한 합성 경로는 데하이드로콜산(DHCA)으로 시작하며, 이는 2개의 환원 단계에 의해 12-케토우르소데옥시콜산으로 전환될 수 있으며; 이들 2개의 단계는 2개의 입체선택적 HSDH(3α-HSDH 및 7β-HSDH)에 의해 촉매화될 수 있다(문헌[Carrea G et al. (1992) Enzymatic synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid in a membrane reactor. Biotechnol. Lett. 14:1131-1135; Liu L et al. (2013) One-step synthesis of 12-ketoursodeoxycholic acid from dehydrocholic acid using a multienzymatic system. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97:633-639]).

씨. 애로파시엔스(C. aerofaciens) 유래의 효소는 매우 적합한 7β-HSDH인 것으로 입증되었다. 씨. 애로파시엔스 유래의 이러한 효소의 유전자 서열은 현재 알려져 있으며, 따라서, 우선 이러한 효소는 클로닝 후에 재조합에 의해 이용가능하게 될 수 있으며; 둘째로, 이러한 효소의 돌연변이체를 단백질 조작 방법에 의해 발생시키고, 따라서, 보다 유리한 효소 변이체를 발견할 수 있다면 선택적으로 발견하는 것이 가능하다.

씨. 테스토스테로니(C. testosteroni) 유래의 효소는 매우 적합한 3α-HSDH인 것으로 입증되었다. 이러한 효소의 유전자 서열은 현재 알려져 있으며, 따라서, 우선, 효소는 클로닝 후 재조합에 의해 이용가능하도록 제조될 수 있으며; 둘째로, 단백질 조작 방법에 의해 이러한 효소의 돌연변이체를 생성하고, 따라서 선택적으로, 경우에 따라 보다 유리한 효소 변이체를 발견하는 것이 가능하다.

활성 성분 우르소데옥시콜산(UDCA) 및 이의 부분입체이성질체 체노데속시콜산(chenodesoxycholic acid; CDCA)은 특히, 담석 질병 치료용 약제로서 오랫동안 이용되어 왔다. 2개의 화합물들은 7번 탄소 원자 상에서의 하이드록실기의 배치만 상이하다(UDCA: β-배치, CDCA: α-배치). UDCA를 제조하기 위해, 다양한 공정들이 선행 기술에 기술되어 있지만, 이들 공정은 순수하게 화학적 수단에 의해 수행되거나, 심지어 화학적 공정 단계와 효소적 공정 단계의 조합으로서 수행된다. 각각의 경우에 출발점은 콜산(CA), 또는 콜산으로부터 시작하여 제조되는 CDCA이다.

따라서, UDCA의 전형적인 화학적 제조 방법은 하기와 같이 도표로 나타날 수 있다:

.

심각한 단점은 특히 하기이다: 화학적 산화가 선택적이지 않기 때문에, 카르복실기 및 3α-하이드록시기와 7α-하이드록시기가 에스테르화에 의해 보호되어야 한다.

효소 12α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(12α-HSDH)의 사용을 기재로 하는 대안적인 화학적/효소적 공정은 하기와 같이 나타날 수 있으며, 예를 들어 본 출원인의 PCT/EP2009/002190에 기술되어 있다.

여기서, 12α-HSDH는 CA를 선택적으로 산화시켜, 12-케토-CDCA를 제공한다. 전형적인 화학적 방법에 의해 요구되는 2개의 보호 단계들이 여기서는 생략될 수 있다.

더욱이, Monti, D. 등(문헌[One-Pot Multienzymatic Synthesis of 12-Ketoursodeoxycholic Acid: Subtle Cofactor Specificities Rule the Reaction Equilibria of Five Biocatalysts Working in a Row. Advanced Synthesis & Catalysis, 2009])은 대안적인 효소적/화학적 공정을 개시하고 있으며, 이는 하기와 같이 도표로 나타날 수 있다:

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CA는 처음에 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis ) ATCC 25285 유래의 7α-HSDH 효소(문헌[Zhu, D., et al., Enzymatic enantioselective reduction of -ketoesters by a thermostable 7 -hydroxysteroid dehydrogenase from Bacteroides fragilis . Tetrahedron, 2006. 62(18): p.　4535-4539]) 및 12α-HSDH에 의해 산화되어, 7,12-다이케토-LCA를 제공한다. 각각의 경우에, 이들 2개의 효소는 NADH-의존적이다. 클로스트리듐 앱소눔(Clostridium absonum) ATCC 27555(DSM 599) 유래의 7β-HSDH(NADPH-의존적)에 의한 환원 후(문헌[MacDonald, I.A. and P.D. Roach, Bile induction of 7 alpha- and 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases in Clostridium absonum . Biochim Biophys Acta, 1981. 665(2): p.　262-9]), 12-케토-UDCA가 생성된다. 볼프-키슈너 환원은 최종 생성물을 제공한다. 이러한 공정의 단점은, 촉매화된 반응의 평형 상황으로 인해 완전한 전환이 불가능하고, 2개의 상이한 효소들이 반응의 제1 단계에 이용되어야 하며, 이는 공정의 비용을 증가시킨다는 점이다. 락테이트 데하이드로게나제(LDH; NAD⁺를 재생하기 위한 것임) 및 글루코스 데하이드로게나제(GlcDH 또는 GDH; NADPH를 재생하기 위한 것임)는 보조인자(cofactor) 재생에 이용된다. 해당 반응에 사용되는 보조인자 재생의 단점은, 형성되는 공동-생성물이 반응 혼합물로부터 오로지 아주 어렵게 제거될 수 있으며, 따라서, 반응 평형이 긍정적으로 영향을 받지 않을 수 있고, 이는 출발 물질의 불완전한 전환을 야기한다는 점이다.

균주 콜린셀라 애로파시엔스(Collinsella aerofaciens) ATCC 25986(DSM 3979; 이전에 유박테리움 애로파시엔스(Eubacterium aerofaciens)) 유래의 7β-HSDH는 1982년에 Hirano 및 Masuda에 의해 기술되었다(문헌[Hirano, S. and N. Masuda, Characterization of NADP-dependent 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. Appl Environ Microbiol, 1982. 43(5): p. 1057-63]). 해당 효소에 대한 서열 정보는 개시되지 않았다. 겔 여과에 의해 확인된 분자량은 45　000　Da에 달하였다(문헌[Hirano, 페이지 1059, 좌측 컬럼] 비교). 더욱이, 7β-하이드록시기로의 7-옥소기의 환원은 상기 효소에서는 관찰될 수 없었다(문헌[Hirano, 페이지 1061, 고찰, 제1 단락] 비교). 따라서, 당업자는, Hirano 등에 의해 기술된 효소가 7-위치에서 데하이드로콜산(DHCA로 지칭됨)의 환원을 촉매화하여 3,12-다이케토-7β-CA를 제공하는 데 적합하지 않음을 알 수 있다.

출원인의 조기의 국제 특허 출원 PCT/EP2010/068576은 콜린셀라 애로파시엔 스 ATCC 25986 유래의 신규 7β-HSDH를 기술하고 있으며, 이는 특히, 약 28 kDa 내지 32　kDa의 분자량(SDS 겔 전기영동에 의해 확인된 바와 같음), 약 53 kDa 내지 60　kDa의 분자량(특히 SDS를 사용하지 않는 것과 같은 비-변성 조건 하에서의 겔 여과에 의해 확인된 바와 같음), 및 7-케토-LCA의 7-카르보닐기를 7β-하이드록시기로 입체선택적으로 환원시키는 능력을 가진다.

더욱이, PCT/EP2010/068576은 UDCA의 제조 방법을 제공하며, 이는 하기와 같이 도표로 나타날 수 있다:

따라서, CA는 전형적인 화학적 경로를 통해 간단한 방식으로 산화된다. DHCA는 효소 쌍 7β-HSDH 및 3α-HSDH에 의해 개별적으로 차례대로 또는 한꺼번에 환원되어, 12-케토-UDCA를 제공한다. 따라서, 볼프-키슈너 환원과 조합 시, UDCA는 CA로부터 출발하여 오로지 3개의 단계에서 합성될 수 있다. 7β-HSDH 효소가 보조인자 NADPH에 의존적이긴 하지만, 3α-HSDH 효소는 보조인자 NADH를 필요로 한다. 동일한 보조인자에 의존적이거나 연장된 의존성(예, 보조인자 NADH 및 NADPH에 대한 의존성)을 가진 효소 쌍의 이용가능성은 보조인자 재생을 간략화할 수 있기 때문에 유리할 것이다.

WO　2012/080504는 씨. 애로파시엔스 서열의 아미노산 라디칼 36 내지 42의 서열 영역에서 씨. 애로파시엔스 유래의 신규 7β-HSDH 돌연변이체, 및 UDCA의 제조를 위한 생물촉매적 공정, 특히 또한 신규 전체-세포 공정을 기술하고 있으며, 여기서, 7β-HSDH 및 3α-HSDH는 기질 상에서 함께 작용한다.

WO　2011/147957은 UDCA의 제조에 특히 적합한 신규 넉아웃 균주가, 원하지 않는 7α-HSDH 효소 활성을 표적화된 방식으로 차단(switch off)할 수 있었기 때문에 이러한 균주에 관해 기술하고 있다.

Hwang 등은 PLOS ONE(2013), 8, 5, e63594에서, 씨. 테스토스테로니 유래의 3α-HSDH의 특정한 단일 돌연변이체(P185A, G 또는 W; T188A, S 또는 W) 및 이중 돌연변이체(W173F/P185W 및 W173F/T188W)를 언급하고 있다. N-His 태그를 가진 이들 돌연변이체는 기질 안드로스테론의 NAD-의존적인 산화에 대해 제안되어 있다. 다른 기질들은 논의되어 있지 않다.

본 발명의 과제는 추가로 개선된 3α-HSDH를 제공하는 것이다. 특히, 3-위치에서 DHCA의 입체특이적 환원을 통해 UDCA의 효소적 제조 또는 미생물학적 제조에 훨씬 더 유리하게 이용될 수 있으며, 특히 기질 및/또는 보조인자에 대해 개선된 활성, 및/또는 감소된 기질 저해 및/또는 변경된 보조인자 이용성(증가된, 변형된 특이성 또는 넓혀진 의존성)을 가진 효소 돌연변이체를 제공하고자 하였다.

놀랍게도, 코마모나스(Comamonas) 속, 특히 코마모나스 테스토스테로니 균주의 호기성 박테리아 유래의 3α-HSDH의 개선된 돌연변이체를 발생시키고 특징화함으로써, 그리고 이러한 돌연변이체를 콜산 화합물의 전환, 특히 UDCA의 생성에 이용함으로써, 상기 문제점들을 해결할 수 있었다.

구조적 양태 및 상동성 양태를 기재로, 본 발명에 따라 조효소 결합 또는 심지어 기질 인지에 관여할 서열 영역을 한정하려는 시도가 이루어져 왔다. 이로써, 이들 영역의 아미노산을 돌연변이발생(mutagenesis)에 의해 표적화된 방식으로 변형시켜, 이러한 구조적 변형에 의해 효소의 특성을 변형시키는 가능성이 존재한다. 따라서, 코마모나스 테스토스테로니의 3α-HSDH의 경우 약 8 내지 68 주위의 아미노산 영역에서 조효소 결합에 관여하는 "로스만 폴드(Rossmann fold)"라는 것이 알려져 있다. 본 발명에 따르면, 현재, 효소가 NADH 대신에 NADPH를 수용하도록, 이러한 조효소 결합 영역에서 아미노산을 변형시키려는 시도가 특히 이루어져 왔다. 위치 68의 아미노산인 루신을 알라닌으로 대체하는 시도 동안, 놀랍게도, 이러한 3α-HSDH 돌연변이체가 확연하게 더 높은 활성을 가진다는 것이 발견되었다. 이는 또한 후속해서, 복수의 추가적인 돌연변이체들이 야생형 효소보다 더 높은 활성을 보여주었으며 이들 모두 위치 68에 돌연변이를 가졌던 한, 확인되었다. 심지어, 동종성(homogeneity)까지 정제되었으며 상응하게 정제된 야생형 효소와 비교되었던 효소 돌연변이체가 확연하게 더 높은 특이적인 효소 활성을 나타내었다.

개선된 활성은 단백질의 양을 기준으로, 돌연변이체 3α-HSDH [R34N], 3α-HSDH [R34C], 3α-HSDH [L68A], 3α-HSDH [L68C], 3α-HSDH [L68K], 3α-HSDH [L68S] 및 이중 돌연변이체 3α-HSDH [R34N/L68A]의 비활성(specific activity), 즉 활성값의 증가에 의해 명확하게 확인될 수 있다. 아미노산의 교환은 스펠링에 의해 표시되며; 예를 들어, R34N은, 위치 34에서 아르기닌(R)이 아스파라긴(N)으로 대체되었음을 의미한다. 씨. 테스토스테로니로부터 수득될 수 있는 3α-HSDH, 또는 C-말단 헥사히스티딘(His) 태그가 제공된 이러한 효소는 야생형 효소로 지칭된다.

더욱이, 기질 CDCA 및/또는 NADH에 대해 단일 돌연변이체, 예컨대 3α-HSDH [T188A], 3α-HSDH [T188S] 및 이중 돌연변이체, 예컨대 3α-HSDH [L68A/T188A] 또는 3α-HSDH [L68A/T188S]에서 확연하게 개선된 비활성이 존재하는 것으로 확인되었다.

더욱이, 상기 문제점은, 임의의 서열에서 동시에 또는 시차를 두고 수행될 수 있는, 본원에 기술된 3α-HSDH 돌연변이체 및 7β-HSDH에 의해 촉매화되는 2개의 환원 부분-단계들을 통한 12-케토-UDCA로의 DHCA의 효소적 전환 단계, 및 2개의 환원 부분-단계들로부터 소모된 보조인자를 재생시키는, 데하이드로게나제를 사용한 보조인자 재생 단계를 포함하는, 생체촉매적(미생물학적 및/또는 효소적) 방법을 제공함으로써 해결되어 왔다.

도　1a는 콜린셀라 애로파시엔스 7β-HSDH의 아미노산 서열(서열번호 2)을 보여주며, 도　1b는 도　1a의 아미노산 서열에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호 1)을 보여주고; 도　1c는 코마모나스 테스토스테로니 3α-HSDH의 아미노산 서열(서열번호 4)을 보여주며, 도　1d는 도 1c의 아미노산 서열에 대한 코딩 핵산 서열(서열번호 3)을 보여주며;
도　2a는 코마모나스 테스토스테로니 3α-HSDH의 아미노산 서열을 보여주며; 이는 His-태그 서열 LEHHHHHH에 의해 C-말단에서 연장되며; 도　2b는 이로부터 유래된 돌연변이체 3α-HSDH[R34N]를 보여주며; 도　2c는 이로부터 유래된 돌연변이체 3α-HSDH[L68A]를 보여주고; 도 2d는 이로부터 유래된 돌연변이체 3α-HSDH[R34N/L68A]를 보여주며;
도　3은 각각 기질 DHCA(상부 이미지) 및 보조인자 NADH(하부 이미지)에 대한, His 태그가 있는 정제된 3α-HSDH의 미카엘리스-멘텐 카이네틱스(Michaelis-Menten kinetics)를 보여준다.
도　4는 기질 DHCA(상부 이미지) 및 보조인자 NADH(하부 이미지)에 대한, 알라닌 돌연변이체 [L68A]의 미카엘리스-멘텐 카이네틱스를 보여준다.
도　5는 LB에서 쉐이크 플라스크 발효에서 발현 후, 3α-HSDH [R34N/L68A](좌측 이미지) 및 3α-HSDH [L68A](우측 이미지)의 SDS 겔을 보여준다. 적용된 가용성 분획은 세포-무함유 미정제 추출물이다. 3α-HSDH의 크기는 약 27.4　kDa이다. 약 10 ㎍의 단백질이 적용되었다. 키(key): 1은 정제된 3α-HSDH [R34N/L68A]이며; 2는 미정제 추출물 3α-HSDH [R34N/L68A]이며; 3은 정제된 3α-HSDH [L68A]이고; 4는 미정제 추출물 3α-HSDH [L68A]이다.
도　6은 기질 DHCA(상부 이미지) 및 조효소 NADH(하부 이미지)에 대한 이중 돌연변이체[R34N/L68A]의 미카엘리스-멘텐 카이네틱스를 보여준다.
도　7은 야생형 효소, 돌연변이체 L68A 및 이중 돌연변이체 R34N/L68A의 카이네틱스 상수의 비교를 보여준다(기질 DHCA: 상부 이미지 및 조효소 NADH: 하부 이미지).
도 8은 각각의 경우 미정제 추출물과 함께 기록되어 있는, 기질 DHCA에 대한 야생형 3α-HSDH의 미카엘리스-멘텐 카이네틱스를 보여준다. 점이 표시되어 있는 곡선은 His 태그를 포함하지 않는 효소에 대해 기질 농도에 대한 반응 속도의 의존성을 보여주며, 삼각형이 표시되어 있는 곡선은 C-말단 His 태그를 포함하는 효소에 대한 것이다.
도 9는 3xHis 태그 및 9xHis 태그(좌측 이미지) 및 표준 6xHis 태그(우측 이미지)를 포함하는 3α-HSDH의 SDS 겔을 보여준다. LB 배지에서 쉐이크 플라스크 발효 시 발현을 수행하였다. 적용된 가용성 분획은 세포-무함유 미정제 추출물 및 정제된 단백질이다. 3α-HSDH 3xHis의 크기는 약 27.1 kDa이며, 6xHis의 크기는 약 27.5 kDa이고, 9xHis의 크기는 약 27.9 kDa이다. 약 10 ㎍의 단백질이 적용되었다.

특히, 본 발명은 하기 구체적인 실시형태에 관한 것이다:

1. 상응하는 3-하이드록시스테로이드로의 3-케토스테로이드의 입체특이적 효소적 환원(예, 특히 NADH 및/또는 NADPH, 특히 NADH의 화학양론적 소모 하에, 12-케토-UDCA 또는 7,12-다이케토-3α-CA(7,12-다이케토-LCA)로의 3,12-다이케토-7β-CA 또는 DHCA의 입체특이적 효소적 환원)을 적어도 촉매화하는 3α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(3α-HSDH)로서,

상기 효소는 서열번호 4의 위치 34 및/또는 위치 68에 돌연변이를 포함하거나, 이로부터 유래되며 서열번호 4와 적어도 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열의 상응하는 서열 위치에 돌연변이를 포함하고/거나;

C-말단 방향에, 25개 이하, 특히 15개, 14개, 13개, 12개, 11개 또는 10개 이하의 동일하거나 상이한(단백질원성(proteinogenic)) 아미노산 라디칼, 특히 1개 내지 10개, 예를 들어, 3개 내지 9개의 염기성 아미노산 라디칼, 예컨대 라이신, 아르기닌 또는 특히 히스티딘(예, 3xHis, 6xHis 또는 9xHis)을 포함하는 펩타이드 사슬만큼 사슬 연장을 포함하며;

히스티딘 잔기는 C-말단에 직접 결합되거나, 임의의 1개 내지 10개, 특히 1개 내지 3개의 아미노산 라디칼을 포함하는 링커기를 통해 결합되는 것이 가능한, 3α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(3α-HSDH).

언급될 수 있는 예로는, LEHHH, LEHHHHHH 및 LEHHHHHHHHH가 있다. 더욱이, 주제는, 하나 이상의 상기 돌연변이에 부가적으로 또는 이에 대한 대안으로서 25개 이하의 동일하거나 상이한 아미노산 라디칼만큼 N-말단 사슬 연장을 포함하는 3α-HSDH이다. 이들은 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개 또는 10개 이하의 동일하거나 상이한 (단백질원성) 아미노산 라디칼, 특히 1개 내지 10개, 예를 들어 3개 내지 9개의 염기성 아미노산 라디칼, 예컨대 라이신, 아르기닌 또는 특히 히스티딘(예, 3xHis, 6xHis 또는 9xHis)을 포함하는 펩타이드 사슬만큼 연장되며; 히스티딘 잔기는 N-말단에 직접 결합되거나, 임의의 1개 내지 10개의 아미노산 라디칼을 포함하는 링커기를 통해 결합되는 것이 가능하다. 언급될 수 있는 예는 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-이다.

예를 들어, 바람직한 3α-HSDH는 위치 34 및/또는 위치 68에 돌연변이를 포함하고, 선택적으로는 N-말단 또는 C-말단 방향으로 부가적으로 연장되거나; 3α-HSDH는 오로지 N-말단 또는 C-말단 방향으로만 연장되며; 각각의 경우 본원에 정의된 바와 같이 보다 상세히 기술된다.

더욱이, 본 발명은 서열번호 4에 따라 돌연변이화되지 않은 네이티브(native) 효소를 포함하며, 이는 전술한 바와 같이 오로지 N-말단 또는 C-말단 방향으로만 변형된다.

2. 상응하는 3-하이드록시스테로이드로의 3-케토스테로이드의 입체특이적 효소적 환원을 적어도 촉매화하고, 서열번호 4에서 아미노산 돌연변이에 의해 변형된 아미노산 서열을 가진 3α-HSDH로서,

상기 아미노산 서열 돌연변이는,

a) R34X₁ 및/또는

b) L68X₂,

여기서,

X₁은 아르기닌(R) 이외의 아미노산 라디칼, 특히 단백질원성 아미노산 라디칼, 특히 임의의 비활성을 증가시키고/거나 기질 저해를 감소시키고/거나 보조인자 이용성 또는 보조인자 의존성을 변형시키는 아미노산, 특히 천연 아미노산을 나타내고;

X₂는 루신(L) 이외의 단백질원성 아미노산 라디칼, 특히 임의의 비활성을 증가시키고/거나 기질 저해를 감소시키고/거나 보조인자 이용성 또는 보조인자 의존성을 변형시키는 아미노산, 특히 천연 아미노산을 나타냄;

c) 1개 내지 10개의 히스티딘(H) 잔기를 포함하는 사슬에 의해 C-말단 방향으로 연장되는 첨가 돌연변이체로서, 예를 들어, 히스티딘 잔기는 C 말단에 직접 결합되거나, 1개 내지 10개, 특히 1개 내지 3개의 아미노산 라디칼을 포함하는 링커기를 통해 결합되는 것이 가능한, 첨가 돌연변이체; 및/또는

d) 1개 내지 10개의 히스티딘(H) 잔기에 의해 N-말단 방향으로 연장되는 첨가 돌연변이체로서, 예를 들어, 히스티딘 잔기는 C 말단에 직접 결합되거나, 1개 내지 10개의 아미노산 라디칼을 포함하는 링커기를 통해 결합되는 것이 가능한, 첨가 돌연변이체

를 포함하는 단일 돌연변이 또는 다중 돌연변이로부터 선택되고,

돌연변이화된, 즉 변형된 아미노산 서열은 서열번호 4와 80% 내지 100% 미만, 예를 들어, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 서열 동일성을 가지는, 3α-HSDH.

3. 실시형태 1 또는 2에 있어서,

a) 단일 돌연변이체

R34X₁ 및

L68X₂, 및

b) 이중 돌연변이체

R34X₁/L68X₂

여기서,

X₁은 N, C, S 또는 L을 나타내며,

X₂는 A, G, C, K, S 또는 V를 나타내고,

X₁, X₂의 특히 바람직한 조합은 X₁ = N 및/또는 X₂ = A를 포함함;

c) 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드 사슬에 의해 C-말단 방향으로 연장되는 첨가 돌연변이체로서, 예를 들어, 히스티딘 잔기는 C 말단에 직접 결합되거나, 1개 내지 10개, 특히 1개 내지 3개의 아미노산 라디칼을 포함하는 링커기를 통해 결합되는 것이 가능한, 첨가 돌연변이체;

d) 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 펩타이드 사슬에 의해 N-말단 방향으로 연장되는 첨가 돌연변이체로서, 예를 들어, 히스티딘 잔기는 N 말단에 직접 결합되거나, 1개 내지 10개의 아미노산 라디칼을 포함하는 링커기를 통해 결합되는 것이 가능한, 첨가 돌연변이체; 및

e) a) 및 b)에 따른 돌연변이체로서, 각각의 경우 c) 및/또는 d), 특히 c) 또는 d)에 따른 첨가 돌연변이를 부가적으로 포함하는, 돌연변이체

로부터 선택되는, 3α-HSDH.

적합한 돌연변이체의 비제한적인 예로는,

[R34N], [R34C], [R34S], [R34L], [L68A], [I68C], [L68K], [L68S], [L68V] 및 [L68G]를 포함하는 단일 돌연변이체

[R34N/L68A]를 포함하는 이중 돌연변이체가 있으며,

각각의 경우, 둘 다 His 태그를 포함하지 않으며, C-말단 His 태그 및/또는 N-말단 His 태그를 포함한다.

4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 한 실시형태에 있어서,

서열번호 4를 포함하는 돌연변이화되지 않은 네이티브 3α-HSDH와 비교하여, 하기 특성 프로파일을 보여주는, 3α-HSDH:

a. 보조인자인 NADH를 이용한 DHCA의 효소적 환원에서 데하이드로콜산(DHCA)에 대한 증가된 비활성(V_max[U/mg]); 여기서, 예를 들어, 돌연변이화되지 않은 효소와 비교하여, 보조인자 NAD(P)H의 존재 하에서의 비활성(U/mg)은 적어도 1%, 5%, 10%, 50% 또는 100%만큼 증가되지만, 특히 적어도 1배, 특히 2배 내지 100배, 3배 내지 20배, 또는 5배 내지 10배만큼 증가됨;

b. DHCA에 의한 감소된 기질 저해로서, 예를 들어, Ki 값은 10　mM 초과, 예를 들어, 11 mM 내지 200　mM, 12 mM 내지 150　mM, 또는 15 mM 내지 100　mM의 범위에 있음;

c. 이들 특성 a) 및 b)는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있으며, 즉, 오로지 a), 오로지 b), 오로지 c), a)와 b), a)와 c) 또는 b)와 c)가 존재할 수 있음.

5. 상응하는 3-하이드록시스테로이드로의 3-케토스테로이드의 입체특이적 효소적 환원(예, 특히 NADH 및/또는 NADPH의 화학양론적 소모, 특히 NADH의 화학양론적 소모 하에, 12-케토-UDCA 또는 7,12-다이케토-3α-CA(7,12-다이케토-LCA)로의 3,12-다이케토-7β-CA 또는 DHCA의 입체특이적 효소적 환원)을 적어도 촉매화하는 3α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(3α-HSDH)로서,

상기 효소는 서열번호 4의 위치 188 및/또는 위치 185 및 선택적으로 위치 68에 돌연변이를 포함하거나, 서열번호 4와 적어도 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열의 상응하는 서열 위치에 돌연변이를 포함하고/거나;

15개, 14개, 13개, 12개, 11개 또는 10개 이하의 동일하거나 상이한 (단백질원성) 아미노산 라디칼, 특히 1개 내지 10개, 예를 들어, 3개 내지 9개의 염기성 아미노산 라디칼, 예컨대 라이신, 아르기닌 또는 특히 히스티딘(예, 3xHis, 6xHis 또는 9xHis)을 포함하는 펩타이드 사슬만큼 C-말단 사슬 연장을 포함하며;

히스티딘 잔기는 C-말단에 직접 결합되거나, 임의의 1개 내지 3개의 아미노산 라디칼을 포함하는 링커기를 통해 결합되는 것이 가능한, 3α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(3α-HSDH).

언급될 수 있는 예로는, LEHHH, LEHHHHHH 및 LEHHHHHHHHH가 있다. 더욱이, 주제는, 하나 이상의 상기 돌연변이에 부가적으로 또는 이에 대한 대안으로서 25개 이하의 동일하거나 상이한 아미노산 라디칼만큼 N-말단 사슬 연장을 포함하는 3α-HSDH이다. 이들은 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개 또는 10개 이하의 동일하거나 상이한 (단백질원성) 아미노산 라디칼, 특히 1개 내지 10개, 예를 들어 3개 내지 9개의 염기성 아미노산 라디칼, 예컨대 라이신, 아르기닌 또는 특히 히스티딘(예, 3xHis, 6xHis 또는 9xHis)을 포함하는 펩타이드 사슬만큼 연장되며; 히스티딘 잔기는 N-말단에 직접 결합되거나, 임의의 1개 내지 10개의 아미노산 라디칼을 포함하는 링커기를 통해 결합되는 것이 가능하다. 언급될 수 있는 예는 MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-이다.

예를 들어, 바람직한 3α-HSDH는 각각 위치 188 및/또는 위치 185 및 선택적으로 위치 68에 돌연변이를 포함하고, 선택적으로는 N-말단 또는 C-말단 방향으로 부가적으로 연장되거나; 3α-HSDH는 오로지 N-말단 또는 C-말단 방향으로만 연장되며; 각각의 경우 본원에 정의된 바와 같이 보다 상세히 기술된다.

6. 상응하는 3-하이드록시스테로이드로의 3-케토스테로이드의 입체특이적 효소적 환원을 적어도 촉매화하고, 서열번호 4에서 아미노산 돌연변이에 의해 변형된 아미노산 서열을 가진 3α-HSDH로서,

상기 아미노산 서열 돌연변이는,

a) P185X₁ 및/또는

b) T188X₃

및 선택적으로 부가적으로는

c) L68X₂

여기서,

X₁은 프롤린(P) 이외의 (단백질원성) 아미노산 라디칼을 나타내며;

X₂는 루신(L) 이외의 단백질원성 아미노산 라디칼을 나타내고;

X₃는 트레오닌(T) 이외의 단백질원성 아미노산 라디칼을 나타냄;

d) 선택적으로 부가적으로는, 1개 내지 10개의 히스티딘(H) 잔기를 포함하는 C-말단 방향 연장; 및/또는 선택적으로 부가적으로는, 1개 내지 10개의 히스티딘(H) 잔기를 포함하는 N-말단 방향 연장

을 포함하는 단일 돌연변이 또는 다중 돌연변이로부터 선택되고,

돌연변이화된, 즉 변형된 아미노산 서열은 서열번호 4와 80% 내지 100% 미만, 예를 들어, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 서열 동일성을 가지는, 3α-HSDH.

7. 실시형태 5 또는 6에 있어서,

a) 단일 돌연변이체

P185X₁

T188X₃

b) 이중 돌연변이체

P185X₁/T188X₃;

L68X₂/T188X₃;

L68X₂/T185X₁;

여기서,

X₁은 A, T, S, G 또는 V, 특히 A를 나타내며;

X₂는 A, G, C, K, S 또는 V, 특히 A를 나타내고;

X₃는 A, G, W, S 또는 V, 특히 A 또는 S를 나타냄;

c) 선택적으로 부가적으로는, 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 C-말단 방향 연장으로서, 예를 들어, 히스티딘 잔기는 C 말단에 직접 결합되거나, 1개 내지 10개의 아미노산 라디칼을 포함하는 링커기를 통해 결합되는 것이 가능한, C-말단 방향 연장; 및/또는

d) 선택적으로 부가적으로는, 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 N-말단 방향 연장으로서, 예를 들어, 히스티딘 잔기는 N 말단에 직접 결합되거나, 1개 내지 10개의 아미노산 라디칼을 포함하는 링커기를 통해 결합되는 것이 가능한, N-말단 방향 연장; 및

e) a) 및 b)에 따른 돌연변이로서, 각각의 경우 c) 및/또는 d), 특히 c) 또는 d)에 따른 첨가 돌연변이를 부가적으로 포함하는, 돌연변이

로부터 선택되는, 3α-HSDH.

언급되어야 하는 것들은 특히, 이중 돌연변이체 P185X₁/T188X₃; L68X₂/T188X₃; L68X₂/T185X₁이며; 이는 상기 정의된 바와 같은 N-말단 연장 또는 C-말단 연장을 포함하거나 포함하지 않는다.

적합한 돌연변이체의 비제한적인 예로는,

[T188A], [T188S], [T188G], [T188V], [T188W], [P185A], [P185T], [P185S], [P185G], [P185V], [P185A]를 포함하는 단일 돌연변이체;

[L68A/T188A] 및 [L68A/T188S]를 포함하는 이중 돌연변이체가 있으며,

각각의 경우, 둘 다 His 태그를 포함하지 않으며, C-말단 His 태그 및/또는 N-말단 His 태그를 포함한다.

8. 실시형태 5 내지 7 중 어느 한 실시형태에 있어서,

서열번호 4를 포함하는 돌연변이화되지 않은 네이티브 3α-HSDH와 비교하여, 하기 특성 프로파일을 보여주는, 3α-HSDH:

a. 보조인자인 NADH를 이용한 DHCA의 효소적 환원에서 데하이드로콜산(DHCA)에 대한 증가된 비활성(V_max[U/mg]); 여기서, 예를 들어, 돌연변이화되지 않은 효소와 비교하여, 보조인자 NADH의 존재 하에서의 비활성(U/mg)은 적어도 1%, 5%, 10%, 50% 또는 100%만큼 증가되지만, 특히 적어도 1배, 특히 2배 내지 100배, 3배 내지 20배, 또는 5배 내지 10배만큼 증가됨;

b. DHCA에 의한 감소된 기질 저해로서, 예를 들어, Ki 값은 10　mM 초과, 예를 들어, 11 mM 내지 200　mM, 12 mM 내지 150　mM, 또는 15 mM 내지 100　mM의 범위에 있음;

c. 보조인자인 NADH를 이용한 DHCA의 효소적 환원에서 NADH에 대한 증가된 비활성(V_max[U/mg]); 여기서, 예를 들어, 돌연변이화되지 않은 효소와 비교하여, DHCA의 존재 하에서의 비활성(U/mg)은 적어도 1%, 5%, 10%, 50% 또는 100%만큼 증가되지만, 특히 적어도 1배, 특히 2배 내지 100배, 3배 내지 20배, 또는 5배 내지 10배만큼 증가됨;

이들 특성 a) 내지 c)는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있으며, 즉, 오로지 a), 오로지 b), 오로지 c), a)와 b), a)와 c) 또는 b)와 c)가 존재할 수 있음.

9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 한 실시형태에 따른 3α-HSDH를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열.

언급될 수 있는 예는 하기 핵산 서열들 중에서 선택되는 핵산 서열이며:

a) GDH 및 실시형태 1 내지 8 중 어느 한 실시형태에 따른 3α-HSDH 돌연변이체, 및 선택적으로 7β-HSDH를 동시에 코딩하는 핵산 서열;

b) GDH 및 실시형태 1 내지 8 중 어느 한 실시형태에 따른 3α-HSDH 돌연변이체, 및 선택적으로 7β-HSDH를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열;

여기서, 코딩 서열은 서로 독립적으로, 구축물, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 내지 10개의 복사물에서 단일로 또는 다중으로 존재할 수 있다. 따라서, 개별 발현 생성물의 활성에서 임의의 기존의 차이는 적합한 복사수(copy number)를 선택함으로써 보상될 수 있다.

10. 적어도 하나의 조절 서열의 조절 하에 실시형태 9에 따른 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열, 및 선택적으로 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제, 특히 7β-HSDH, 및 보조인자 재생에 적합한 데하이드로게나제, 예를 들어, FDH, GDH, ADH, G-6-PDH, PDH로부터 선택되는 적어도 하나의(예, 1개, 2개 또는 3개의) 추가적인 효소에 대한 코딩 서열을 포함하는, 발현 카세트.

특히, 발현 카세트에 존재하는 효소는, 상이하지만 바람직하게는 동일한 보조인자 쌍, 예를 들어 보조인자 NAD⁺/NADH 또는 NADP⁺/NADPH 쌍을 이용할 수 있다.

11. 실시형태 10에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터.

12. 실시형태 9에 따른 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열, 실시형태 10에 따른 적어도 하나의 발현 카세트 또는 실시형태 11에 따른 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 재조합 미생물.

13. 실시형태 12에 있어서,

하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(HSDH) 및 보조인자 재생에 적합한 데하이드로게나제로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 효소에 대한 코딩 서열을 부가적으로 선택적으로 포함하는 재조합 미생물.

14. 실시형태 13에 있어서,

추가적인 HSHD가 7β-HSDH로부터 선택되고;

데하이드로게나제가 NADPH-재생 효소, 예컨대 NADPH 데하이드로게나제, 알코올 데하이드로게나제(ADH) 및 NADPH-재생 포르메이트 데하이드로게나제(FDH), 또한 글루코스 데하이드로게나제(GDH), 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G-6-PDH) 또는 포스파이트 데하이드로게나제(PtDH), 또는 NADH-재생 효소, 예컨대 NADH 데하이드로게나제, NADH-재생 포르메이트 데하이드로게나제(FDH), NADH-재생 알코올 데하이드로게나제(ADH), NADH-재생 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PDH), NADH-재생 포스파이트 데하이드로게나제(PtDH) 및 NADH-재생 글루코스 데하이드로게나제(GDH)로부터 선택되는, 재조합 미생물.

언급될 수 있는 일례는 본 발명의 3α-HSDH 돌연변이체, 본원에 기술된 GDH, 및 선택적으로 본원에 기술된 7β-HSDH를 동시에 발현할 수 있는 재조합 미생물이다.

재조합 미생물은 3α-HSDH 돌연변이체, GDH 또는 이의 돌연변이체 및 7β-HSDH에 대한 코딩 서열 및 하나 이상의(상이한) 발현 구축물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 주제는, 3α-HSDH 돌연변이체, GDH 또는 이의 돌연변이체 및 7β-HSDH 또는 이의 돌연변이체에 대한 코딩 서열을 하나 이상의 복사물, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 내지 10개의 복사물에 포함하는 단일-플라스미드 시스템으로 변형된(예, 형질전환된) 재조합 미생물이다. 따라서, 본 발명의 주제는 또한, 7β-HSDH 또는 이의 돌연변이체, GDH 또는 이의 돌연변이체 및 3α-HSDH 또는 이의 돌연변이체에 대한 코딩 서열을 하나 이상의 복사물, 예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 내지 10개의 복사물에 포함하는 단일-플라스미드 시스템으로 변형된(예, 형질전환된) 재조합 미생물이다. 그러나, 효소(7β-HSDH, GDH 및 3α-HSDH 또는 이들의 돌연변이체)는 또한, 서로 상용성인(compatible) 2개 또는 3개의 개별 플라스미드 상의 하나 이상의 복사물에 존재할 수도 있다. 단일-플라스미드 시스템 및 다중복사(multicopy) 플라스미드의 제조에 적합한 기본적인 벡터는 당업자에게 알려져 있다. 단일-플라스미드 시스템의 언급될 수 있는 예는 예를 들어 pET21a이고, 다중복사 플라스미드의 언급될 수 있는 예는 예를 들어 Duet 벡터, 예컨대 pACYCDuet-1, pETDuet-1, pCDFDuet-1, pRSFDuet-1 및 pCOLADuet-1이며, 이들은 Novagen사로부터 입수가능하다. 이들 벡터, 이들과 다른 벡터들과의 상용성, 및 미생물 숙주 균주는 예를 들어, Novagen사의 "User Protocol" TB340 Rev. E0305에서 찾을 수 있다.

플라스미드 시스템을 발생시키기 위한 효소들의 최적의 조합은 본 발명의 교시를 고려하여, 당업자에 의해 과도한 부담 없이 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 당업자는 예를 들어 각각의 경우에 사용되는 HSDH 효소의 보조인자 특이성의 함수로서 상기 언급된 데하이드로게나제, 특히 GDH 및 이들의 각각의 돌연변이체로부터 선택되는, 보조인자 재생에 최적화된 효소를 선택할 수 있다.

더욱이, 2개 이상의 플라스미드로의 전환에 선택되는 효소를 분배하고, 이렇게 해서 제조된 플라스미드를 사용하여 2개 이상의 상이한 재조합 미생물을 제조한 다음, 이들을 함께 본 발명의 생체촉매적 전환에 이용하는 것이 가능하다. 이러한 맥락에서, 플라스미드의 제조에 사용되는 각각의 효소 조합은 특히 유사한 보조인자의 이용을 필요로 하면서 발생할 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 제1 미생물은 7β-HSDH 또는 이의 돌연변이체 및 GDH에 대한 코딩 서열을 가진 플라스미드를 사용하여 변형될 수 있다. 이와는 대조적으로, 제2 미생물은 3α-HSDH 또는 이의 돌연변이체에 대한 코딩 서열 및 GDH에 대한 코딩 서열을 가진 플라스미드를 사용하여 변형될 수 있다. 효소 쌍 둘 다는, 이들이 동일한 보조인자 쌍을 재생할 수 있도록 선택될 수 있다. 그런 다음, 2개의 미생물은 둘 다 본 발명의 생체촉매적 전환에 동시에 이용될 수 있다.

2개의 개별 생체촉매(제조합 미생물)의 사용은, 모든 합성 효소들이 발현되는 오로지 1개의 생체촉매의 사용을 능가하는 2개의 필수적인 이점을 가질 수 있다:

a) 2개의 생체촉매는 모두 유전적으로 변형될 수 있고, 서로 개별적으로 최적화될 수 있다. 특히, NADH 또는 NADPH의 재생에 최적화된 다양한 보조인자 재생 효소들을 사용하는 것이 가능하다.

b) 생체촉매 작용에 대해 생체촉매를 상이한 비율로 이용하는 것이 가능하다. 이는, 생체촉매 작용 동안, 심지어 모든 생체촉매들이 이미 제조된 후라도, 다중효소 공정의 개별 반응 속도에 관여할 수 있게 한다.

15. 실시형태 12 내지 14 중 어느 한 실시형태에 있어서,

재조합 미생물이 7α-HSDH 넉아웃 균주이며,

균주가 예를 들어, WO　2011/147957에 기술된 바와 같은 것인, 재조합 미생물.

16. 3α-하이드록시스테로이드의 효소적 합성 또는 미생물적 합성 방법으로서,

상응하는 3-케토스테로이드가, 실시형태 1 내지 8 중 어느 한 실시형태에 따른 3α-HSDH의 존재 하에, 또는 이러한 3α-HSDH를 발현하는 실시형태 12 내지 15 중 어느 한 실시형태에 따른 재조합 미생물의 존재 하에 환원되고,

선택적으로 적어도 하나의 형성된 환원 생성물이 반응 혼합물로부터 단리되는, 방법.

17. 실시형태 16에 있어서,

3-케토스테로이드가 데하이드로콜산(DHCA), 이들의 유도체, 예컨대 특히, 산의 염, 아미드 또는 알킬 에스테르로부터 선택되는, 방법.

18. 실시형태 16 또는 17에 있어서,

환원이 NADPH 및/또는 NADH의 존재 하에, 특히 NADPH 및/또는 NADH의 소모 시 발생하는, 방법.

19. 실시형태 18에 있어서,

소모된 NADPH가 NADPH-재생 효소와 커플링함으로써 재생되며,

NADPH-재생 효소가 특히 NADPH 데하이드로게나제, 알코올 데하이드로게나제(ADH), NADPH-재생 포르메이트 데하이드로게나제(FDH) 및 NADPH-재생 글루코스 데하이드로게나제(GDH)로부터 선택되며,

NADPH-재생 효소는 선택적으로 재조합 미생물에 의해 발현되고/거나;

소모된 NADH가 NADH-재생 효소와 커플링함으로써 재생되며,

NADH-재생 효소가 특히 NADH-데하이드로게나제, NADH-재생 포르메이트 데하이드로게나제(FDH), NADH-재생 알코올 데하이드로게나제(ADH), NADH-재생 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PDH), NADH-재생 포스파이트 데하이드로게나제(PtDH) 및 NADH-재생 글루코스 데하이드로게나제(GDH)로부터 선택되며,

NADH-재생 효소가 선택적으로 재조합 미생물에서 발현되는, 방법.

20. 실시형태 19에 있어서,

NADPH-재생 효소가

a) CO₂로의 포름산의 효소적 산화를 적어도 촉매화하는 NAD⁺-의존적 FDH의 돌연변이체를 포함한 FDH; 및

b) GDH

로부터 선택되며,

돌연변이화되지 않은 효소와 비교하여 상기 돌연변이체가 NADP⁺를 보조인자로서 부가적으로 수용하는, 방법.

21. 식 (1)의 우르소데옥시콜산(UDCA)의 제조 방법으로서,

상기 식 (1)에서,

R은 알킬, H, 알칼리 금속 이온 또는 N(R³)₄ ⁺를 나타내며,

라디칼 R³는 동일하거나 상이하고, H 또는 알킬을 나타내거나,

기 -CO₂R은 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체되며,

R¹ 및 R²는 서로 독립적으로 알킬 라디칼을 나타내며;

a) 선택적으로 식 (2)의 콜산(CA)은:

식 (3)의 데하이드로콜산(DHCA)으로 화학적으로 산화되며:

상기 식 (2)에서, R은 상기 언급된 의미를 가지거나, 기 -CO₂R은 상기 정의된 바와 같이 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체되고,

상기 식 (3)에서, R은 상기 언급된 의미를 가지거나, 기 -CO₂R은 상기 정의된 바와 같이 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체됨;

b) DHCA는 실시형태 1 내지 8 중 어느 한 실시형태에 따른 적어도 하나의 3α-HSDH 돌연변이체의 존재 하에(단리된 효소로서 존재하거나 상응하는 재조합 미생물에 의해 발현됨), 및 적어도 하나의 7β-HSDH의 존재 하에(단리된 효소로서 존재하거나 상응하는 재조합 미생물에 의해 발현됨), 특히 NADH 및/또는 NADPH의 존재 하에 NADH 및/또는 NADPH의 소모 시, 식 (5)의 상응하는 12-케토-우르소데옥시콜산(12-케토 UDCA)으로 환원되며:

상기 식 (5)에서, R은 상기 언급된 의미를 가지거나, 기 -CO₂R은 상기 정의된 바와 같이 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체됨; 후속적으로

c) 식 (5)의 12-케토-UDCA는 UDCA로 화학적으로 환원되고;

d) 선택적으로, 반응 생성물은 추가로 정제되는, 방법.

22. 실시형태 21에 있어서,

적어도 단계 b)가 실시형태 12 내지 15 중 어느 한 실시형태에 따른 재조합 미생물의 존재 하에 수행되는, 방법.

23. 실시형태 21 또는 22에 있어서,

단계 b)가 동일하거나 상이한 보조인자 재생 시스템과 커플링되는, 방법.

24. 식 (1)의 UDCA의 제조 방법으로서,

상기 식 (1)에서,

R은 알킬, H, 알칼리 금속 이온 또는 N(R³)₄ ⁺를 나타내며,

라디칼 R³는 동일하거나 상이하고, H 또는 알킬을 나타내거나,

기 -CO₂R은 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체되며;

a) 선택적으로 식 (2)의 CA는:

식 (3)의 DHCA로 화학적으로 산화되며:

상기 식 (2)에서, R은 상기 언급된 의미를 가지거나, 기 -CO₂R은 상기 정의된 바와 같이 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체되고,

상기 식 (3)에서, R은 상기 언급된 의미를 가지거나, 기 -CO₂R은 상기 정의된 바와 같이 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체됨;

b) DHCA는 적어도 하나의 7β-HSDH 돌연변이체의 존재 하에, 및 적어도 하나의 3α-HSDH의 존재 하에, 특히 NADH 및/또는 NADPH의 존재 하에 NADH 및/또는 NADPH의 소모 시, 식 (5)의 상응하는 12-케토 UDCA로 환원되며:

상기 식 (5)에서, R은 상기 언급된 의미를 가지거나, 기 -CO₂R은 상기 정의된 바와 같이 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체됨; 후속적으로

c) 식 (5)의 12-케토-UDCA는 UDCA로 화학적으로 환원되고;

d) 선택적으로, 반응 생성물은 추가로 정제되며,

단계 b)의 전환은 실시형태 12 내지 15 중 어느 한 실시형태에 따른 재조합 미생물의 존재 하에, 예를 들어 실시형태 12 내지 15 중 어느 한 실시형태에 따른 하나 이상의 상이한 재조합 미생물의 전체 세포의 존재 하에 수행되며,

미생물(들)은 본원에서 보다 상세히 기술되는 방식으로 전환 및 보조인자 재생에 필요한 효소들을 포함하는, 방법.

이러한 맥락에서, 공정 단계 b)는 상이한 방식으로 설정될 수 있다. 2개의 효소들(7β-HSDH 돌연변이체 및 3α-HSDH)은 모두 동일한 때에 존재할 수 있거나(예, 2개의 단리된 효소 모두, 또는 2개의 효소 모두를 발현하는 하나 이상의 상응하는 재조합 미생물이 존재하는 원-탑(one-top) 반응), 부분적인 반응이 임의의 요망되는 순서로 진행될 수 있다(우선, 7β-HSDH 돌연변이체-촉매화된 환원이 수행된 다음, 3α-HSDH-촉매화된 환원이 수행되거나; 또는 우선 3α-HSDH-촉매화된 환원이 수행된 다음, 7β-HSDH 돌연변이체-촉매화된 환원이 수행됨).

더욱이, 단계 b)는, NADPH가 글루코스의 소모 시 NADPH-재생 GDH에 의해 재생되는 보조인자 재생 시스템과 커플링될 수 있거나, 또는 소모된 NADH가 NADH-재생 GDH, ADH 또는 FDH에 의해 재생되는 보조인자 재생 시스템과 커플링된다.

25. 특히 적어도 하나의 효소 7β-HSDH, FDH 및/또는 3α-HSDH 또는 이들의 돌연변이체; 또는 7β-HSDH, GDH 및/또는 3α-HSDH 또는 이들의 돌연변이체를 포함하는, 실시형태 16 내지 24 중 어느 한 실시형태에 따른 방법을 수행하기 위한 생물반응기(bioreactor).

본 발명은 본원에 기술된 구체적인 실시형태에 제한되지 않는다. 그보다는, 본 발명의 교시는 당업자가 과도한 부담 없이 본 발명의 추가적인 개발을 제공할 수 있게 한다. 따라서, 예를 들어, 당업자는 추가적인 효소 돌연변이체를 표적화된 방식으로 재생시킬 수 있으며, 이들을 요망되는 특성 프로파일(개선된 보조인자 의존성 및/또는 안정성, 감소된 기질 저해)을 위해 스크리닝 및 최적화할 수 있거나; 당업자는 본 발명에 따라 추가적인 적합한 야생형 효소(7β-HSDH 및 3α-HSDH, FDHs, GDH, ADH 등)를 단리하고 이들 효소를 사용할 수 있다. 더욱이, 당업자는 예를 들어, 사용되는 HSDH, 예컨대 특히 7β-HSDH 및 3α-HSDH 또는 이의 돌연변이체의 특성 프로파일(특히 보조인자 의존성)에 따라, 보조인자 재생에 사용될 수 있는 적합한 데하이드로게나제(GDH, FHD, ADH 등) 및 이의 돌연변이체를 선택할 수 있고, 선택된 효소를 하나 이상의 발현 구축물 또는 벡터에 분배시키고, 따라서 필요하다면, 하나 이상의 재조합 미생물을 생성할 수 있으며, 그런 다음, 이는 전체 세포를 기재로 최적화된 제조 방법을 가능하게 한다.

본 발명의 추가적인 개발

1. 일반적인 정의 및 사용된 약어

다르게 명시되지 않는 한, 용어 "7β-HSDH"는, 특히 NADPH의 화학양론적 소모 및 선택적으로 상응하는 역반응과 함께, 적어도 DHCA 또는 7,12-다이케토-3α-CA(7,12-다이케토-LCA)의 입체특이적 및/또는 위치특이적 환원을 촉매화하여 3,12-다이케토-7β-CA 또는 12-케토-UDCA를 수득하는 데하이드로게나제 효소를 지칭한다. 이러한 맥락에서, 효소는 천연 효소이거나 재조합에 의해 생성된 효소일 수 있다. 효소는 원칙적으로, 세포성 오염물질, 예를 들어 단백질 오염물질과의 혼합물로서 존재할 수 있으나, 바람직하게는 순수한 형태로 존재할 수 있다. 적합한 검출 방법은 예를 들어, 후속되거나 문헌으로부터 알려져 있는 실험 부문에 기술되어 있다(예, 문헌[Characterization of NADP -dependent 7 beta- hydroxysteroid dehydrogenases from Peptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens. S Hirano and N Masuda. Appl Environ Microbiol. 1982]). 이러한 활성을 가진 효소는 EC 넘버 1.1.1.201 하에 분류된다. 적합한 효소는 예를 들어, 콜린셀레아 애로파시엔스(Colinsellea aerofaciens)로부터 단리될 수 있다.

다르게 명시되지 않는 한, 용어 "3α-HSDH"는, 특히 NADH 및/또는 NADPH의 화학양론적 소모 및 선택적으로 상응하는 역반응과 함께, 적어도 12-케토-UDCA 또는 7,12-다이케토-3α-CA(7,12-다이케토-LCA)로의 3,12-다이케토-7β-CA 또는 DHCA의 입체특이적 및/또는 위치특이적 환원을 촉매화하는 데하이드로게나제 효소를 지칭한다. 적합한 검출 방법은 예를 들어, 후속되거나 문헌으로부터 알려져 있는 실험 부문에 기술되어 있다. 적합한 효소는 예를 들어, 코마노모나스 테스토스테로 니(즉, 코마모나스 테스토스테로니)(예, ATCC11996)로부터 수득가능하다. NADPH-의존적 3α-HSDH는 예를 들어 설치류로부터 알려져 있으며, 마찬가지로 이용될 수 있다(문헌[Cloning and sequencing of the cDNA for rat liver 3 alpha-hydroxysteroid/dihydrodiol dehydrogenase, J E Pawlowski, M　Huizinga and T M Penning, May 15, 1991 The Journal of Biological Chemistry, 266, 8820-8825]). 이러한 활성을 가진 효소는 EC 넘버 1.1.1.50 하에 분류된다.

다르게 명시되지 않는 한, 용어 "GDH"는, NAD⁺ 및/또는 NADP⁺의 화학양론적 소모 및 선택적으로 상응하는 역반응과 함께, 적어도 D-글루코노-1,5-락톤으로의 β-D-글루코스의 산화를 촉매화하는 데하이드로게나제 효소를 지칭한다. 적합한 효소는 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 메가테리 움(Bacillus megaterium)으로부터 수득될 수 있다. 이러한 활성을 가진 효소는 EC 넘버 1.1.1.47 하에 분류된다.

다르게 명시되지 않는 한, 용어 "FDH"는, NAD⁺ 및/또는 NADP⁺의 화학양론적 소모 및 선택적으로 상응하는 역반응과 함께, 적어도 이산화탄소로의 포름산(또는 상응하는 포르메이트 염)의 산화를 촉매화하는 데하이드로게나제 효소를 지칭한다. 적합한 검출 방법은 예를 들어, 후속되거나 문헌으로부터 알려져 있는 실험 부문에 기술되어 있다. 적합한 효소는 예를 들어, 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 슈도모나스 에스피(Pseudomonas sp) 또는 미코박테리움 바캐(Mycobacterium vaccae)로부터 수득될 수 있다. 이러한 활성을 가진 효소는 EC 넘버 1.2.1.2 하에 분류된다.

본 발명에 따르면, "순수한 형태", "순수한" 또는 "본질적으로 순수한" 효소는, 본 발명에 따르면 통상적인 단백질 검출 방법, 예를 들어 뷰렛 방법 또는 Lowry 등에 의해 기술된 바와 같은 단백질 검출(문헌[R.K. Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1982)]의 설명과 비교)에 의해 확인 시, 총 단백질 함량을 기준으로, 80 중량% 초과, 바람직하게는 90 중량% 초과, 특히 95 중량% 초과, 특히 99 중량% 초과의 순도를 가진 효소인 것으로 이해된다.

"산화환원 당량(redox equivalent)"은 각각 전자 공여자 및/또는 전자 수용자, 예를 들어, 니코틴아미드 유도체, 예컨대 NAD⁺와 NADH⁺, 및 이들의 환원 형태 NADH와 NADPH로서 사용될 수 있는 저분자량 유기 화합물을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명의 맥락에서, "산환환원 당량" 및 "보조인자"는 동의어로서 사용된다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, "보조인자"는 또한, "산화환원-가능 보조인자", 즉 환원 형태 및 산화 형태로 존재할 수 있는 보조인자로서 바꾸어 표현될 수 있다.

"소모된" 보조인자는, 기질의 주어진 환원 또는 산화 반응 도중에, 각각 상응하는 산화 형태 또는 환원 형태로 전환되는 환원 형태 또는 산화 형태의 보조인자를 의미하는 것으로 이해된다. 재생은 반응 동안에 형성된 산화 또는 환원된 보조인자를 각각 이의 환원 또는 산화된 초기 형태로 복구시키며, 따라서, 이러한 초기 형태는 기질의 전환에 다시 이용가능하다.

본 발명에 따르면, "변경된 보조인자 이용성"은 참조와 비교하여, 정성적 변경 또는 정량적 변경을 의미하는 것으로 이해된다. 특히, 변경된 보조인자 이용성은 아미노산 서열 돌연변이를 수행함으로써 관찰될 수 있다. 그런 다음, 이러한 변경은 돌연변이화되지 않은 출발 효소와 비교하여 식별될 수 있다. 본원에서, 특정한 보조인자에 대한 활성은 돌연변이를 수행함으로써 증가 또는 감소될 수 있거나, 완전히 방지될 수 있다. 그러나, 변경된 보조인자 이용성은 또한, 단일 보조인자에 대한 특이성 대신에, 제1 보조인자와 상이한 적어도 하나의 추가적인 제2 보조인자가 현재 이용될 수 있게 하는 변경(즉, 연장된 보조인자 이용성이 존재함)을 포함한다. 그러나, 이와는 대조적으로, 2개의 상이한 보조인자들을 이용하는 본래 존재하는 능력은, 특이성이 이들 보조인자 중 하나에 대해서만 증가되거나, 이들 보조인자 중 하나에 대해서만 감소 또는 완전히 제거되도록 변경될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 보조인자 NAD(NADH)에 의존적인 효소는 보조인자 이용성의 변경으로 인해, 현재 NAD(NADH) 및 보조인자 NADP(NADPH) 둘 다에 대해 의존적일 수 있거나, NAD(NADH)의 본래의 의존성은 NADP(NADPH)의 의존성으로 완전히 전환될 수 있으며, 그 반대일 수도 있다.

다르게 명시되지 않는 한, "NAD⁺/NADH 의존성" 또는 "NADP⁺/NADPH 의존성"이라는 표현은 본 발명에 따라 광범위하게 해석되어야 한다. 이들 표현은 NAD⁺/NADH 및/또는 NADP⁺/NADPH에 대한 "특이적인" 의존성, 즉 이들에 대한 독점적인 의존성뿐만 아니라, 2개의 보조인자 모두에 대한 본 발명에 따라 사용되는 효소의 의존성, 즉, NAD⁺/NADH 및 NADP⁺/NADPH의 의존성을 포함한다.

사용되는 "NAD⁺/NADH-수용" 및/또는 "NADP⁺/NADPH-수용"이라는 표현에도 동일한 것이 적용된다.

다르게 명시되지 않는 한, "NAD⁺/NADH 재생" 또는 "NADP⁺/NADPH 재생"이라는 표현은 본 발명에 따라 광범위하게 해석되어야 한다. 이들 표현은 소모된 보조인자 NAD⁺/NADH 및/또는 NADP⁺/NADPH를 재생시키는 "특이적인", 즉 독점적인 능력뿐만 아니라, 2개의 보조인자 모두, 즉 NAD⁺/NADH 및 NADP⁺/NADPH를 재생시키는 능력을 포함한다.

"단백질원성" 아미노산은 특히 (한글자 코드): G, A, V, L, I, F, P, M, W, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R 및 H를 포함한다.

본 발명에 따르면, "고정화"는 고체 지지체 물질, 즉 주변의 액체 배지에서 본질적으로 불용성인 지지체 물질에의 본 발명에 따라 사용되는 생체촉매, 예를 들어 7β-HSDH의 공유 결합 또는 비공유 결합을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따라 사용되는 전체 세포, 예컨대 재조합 미생물 또한, 이러한 지지체에 의해 고정화될 수 있다.

"돌연변이화되지 않은 효소와 비교하여 감소된 기질 저해"는, 돌연변이화되지 않은 효소에서 관찰되는 특정 기질에 대한 기질 저해가 더 이상 관찰될 수 없음을, 즉 본질적으로 더 이상 측정될 수 없거나, 더 높은 기질 농도에서만 저해됨, 즉 K_i 값이 증가됨을 의미한다.

본 발명에 따른 N-말단 또는 C-말단 연장은, 예를 들어 프로테아제 절단 부위를 통해 선택적으로는 가역적으로, 말단 아미노산 라디칼에 부착되는 약 15개 내지 25개의 단백질원성 아미노산 라디칼을 포함한다. 바람직한 잔기는 소위 "His 태그"를 포함하며, 이는 당업계에서 예를 들어 연장 서열에 3개, 6개 또는 9개의 연속적인 히스티딘 잔기를 가진 것으로 알려져 있다.

본 발명에 따르면, "콜산 화합물"은 콜산의 탄소 골격, 특히 스테로이드 구조를 가지며, 고리 위치 7 및 선택적으로 위치 3 및/또는 12에 케토기 및/또는 하이드록실기 및/또는 아실옥시기가 존재하는 화합물을 의미하는 것으로 이해된다.

특정 유형의 화합물, 예를 들어 "콜산 화합물" 또는 "우르소데옥시콜산 화합물"은 또한 특히, 기저(underlying) 출발 화합물(예, 콜산 또는 우르소데옥시콜산)의 유도체를 의미하는 것으로 이해된다.

이러한 유도체는 화합물의 "염", 예를 들어, 알칼리 금속 염, 예컨대 리튬염, 나트륨염 및 칼륨염; 및 암모늄염을 포함하며, 여기서, 암모늄염에는, NH₄ ⁺ 염, 또는 적어도 하나의 수소 원자가 C₁-C₆ 알킬 라디칼에 의해 대체될 수 있는 암모늄염이 포함딘다. 전형적인 알킬 라디칼은 특히 C₁-C₄-알킬 라디칼, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실, 및 하나 이상의 분지를 가진 이들의 유사체이다.

본 발명에 따른 화합물의 "알킬 에스테르"는 특히, 저급 알킬 에스테르, 예를 들어 C₁-C₆-알킬 에스테르이다. 언급될 수 있는 비제한적인 예로는, 메틸 에스테르, 에틸 에스테르, n-프로필 에스테르, i-프로필 에스테르, n-부틸 에스테르, sec-부틸 에스테르, tert-부틸 에스테르, 또는 장쇄 에스테르, 예를 들어, n-펜틸 에스테르 및 n-헥실 에스테르, 및 하나 이상의 분지를 가진 이들의 유사체가 있다.

"아미드"는 특히, 본 발명에 따른 산과 암모니아, 1차 모노아미드 또는 2차 모노아미드와의 반응 생성물이다. 이러한 아미드는 예를 들어, 모노-C₁-C₆-알킬 모노아민 또는 다이-C₁-C₆-알킬 모노아민이며, 알킬 라디칼은 서로 독립적으로 예를 들어 추가적인 카르복실기, 하이드록실기, 할로겐(예, F, Cl, Br, I), 니트로기 및 술포네이트기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다.

본 발명에 따른 "아실기"는 특히, 2개 내지 4개의 탄소 원자를 가진 비방향족 기, 예를 들어 아세틸, 프로피오닐 및 부티릴, 및 선택적으로 치환된 모노뉴클리어(mononuclear) 방향족 고리를 가진 방향족 기이며, 적합한 치환기는 예를 들어, 하이드록실기, 할로겐(예, F, Cl, Br, I), 니트로기 및 C₁-C₆-알킬기, 예를 들어 벤조일 또는 톨루오일로부터 선택된다.

본 발명에 따라 적용되고/거나 생성되는 하이드록시스테로이드 화합물, 예를 들어 콜산, 우르소데옥시콜산, 12-케토-케노데옥시콜산, 케노데옥시콜산 및 7-케토-리토콜산은 본 발명에 따라 입체이성질체적으로 순수한 형태 또는 다른 입체이성질체화의 혼합물의 존재 하에 이용되거나 이들로부터 수득될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 적용되고/거나 생성되는 화합물은 본질적으로 입체이성질체적으로 순수한 형태로 이용되고/거나 단리된다.

필수적인 화학적 화합물의 구조식, 이의 화학적 명칭 및 약어는 하기 표에 나타나 있다:

2. 단백질

본 발명은 7β-HSDH, FDH, GDH 또는 3α-HSDH 활성을 가진 구체적으로 개시된 단백질 또는 효소 및/또는 이들의 돌연변이체에 제한되지 않으며, 그보다는 이의 기능적인 등가물까지 연장된다.

본 발명의 목적을 위해, 구체적으로 개시된 효소의 "기능적인 등가물" 또는 유사체는 전자와 상이하며 여전히 요망되는 생물학적 활성, 7β HSDH 활성을 보유하는 폴리펩타이드이다.

따라서, 예를 들어, "기능적 등가물"이라는 표현은, 사용되는 7β-HSDH, FDH, GDH 또는 3α-HSDH 활성 시험에서, 본원에 정의된 아미노산 서열을 포함하는 출발 효소의 활성의 적어도 1%, 예를 들어 적어도 10% 또는 20%, 예를 들어 적어도 50% 또는 75%, 또는 90% 초과 또는 미만인 활성을 가진 효소를 의미하는 것으로 이해된다.

더욱이, 기능적인 등가물은 바람직하게는 pH 4 내지 pH 11에서 안정하며, 유리하게는 pH　6 내지 pH 10, 예컨대, 특히 pH 8.5 내지 pH 9.5의 범위에서 최적의 pH, 및 15℃ 내지 80℃ 또는 20℃ 내지 70℃, 예를 들어 약 45℃ 내지 60℃ 또는 약 50℃ 내지 55의 범위에서 최적의 온도를 가진다.

7β-HSDH 활성은 다양한 공지된 시험들에 의해 검출될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 참조 기질, 예를 들어 CA 또는 DHCA가 실험 부문에 정의된 바와 같이 표준화된 조건 하에 사용되는 시험이 언급될 수 있다.

FDH, GDH, 7β-HSDH 또는 3α-HSDH 활성을 확인하는 시험 역시 당업계에 알려져 있다.

본 발명에 따르면, "기능적 등가물"이라는 표현은 또한 특히, 상기 언급된 아미노산 서열의 적어도 하나의 서열 위치에, 구체적으로 언급된 아미노산과 상이한 아미노산을 가지지만 상기 언급된 생물학적 활성들 중 하나를 보유하는 "돌연변이체"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, "기능적 등가물"은 하나 이상의, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 첨가, 치환, 결실 및/또는 역위(inversion)에 의해 수득가능한 돌연변이체를 포함하며, 상기 언급된 변형은 본 발명에 따른 특성 프로파일을 가진 돌연변이체를 생성하는 한 임의의 서열 위치에서 발생할 수 있다. 기능적 등가물은 또한 특히, 돌연변이체 및 비변형된 폴리펩타이드의 반응성 패턴이 정성적인 측면에서 일치할 때, 즉, 예를 들어 동일한 기질이 상이한 속도로 전환될 때 존재한다. 적합한 아미노산 치환의 예들은 하기 표에 나타나 있다:

상기 의미에서 "기능적 등가물"은 또한, 상기 기술된 폴리펩타이드의 "전구체" 및 폴리펩타이드의 "기능적 유도체" 및 "염"이다.

이러한 맥락에서, "전구체"는 요망되는 생물학적 활성을 갖거나 갖지 않는 폴리펩타이드의 천연 전구체 또는 합성 전구체이다.

"염"이라는 표현은, 카르복실기의 염뿐만 아니라 본 발명에 따른 단백질 분자의 아미노기의 산 부가 염을 의미하는 것으로 이해된다. 카르복실기의 염은 당업계에 알려진 방식으로 제조될 수 있으며, 무기염, 예를 들어 나트륨염, 칼슘염, 암모늄염, 철염 및 아연염, 및 유기 염기와의 염, 예를 들어 아미드, 예컨대 트리에탄올아민, 아르기닌, 라이신, 피페리딘 등과의 염을 포함한다. 산 부가 염, 예를 들어 무기산, 예컨대 염산 또는 황산과의 염, 및 유기산, 예컨대 아세트산 및 옥살산과의 염 또한 본 발명의 주제이다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 "기능적 유도체"는 또한, 알려진 기술을 사용하여, 기능적 아미노산 측기 또는 이의 N-말단 또는 C-말단에서 생성될 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들어, 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아, 1차 아민 또는 2차 아민과의 반응에 의해 수득가능한 카르복실기의 아미드; 아실기와의 반응에 의해 제조되는 유리(free) 아미노기의 N-아실 유도체; 또는 아실기와의 반응에 의해 제조되는 유리 하이드록실기의 O-아실 유도체를 포함한다.

본래, "기능적 등가물"은 또한, 다른 유기체로부터 입수가능한 폴리펩타이드, 및 자연 발생 변이체를 포함한다. 예를 들어, 서열 비교를 사용하여, 상동성 서열 영역들의 영역을 확인할 수 있으며, 등가의(equivalent) 효소는 본 발명의 구체적인 요건을 기재로 구축될 수 있다.

마찬가지로, "기능적 등가물"은 예를 들어 요망되는 생물학적 기능을 가진 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 단편, 바람직하게는 개별 도메인 또는 서열 모티프를 포함한다.

더욱이, "기능적 등가물"은, 상기 언급된 폴리펩타이드 서열들 중 하나 또는 이로부터 유래되는 기능적 등가물, 및 이와 기능적으로 상이한 적어도 하나의 다른 이종성 서열을 기능적 N-말단 또는 C-말단 연결부에 가진 융합 단백질이다(즉, 융합 단백질의 일부의 기능에 유의미한 상호간 손상(mutual impairment)이 없음). 이러한 이종성 서열의 비제한적인 예는 예를 들어, 신호 펩타이드, 히스티딘 앵커 또는 효소이다.

"기능적 등가물"은 본 발명에 따라 구체적으로 개시된 단백질의 호모로그(homolog)를 포함한다. 이들은 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448]의 알고리즘에 의해 계산 시, 구체적으로 개시된 아미노산 서열들 중 하나와 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 75%, 특히 적어도 85%, 예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성(또는 동일성)을 가진다. 본 발명에 따른 상동성 폴리펩타이드의 상동성 또는 동일성 백분율은 특히, 본원에 구체적으로 기술된 아미노산 서열들 중 하나의 전체 길이를 기준으로 아미노산 라디칼의 동일성 백분율을 의미한다.

동일성 백분율 데이터는 또한, BLAST 정렬 또는 blastp(단백질-단백질 BLAST) 정렬을 사용하거나, 본원 하기에 명시된 Clustal 세팅을 이용함으로써 확인될 수 있다.

가능한 단백질 글리코실화의 경우, 본 발명에 따른 "기능적 등가물"은 탈글리코실화된 형태 또는 글리코실화된 형태의 상기 명시된 유형의 단백질, 및 글리코실화 패턴을 변화시킴으로써 수득가능한 변형된 형태의 상기 명시된 유형의 단백질을 포함한다.

본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드의 호모로그는 돌연변이발생, 예를 들어 점돌연변이, 또는 단백질의 신장(extension) 또는 절단(truncation)에 의해 생성될 수 있다.

본 발명에 따른 단백질의 호모로그는 돌연변이체, 예를 들어 절단 돌연변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 예를 들어 합성 올리고뉴클레오타이드의 혼합물의 효소적 연결에 의해, 핵산 수준에서 조합 돌연변이발생에 의해 단백질 변이체의 다양화된(variegated) 라이브러리를 생성하는 것이 가능하다. 변성(degenerate) 올리고뉴클레오타이드 서열로부터 잠재적인 호모로그 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있는 공정들은 다수 존재한다. 변성 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 그런 다음, 합성 유전자는 적합한 발현 벡터에 연결될 수 있다. 변성 유전자 세트의 사용은, 잠재적인 단백질 서열의 요망되는 세트를 코딩하는 모든 서열들을 하나의 혼합물에 제공할 수 있게 한다. 변성 올리고뉴클레오타이드의 합성 방법은 당업자에게 알려져 있다(예, 문헌[Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science　198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477]).

선행 기술은 점돌연변이 또는 절단에 의해 생성된 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고, 선택된 특징을 가진 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 기술들을 알고 있다. 이들 기술은 본 발명에 따른 호모로그의 조합 돌연변이발생에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 맞게 조정될 수 있다. 고속 처리 분석을 수행하는 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 데 가장 빈번하게 사용되는 기술은 유전자 라이브러리를 복제 가능한 발현 벡터로 클로닝하는 단계, 적합한 세포를 생성된 벡터 라이브러리를 사용하여 형질변환시키는 단계, 요망되는 활성의 검출이, 생성물이 검출되는 유전자를 코딩하는 벡터의 단리를 촉진하는 조건 하에 조합 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 기능성 돌연변이체의 빈도를 라이브러리에서 증가시키는 기술인 반복 앙상블 돌연변이발생(recursive ensemble mutagenesis; REM)은, 호모로그를 동정하기 위해 스크리닝 시험과 조합하여 사용될 수 있다(문헌[Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331]).

더욱이, 본 발명은 본원에 참조로서 인용된 출원인의 WO　2011/064404에 기술된 바와 같이 콜린셀라 애로파시엔스 ATCC 25986 유래의 7β-HSDH 야생형의 용도를 포함한다.

콜린셀라 애로파시엔스 ATCC 25986으로부터 수득가능한 이러한 7β-HSDH는 특히, 하기 특성들 중 적어도 하나의 추가적인 특성, 예를 들어 이러한 특성들 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 모두를 특징으로 한다:

a) 분자량(SDS 겔 전기영동): 약 28 kDa 내지 32　kDa, 특히 약 29 kDa 내지 31　kDa 또는 약 30　kDa;

b) 분자량(비-변성 조건, 예컨대 특히 SDS 없는 조건 하에서의 겔 여과): 약 53 kDa 내지 60　kDa, 특히 약 55 kDa 내지 57　kDa, 예컨대 56.1　kDa. 이는 콜린셀라 애로파시엔스 DSM 3979 7β-HSDH의 이량체 성질을 확인시켜줌;

c) 7β-하이드록시기로의, 7-케토-LCA의 7-카르보닐기의 입체선택적 환원;

d) UDCA의 산화에 최적인 pH의 범위가 pH　8.5 내지 pH 10.5, 특히 내지 pH 9 내지 pH 10임;

e) DHCA 및 7-케토-LCA의 산화에 최적인 pH의 범위가 pH　3.5 내지 pH 6.5, 특히 pH　4 내지 pH 6임;

f) 하기 표에서, 본원에 언급된 기질/보조인자 중 적어도 하나에 대한 적어도 하나의 카이네틱 파라미터(kinetic parameter); 각각의 경우에, 후속하는 표에 구체적으로 언급된 값 주위로 ±20%, 특히 ±10, ±5, ±3%, ±2% 또는 ±1%의 범위.

g) 원핵생물 콜린셀라 애로파시엔스 DSM 3979 7β-HSDH와, 카비아 포르셀루스(Cavia porcellus), 호모 사피엔스(Homo sapiens) 및 무스 무술루스(Mus musulus)를 포함하는 동물 11β-HSDH 하위군과의 계통발생적(phylogenetic) 서열 관계.

예를 들어, 이러한 7β-HSDH는 하기 특성들 또는 특성들의 조합을 나타낸다: a); b); a) 및 b); a) 및/또는 b) 및 c); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e) 및 f).

더욱이, 이러한 7β-HSDH 또는 이로부터 유래되는 기능적 등가물은 하기를 특징으로 한다:

a. 상응하는 7β-하이드록시스테로이드로의 7-케토스테로이드의 입체특이적 환원, 및/또는

b. 7-위치에 케토기를 포함하는 케토스테로이드 및 스테로이드 골격 상의 적어도 하나의 추가적인 케토기의 위치특이적 하이드록실화를 통해, 7-위치에서 예컨대, 특히 데하이드로콜산(DHCA)의 상응하는 7β-하이드록시스테로이드를 제공하여, 상응하는 3,12-다이케토-7β-콜란산을 제공하며, 이는 예를 들어 NADPH-의존적임.

이러한 7β-HSDH는 특히, 서열번호 2(접수 번호: ZP_01773061)에 따른 아미노산 서열, 또는 이로부터 유래되며 이러한 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%, 예를 들어, 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 동일성을 가진 서열을 가지며; 선택적으로 부가적으로는, 하기 특성들 또는 특성들의 조합을 특징으로 한다: 상기 정의에 따른 a); b); a) 및 b); a) 및/또는 b) 및 c); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e); a) 및/또는 b) 및 c) 및 d) 및 e) 및 f).

3. 핵산 및 구축물

3.1 핵산

본 발명의 주제는 또한, 7β-HSDH, FDH, GDH 및/또는 3α-HSDH 활성을 가진 효소를 코딩하는 핵산 서열 및 이의 돌연변이체이다.

본 발명은 또한, 본원에 기술된 특정한 서열과 특정한 정도의 동일성을 가진 핵산에 관한 것이다.

2개의 핵산들 사이의 "동일성"은 각각의 경우 핵산의 전체 길이에 걸쳐 뉴클레오타이드의 동일성, 특히 Clustal 방법을 적용함으로써 Informax(USA)사의 벡터 NTI Suite 7.1 소프트웨어에 의해 비교함으로써 계산되는 동일성을 의미하는 것으로 이해되며(문헌[Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1]), 파라미터 세팅은 하기와 같다:

다중 정렬 파라미터:

갭 오프닝 페널티(Gap opening penalty) 10

갭 익스텐션 페널티(Gap extension penalty) 10

갭 분리 페널티 범위(Gap separation penalty range) 8

갭 분리 페널티 오프(off)

정렬 딜레이에 대한 동일성 % 40

잔기 특이적 갭 오프

친수성 잔기 갭 오프

전이 중량(Transition weighing) 0

페어와이즈 정렬 파라미터(Pairwise alignment parameter):

FAST 알고리즘 온(on)

K-터플 크기(K-tuple size) 1

갭 페널티 3

윈도우 크기 5

최상 다이아고날(diagonal)의 수 5

대안적으로, 동일성은 또한, 하기 파라미터를 사용하여 문헌[Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, internet address: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#]의 방법에 의해 확인될 수 있다:

DNA 갭 오픈 페널티 15.0

DNA 갭 익스텐션 페널티 6.66

DNA 매트릭스 동일성(Identity)

단백질 갭 오픈 페널티 10.0

단백질 갭 익스텐션 페널티 0.2

단백질 매트릭스 고넷(Gonnet)

단백질/DNA ENDGAP -1

단백질/DNA GAPDIST 4

본원에 언급된 모든 핵산 서열들(단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 및 RNA, 예를 들어 cDNA 및 mRNA)은 당업계에 알려진 방식으로, 예를 들어, 이중 가닥의 개별적인 오버랩핑되는(overlapping) 상보적 핵산 단위의 단편 축합에 의해, 뉴클레오타이드 단위로부터 출발하는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 포스포아미다이트 방법(phosphoamidite method)에 따라 알려진 방식대로 화학적으로 합성될 수 있다(문헌[Voet, Voet, 2^nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897]). 합성 올리고뉴클레오타이드의 조립, 및 DNA 폴리머라제 및 연결 반응과 일반적인 클로닝 방법에 의한 Klenow 단편을 사용한 갭의 충전(filling-in)은 문헌[Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 의해 기술되어 있다.

본 발명의 주제는 또한, 예를 들어 인공 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 제조될 수 있는 폴리펩타이드들의 기능적 등가물에서 상기 폴리펩타이드들 중 임의의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열(단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 및 RNA 서열, 예를 들어, cDNA 및 mRNA)이다.

본 발명은, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 이의 생물학적으로 활성인 구획, 및 본 발명에 따른 코딩 핵산을 동정하거나 증폭시키기 위해 예를 들어 혼성화 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 핵산 단편 둘 다에 관한 것이다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 부가적으로는, 코딩 유전자 영역의 3' 말단 및/또는 5' 말단으로부터 비번역된 서열을 포함할 수 있다.

더욱이, 본 발명은 구체적으로 기술된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 구획에 상보적인 핵산 분자를 포함한다.

본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열은 다른 세포 유형 및 다른 유기체에서 상동성 서열을 동정 및/또는 클로닝하는 데 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머의 생성을 가능하게 한다. 이러한 프로브 또는 프라이머는 통상, "엄격한" 조건(하기 참조) 하에, 본 발명에 따른 핵산 서열의 센스 가닥 또는 상응하는 안티센스 가닥의 적어도 약 12개, 바람직하게는 적어도 약 25개, 예를 들어, 약 40개, 50개 또는 75개의 연속 뉴클레오타이드(consecutive nucleotide)에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 영역을 포함한다.

"단리된" 핵산 분자는, 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리되며, 부가적으로는, 이것이 재조합 기술에 의해 생성된다면 다른 세포성 물질 또는 배양 배지를 본질적으로 포함하지 않을 수 있거나, 이것이 화학적으로 합성된다면 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 본질적으로 포함하지 않을 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 본 발명에 따라 제공된 표준 분자생물학 기술 및 서열 정보에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, cDNA는 구체적으로 개시된 완전한 서열들 중 하나 또는 이의 구획을 혼성화 프로브로서 사용하고 표준 혼성화 기술을 사용함으로써, 적합한 cDNA 라이브러리로부터 단리될 수 있다(예, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A　Laboratory Manual. 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기술된 바와 같음). 더욱이, 개시된 서열들 중 임의의 서열 또는 이의 구획을 포함하는 핵산 분자는, 이러한 서열을 기재로 하여 구축된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 단리될 수 있다. 이러한 방식으로 증폭된 핵산은 적합한 벡터 내로 클로닝되고, DNA 서열 분석에 의해 특징화될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 자동 DNA 합성기를 사용하여 표준 합성 방법에 의해 생성될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 서열 또는 이의 유도체, 이러한 서열의 호모로그 또는 부분은 예를 들어, 통상적인 혼성화 방법 또는 PCR 기술을 사용하여, 예를 들어 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 사용하여 다른 박테리아들로부터 단리될 수 있다. 이들 DNA 서열은 표준 조건 하에 본 발명에 따른 서열과 혼성화된다.

"혼성화되는"은, 표준 조건 하에서, 비-상보적인 파트너들 사이의 비특이적인 결합이 이러한 조건 하에 발생하지 않을 것인 한편, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드가 대체로 상보적인 서열에 결합하는 능력을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 맥락에서, 서열은 90% 내지 100% 상보적일 수 있다. 상보적 서열이 서로 특이적으로 결합할 수 있는 특성은 예를 들어, 노던 블롯 기술 또는 서던 블롯 기술, 또는 PCR 또는 RT-PCR에서의 프라이머 결합에 이용된다.

혼성화에 있어서, 보존된 영역의 짧은 올리고뉴클레오타이드가 유리하게 사용된다. 그러나, 혼성화를 위해 본 발명에 따른 핵산의 더 긴 단편 또는 완전한 서열을 사용하는 것 또한 가능하다. 이용되는 핵산(올리고뉴클레오타이드, 더 긴 단편 또는 완전한 서열)에 따라, 또는 어떤 핵산 유형, DNA 또는 RNA가 혼성화에 사용되는지에 따라, 이들 표준 조건은 변할 것이다. 따라서, 예를 들어, DNA:DNA 하이브리드의 용융점은 동일한 길이의 DNA:RNA 하이브리드의 용융점보다 약 10℃ 더 낮다.

핵산에 따라, 표준 조건은 예를 들어, 0.1 x 내지 5 x SSC(1 x SSC = 0.15 M NaCl, 15　mM 소듐 시트레이트, pH 7.2)의 농도를 가진 수성 완충액 중 42℃ 내지 58℃의 온도 또는 부가적으로 50% 포름아미드의 존재, 예를 들어 42℃, 5 x SSC, 50% 포름아미드를 의미하는 것으로 이해된다. 유리하게는, DNA:DNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 0.1 x SSC 및 약 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 45℃의 온도이다. DNA:RNA 하이브리드에 있어서, 혼성화 조건은 유리하게는 0.1 x SSC 및 약 30℃ 내지 55℃, 바람직하게는 약 45℃ 내지 55℃의 온도이다. 혼성화에 대해 언급된 이들 온도는 예를 들어, 포름아미드의 부재 하에 약 100개의 뉴클레오타이드 및 50%의 G　+　C 함량을 가진 핵산에 대해 계산된 용융 온도 값이다. DNA 혼성화에 대한 실험 조건은 유전학 전문 교재, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]에 기술되어 있으며, 당업자에게 알려진 식을 사용하여, 예를 들어 핵산의 길이, 하이브리드의 유형 또는 G + C 함량의 함수로서 계산될 수 있다. 당업자는 하기 교재로부터 혼성화에 관한 추가적인 정보를 수득할 수 있다: 문헌[Ausubel et al. (eds.), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds.), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed.), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford].

"혼성화"는 특히, 엄격한 조건 하에 수행될 수 있다. 이러한 혼성화 조건은 예를 들어 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57 or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에 기술되어 있다.

"엄격한" 혼성화 조건은 특히, 하기의 조건을 의미하는 것으로 이해된다: 50% 포름아미드, 5　x　SSC(750 mM NaCl, 75 mM 트리소듐 시트레이트), 50 mM 소듐 포스페이트(pH 7.6), 5x Denhardt's 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 g/ml 변성 시어드 연어 정자(denatured sheared salmon sperm) DNA로 이루어진 용액에서 42℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 65℃에서 0.1 x SSC를 사용한 필터의 세척 단계.

본 발명의 주제는 또한, 구체적으로 개시되거나 유도가능한 핵산 서열의 유도체이다.

따라서, 본 발명에 따른 추가적인 핵산 서열은 예를 들어, 서열번호 1, 3 또는 10으로부터 유래될 수 있으며, 개별 뉴클레오타이드 또는 몇몇 뉴클레오타이드의 첨가, 치환, 삽입 또는 결실에 의해 이들과 상이하지만, 요망되는 특성 프로파일을 가진 폴리펩타이드를 여전히 코딩한다.

또한, 본 발명은, 특정한 공급원 유기체 또는 숙주 유기체의 코돈 사용에 따라, 구체적으로 언급된 서열과 비교하여 "침묵" 돌연변이를 포함하거나 변경된 핵산 서열을 포함하며, 이의 자연 발생적인 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체 또한 포함한다.

또 다른 주제는 보존적 뉴클레오타이드 치환(즉, 문제의 아미노산이 동일한 전하, 크기, 극성 및/또는 수용성을 가진 아미노산으로 대체됨)에 의해 수득가능한 서열이다.

본 발명의 주제는 또한, 서열 다형성(sequence polymorphism)에 의해, 구체적으로 개시된 핵산으로부터 유래되는 분자이다. 이러한 유전적 다형성은 자연 변이의 결과 집단 내에서 개별 요소들 사이에 존재할 수 있다. 이들 자연 변이는 통상, 유전자의 뉴클레오타이드에서 1% 내지 5%의 변동성(variance)을 유발한다.

본 발명에 따른 것이며 서열 서열번호 1, 3 또는 10을 가진 핵산 서열의 유도체는 예를 들어, 추론된(deduced) 아미노산 수준에서, 전체 서열 영역에 걸쳐 적어도 60%의 상동성, 바람직하게는 적어도 80%의 상동성, 매우 특히 바람직하게는 적어도 90%의 상동성을 가진 대립유전자 변이체를 의미하는 것으로 이해된다(아미노산 수준에서의 상동성에 대해서는, 독자는 폴리펩타이드에 관한 상기 코멘트를 참조로 할 수 있음). 유리하게는, 상동성은 서열의 하위영역에 걸쳐 더 높을 수 있다.

더욱이, 유도체는 또한, 특히 서열번호 1, 3 또는 10의 본 발명에 따른 핵산 서열의 호모로그, 예를 들어 진균류 또는 박테리아의 호모로그, 절단된 서열, 코딩 DNA 서열 및 비-코딩 DNA 서열의 단일-가닥 DNA 또는 RNA를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어 서열번호 1, 3 또는 10에 대한 호모로그는 서열번호 1, 3 또는 10에서 명시된 전체 DNA 영역에 걸쳐 DNA 수준에서 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 60%, 특히 바람직하게는 적어도 70%, 매우 특히 바람직하게는 적어도 80% 상동성을 가진다.

더욱이, 유도체는 프로모터와의 융합을 의미하는 것으로 이해된다. 지시된 뉴클레오타이드 서열의 상류에 위치한 프로모터는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 치환, 적어도 하나의 삽입, 역위 및/또는 결실에 의해 변경될 수 있었으나, 프로모터의 기능성 및 효능은 악영향을 받지 않는다. 더욱이, 프로모터의 효능은 이의 서열을 변경시킴으로써 증가될 수 있거나, 프로모터는 다른 종의 유기체로부터의 프로모터를 포함하여 보다 활성인 프로모터로 완전히 대체될 수 있다.

또한, 당업자는 기능성 돌연변이체를 생성하는 공정에 친숙하다.

사용되는 기술에 따라, 당업자는 완전히 랜덤한 돌연변이 또는 마찬가지로 보다 특이적인 돌연변이를 유전자 또는 마찬가지로 비-코딩 핵산 영역(예, 발현을 조절하는 데 중요한 영역)에 도입하고, 후속적으로 유전자 라이브러리를 생성할 수 있다. 이러한 목적에 필요한 분자생물학적 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning. 3^rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001]에 기술되어 있다.

유전자의 변형 방법, 따라서 이러한 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 변경 방법은 당업자에게 오랫동안 친숙해져 왔으며, 예를 들어 하기가 존재한다:

- 부위-특이적 돌연변이발생으로서, 여기서, 유전자의 단일 뉴클레오타이드 또는 다중 뉴클레오타이드가 특이적으로 치환됨(문헌[Trower MK (Ed.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey]),

- 포화 돌연변이발생으로서, 여기서, 임의의 요망되는 아미노산에 대한 코돈이 유전자의 임의의 요망되는 위치에서 치환 또는 첨가될 수 있음(문헌[Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcarel R, Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541; Barik S (1995) Mol. Biotechnol. 3:1]),

- 오류-취약 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로서, 여기서, 뉴클레오타이드 서열은 DNA 폴리머라제를 불완전하게(defectively) 작동시킴으로써 돌연변이화됨(문헌[Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739]);

- 돌연변이 유발자(mutator) 균주에서의 유전자의 계대배양으로서, 여기서, 예를 들어 DNA 복구 메커니즘의 결여로 인해, 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이 비율이 증가됨(문헌[Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E. coli mutator strain. In: Trower MK (Ed.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey]), 또는

- DNA 셔플링으로서, 여기서, 밀접하게 관련된 유전자의 풀(pool)이 형성되고 분해되며, 단편들은 폴리머라제 연쇄 반응을 위한 주형으로서 사용되고, 여기서, 전장 모자이크 유전자는 궁극적으로 반복된 가닥 분리 및 재어닐링(reannealing)에 의해 생성됨(문헌[Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747]).

방향적 진화(directed evolution)라고 알려진 것(특히, 문헌[Reetz MT and Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Ed.) Manual of industrial microbiology and biotechnology. American Society for Microbiology]에 기술되어 있음)을 이용하여, 당업자는 또한, 기능성 돌연변이체를 표적화된 방식으로, 또한 대규모로 생성할 수 있다. 본원에서, 각각의 단백질의 유전자 라이브러리는 제1 단계에서 생성되며, 이들 유전자 라이브러리는 예를 들어, 상기 명시된 방법을 이용하여 설정될 수 있다. 유전자 라이브러리는 적합한 방식으로, 예를 들어 박테리아 또는 파지 디스플레이 시스템에 의해 발현된다.

대체로 요망되는 특성에 상응하는 특성을 가진 기능성 돌연변이체를 발현하는 숙주 유기체의 관련 유전자는 추가적인 돌연변이 사이클을 받을 수 있다. 돌연변이, 선별 및 스크리닝 단계는, 존재하는 기능성 돌연변이체가 요망되는 특성을 충분한 정도로 보여줄 때까지 되풀이해서 반복될 수 있다. 제한된 수의 돌연변이, 예를 들어 1개 내지 5개의 돌연변이가 이러한 되풀이되는 접근법에 의해 단계식으로 생성될 수 있으며, 관련된 효소 특성에 미치는 이러한 돌연변이의 영향은 평가 및 선별될 수 있다. 그런 다음, 선별된 돌연변이체는 동일한 방식으로 추가적인 돌연변이 단계를 받을 수 있다. 이로써, 연구되어야 하는 개별 돌연변이체의 수가 상당히 감소될 수 있다.

본 발명에 따른 결과는 또한, 문제의 효소의 구조 및 서열에 관한 중요한 정보를 제공하며, 이러한 효소는 요망되는 변형된 특성을 가진 추가적인 효소를 표적화된 방식으로 생성하는 데 필요하다. 특히, "핫 스팟(hot spot)"이라고 알려져 있는 것, 즉, 표적화된 돌연변이의 도입을 통해 효소의 특성을 변형시키는 데 잠재적으로 적합한 서열 구획을 한정하는 것이 가능하다.

3.2 구축물

더욱이, 본 발명의 주제는, 조절 핵산 서열의 유전적 조절 하에, 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구축물들; 및 이러한 발현 구축물들 중 적어도 하나를 포함하는 벡터이다.

본 발명에 따르면, "발현 단위"는 발현 활성을 가지며, 본원에 정의된 바와 같은 프로모터를 포함하고, 발현되어야 하는 핵산 또는 유전자에 기능적으로 연결된 후 상기 핵산 또는 상기 유전자의 발현, 즉 전사 및 번역을 조절하는 핵산을 의미하는 것으로 이해된다. 즉, 이러한 맥락에서, 발현 단위는 또한, "조절 핵산 서열"로서 지칭된다. 프로모터 외에도 추가적인 조절 요소들, 예컨대 인핸서가 존재할 수 있다.

본 발명에 따르면, "발현 카세트" 또는 "발현 구축물"은 발현되어야 하는 핵산 또는 발현되어야 하는 유전자에 기능적으로 연결된 발현 단위를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 발현 단위와는 대조적으로, 발현 카세트는 전사 및 번역을 조절하는 핵산 서열뿐만 아니라, 전사 및 번역의 결과 단백질로서 발현되어야 하는 핵산 서열도 포함한다.

본 발명의 맥락에서, "발현" 또는 "과발현"이라는 표현은 미생물에서 하나 이상의 효소의 세포내 활성의 생성 또는 증가를 기술하며, 이러한 효소는 상응하는 DNA에 의해 코딩된다. 이를 위해, 예를 들어, 유전자가 유기체 내에 도입될 수 있으며, 기존의 유전자는 상이한 유전자에 의해 대체될 수 있고, 유전자(들)의 복사수가 증가될 수 있으며, 강한 프로모터가 사용될 수 있거나, 높은 활성을 가진 상응하는 효소를 인코딩하는 유전자가 사용될 수 있으며, 선택적으로 이들 조치(measure)는 조합될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 이러한 구축물은 특정 코딩 서열의 업스트림에, 즉 5' 말단에 프로모터를 포함하고, 하류에, 즉 3' 말단에 종결자 서열을 포함하며, 선택적으로 추가의 통상적인 조절 요소를 포함하며, 각각의 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있다.

본 발명에 따라, "프로모터", "프로모터 활성을 가진 핵산" 또는 "프로모터 서열"은, 전사되어야 하는 핵산에 기능적으로 연결되어 있으며 상기 핵산의 전사를 조절하는 핵산을 의미하는 것으로 이해된다.

이러한 맥락에서, "기능적" 또는 "작동적" 연결은 예를 들어, 프로모터 활성을 가진 핵산 및 전사되어야 하는 핵산 서열 중 하나, 및 선택적으로 추가의 조절 요소, 예를 들어 핵산의 전사를 보장하는 핵산 서열 및 예를 들어 종결자에, 각각의 조절 요소가 핵산 서열의 전사에서 의도되는 바와 같은 조절 요소의 기능을 수행할 수 있는 방식으로 순차적으로 배열되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 화학적인 의미에서 직접 연결은 이러한 맥락에서 의무적이지 않다. 유전적 조절 서열, 예를 들어 인핸서 서열 또한, 추가로 제거되는 위치로부터, 또는 심지어 상이한 DNA 분자로부터 표적 서열 상에서 인핸서의 기능을 발휘할 수 있다. 바람직한 배열은, 전사되어야 하는 핵산 서열이 프로모터 서열 다음에(즉, 프로모터 서열의 3' 말단에) 위치하여, 2개의 서열들이 서로 공유 결합되는 배열이다. 이러한 맥락에서, 프로모터 서열과 재조합적으로 발현되는 핵산 서열 사이의 거리는 200 염기쌍 미만, 100 염기쌍 미만 또는 50 염기쌍 미만일 수 있다.

프로모터 및 종결자 외에도 언급될 수 있는 추가의 조절 요소의 예로는, 표적 서열, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 선별 마커, 증폭 신호, 복제 기원 등이 있다. 적합한 조절 서열은 예를 들어, 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있다.

본 발명에 따른 핵산 구축물은 특히, 서열 서열번호 1, 3 또는 10 또는 이의 유도체 및 호모로그, 및 이로부터 유래될 수 있으며 유리하게는 유전자 발현을 조절, 예를 들어 증가시키기 위한 하나 이상의 조절 신호에 작동적으로 또는 기능적으로 연결된 핵산 서열을 포함한다.

이들 조절 서열 외에도, 이들 서열의 자연적인 조절은 실제 구조 유전자의 상류에 여전히 존재할 수 있으며, 자연적인 조절의 작동이 중단되고 유전자의 발현이 증가되도록 선택적으로 유전적으로 변경되었을 수 있다. 그러나, 핵산 구축물은 또한, 더 간단한 디자인을 가질 수 있는데, 즉, 어떠한 부가적인 조절 신호도 코딩 서열의 상류에 삽입되지 않았으며, 자연적인 프로모터가 이의 조절과 더불어 제거되지 않았다. 대신에, 자연적인 조절 서열은, 조절이 더 이상 발생하지 않고 유전자 발현이 증가되도록 돌연변이화된다.

바람직한 핵산 구축물은 유리하게는 또한, 이전에 언급된 "인핸서"를 하나 이상 포함하며, 이러한 인핸서는 프로모터에 기능적으로 연결되어 있으며 핵산 서열의 발현을 증가시킬 수 있다. 부가적인 유리한 서열, 예컨대 추가의 조절 요소 또는 종결자가 또한, DNA 서열의 3' 말단에 삽입될 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 하나 이상의 복사본에서 구축물에 존재할 수 있다. 구축물은 부가적으로는, 선택적으로는 구축물을 선별할 목적으로 항생제 내성 유전자 또는 영양요구성-보완 유전자(auxotrophy-complementing gene)와 같은 추가의 마커를 포함할 수 있다.

적합한 조절 서열의 예들은 프로모터, 예컨대 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacI^q, T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP (rhaP_BAD)SP6, 람다-P_R 또는 람다-P_L 프로모터에 존재하며, 이들은 유리하게는 그람-음성 박테리아에 사용된다. 다른 유리한 조절 서열은 예를 들어, 그람-양성 프로모터 amy 및 SPO2, 효모 또는 진균류 프로모터 ADC1, MF알파, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH에 존재한다. 인공 프로모터 또한, 조절용으로 사용될 수 있다.

숙주 유기체에서의 발현을 위해, 핵산 구축물은 유리하게는, 유전자가 숙주 내에서 최적으로 발현될 수 있게 하는 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 파지에 삽입된다. 플라스미드 및 파지 외에도 벡터는 또한, 당업자에게 알려진 다른 모든 벡터들, 즉, 예를 들어 바이러스, 예컨대 SV40, CMV, 바큘러바이러스 및 아데노바이러스, 트랜스포존, IS 요소, 파스미드(phasmid), 코스미드(cosmid) 및 선형 DNA 또는 환형 DNA를 의미하는 것으로 이해된다. 이들 벡터는 숙주 유기체 내에서 독자적으로(autonomously) 복제되거나 염색체로(chromosomally) 복제될 수 있다. 이들 벡터는 본 발명의 추가의 개발을 구성한다.

적합한 플라스미드의 예들은, 예를 들어, 이. 콜라이 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 또는 pBdCl, 스트렙토마이세스 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361, 바실러스 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테리움 pSA77 또는 pAJ667, 진균류 pALS1, pIL2 또는 pBB116, 효모 2알파M, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23 또는 식물 pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51에 존재한다. 언급된 플라스미드는 가능한 플라스미드 중 작은 선별들일 뿐이다. 다른 플라스미드들이 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 클로닝 벡터 서적(문헌[Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN　0　444　904018])에서 찾을 수 있다.

벡터의 추가의 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산 구축물 또는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터 또한, 유리하게는 선형 DNA의 형태로 미생물에 도입되고, 이종성 재조합 또는 상동성 재조합을 통해 숙주 유기체의 게놈에 통합될 수 있다. 이러한 선형 DNA는 선형화된 벡터, 예컨대 플라스미드로 이루어질 수 있거나, 본 발명에 따른 핵산 구축물 또는 핵산으로만 이루어질 수 있다.

유기체에서 이종성 유전자를 최적으로 발현시키기 위해, 유기체에 이용되는 특이적인 "코돈 사용빈도(codon usage)"에 따라 핵산 서열을 변경하는 것이 유리하다. "코돈 사용빈도"는 문제의 유기체의 다른 알려진 유전자들의 컴퓨터 분석을 통해 쉽게 확인될 수 있다.

본 발명에 따른 발현 카세트는, 적합한 프로모터를 적합한 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 종결자 신호 또는 폴리아데닐화 신호에 융합함으로써 생성된다. 보편적인 재조합 및 클로닝 기술은 이러한 목적을 위해 사용되며, 예를 들어, 문헌[T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)]에 기술된 바와 같다.

적합한 숙주 유기체에서의 발현을 위해, 재조합 핵산 구축물 또는 유전자 구축물이 유리하게는 숙주-특이적 벡터에 삽입되며, 이러한 벡터는 유전자를 숙주에서 최적으로 발현시킬 수 있다. 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌["Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Eds., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)]에서 찾을 수 있다.

4. 미생물

맥락에 따라, 용어 "미생물"은 출발 (야생형) 미생물 또는 유전적으로 변형된 재조합 미생물, 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명에 따른 벡터의 도움으로, 예를 들어 본 발명에 따른 적어도 하나의 벡터로 형질변환되고 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 생성하는 데 사용될 수 있는 재조합 미생물을 제조하는 것이 가능하다. 유리하게는, 본 발명에 따른 상기 기술된 재조합 구축물은 적합한 숙주 시스템에 도입된 다음, 이러한 시스템에서 발현된다. 이러한 측면에서, 상기 핵산이 특정한 발현 시스템에서 발현되도록 하기 위해, 친숙한 클로닝, 및 당업자가 친숙한 형질감염 방법, 예컨대 공동침전(coprecipitation), 원형질(protoplast) 융합, 전기천공, 레트로바이러스 형질감염 등이 바람직하게는 사용된다. 적합한 시스템은 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds., Wiley Interscience, New York 1997, or Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기술되어 있다. 단백질의 이종성 발현을 위한 박테리아 발현 시스템에 관한 개요는 또한, 예를 들어, 문헌[Terpe, K. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 72: 211-222]에 의해 제공된다.

본 발명에 따른 핵산 또는 핵산 구축물을 위한 재조합 숙주 유기체는 원칙적으로, 모든 원핵생물 또는 진핵생물 유기체이다. 숙주 유기체로서, 미생물, 예컨대 박테리아, 진균류 또는 효모를 이용하는 것이 유리하다. 그람-양성 박테리아 또는 그람-음성 박테리아, 바람직하게는 엔테로박테리아세애, 슈도모나다세애(Pseudomonadaceae), 리조비아세애(Rhizobiaceae), 스트렙토마이세타세애(Streptomycetaceae) 또는 노카르디아세애(Nocardiaceae) 과(family)의 박테리아, 특히 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 코마모나스, 스트렙토마이세스, 노카르디아(Nocardia), 부르콜데리아(Burkholderia), 살모넬라, 아그로박테리움, 클로스트리디움 또는 로도콕커스(Rhodococcus) 속의 박테리아를 이용하는 것이 유리하다. 매우 특히 바람직한 것은, 에스케리키아 콜라이 종 및 속이다. 더욱이, 추가로 유리한 박테리아는 알파-프로테오박테리아, 베타-프로테오박테리아 또는 감마-프로테오박테리아로 이루어진 군에서 찾을 수 있다.

이러한 맥락에서, 본 발명에 따른 숙주 유기체(들)는 바람직하게는, 본 발명에 기술되어 있으며 상기 정의된 바와 같이 7β-HSDH 활성을 가진 효소를 인코딩하는 핵산 서열, 핵산 구축물 또는 벡터 중 적어도 하나를 포함한다.

숙주 유기체에 따라, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 유기체는 당업자에게 알려진 방식대로 생장 또는 배양된다. 원칙적으로, 미생물은 산소에서 통과되면서, 통상 당 형태의 탄소 공급원, 통상 유기 질소 공급원 형태의 질소 공급원, 예컨대 효모 추출물 또는 염, 예컨대 암모늄 술페이트, 미량 원소, 예컨대 철, 망간 및 마그네슘의 염, 및 선택적으로 비타민을 포함하는 액체 배지에서 0℃ 내지 100℃, 바람직하게는 10℃ 내지 60℃의 온도에서 생장된다. 액체 배지의 pH는 일정하게 유지될 수 있거나, 즉, 배양 동안에 조절될 수 있거나, 그렇지 않을 수 있다. 배양은 회분식, 준회분식(semibatchwise) 또는 연속식으로 수행될 수 있다. 영양소는 발효의 시작 시에 제공되거나 반연속적으로(semicontinuously) 또는 연속적으로 공급될 수 있다.

5. UDCA의 생성

단계 1: DHCA로의 CA의 화학적 전환

CA의 하이드록실기는 크롬산 또는 산성 용액(예, H₂SO₄) 중 크로메이트를 사용하여 전형적인 화학적 경로를 통해 카르보닐기로 산화된다. 이로써, DHCA가 생성된다.

단계 2: 12 - 케토 - UDCA로의 DHCA의 효소적 전환 또는 미생물적 전환

DHCA는 NADPH 또는 NADH의 존재 하에 수용액에서 3α-HSDH 및 7β-HSDH 또는 이들의 돌연변이체에 의해 특이적으로 환원되어, 12-케토-UDCA가 수득된다. 보조인자 NADPH 또는 NADH는 각각 이소프로판올 또는 소듐 포르메이트 또는 글루코스로부터 ADH 또는 FDH 또는 GDH 또는 이의 돌연변이체에 의해 재생될 수 있다. 반응은 온화한 조건 하에 진행된다. 예를 들어, 반응은 pH = 6 내지 9, 특히 약 pH = 8 및 약 10℃ 내지 30℃, 15℃ 내지 25℃ 또는 약 23℃에서 수행될 수 있다.

미생물적 전환 단계의 경우, 필요한 효소 활성/활성들을 나타내는 재조합 미생물은, 전환되어야 하는 기질(DHCA)의 존재 하에 적합한 액체 매질 내에서 혐기성적으로 또는 호기성적으로 배양될 수 있다. 적합한 배양 조건들은 당업자에게 알려져 있다. 이러한 조건들은 예를 들어, pH 5 내지 pH 10, 또는 pH 6 내지 pH 9의 pH 범위, 10℃ 내지 60℃, 또는 15℃ 내지 45℃, 또는 25℃ 내지 40℃, 또는 37℃ 범위의 온도에서의 전환을 포함한다. 적합한 배지는 예를 들어, 본원 하기에 기술되는 LB 배지 및 TB 배지를 포함한다. 이러한 맥락에서, 전환 시간은 예를 들어, 회분식으로, 연속식으로 또는 임의의 다른 통상적인 공정 변화(상기에 기술된 바와 같음)에서 수행될 수 있다. 이러한 맥락에서, 전환 시간은 예를 들어, 수분 내지 수시간 또는 수일의 범위일 수 있으며, 예를 들어, 1시간 내지 48시간일 수 있다. 선택적으로, 효소적 활성이 연속적으로 나타나지 않는다면, 후자(the latter)는, 예를 들어, 약 OD₆₀₀ = 0.5 내지 1.0의 표적 세포 밀도에 도달된 후, 적합한 유도물질(inductor)을 첨가함으로써 개시될 수 있다.

발효의 작동, 배지에의 첨가, 효소 고정화 및 중요한 성분의 단리와 관련하여, 가능한 미생물학적 생성 공정의 추가의 적합한 변형 또한, "효소 또는 돌연변이체의 생성"에 관한 하기의 섹션에서 찾을 수 있다.

단계 3: UDCA로의 12- 케토 - UDCA의 화학적 전환

12-케토-UDCA의 12-카르보닐기는 당업계에 알려진 방식대로 Wolff-Kischner 환원에 의해 제거되며, 이로써, UDCA는 12-케토-UDCA로부터 생성된다. 반응에서, 카르보닐이 우선 하이드라진과 반응하여, 하이드라존을 제공한다. 이후, 하이드라존은 염기(예, KOH)의 존재 하에 200℃까지 가열되며; 이러한 공정 동안, 질소가 제거되어, UDCA가 수득된다.

6. 효소 및 돌연변이체의 재조합 생성

더욱이, 본 발명의 주제는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 기능적인 생물학적 활성 단편의 재조합 생성 방법이며, 여기서, 폴리펩타이드-생성 미생물이 배양되며, 폴리펩타이드의 발현이 선택적으로 유도되고, 폴리펩타이드가 배양물로부터 단리된다. 요망되는 경우, 폴리펩타이드는 또한, 이러한 방식에서, 공업적인 규모로 생산될 수 있다.

본 발명에 따라 생성된 미생물은 회분법(batch method), 유가법(fed-batch method) 또는 반복 유가법(repeated fed-batch method)에 의해 불연속적으로 또는 연속적으로 생장될 수 있다. 알려진 배양 방법에 관한 개요는 Chmiel에 의한 교재(문헌[Bioprozebtechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Engineering 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)]) 또는 Storhas에 의한 교재(문헌[Bioreaktoren and periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Units] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)])에서 찾을 수 있다.

사용되는 배양 배지는 적합하게는, 문제의 균주의 필요성을 충족시켜야 한다. 다양한 미생물들에 대한 배양 배지에 관한 설명은 매뉴얼 ["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981)]에서 찾는다.

본 발명에 따라 이용될 수 있는 이들 배지는 통상, 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기 염, 비타민 및/또는 미량 원소를 포함한다.

바람직한 탄소 공급원은 당, 예컨대 단당류, 이당류 또는 다당류이다. 매우 양호한 탄소 공급원의 예는 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스이다. 당은 또한, 복합 화합물, 예컨대 당밀을 통해 배지에 첨가될 수 있거나, 당 정제의 다른 부산물을 통해 배지에 첨가될 수 있다. 또한, 다양한 탄소 공급원들의 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소 공급원은 오일 및 지방, 예를 들어 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방, 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀레산, 알코올, 예를 들어 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올, 및 유기 산, 예를 들어 아세트산 또는 락트산이다.

질소 공급원은 통상 유기 질소 화합물 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예로는, 암모니아 기체 또는 암모늄 염, 예컨대 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카르보네이트 또는 암모늄 니트레이트, 니트레이트, 우레아, 아미노산 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액(corn steep liquor), 대두 가루(soya meal), 대두 단백질, 효모 추출물, 고기(meat) 추출물 및 다른 것들 등이 있다. 질소 공급원은 개별적으로 사용되거나 혼합물로서 사용될 수 있다.

배지에 존재할 수 있는 무기 염 화합물로는, 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철 등의 클로라이드, 인 또는 술페이트 염 등이 있다.

무기 황-함유 화합물, 예를 들어, 술페이트, 술파이트, 다이티오나이트, 테트라티오네이트, 티오술페이트, 술파이드뿐만 아니라, 유기 황 화합물, 예컨대 머캅탄 및 티올이 황 공급원으로서 사용될 수 있다.

인산, 포타슘 다이하이드로겐포스페이트 또는 다이포타슘 하이드로겐포스페이트 또는 상응하는 소듐-함유 염이 인 공급원으로서 사용될 수 있다.

용액에서 금속 이온을 유지시키기 위해, 금속 이온 봉쇄제(sequestrant)가 배지에 첨가될 수 있다. 특히 적합한 금속 이온 봉쇄제로는, 다이하이드록시페놀, 예컨대 카테콜 또는 프로토카테츄에이트(protocatechuate), 또는 유기 산, 예컨대 시트르산 등이 있다.

통상, 본 발명에 따라 이용되는 발효 배지는 또한, 다른 성장 인자, 예컨대 비타민 또는 성장 촉진제를 포함하며, 이들로는, 예를 들어, 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신 등이 있다. 성장 인자 및 염은 종종, 복합 배지 구성성분, 예컨대 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등으로부터 수득된다. 더욱이, 적합한 전구체가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 배지에서의 화합물의 정확한 조성은 문제의 실험에 따라 크게 좌우되며, 각각의 개별 경우에 대해 개별적으로 결정된다. 배지의 최적하에 대한 정보는 교재 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Eds P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 찾을 수 있다. 성장 배지는 또한, 상업적인 공급원, 예컨대 Standard 1(Merck) 또는 BHI(뇌 심장 인퓨젼, DIFCO) 등으로부터 수득될 수 있다.

모든 배지 구성성분들은 열(1.5　bar 및 121℃에서 20분) 또는 필터 멸균에 의해 멸균된다. 구성성분들은 함께 또는 필요하다면 개별적으로 멸균될 수 있다. 모든 배지 구성성분들은 배양 시작 시에 존재하거나, 요망되는 경우 연속식으로 또는 회분식으로 첨가될 수 있다.

배양 온도는 통상 15℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이며, 실험 동안 일정하게 유지되거나 심지어 변할 수 있다. 배지의 pH는 pH 5 내지 pH 8.5, 바람직하게는 약 pH 7.0의 범위에 있어야 한다. 배양 pH는 배양 동안 염기성 화합물, 예컨대 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 암모니아 또는 암모니아수, 또는 산성 화합물, 예컨대 인산 또는 황산의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 소포제, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르가 이용되어, 기포 발생을 제어할 수 있다. 플라스미드 안정성을 유지시키기 위해, 선택적으로 작용하는 적합한 성분, 예를 들어 항생제가 배지에 첨가될 수 있다. 호기성 조건을 유지시키기 위해, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예를 들어 주위 공기가 배양에 통과된다. 배양 온도는 통상 20℃ 내지 45℃이다. 배양은, 요망되는 생성물이 최대로 형성될 때까지 지속된다. 이러한 목적은 통상 10시간 내지 160시간 이내에 달성된다.

이후, 발효 브로쓰(broth)가 추가로 처리된다. 필요한 것이 어떤 것인지에 따라, 바이오매스 중 일부 또는 모두가 분리 방법, 예를 들어 원심분리, 여과, 경사분리 또는 이들 방법의 조합에 의해 발효 브로쓰로부터 제거될 수 있거나, 심지어 상기 브로쓰에 완전히 남아 있을 수 있다.

폴리펩타이드가 배양 배지 내로 분비되지 않는다면, 세포는 또한 분해될 수 있으며, 생성물은 알려진 단백질 단리 방법에 의해 용해물로부터 수득될 수 있다. 세포는 선택적으로, 고-진동수 초음파(high-frequency ultrasound), 고압, 예를 들어 프렌치 압력 셀(French pressure cell)에서의 고압, 삼투용해, 세제, 용해 효소 또는 유기 용매의 작용, 균질화기, 또는 상기 언급된 방법들 중 몇몇의 조합에 의해 분해될 수 있다.

폴리펩타이드는 알려진 크로마토그래피 기술, 예컨대 분자체 크로마토그래피(겔 여과), 예컨대 Q-세파로스 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있으며, 또한, 다른 보편적인 방법들, 예컨대 한외여과(ultrafiltration), 결정화, 염석(salting out), 투석 및 네이티브(native) 겔 전기영동에 의해 정제될 수 있다. 적합한 방법은 예를 들어, 문헌[Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical working methods], Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin]에 기술되어 있다.

재조합 단백질을 단리하기 위해, 특정 뉴클레오타이드 서열에 의해 cDNA를 연장시키고(extend), 따라서 예를 들어 더 간단한 정제를 위해 작용하는 변형된 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 벡터 시스템 또는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 적합한 이러한 변형으로는, 예를 들어 "태그"로 알려져 있는 것이 있으며, 이러한 태그는 앵커, 예를 들어 헥사-히스티딘 앵커, 또는 항체에 의해 항원으로서 인지될 수 있는 에피토프로 알려져 있는 변형으로서 역할을 한다(예를 들어, 문헌[Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press]에 기술되어 있음). 이들 앵커는 단백질을, 예를 들어 크로마토그래피 컬럼 내로 패킹(packing)될 수 있는 고체 지지체, 예를 들어 중합체 매트릭스에 부착시키거나, 단백질을 마이크로타이터 플레이트 또는 임의의 다른 지지체에 부착시키는 역할을 할 수 있다.

동시에, 이들 앵커는 또한, 단백질의 동정에 사용될 수도 있다. 더욱이, 단백질의 동정을 위해, 통상적인 마커, 예컨대 형광 염료, 기질과의 반응 후 검출가능한 반응 생성물을 형성하는 효소 마커, 또는 방사성 마커가 단독으로 사용되거나, 단백질의 유도체화를 위한 앵커와 조합하여 사용될 수 있다.

7. 효소 고정화

본원에 기술된 방법에서, 본 발명에 따른 효소는 유리(free) 형태 또는 고정화된 형태로 이용될 수 있다. 고정화된 효소는 불활성 지지체에 고정된 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 적합한 고체 지지체, 및 이러한 지지체 상에 고정된 효소는 EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 및 DE-OS 100193773 및 이러한 출원들에서 인용된 문헌들로부터 알려져 있다. 이러한 측면에서, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전체가 참조로서 삽입되어 있다. 적합한 지지체 물질로는, 예를 들어, 클레이(clay), 클레이 무기물질, 예컨대 카올리나이트, 규조토, 펄라이트(perlite), 실리카, 알루미나, 소듐 카르보네이트, 칼슘 카르보네이트, 셀룰로스 분말, 음이온 교환 물질, 합성 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 아크릴 수지, 페놀-포름알데하이드 수지, 폴리우레탄 및 폴리올레핀, 예컨대 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌 등이 있다. 지지체 물질은 통상, 지지된(supported) 효소의 제조를 위해 미분된 과립 형태로 이용되며, 다공성 형태가 바람직하다. 지지체 물질의 입자 크기는 통상 5　mm 이하, 특히 2　mm 이하(입도 곡선(grading curve))이다. 유사하게는, 데하이드로게나제를 전체 세포 촉매로서 사용 시, 유리 형태 또는 고정화된 형태가 선택될 수 있다. 지지체 물질은 예를 들어, 칼슘 알기네이트 및 카라기닌(carrageenan)이다. 효소뿐만 아니라 세포는 또한, 글루타르알데하이드를 사용하여 직접 가교(CLEA에의 가교)될 수 있다. 상응하며 추가적인 고정화 공정은 예를 들어, 문헌[J. Lalonde and A. Margolin "Immobilization of Enzymes" in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim]에 기술되어 있다.

실험 부문:

다르게 명시되지 않는 한, 본 발명의 범위 내에서 수행되는 클로닝 단계, 예를 들어, 제한효소 절단(restriction cleavage), 아가로스 겔 전기영동, DNA 단편의 정제, 니트로셀룰로스 및 나일론 막으로의 핵산의 트랜스퍼, DNA 단편의 연결, 미생물의 형질변환, 미생물의 배양, 파지의 증식 및 재조합 DNA의 서열 분석은 문헌[Sambrook et al. (1989) loc. cit]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

A. 일반적인 정보

물질:

콜린셀라 애로파시엔스 DSM 3979(ATCC 25986, 이전에는 유박테리움 애로파시 엔스로서 지칭됨)의 게놈 DNA를 Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)으로부터 입수하였다.

씨. 테스토스테로니의 게놈 DNA는 Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)으로부터 수득할 수 있거나, 당업계에 알려진 방법을 사용하여 씨. 테스토스테로니 균주로부터 단리할 수 있다.

DHCA, UDCA 및 7-케토-LCA는 당업계에 알려져 있으며 문헌에 기술되어 있는 출발 화합물이다. 모든 다른 화학물질들을 Sigma-Aldrich사 및 Fluka사(독일)로부터 입수하였다. 모든 제한효소 엔도뉴클레아제, T4 DNA 리가제, Taq DNA 폴리머라제, Plusion DNA 폴리머라제 및 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 Fermentas사(독일)로부터 입수하였다.

배지:

배지 1 리터 당 트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, NaCl 10 g을 포함하는 LB 배지,

배지 1 리터 당 트립톤 12 g, 효모 추출물 24　g, 글리세롤 4 ml, 10% KPi 완충액(11.55 g KH₂PO₄, 62.7 g K₂HPO₄, 500 ml이 되게 하는 양의 H₂O)을 포함하는 AI 배지(자가-유도 배지).

문헌[Wilms et al, BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, 2001 VOL. 73, NO. 2, 95-103]에 따라 변형된 최소 배지.

서열:

도　2는 야생형 7β-HSDH 효소 및 돌연변이체의 아미노산 서열을 보여주지만; 이들은 모두 각각의 경우 C-말단에 헥사-히스티딘 태그가 제공되어 있다. 이러한 방식으로, 모든 효소들은 단리되고 특징화되었다.

실시예 　1: 재조합 3α - HSDH의 생성

A)　플라스미드 형질변환:

각각의 3α-HSDH 유전자가 제한효소 NcoI/Eco31I 및 XhoI의 절단 부위를 통해 클로닝된 상업적으로 입수가능한 발현 벡터 pET28a(+)를, 재조합 3α-HSDH 효소(야생형 효소 및 돌연변이체 효소)의 발현에 사용하였다. 발현 벡터 pET28a(+)는, HSDH 유전자를 클로닝할 때, 유전자 서열을 HSDH 유전자에 직접 부착시킬 수 있으며, 이러한 서열은 6개의 히스티딘 분자의 연속을 코딩한다. 발현 후, 이러한 서열(헥사히스티딘 태그 또는 His-태그로 지칭됨)은 HSDH 단백질의 C-말단쪽에 나타난다. 본래의 또는 야생형 HSDH 유전자는 코마모나스 테스토스테로니 박테리아로부터 기원하고, 각각의 3α-HSDH 유전자를 포함하는 플라스미드는 pET28a(+)_3α-HSDH로 지칭된다. pET28a(+)_3α-HSDH 플라스미드를 형질변환하기 위해, 5 ㎕의 연결 혼합물을 100 ㎕의 컴피턴트(competent) BL21(DE3)Δ7α-HSDH 이. 콜라이 세포에 처리하고, 형질변환을 Hanahan에 의해 기술된 바와 같이 수행하였으며(문헌[J. Mol. Biol. (1983), vol. 166, pp. 557]), 동일한 단계를, 야생형 유전자를 포함하는 플라스미드, 및 돌연변이화된 HSDH 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용해서도 수행하였다. 이러한 맥락에서 정기적으로 사용되어 온 이. 콜라이 균주 BL21(DE3)Δ7α-HSDH는, 7α-HSDH에 대한 유전자가 이러한 균주에서 결실되었다는 점에서 구별된다. 이러한 연구에 사용된 이. 콜라이 균주의 정확한 특징은 표 1에 간추린다.

표 1: 사용된 에스케리키아 콜라이 균주

B) 발현 및 세포 증식:

발현을 위해, 발현 구축물(pET28a(+)_3α-HSDH 플라스미드)을 포함하는 이. 콜라이 균주를 25℃에서 LB 배지(1 리터 당 트립톤 10　g, 효모 추출물 5　g, NaCl 10　g)에서 20시간 동안 증식시켰으며, 배지는 50　㎍/ml 카나마이신을 포함하였다. 세포를 원심분리(5000　x　g, 30분, 4℃)에 의해 수합하였다.

C) 미정제 추출물의 수득:

펠렛을 분해 완충액(10　mM 이미다졸, 50　mM 소듐 포스페이트, 300　mM NaCl, pH　8)에 재현탁화하고, 완충액 4　ml를 세포 1 g(습윤 질량(moist mass)) 당 첨가하였다. 그런 다음, 세포를 일정하게 냉각시키면서 Sonopuls HD2070 소니케이터(Bandelin, Berlin, Germany)를 사용하여 소니케이션(sonication)에 의해 1분 동안(30　W 파워, 50% 작동 간격 및 1분 휴지기(break)) 분해시켰다. 분해를 3회 반복하였다. 세포 현탁액을 원심분리(18　000　x　g, 30분, 4℃)하였고, 상층액을 세포-무함유 미정제 추출물이라 지칭하였다.

D) 효소의 정제:

His-태그는, 이러한 서열이 특정한 크로마토그래피 물질(NTA(2가 니켈 이온이 로딩된 Ni-니트릴로트리아세테이트)-변형된 지지체 물질, 예를 들어 "His Pur Ni-NTA"(Nimagen B. V., Nijmegen, 네덜란드))에 의해 높은 특이성으로 결합되기 때문에, HSDH 단백질을 매우 간단하게 정제할 수 있게 한다. 이를 위해, 세포-무함유 미정제 추출물을, 이러한 물질을 포함하는 적하 컬럼(dropping column)에 적용하며, 이러한 적하 컬럼은 이미 분해 완충액(3 내지 5 컬럼 부피)으로 평형화되어 있다. 3 내지 5 컬럼 부피의 세척 완충액(20　mM 이미다졸, 50　mM 소듐 포스페이트, 300　mM NaCl, pH　8)을 사용하여 세척함으로써, 약하게 결합한 단백질을 제거하였다. His-태그-3α-HSDH 단백질을, 이미다졸-포함 용출 완충액(250　mM 이미다졸, 50　mM 소듐 포스페이트, 300　mM NaCl, pH　8)을 사용하여 용출하였다. 공정을 실온에서 수행하였다. 존재한 이미다졸은 완충액 교환에 의해 제거되어야 했다.

단백질 농도를 Bradford에 의해 기술된 방법에 의해 확인하였다(100 ㎕의 검체를 900 ㎕의 Bradford 시약과 혼합하고, 암실에서 적어도 15분 동안 인큐베이션한 다음, 소 혈청 알부민으로 구축된 보정 곡선(calibration curve)에 대해 595 nm에서 확인함). SDS-PAGE(SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 분석을 수행하기 위해, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)를 사용하여 염색하였다.

E) 활성 확인:

3α-HSDH 및 돌연변이체의 활성을 광도측정 분석법을 사용하여 확인하였으며, 여기서, 흡광도 감소를 340　nm에서 30초 동안 측정하였다. 총 1 ml의 부피에서, 반응 용액은 874 ㎕ 50　mM 포타슘 포스페이트(KPi) 완충액, pH 8.0; 100 ㎕의 100 mM 데하이드로콜산(DHCA) 용액(50　mM KPi, pH 8에 용해된 DHCA); 10 ㎕의 효소 용액(선택적으로 희석됨); 16 ㎕의 12.5　mM NADPH 용액(증류된 H₂O에 용해됨)을 포함하였다. 후속해서, 활성은 단위(U)로 명시되며, 1　U는 1　μmol NADPH/min의 감소에 상응한다.

실시예 　2: 아미노산 위치 34에서 3α - HSDH 돌연변이체의 생성, 및 이의 특징화

A) 프라이머 :

표 2에 명시된 돌연변이발생 프라이머를, 3α-HSDH의 위치-방향적 돌연변이발생을 수행하는 데 사용하였다. 3α-HSDH 유전자 서열을 기재로, 프라이머를, 이것이 요망되는 아미노산 교환을 유발하도록 선별하였다. 하기 프라이머 쌍을 돌연변이체 생성에 사용하였다:

표 2: 위치 34에서 3α-HSDH의 위치-방향적 돌연변이발생을 위한 프라이머

B) QuikChange ®- PCR :

아미노산의 표적화된 교환은 "QuikChange®-PCR" 방법으로 달성될 수 있다. 이를 위해, 하기 PCR 반응을 수행하였다(반응 혼합물은 표　3 참조): 우선, 95℃에서 2분 동안 초기 변성 단계를 수행하였으며, 이후, 20 사이클의 변성(95℃에서 30초), 프라이머 혼성화(60℃ 내지 68℃에서 1분) 및 신장(68℃에서 11분)을 수행하였다. 수행되는 마지막 단계는 68℃에서 10분 동안의 최종 신장이었으며, 이후, 4℃까지 냉각시킴으로써 폴리머라제 연쇄 반응을 종료하였다. 사용된 주형은 3α-HSDH(야생형)의 유전자를 가진 pET28a 벡터였다.

표 3: 다양한 3α-HSDH 변이체의 생성을 위한 PCR 혼합물

단백질 서열 내의 아미노산을 표적화된 방식으로 교환하기 위해, 문제의 유전자의 DNA 서열을 위치-방향적 돌연변이화시킨다. 이를 위해, 당업자는 서로 상보적이며 요망되는 돌연변이를 이의 서열에 함유하는 프라이머를 이용한다. 사용된 주형은 N6-아데닌-메틸화된 이중 가닥 플라스미드 DNA이며, 이는 돌연변이화되어야 하는 유전자를 함유한다. N6-아데닌 메틸화된 플라스미드 DNA는 dam+ 이. 콜라이 균주, 예를 들어　이. 콜라이 DH5α로부터 단리된다.

폴리머라제 연쇄 반응을 상기 기술된 바와 같이 수행한다. 본원에서, 프라이머가 주형에 상보적이기 위해 연장되어, 요망되는 돌연변이를 가지며 가닥 절단을 가진 플라스미드가 수득된다. 다른 PCR 반응과는 대조적으로, DNA 수율의 증가는 오로지 선형적인데, 왜냐하면 새로 형성된 DNA 분자가 PCR 반응을 위한 주형으로서 작용할 수 없기 때문이다.

PCR 반응이 종결된 후, PCR 생성물을 PCR 정제 키트(Analytik Jena AG, Jena, 독일)에 의해 정제하였으며, 부모 N6-아데닌-메틸화된 것을 제한효소 dpnI를 사용하여 분해하였다. 이러한 효소의 특이한 점(peculiarity)은, 이것이 N6-아데닌-메틸화된 DNA를 비특이적으로 제한하지만 새로 형성된 비메틸화된 DNA는 제한하지 못한다는 점이다. 제한은, 1 ㎕의 dpnI를 PCR 반응 혼합물에 첨가하고, 이 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 또는 밤새 인큐베이션함으로써 발생하였다. 이러한 혼합물 7.5 ㎕를 화학적 컴피턴트 DH5α 세포 100 ㎕의 형질변환을 위해 적용하였다.

C) 효소 돌연변이체의 활성 데이터:

위치 34에서 돌연변이가 형성된 돌연변이체의 활성 측정(실시예 1 참조)은 하기 표 4에서 나타난 데이터를 보여주었다.

표 4: 위치 34에서 변형되었던 다양한 3α-HSDH 변이체들의 활성

최상의 돌연변이체([R34N])는 약 3배만큼 개선된 활성을 나타낸다.

실시예 3: 아미노산 위치 68에서 3α - HSDH 돌연변이체의 생성, 및 이의 특징화

하기 내용은, 위치 68에서 아스파르트산이 일부 다른 아미노산으로 교환된 3α-HSDH 돌연변이체를 기술하고 있다. 유리한 돌연변이체는 상세하게는, 미카엘리스-멘텐 카이네틱스를 통해 파라미터 K_M 및 v_max를 확인함으로써 이의 카이네틱스에 의해 특징화된다. 돌연변이체를 야생형 효소와 비교할 수 있도록, 야생형 효소를 마찬가지로, 미리 정제하고, 이의 카이네틱스에 관해 특징화하였다.

A) 야생형 효소의 미카엘리스-멘텐 카이네틱스

돌연변이체의 변형을 카이네틱 상수의 측면에서 명확하게 나타내기 위해, 야생형 효소를 정제하고, 하기 내용에서 특징화하였다.

His 태그를 가진 정제된 효소에 대한 데이터는 도 3 및 표 5에 주어져 있다.

표 5: 기질 DHCA 및 보조인자 NADH에 대한 야생형 효소에 대한 카이네틱 상수(x = 저해 없음)

A) 돌연변이체의 구축을 위한 프라이머 :

표 6에 열거된 돌연변이발생 프라이머를, 3α-HSDH의 위치-방향적 돌연변이발생을 수행하는 데 사용하였다. 3α-HSDH 유전자 서열을 기재로, 프라이머를, 이것이 요망되는 아미노산 교환을 유발하도록 선별하였다.

하기 프라이머 쌍을 돌연변이체 생성에 사용하였다:

표 6: 위치 68에서 3α-HSDH의 위치-방향적 돌연변이발생을 위한 프라이머

B) QuikChange ® PCR :

위치 68에서 아스파르트산을 표적 교환하는 것을, 실시예 2B에 기술된 바와 같이 QuikChange® PCR에 의해 수행하였다.

C) 효소 돌연변이체의 활성값 :

위치 68에서 돌연변이화된 돌연변이체의 광도 활성(photometric activity) 측정(실시예 1 참조)은, 하기 표 7에 열거된 데이터를 제공하였다.

표 7: 위치 68에서 변형된 다양한 3α-HSDH 변이체들의 활성

D) 미카엘리스 - 멘텐 카이네틱스

최상의 돌연변이체(3α-HSDH [L68A])를 정제하고(1D 참조), 이의 카이네틱 파라미터 상수 v_max 및 K_M을 확인하였다. 도 4는 카이네틱 과정의 다이어그램을 보여주고, 이로부터 유도되는 카이네틱 상수는 표 8에 열거되어 있다.

표 8: 기질 DHCA 및 보조인자 NADH에 대한 돌연변이체 L68A에 대한 카이네틱 상수(x = 저해 없음)

표　7로부터, 최대 속도를 야생형 효소(3E 참조)보다 약 2배만큼 증가시킬 수 있었음을 알 수 있다. 돌연변이체의 K_M 값은 야생형 효소에 대한 값과 유사하다.

실시예 　4: 여러 위치들에 아미노산 교환을 포함하는 3α - HSDH 돌연변이체의 생성, 및 이의 특징화

실시예 2 및 실시예 3에 기술된 개별 돌연변이체 외에도, 유리하게는 돌연변이들을 조합할 수도 있다. 예로서, 위치 34 및 위치 68이 동시에 변형된 이중 돌연변이체를 생성하였다. 여기서, 위치 34에서의 최상의 아미노산 교환([R34N])을 위치 68에서의 최상의 교환([L68A])과 조합하였다.

A) 이중 돌연변이체의 생성 및 활성 값

이중 돌연변이체의 수득 방법 및 활성 시험은 실시예　2B　내지 실시예　2C에 기술된 방법에 따라 수행하였다. 표 9는 야생형 효소의 활성과 비교하여, 미정제 추출물 내 이중 돌연변이체의 활성을 간추린 것이다.

표 9: 위치 34 및 위치 68에서 변형된 3α-HSDH 이중 돌연변이체의 활성

B) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 발현 조절

이종성 발현의 발현 거동을 평가할 수 있기 위해, SDS-PAGE를 수행하였다. 도 5는, 돌연변이체 3α-HSDH [R34N/L68A] 및 3α-HSDH [L68A]의 SDS 겔을 보여준다. 돌연변이체의 크기는 약 27.4 kDa이었다. 도면은, 3α-HSDH가 SDS 겔에서 이의 크기에 따라 이동하지 않음을 보여준다. 이는 항상, 마커의 25 kDa 밴드의 약간 아래에서 이동한다.

C) 미카엘리스 - 멘텐 카이네틱스

돌연변이체 3α-HSDH [R34N/L68A]를 정제하였으며, 정제된 효소에 대한 카이네틱 파라미터를 확인하였다. 도 6은 미카엘리스-멘텐 카이네틱스의 다이어그램을 보여준다.

D) 이중 돌연변이체에 대한 활성 값

표 10은 미카엘리스-멘텐 카이네틱스를 근거로 구축된 바와 같은, 이중 돌연변이체에 대한 활성 값을 간추린 것이다.

표 10: 기질 DHCA 및 보조인자 NADH에 대한 정제된 효소 3α-HSDH [R34N/L68A]에 대한 카이네틱 상수(x = 저해 없음)

이중 돌연변이체의 최대 활성을 야생형보다 약 25%만큼 증가시키는 것이 가능하였다. K_M 값은 급격하게 개선되었다: 야생형 효소에 대해서는 134 μM의 값이 확인된 한편, 돌연변이체는 80 μM의 K_M 값을 보여준다.

E) 돌연변이체([ L68A ]) 및 이중 돌연변이체[ R34N / L68A ])와 야생형의 미카엘 리스-멘텐 카이네틱스의 비교에 대한 요약

각각의 돌연변이체들의 경로에 대한 다이어그램을 도 7에 나타낸 바와 같이 야생형과 비교하였다. His 태그를 포함하며 이미 변형된 야생형 효소를 비교를 위해 본 실시예에서 사용하였다. 단일 돌연변이체(L68A)는 개선된 활성을 보여주는 한편(DHCA와 함께), 초과 기질 저해(substrate excess inhibition)가 약간 더 두드러진 것으로 보인다. 2개의 위치들의 조합은 이러한 돌연변이체가 낮은 기질 농도(DHCA)에서 야생형만큼 활성이지 않도록 하였으며, 한편, 이중 돌연변이체는 보다 높은 기질 농도, 즉, 적용에 중요한 범위 내에서 야생형 효소보다 확연하게 더 높은 활성을 가진다.

실시예 5: 헥사히스티딘 (His) 태그의 효과

His 태그를 포함하는 야생형 효소의 활성과 His 태그를 포함하지 않는 야생형 효소의 활성을 비교한 경우, 활성이 서로 명확하게 상이한 것을 주목하였다. 그런 다음, 이러한 차이는 미카엘리스-멘텐 카이네틱스의 비교에서 명확해졌다(도 8). 표 11은 K_M 및 v_max 값을 비교한 개요를 제공한다. His 태그를 포함하지 않는 효소의 정제가 매우 힘든 것이기 때문에, 비교는 비-정제 효소(미정제 추출물)를 이용하여 기록하였다. 그러나, 카이네틱스의 상대적인 경로, 및 따라서 His 태그의 효과에 대한 발견들은 정제된 효소를 사용할 때 변할 것으로 예상되지 않는다.

표 11: 기질 DHCA에 대한 비-태깅된 3α-HSDH 및 태깅된 3α-HSDH의 카이네틱스 상수. 키: * = 다이어그램으로부터 판독되는 카이네틱 상수

도 8 및 표 11의 값들은, 효소의 활성을 상실하지 않으면서도 적어도 효소의 C-말단 방향에 His 태그가 제공될 수 있음을 보여준다. 기질에 대해 높은 친화성을 가지고, 오로지 약 1 mM에서도 이의 최대 활성에 도달하는 한편, DHCA를 더 증가시킨 후 활성이 급격하게 저하되는 것은 야생형 효소의 특징이다(도 8, 검정색 도트(dot)). 비-태깅된 효소는 오로지 약 10% 내지 20%의 잔여 활성을 가진다. 이와는 대조적으로, 효소의 His-태그 변이체는 확연하게 상이한 거동을 보여준다. DHCA 농도를 증가시켜도, 활성은 낮은 DHCA 농도 범위에서 그다지 급격하게 증가하지 않으며, 즉, 친화성이 다소 감소하기는 하지만, 이러한 효소는 더 이상 두드러진 초과 기질 저해를 나타내지 않는다. 따라서, 태깅된 효소는 특히, 제조 적용에 대해 비-태깅된 효소보다 더 양호한 특성을 가지며, 이는 더 높은 DHCA 농도에서 그러하다.

실시예 6: 히스티딘(His) 태그 길이의 효과

His 태그를 포함하는 야생형 효소의 활성과 His 태그를 포함하지 않는 야생형 효소의 활성을 비교한 경우, 활성이 서로 명확하게 상이한 것을 주목하였다. 6xHis 태그의 효과를 보다 명확하게 나타내기 위해, C 말단에 3xHis 태그를 포함하는 3α-HSDH 변이체 및 9xHis 태그를 포함하는 3α-HSDH 변이체를 Quick-Change® PCR에 의해 생성하였다. 발현(25℃, 0.5　mM, IPTG, 20시간) 후, 단백질을 정제하고, 발현 및 정제를 SDS 겔에 의해 검사하였다. 첨부된 도면 9는 SDS 겔을 보여주고, 후속하는 표 12는 다양한 변이체들의 카이네틱 상수를 보여준다.

표 12: C 말단에서 상이한 수의 히스티딘을 가진 3α-HSDH의 카이네틱 상수의 비교. 상수를 10　μM 내지 10　mM의 DHCA 농도와 함께 기록하였다. NADH 농도는 0.2 mM이었다. 정제된 단백질을 측정에 이용하였다.

표 12에 보여진 카이네틱 상수는, C-말단 히스티딘 잔기가 촉매 특성에 효과를 가진다는 가정을 확인시켜 준다. 표로부터, His 태그 길이를 증가시킴에 따라 친화성이 증가한다는 것을 매우 명확하게 알 수 있다. 9개의 히스티딘으로 이루어진 꼬리를 가진 효소 변이체는, C 말단에 3개의 히스티딘을 가진 변이체보다 14배 더 양호한 K _M 값을 나타낸다. 더욱이, 촉매 효율(k _cat/K _M)은, 히스티딘 사슬 길이가 증가함에 따라 증가하는 것으로 나타나며; 9개의 히스티딘을 가진 변이체는 오로지 3개의 히스티딘을 가진 변이체보다 19배 더 높은 효율을 가진다.

실시예 7: 위치 P185, T188 및 선택적으로 부가적으로는 L68에서 추가의 3α -HSDH 단일 돌연변이체 및 이중 돌연변이체의 생성 및 특징화

A) 프라이머 :

표 13에 명시된 돌연변이발생 프라이머를 3α-HSDH의 위치-방향적 돌연변이발생에 사용하였다. 3α-HSDH 유전자 서열을 기준으로, 요망되는 아미노산 교환을 유발하도록 프라이머를 선택하였다.

하기 프라이머 쌍을 돌연변이체를 생성하는 데 사용하였다:

상기 언급된 돌연변이발생 프라이머(표 6 참조)를 위치 L68에서의 돌연변이에 사용하였다.

B) QuikChange ® PCR :

아미노산 라디칼의 표적화된 교환을 실시예 2B와 유사하게 수행하였다. 이를 위해, N-말단에 헥사히스티딘 태그를 가진 플라스미드 pET28a(+)3α-HSDH(N-His) 및 C-말단에 헥사히스티딘 태그를 가진 플라스미드 pET28a(+)3α-HSDH(C-His)에서 3α-HSDH의 야생형 유전자를, 하기 표 14 및 표 15에서 나타낸 돌연변이체가 생성되도록, QuikChange® PCR에 의해 변형시켰다.

배양 및 발현 후, 세포를 수합하고, 세포-무함유 미정제 추출물의 비활성을 10　mM DHCA의 기질 농도에서 확인하였다. 미정제 추출물 효소를 이용한 활성 측정이 가장 기대되는(promising) 효소 변이체들을 Ni-NTA 크로마토그래피에 의해 정제하고, 이들의 카이네틱 상수를, 10　μM 내지 20　mM의 상이한 DHCA 농도에서 측정에 의해 확인하였다. 또한, 모든 돌연변이체들에 대해 SDS PAGE에 의한 발현 검사를 수행하였다.

상응하는 야생형 효소와 비교하여 10　mM DHCA에서 이들의 활성에 대해 가장 기대되는 후보물질들은:

N-말단 헥사히스티딘 태그를 가진 T188A, T188S, T188G, P185A, L68A, T188S/L68A, T188A/L68A, P185A/T188A 및 C-말단 헥사히스티딘 태그를 가진 T188A, L68A이었다.

여기서 수득된 결과를 하기 내용에 명시한다.

[ T188A ] N-말단 헥사히스티딘 태그

0.5　mM DHCA에서 최고 비활성에 도달한 후, 활성은 다시 저하하기 시작하는 것으로 보인다. 야생형과 마찬가지로, 효소는 확연한 초과 기질 저해를 특징으로 한다. 단백질은 약 4.5　mM DHCA에서 여전히 약 50%의 잔여 활성을 가지며, 20 mM에서 약 20%의 잔여 활성을 가진다. 점근적인(asymptotic) 경로가 구축된다.

[ T188S ] N-말단 헥사히스티딘 태그

0.5　mM의 기질 농도에서 최대 비활성에 도달한 후, 초과 기질 저해가 관찰된다. 20　mM DHCA의 기질 농도에서, 효소는 20%를 초과하는 잔여 활성을 유지한다.

[ T188G ] N-말단 헥사히스티딘 태그

여기서는, 확연한 초과 기질 저해가 관찰되지 않는다. 그러나, 활성은 다른 효소 변이체들과 비교하여 상대적으로 낮으며(대략 10%), 최대 활성은 25　U/mg에서 달성된다. 높은 기질 농도(5 mM 초과)에서, 활성은 지금까지 기술되었던 다른 변이체들과 대략적으로 동일하다. 카이네틱 파라미터를 경로 다이어그램을 이용하여 확인하였다.

[ P185A ] N-말단 헥사히스티딘 태그

마찬가지로, 0.25 mM의 DHCA 기질 농도에서 최대 비활성에 도달한 후, 확연한 초과 기질 저해가 관찰되었다. 10 mM의 기질 농도에서, 잔여 활성은 여전히 5%이다.

[ L68A ] N-말단 헥사히스티딘 태그

[Hwang et al., 2013]에 의해 동정되었던 상기 기술된 위치 T188 및 P185 외에도, 3α-HSDH L68A를 비교를 위해 생성하였다. 다른 2개의 위치와 대조적으로, 위치 68은 단백질의 N-말단 영역에 존재한다. 모든 3개의 위치들은, 이들 아미노산이 조효소와 연결을 형성한다는 사실을 공유하며, 이것이, 이러한 돌연변이체 또한 N-말단 His 태그를 포함하도록 생성되며 생화학적 특징화에 포함된 이유이다. 이를 위해, 플라스미드 pET28a(+)3α-HSDH(N-His)를, 요망되는 돌연변이체가 생성되도록 QuickChange® PCR에 의해 변형시켰다. 배양 및 발현 후, 단백질을 Ni-NTA 크로마토그래피에 의해 정제하고, 비활성을 확인한 다음, 이의 카이네틱 상수를 확인하였다. 또한, DHCA 기질 농도를 10 μM 내지 10 mM에서 변화시켰으며, 한편, NADH 농도는 일정하게 0.2 mM이었다.

0.1　mM DHCA의 기질 농도에서 최대 비활성에 도달한 후, 확연한 초과 기질 저해가 관찰되었다. 1　mM DHCA의 기질 농도에서, 잔여 활성은 약 15%에 달하며, 10 mM에서 잔여 활성은 약 8%에 달한다.

하기 이중 돌연변이체를 생성하기 위해, 각각의 경우, 하나의 기존 돌연변이체를 상기 기술된 바와 같이 Quick Change® PCR에 의해 다시 변형시켰으며, 발현시키고, 정제한 다음, 이의 파라미터를 확인하였다.

[ L68A / T188A ] N-말단 헥사히스티딘 태그

0.5　mM DHCA의 기질 농도에서 최대 비활성에 도달한 후, 덜 확연한 초과 기질 저해가 관찰되었다. 1　mM DHCA의 기질 농도에서, 잔여 활성은 여전히 약 85%에 달하며, 10 mM에서 잔여 활성은 여전히 20%보다 높다. 이는 2개의 단일 돌연변이체의 경우보다 비교적 더 크다.

[ L68A / T188S ] N-말단 헥사히스티딘 태그

0.5　mM에서 최대 비활성에 도달한 후, 활성의 저하가 관찰되었다. 이는 확연한 초과 기질 저해로 인한 것일 수 있다. 곡선의 경로는 상응하는 단일 돌연변이체의 경로와 동일하다. 10　mM DHCA의 기질 농도에서, 잔여 활성은 여전히 약 20%인 것으로 관찰된다.

[ P185A / T188A ] N-말단 헥사히스티딘 태그

0.5　mM의 DHCA 기질 농도에서 최대 비활성에 도달한 후, 초과 기질 저해가 관찰되었다. 10　mM DHCA의 기질 농도에서, 효소의 잔여 활성은 여전히 약 30%이다. 종합해서, 곡선의 경로 및 기질 저해는 상응하는 단일 돌연변이체의 경우보다 더 낮고 덜 두드러지지만, 활성은 뚜렷하게 더 낮다.

C) 본 섹션에서 생성된 효소 돌연변이체의 활성 데이터의 모음:

돌연변이체 및 이의 카이네티 파라미터의 광도 활성 측정(실시예 1과 유사함)을 하기 표 14 및 표 15에 간추린다.

표 14: 기질 DHCA에 대해 확인된, 야생형 및 효소 변이체의 카이네틱 파라미터의 결과에 대한 요약. 겉보기 값(apparent value)을 열거하였다.

표 15: 기질 NADH에 대해 확인된, 야생형 및 효소 변이체의 카이네틱 파라미터의 결과에 대한 요약. 겉보기 값을 열거하였다.

요약하자면, 생성된 돌연변이체는 상응하는 야생형 효소와 비교하여, 기질인 DHCA 및/또는 NADH에 대해 촉매 활성 및/또는 친화성 및 효율의 개선을 보여준다고 말할 수 있다.

언급되어야 하는 N-말단 His 태그 돌연변이체는 특히, [T188A], [T188S], [L68A], [P185A], [L68A/T188S], [L68A/T188A]이며, 둘 다 기질 DHCA 및 기질 NADH에 대한 것이다.

언급되어야 하는 C-말단 His 태그 돌연변이체는 특히 [T188A] 및 [L68A]이다.

본원에서 사용된 서열들

본원에 언급된 공개문헌의 개시내용은 원용되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> PharmaZell GmbH <120> 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase mutants and process for the preparation of ursodeoxycholic acid <130> M/55001-PCT <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 792 <212> DNA <213> Colinsella aerofaciems <220> <221> CDS <222> (1)..(792) <400> 1 atg aac ctg agg gag aag tac ggt gag tgg ggc ctg atc ctg ggc gcg 48 Met Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Leu Ile Leu Gly Ala 1 5 10 15 acc gag ggc gtc ggc aag gcg ttc tgc gag aag atc gcc gcc ggc ggc 96 Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Lys Ile Ala Ala Gly Gly 20 25 30 atg aac gtc gtc atg gtc ggc cgt cgc gag gag aag ctg aac gtg ctc 144 Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Asn Val Leu 35 40 45 gca ggc gag atc cgc gag acc tac ggc gtg gag acc aag gtc gtg cgc 192 Ala Gly Glu Ile Arg Glu Thr Tyr Gly Val Glu Thr Lys Val Val Arg 50 55 60 gcc gac ttt agc cag ccc ggc gct gcc gag acc gtc ttc gcc gcg acc 240 Ala Asp Phe Ser Gln Pro Gly Ala Ala Glu Thr Val Phe Ala Ala Thr 65 70 75 80 gag ggc ctg gac atg ggc ttc atg agc tac gtg gcc tgc ctg cac agc 288 Glu Gly Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Leu His Ser 85 90 95 ttc ggt aag atc cag gac acc ccc tgg gag aag cac gag gcc atg atc 336 Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Ala Met Ile 100 105 110 aac gtc aac gtc gtg acc ttc ctc aag tgc ttc cac cac tac atg cgg 384 Asn Val Asn Val Val Thr Phe Leu Lys Cys Phe His His Tyr Met Arg 115 120 125 atc ttt gcc gcc cag gac cgc ggc gcc gtg atc aac gtc tcg tcg atg 432 Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Met 130 135 140 acc ggc atc agc tcc agc ccc tgg aac ggc cag tac ggc gcg ggc aag 480 Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln Tyr Gly Ala Gly Lys 145 150 155 160 gcc ttc atc ctc aag atg acc gag gcc gtg gcc tgc gag tgc gag ggc 528 Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Cys Glu Gly 165 170 175 acc ggc gtc gac gtc gag gtc atc acc ctc ggc acc acc cta acc ccc 576 Thr Gly Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Leu Thr Pro 180 185 190 agc ctg ctg tcc aac ctc ccc ggc ggc ccg cag ggc gag gcc gtc atg 624 Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln Gly Glu Ala Val Met 195 200 205 aag atc gcc ctc acc ccc gag gag tgc gtt gac gag gcc ttt gag aag 672 Lys Ile Ala Leu Thr Pro Glu Glu Cys Val Asp Glu Ala Phe Glu Lys 210 215 220 ctg ggt aag gag ctc tcc gtc atc gcc ggc cag cgc aac aag gac tcc 720 Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ala Gly Gln Arg Asn Lys Asp Ser 225 230 235 240 gtc cac gac tgg aag gca aac cac acc gag gac gag tac atc cgc tac 768 Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Glu Tyr Ile Arg Tyr 245 250 255 atg ggg tcg ttc tac cgc gac tag 792 Met Gly Ser Phe Tyr Arg Asp 260 <210> 2 <211> 263 <212> PRT <213> Colinsella aerofaciems <400> 2 Met Asn Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Leu Ile Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Lys Ile Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Asn Val Leu 35 40 45 Ala Gly Glu Ile Arg Glu Thr Tyr Gly Val Glu Thr Lys Val Val Arg 50 55 60 Ala Asp Phe Ser Gln Pro Gly Ala Ala Glu Thr Val Phe Ala Ala Thr 65 70 75 80 Glu Gly Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Leu His Ser 85 90 95 Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Ala Met Ile 100 105 110 Asn Val Asn Val Val Thr Phe Leu Lys Cys Phe His His Tyr Met Arg 115 120 125 Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Met 130 135 140 Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln Tyr Gly Ala Gly Lys 145 150 155 160 Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Cys Glu Gly 165 170 175 Thr Gly Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Leu Thr Pro 180 185 190 Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln Gly Glu Ala Val Met 195 200 205 Lys Ile Ala Leu Thr Pro Glu Glu Cys Val Asp Glu Ala Phe Glu Lys 210 215 220 Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ala Gly Gln Arg Asn Lys Asp Ser 225 230 235 240 Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Glu Tyr Ile Arg Tyr 245 250 255 Met Gly Ser Phe Tyr Arg Asp 260 <210> 3 <211> 774 <212> DNA <213> Comamonas testosteroni <220> <221> CDS <222> (1)..(774) <400> 3 atg tcc atc atc gtg ata agc ggc tgc gcc acc ggc att ggt gcc gct 48 Met Ser Ile Ile Val Ile Ser Gly Cys Ala Thr Gly Ile Gly Ala Ala 1 5 10 15 acg cgc aag gtc ctg gag gcg gcc ggt cac cag atc gta ggc atc gat 96 Thr Arg Lys Val Leu Glu Ala Ala Gly His Gln Ile Val Gly Ile Asp 20 25 30 ata cgc gat gcg gaa gtg att gcc gat ctc tcg acg gcc gaa ggt cga 144 Ile Arg Asp Ala Glu Val Ile Ala Asp Leu Ser Thr Ala Glu Gly Arg 35 40 45 aag cag gcg att gcc gat gta ctg gcg aag tgc agc aag ggc atg gac 192 Lys Gln Ala Ile Ala Asp Val Leu Ala Lys Cys Ser Lys Gly Met Asp 50 55 60 ggc ctg gtg ctg tgc gcc ggc ctg gga ccg cag acc aag gtg ctt ggc 240 Gly Leu Val Leu Cys Ala Gly Leu Gly Pro Gln Thr Lys Val Leu Gly 65 70 75 80 aat gtg gtt tcg gtc aat tat ttt ggc gcg acc gag ctg atg gat gcc 288 Asn Val Val Ser Val Asn Tyr Phe Gly Ala Thr Glu Leu Met Asp Ala 85 90 95 ttt ttg cca gcg ctg aaa aaa ggc cat cag ccc gca gcc gtc gtc atc 336 Phe Leu Pro Ala Leu Lys Lys Gly His Gln Pro Ala Ala Val Val Ile 100 105 110 tcg tcc gtg gct tcc gcg cat ctg gct ttt gac aag aac cca ctg gcg 384 Ser Ser Val Ala Ser Ala His Leu Ala Phe Asp Lys Asn Pro Leu Ala 115 120 125 ctg gca ctg gaa gcc ggc gag gaa gcc aag gcc cgc gcc att gtc gaa 432 Leu Ala Leu Glu Ala Gly Glu Glu Ala Lys Ala Arg Ala Ile Val Glu 130 135 140 cat gcg gga gag cag ggc gga aat ctg gcc tat gcg ggc agc aag aat 480 His Ala Gly Glu Gln Gly Gly Asn Leu Ala Tyr Ala Gly Ser Lys Asn 145 150 155 160 gct ttg acg gtg gct gtg cgc aaa cgc gcc gcc gcc tgg ggc gag gct 528 Ala Leu Thr Val Ala Val Arg Lys Arg Ala Ala Ala Trp Gly Glu Ala 165 170 175 ggc gtg cgc ctg aac acc atc gcc ccc ggt gca acc gag act ccc ttg 576 Gly Val Arg Leu Asn Thr Ile Ala Pro Gly Ala Thr Glu Thr Pro Leu 180 185 190 ctg cag gcg ggc ctg cag gac ccg cgc tat ggc gaa tcc att gcc aag 624 Leu Gln Ala Gly Leu Gln Asp Pro Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Ala Lys 195 200 205 ttc gtt cct ccc atg ggc cgc cgt gcc gag ccg tcc gag atg gcg tcg 672 Phe Val 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Val Leu Ala Lys Cys Ser Lys Gly Met Asp 50 55 60 Gly Leu Val Leu Cys Ala Gly Leu Gly Pro Gln Thr Lys Val Leu Gly 65 70 75 80 Asn Val Val Ser Val Asn Tyr Phe Gly Ala Thr Glu Leu Met Asp Ala 85 90 95 Phe Leu Pro Ala Leu Lys Lys Gly His Gln Pro Ala Ala Val Val Ile 100 105 110 Ser Ser Val Ala Ser Ala His Leu Ala Phe Asp Lys Asn Pro Leu Ala 115 120 125 Leu Ala Leu Glu Ala Gly Glu Glu Ala Lys Ala Arg Ala Ile Val Glu 130 135 140 His Ala Gly Glu Gln Gly Gly Asn Leu Ala Tyr Ala Gly Ser Lys Asn 145 150 155 160 Ala Leu Thr Val Ala Val Arg Lys Arg Ala Ala Ala Trp Gly Glu Ala 165 170 175 Gly Val Arg Leu Asn Thr Ile Ala Pro Gly Ala Thr Glu Thr Pro Leu 180 185 190 Leu Gln Ala Gly Leu Gln Asp Pro Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Ala Lys 195 200 205 Phe Val Pro Pro Met Gly Arg Arg Ala Glu Pro Ser Glu Met Ala Ser 210 215 220 Val Ile Ala Phe Leu Met Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Val His Gly Ala 225 230 235 240 Gln Ile Val Ile Asp Gly Gly Ile Asp Ala Val Met Arg Pro Thr Gln 245 250 255 Phe Leu Glu His His His His His 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Leu Ala Phe Asp Lys Asn Pro Leu Ala 115 120 125 Leu Ala Leu Glu Ala Gly Glu Glu Ala Lys Ala Arg Ala Ile Val Glu 130 135 140 His Ala Gly Glu Gln Gly Gly Asn Leu Ala Tyr Ala Gly Ser Lys Asn 145 150 155 160 Ala Leu Thr Val Ala Val Arg Lys Arg Ala Ala Ala Trp Gly Glu Ala 165 170 175 Gly Val Arg Leu Asn Thr Ile Ala Pro Gly Ala Thr Glu Thr Pro Leu 180 185 190 Leu Gln Ala Gly Leu Gln Asp Pro Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Ala Lys 195 200 205 Phe Val Pro Pro Met Gly Arg Arg Ala Glu Pro Ser Glu Met Ala Ser 210 215 220 Val Ile Ala Phe Leu Met Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Val His Gly Ala 225 230 235 240 Gln Ile Val Ile Asp Gly Gly Ile Asp Ala Val Met Arg Pro Thr Gln 245 250 255 Phe Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 8 <211> 265 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3alpha-HSDH [R34N/L68A]; <400> 8 Met Ser Ile Ile Val Ile Ser Gly Cys Ala Thr Gly Ile Gly Ala Ala 1 5 10 15 Thr Arg Lys Val Leu Glu Ala Ala Gly His Gln Ile Val Gly Ile Asp 20 25 30 Ile Asn Asp Ala Glu Val Ile Ala Asp Leu Ser Thr Ala Glu Gly Arg 35 40 45 Lys Gln Ala Ile Ala Asp Val Leu Ala Lys Cys Ser Lys Gly Met Asp 50 55 60 Gly Leu Val Ala Cys Ala Gly Leu Gly Pro Gln Thr Lys Val Leu Gly 65 70 75 80 Asn Val Val Ser Val Asn Tyr Phe Gly Ala Thr Glu Leu Met Asp Ala 85 90 95 Phe Leu Pro Ala Leu Lys Lys Gly His Gln Pro Ala Ala Val Val Ile 100 105 110 Ser Ser Val Ala Ser Ala His Leu Ala Phe Asp Lys Asn Pro Leu Ala 115 120 125 Leu Ala Leu Glu Ala Gly Glu Glu Ala Lys Ala Arg Ala Ile Val Glu 130 135 140 His Ala Gly Glu Gln Gly Gly Asn Leu Ala Tyr Ala Gly Ser Lys Asn 145 150 155 160 Ala Leu Thr Val Ala Val Arg Lys Arg Ala Ala Ala Trp Gly Glu Ala 165 170 175 Gly Val Arg Leu Asn Thr Ile Ala Pro Gly Ala Thr Glu Thr Pro Leu 180 185 190 Leu Gln Ala Gly Leu Gln Asp Pro Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Ala Lys 195 200 205 Phe Val Pro Pro Met Gly Arg Arg Ala Glu Pro Ser Glu Met Ala Ser 210 215 220 Val Ile Ala Phe Leu Met Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Val His Gly Ala 225 230 235 240 Gln Ile Val Ile Asp Gly Gly Ile Asp Ala Val Met Arg Pro Thr Gln 245 250 255 Phe Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 9 <211> 401 <212> PRT <213> Mycobacterium vaccae <400> 9 Met Ala Lys Val Leu Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asp Gly Tyr 1 5 10 15 Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp His Tyr Pro 20 25 30 Gly Gly Gln Ile Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Thr Pro Gly 35 40 45 Gln Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Glu Tyr Leu 50 55 60 Glu Ser Asn Gly His Thr Leu Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Phe Glu Arg Glu Leu Val Asp Ala Asp Val Val Ile Ser 85 90 95 Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Pro Glu Arg Ile Ala Lys Ala 100 105 110 Lys Asn Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val 115 120 125 Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asp Arg Asn Val Thr Val Ala Glu Val Thr 130 135 140 Tyr Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu 145 150 155 160 Ser Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Glu Trp Ala Arg Lys Gly 165 170 175 Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser His Ala Tyr Asp Leu Glu Ala 180 185 190 Met His Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu 195 200 205 Arg Arg Leu Ala Pro Phe Asp Val His Leu His Tyr Thr Asp Arg His 210 215 220 Arg Leu Pro Glu Ser Val Glu Lys Glu Leu Asn Leu Thr Trp His Ala 225 230 235 240 Thr Arg Glu Asp Met Tyr Pro Val Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Cys 245 250 255 Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Asp Glu Thr Leu Lys 260 265 270 Leu Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Ile Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu 275 280 285 Cys Asp Arg Asp Ala Val Ala Arg Ala Leu Glu Ser Gly Arg Leu Ala 290 295 300 Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His 305 310 315 320 Pro Trp Arg Thr Met Pro Tyr Asn Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly 325 330 335 Thr Thr Leu Thr Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile 340 345 350 Leu Glu Cys Phe Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile 355 360 365 Val Gln Gly Gly Ala Leu Ala Gly Thr Gly Ala His Ser Tyr Ser Lys 370 375 380 Gly Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Lys Ala 385 390 395 400 Val <210> 10 <211> 786 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(786) <400> 10 atg tat ccg gat tta aaa gga aaa gtc gtc gct att aca gga gct gct 48 Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala 1 5 10 15 tca ggg ctc gga aag gcg atg gcc att cgc ttc ggc aag gag cag gca 96 Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala 20 25 30 aaa gtg gtt atc aac tat tat agt aat aaa caa gat ccg aac gag gta 144 Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val 35 40 45 aaa gaa gag gtc atc aag gcg ggc ggt gaa gct gtt gtc gtc caa gga 192 Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly 50 55 60 gat gtc acg aaa gag gaa gat gta aaa aat atc gtg caa acg gca att 240 Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile 65 70 75 80 aag gag ttc ggc aca ctc gat att atg att aat aat gcc ggt ctt gaa 288 Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu 85 90 95 aat cct gtg cca tct cac gaa atg ccg ctc aag gat tgg gat aaa gtc 336 Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val 100 105 110 atc ggc acg aac tta acg ggt gcc ttt tta gga agc cgt gaa gcg att 384 Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile 115 120 125 aaa tat ttc gta gaa aac gat atc aag gga aat gtc att aac atg tcc 432 Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser 130 135 140 agt gtg cac gaa gtg att cct tgg ccg tta ttt gtc cac tat gcg gca 480 Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala 145 150 155 160 agt aaa ggc ggg ata aag ctg atg aca gaa aca tta gcg ttg gaa tac 528 Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr 165 170 175 gcg ccg aag ggc att cgc gtc aat aat att ggg cca ggt gcg atc aac 576 Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn 180 185 190 acg cca atc aat gct gaa aaa ttc gct gac cct aaa cag aaa gct gat 624 Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp 195 200 205 gta gaa agc atg att cca atg gga tat atc ggc gaa ccg gag gag atc 672 Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile 210 215 220 gcc gca gta gca gcc tgg ctt gct tcg aag gaa gcc agc tac gtc aca 720 Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr 225 230 235 240 ggc atc acg tta ttc gcg gac ggc ggt atg aca caa tat cct tca ttc 768 Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe 245 250 255 cag gca ggc cgc ggt taa 786 Gln Ala Gly Arg Gly 260 <210> 11 <211> 261 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 11 Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala 20 25 30 Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val 35 40 45 Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly 50 55 60 Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile 65 70 75 80 Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu 85 90 95 Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val 100 105 110 Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile 115 120 125 Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser 130 135 140 Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala 145 150 155 160 Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr 165 170 175 Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn 180 185 190 Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp 195 200 205 Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile 210 215 220 Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr 225 230 235 240 Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe 245 250 255 Gln Ala Gly Arg Gly 260 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ggcatcgata taaacgatgc ggaagtg 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 cacttccgca tcgtttatat cgatgcc 27 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tcgtaggcat cgatatactc gatgcggaag tgat 34 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 atcacttccg catcgagtat atcgatgcct acga 34 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 accagatcgt aggcatcgat ataagcgatg cggaag 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 cttccgcatc gcttatatcg atgcctacga tctggt 36 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 accagatcgt aggcatcgat atatgcgatg cggaag 36 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 cttccgcatc gcatatatcg atgcctacga tctggt 36 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ggacggcctg gtgtcgtgcg ccggcctg 28 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 caggccggcg cacgacacca ggccgtcc 28 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 ggacggcctg gtgtgctgcg ccggcctgg 29 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 ccaggccggc gcagcacacc aggccgtcc 29 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ggacggcctg gtgaagtgcg ccggcctg 28 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 caggccggcg cacttcacca ggccgtcc 28 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 acggcctggt ggtgtgcgcc ggc 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 gccggcgcac accaccaggc cgt 23 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 gacggcctgg tggcgtgcgc cggcct 26 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 aggccggcgc acgccaccag gccgtc 26 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 30 aacaccatcg ccgccggtgc aaccg 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 31 cggttgcacc ggcggcgatg gtgtt 25 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 32 gaacaccatc gccggcggtg caaccgag 28 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 33 ctcggttgca ccgccggcga tggtgttc 28 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 34 gaacaccatc gccaccggtg caaccga 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 35 tcggttgcac cggtggcgat ggtgttc 27 <210> 36 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 36 ctgaacacca tcgccgtcgg tgcaaccgag ac 32 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 37 gtctcggttg caccgacggc gatggtgttc ag 32 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 38 ctgaacacca tcgccagcgg tgcaaccgag ac 32 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 39 gtctcggttg caccgctggc gatggtgttc ag 32 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 40 cgcccccggt gcagccgaga ctcc 24 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 41 ggagtctcgg ctgcaccggg ggcg 24 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 42 cccccggtgc aagcgagact ccc 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 43 gggagtctcg cttgcaccgg ggg 23 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 44 atcgcccccg gtgcagtcga gactcccttg 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 45 caagggagtc tcgactgcac cgggggcgat 30 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 46 tcgcccccgg tgcaggcgag actccctt 28 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 47 aagggagtct cgcctgcacc gggggcga 28 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 48 atcgcccccg gtgcatggga gactcccttg ctg 33 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 49 cagcaaggga gtctcccatg caccgggggc gat 33

Claims (27)

1. NADH의 화학양론적 소모 하에서, 상응하는 3-하이드록시스테로이드로의 3-케토스테로이드의 적어도 입체특이적 효소적 환원을 촉매화하는 3α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(3α-HSDH)로서,
   상기 효소는 서열번호 4와 적어도 90%의 서열 동일성을 가지고;
   상기 효소는
   a)　단일 돌연변이체
   R34X₁ 및
   L68X₂ 및
   b) 이중 돌연변이체
   R34X₁/L68X₂,
   여기서,
   X₁은 N, C, S 또는 L을 나타내고;
   X₂는 A, C, K, S 또는 V를 나타냄;
   c) 3개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 잔기에 의해 C-말단 방향으로 연장된 첨가 돌연변이체;
   d) 3 내지 10 개의 히스티딘 잔기를 포함하는 잔기에 의해 N-말단 방향으로 연장된 추가 돌연변이체; 및
   e) a) 및 b)에 따른 돌연변이체로서, 각각의 경우 부가적으로는, 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 잔기에 의해 C-말단 방향으로 연장되거나, 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 잔기에 의해 N-말단 방향으로 연장되거나, 동시에 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 잔기에 의해 N-말단 방향으로 연장 및 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 잔기에 의해 C-말단 방향으로 연장된 돌연변이체;로부터 선택되며;
   상기 3α-HSDH는 서열번호 4를 가진 3α-HSDH와 비교하여, 하기 특성 프로파일:
   i) 보조인자인 NADH를 이용한 DHCA의 효소적 환원에서 데하이드로콜산(DHCA)에 대한 증가된 비활성(specific activity)(V_max[U/mg]);
   ii) DHCA에 의한 감소된 기질 저해;
   iii) 보조인자인 NADH를 이용한 DHCA의 효소적 환원에서 NADH에 대한 증가된 비활성(V_max[U/mg]);
   iv) 이들 특성 i) 내지 iii)은 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있음
   을 보여주는, 3α-HSDH.
2. NADH의 화학양론적 소모 하에서의, 상응하는 3-하이드록시스테로이드로의 3-케토스테로이드의 적어도 입체특이적 효소적 환원을 촉매화하는 3α-하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(3α-HSDH)로서,
   상기 효소는 서열번호 4와 적어도 90%의 서열 동일성을 가지고;
   상기 효소는
   (i) 이중 돌연변이체
   P185X₁/T188X₃;
   L68X₂/T188X₃;
   L68X₂/T185X₁;
   여기서,
   X₁는 A, T, S, G 또는 V를 나타내며;
   X₂는 A, G, C, K, S 또는 V를 나타내고;
   X₃는 A, G, W, S 또는 V를 나타냄;
   (ii) 상기 (i) 의 이중 돌연변이체는
   부가적으로는, 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 C-말단 연장; 또는 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 N-말단 연장 또는 동시에 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 잔기에 의해 N-말단 방향으로 연장 및 1개 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 잔기에 의해 C-말단 방향으로 연장된 것인 돌연변이체;
   로부터 선택되며;
   상기 3α-HSDH는 서열번호 4를 가진 3α-HSDH와 비교하여, 하기 특성 프로파일:
   a) 보조인자인 NADH를 이용한 DHCA의 효소적 환원에서 데하이드로콜산(DHCA)에 대한 증가된 비활성(V_max[U/mg]);
   b) DHCA에 의한 감소된 기질 저해;
   c) 보조인자인 NADH를 이용한 DHCA의 효소적 환원에서 NADH에 대한 증가된 비활성(V_max[U/mg])
   을 보여주며,
   이들 특성 a) 내지 c)는 개별적으로 또는 임의의 조합으로 존재할 수 있는, 3α-HSDH.
   
3. 제1항 또는 제2항에 따른 3α-HSDH를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
4. 적어도 하나의 조절 서열의 조절 하에, 제3항에 따른 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트.
5. 제4항에 따른 적어도 하나의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터.
6. 제1항 또는 제2항에 따른 3α-HSDH를 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는, 재조합 미생물.
7. 제6항에 있어서,
   재조합 미생물이 부가적으로, 하이드록시스테로이드 데하이드로게나제(HSDH), 및 보조인자 재생에 적합한 데하이드로게나제로부터 선택되는 적어도 하나의 추가적인 효소에 대한 코딩 서열을 포함하는, 재조합 미생물.
   
8. 제7항에 있어서,
   추가적인 HSDH가 NADPH-의존적이거나 NADH-의존적인 7β-HSDH로부터 선택되고;
   데하이드로게나제가 NADPH-재생 효소 및 NADH-재생 효소에서 선택되는 것인, 재조합 미생물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 NADPH-재생 효소는
   NADPH 데하이드로게나제, 알코올 데하이드로게나제(ADH), NADPH-재생 포르메이트 데하이드로게나제(FDH), 글루코스 데하이드로게나제(GDH), 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G-6-PDH) 및 포스파이트 데하이드로게나제(PtDH) 중에서 선택되는 것인, 재조합 미생물.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 NADH-재생 효소는
    NADH 데하이드로게나제, NADH-재생 포르메이트 데하이드로게나제(FDH), NADH-재생 알코올 데하이드로게나제(ADH), NADH-재생 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PDH), NADH-재생 포스파이트 데하이드로게나제(PtDH) 및 NADH-재생 글루코스 데하이드로게나제(GDH)로부터 선택되는, 재조합 미생물.
    
11. 제6항에 있어서,
    재조합 미생물이 7α-HSDH 넉아웃 균주인, 재조합 미생물.
    
12. 3α-하이드록시스테로이드의 효소적 합성 또는 미생물적 합성 방법으로서,
    상응하는 3-케토스테로이드가, 제1항 또는 제2항에 따른 3α-HSDH의 존재 하에, 또는 상기 3α-HSDH를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 미생물의 존재 하에 환원되는, 3α-하이드록시스테로이드의 효소적 합성 또는 미생물적 합성 방법.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 적어도 하나의 형성된 환원 생성물이 반응 혼합물로부터 단리되는, 3α-하이드록시스테로이드의 효소적 합성 또는 미생물적 합성 방법.
    
14. 제12항에 있어서,
    3-케토스테로이드가 데하이드로콜산(DHCA) 및 산의 알킬 에스테르, 염 또는 아미드로부터 선택되는 이들의 유도체로부터 선택되는 것인, 방법.
    
15. 제12항에 있어서,
    반응이 NADPH, NADH, 또는 NADPH 및 NADH의 존재 하에 또는 소모 시 발생하는, 방법.
    
16. 제15항에 있어서,
    소모된 NADPH가 NADPH-재생 효소와 커플링함으로써 재생되는, 방법.
    
17. 제16항에 있어서, NADPH-재생 효소가 NADPH 데하이드로게나제, 알코올 데하이드로게나제(ADH), NADPH-재생 포르메이트 데하이드로게나제(FDH) 및 NADPH-재생 글루코스 데하이드로게나제(GDH)로부터 선택되는 것인, 방법.
    
18. 제15항에 있어서,
    소모된 NADH가 NADH-재생 효소와 커플링함으로써 재생되는, 방법.
    
19. 제18항에 있어서, NADH-재생 효소가 NADH-데하이드로게나제, NADH-재생 포르메이트 데하이드로게나제(FDH), NADH-재생 알코올 데하이드로게나제(ADH), NADH-재생 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(G6PDH), NADH-재생 포스파이트 데하이드로게나제(PtDH) 및 NADH-재생 글루코스 데하이드로게나제(GDH)로부터 선택되는 것인, 방법.
    
20. 제16항에 있어서, 상기 NADPH-재생 효소는 재조합 미생물에서 발현되는 것인, 방법.
    
21. 제18항에 있어서, 상기 NADH-재생 효소는 재조합 미생물에서 발현되는 것인, 방법.
22. 제16항에 있어서,
    NADPH-재생 효소가
    a) CO₂로의 포름산의 효소적 산화를 적어도 촉매화하는 NAD⁺-의존적 FDH의 돌연변이체를 포함한 FDH; 및
    b) GDH
    로부터 선택되는 것인, 방법.
    
23. 식 (1)의 우르소데옥시콜산(UDCA)의 제조 방법으로서,
    

    

    
    상기 식 (1)에서,
    R은 알킬, H, 알칼리 금속 이온 또는 N(R³)₄ ⁺를 나타내며,
    라디칼 R³는 동일하거나 상이하고, H 또는 알킬을 나타내거나,
    기 -CO₂R은 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체되며,
    R¹ 및 R²는 서로 독립적으로 알킬 라디칼을 나타내며;
    a) 하기 식(3) 의 데하이드로콜산(DHCA)이
    

    

    
    NADH 또는 NADPH의 존재 및 소모하에, 제1항 또는 제2항에 따른 적어도 하나의 3α-HSDH 돌연변이체의 존재 하에, 및 적어도 하나의 7β-HSDH의 존재 하에, 하기 식 (5)의 상응하는 12-케토-우르소데옥시콜산(12-케토 UDCA)으로 환원되며, 여기서 R은 상기 언급된 의미를 가지거나, 기 -CO₂R은 상기 정의된 바와 같이 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체되고,
    

    

    
    상기 식 (5)에서, R은 상기 언급된 의미를 가지거나, 기 -CO₂R은 상기 정의된 바와 같이 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체되며; 후속적으로
    b) 식 (5)의 12-케토-UDCA는 UDCA로 화학적으로 환원됨.
24. 제23항에 있어서,
    상기 식 (3)의 데하이드로콜산(DHCA)은 하기 식(2)의 콜산(CA)이 식 (3)의 데하이드로콜산(DHCA)으로 화학적으로 산화되어 제조되는 것이며,
    

    

    
    R은 상기 언급된 의미를 가지거나, 기 -CO₂R은 상기 정의된 바와 같이 산 아미드기 -CONR¹R²에 의해 대체되는 것인, 방법.
    
25. 제23항에 있어서, 상기 반응 생성물은 추가로 정제되는, 방법.
26. 제23항에 있어서,
    적어도 단계 a)가 상기 3α-HSDH-돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 미생물의 존재 하에 수행되는, 방법.
27. 제23항에 있어서,
    단계 a)가 동일하거나 상이한 보조인자 재생 시스템과 커플링되는, 방법.

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